KR101649733B1 - 효소를 이용한 실라스타틴 나트륨염의 신규한 제조 방법 - Google Patents

효소를 이용한 실라스타틴 나트륨염의 신규한 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트를 가수분해 효소를 이용하여 가수분해하여 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산을 제조하고, 이로부터 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산을 제조하고, 이로부터 실라스타틴 나트륨염을 제조하는 것을 포함하는, 실라스타틴 나트륨염의 신규한 제조 방법에 관한 것이다.

Description

효소를 이용한 실라스타틴 나트륨염의 신규한 제조 방법{NOVEL METHOD FOR PREPARING CILASTATIN SODIUM USING ENZYME}
본원은 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트를 가수분해 효소를 이용하여 가수분해하여 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산을 제조하고, 이로부터 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산을 제조하고, 이로부터 실라스타틴 나트륨염을 제조하는 것을 포함하는, 실라스타틴 나트륨염의 신규한 제조 방법에 관한 것이다.
실라스타틴 나트륨염을 제조하기 위한 종래의 제조방법으로는, 예를 들어, 1-브로모-5-클로로펜탄(2)으로부터 그리그나드(Grignard) 반응을 통해 제조하는 방법으로서 하기 반응식과 같은 제조방법(유럽특허공보 제 48301호) 및 에틸-1.3-디티안-2-카르복실레이트를 출발물질로 한 합성법(Donald W.Graham, Wallace T. Ashton, Louis Barash, Jeannette E. Brown, Ronald D. Brown, Laura F. Canning, Anna Chen, James P. Springer, Edward F. Rogers, J. Med. Chem., 30, p1074, 1987)이 알려져 있다.
Figure 112014099245626-pat00001
상기 방법은 제 1공정에서 1-브로모-5-클로로펜탄(2)을 디에틸 옥살레이트와 그리그나드(Grignard)반응을 통해 에틸7-클로로-2-옥소-헵타노에이트(3)를 제조하고, 제 2공정에서 에틸 7-클로로-2-옥소-헵타노에이트(3)를 (S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미드와 반응시켜 에틸 (Z)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트(4)를 제조한다. 이 때 하기 반응식에 기재된 바와 같이 (E) 형태의 이성체 화합물(7)이 불순물로써 10 내지 13%의 양으로 생성됨을 가스 크로마토그래피로 확인하였고, 상기 제 3공정 과정에서 이 불순물은 (E)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산(8)으로 가수분해된다.
Figure 112014099245626-pat00002
기존에 공지된 방법에서는 산 처리한 후 재결정을 통하여 이 불순물을 제거하거나, 또는 제 4공정에서 제 3공정 반응액에 시스테인을 넣고 반응시킨 후 산성화하여 가열함으로써(E)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산과 시스테인이 반응하여 생성된 불순물인 (E)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산을 제거하였으나, 본 발명자의 연구결과, 제 3공정의 수행 후 재결정 과정에서 생성되는 불순물인 (E)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산(8)으로 인하여 목적물인 (Z)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산(5)의 수율이 매우 떨어졌으며, 또한 두 이성질체의 혼합물(9)을 산성조건에서 가열했을 경우 하기 반응식에서 보는 바와 같이 미지의 불순물(10) 및 (S)-2,2-디메틸시클로프로판 카르복사미드(11)로 분해됨을 고속액체 크로마토그래피(HPLC)로 확인하였으며, 생성된 미지의 불순물(10)을 제거하는 데에 큰 어려움이 있었다.
Figure 112014099245626-pat00003
또한, 상기 반응식의 제 4공정에서 실라스타틴을 얻기 위하여 양이온 교환수지를 통과하고 2N 암모니아액으로 용출하여 농축시키고 에탄올과 디에틸에테르로 분리 정제하여 실라스타틴을 상기 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산(6)과 같은 유기산의 형태로 제조하고, 제 5공정에서 수산화나트륨과 반응하여 실라스타틴 나트륨염(1)을 제조한다고 공지되었으나, 국제특허공개공보 제 0318544호에 보고된 바와 같이, 실제로는 상기 반응식의 제 4공정에서 암모니아액 농축 후 농축액은 실라스타틴이 유기산(6)의 형태가 아닌 암모늄염의 형태로 존재함을 확인하였으며, 유기산 형태로 얻기 위하여 염산을 사용하는 경우 염화암모늄과 같은 무기암모늄염의 형성을 동반하기 때문에 고순도의 실라스타틴 나트륨염을 수득할 수가 없었다. 따라서, 고효율 및 저비용으로 고순도의 실라스타틴 나트륨염을 수득하기 위한 신규한 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법이 요구된다.
본원은 가수분해 효소를 이용한 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법, 이로부터 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산을 제조하는 방법, 및 이로부터 실라스타틴 나트륨염을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 하기 화학식 1로 표시되는 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트를 완충 용액 내에서 가수분해 효소를 첨가하여 가수분해하고, 가수분해 생성물 중 하기 화학식 2로 표시되는 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산을 수득하는 것을 포함하는, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112014099245626-pat00004
[화학식 2]
Figure 112014099245626-pat00005
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면의 방법에 따라 제조된 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산을 수산화나트륨과 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 3으로 표시되는 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법을 제공할 수 있다.
[화학식 3]
Figure 112014099245626-pat00006
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면의 방법에 따라 제조된 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산을 소듐 메톡사이드와 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 4로 표시되는 실라스타틴 나트륨염의 제조 방법을 제공할 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112014099245626-pat00007
본원에 의하면, 이미페넴의 보조제로 널리 사용되고 있는 실라스타틴 나트륨염의 중간체인 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 (E) 이성질체를 제거하거나 (E) 이성질체의 생성을 억제함으로써 순도 높은 (Z) 이성질체의 수득을 가능하게 하는, 가수분해 효소를 이용한 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조방법을 제공할 수 있다. 또한, 상기 제조방법에 의해 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산을 고효율, 저비용으로 제조 가능하므로, 고순도의 실라스타틴 나트륨염을 또한 효율적, 경제적으로 제조하는 것이 가능하다.
도 1 은 본원의 일 구현예에 따른 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산, (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산, 및 실라스타틴 나트륨염의 제조과정을 나타내는 순서도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트 및 7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산 각각의 (E) 이성질체 및 (Z) 이성질체를 고성능 액체크로마토그래피 분석한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 (Z)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 고성능 액체크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 (Z)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 전처리 수행 후의 고성능 액체크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.
그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.
이하, 본원의 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법, (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법, 및 실라스타틴 나트륨염의 제조 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, 하기 화학식 1로 표시되는 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트를 완충 용액 내에서 가수분해 효소를 첨가하여 가수분해하고, 가수분해 생성물 중 하기 화학식 2로 표시되는 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산을 수득하는 것을 포함하는, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법을 제공할 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112014099245626-pat00008
[화학식 2]
Figure 112014099245626-pat00009
종래의 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법에 따르면, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산 생성후의 (E) 이성질체 및 (Z) 이성질체 혼합물 (E:Z=1:10~1:20)에서 (E) 이성질체를 제거하거나 이성화 방법, 또는 화학적 가수분해를 통한 순수한 (Z) 이성질체 생성물을 얻기 위하여 고비용, 저효율의 공정이 요구되었으며, 회수율도 50% 정도로 낮았다.
본원의 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법에 따르면 종래의 방법과 달리 효소를 이용하여 가수분해 공정을 진행하므로, 높은 효율 및 낮은 비용으로 순수한 (Z) 이성질체의 생성물을 수득하는 것이 가능하다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 가수분해 효소는 프로테아제(protease) 또는 리파아제(lipase)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 가수분해 효소는 사비나제(Savinase), 폴라자임(Polarzyme), 알카레이즈(Alcalase), 플라보자임(Flavourzyme), 리포자임 CAL-B, 이스트 및 이들의 고정화 효소를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 가수분해 효소는 Bacillus sp.로부터 얻어진 사비나제류 및 폴라자임, B.Licheniformis로부터 얻어진 알카레이즈, aspergillus oryzae로부터 얻어진 플라보자임(Flavourzyme, Novozym 871) 또는 리포자임 CAL-B를 포함하는 것일 수 있으며, Candida sp., Rhizomucor miehei, 또는 Thermomyces lanuginosus로부터 얻어진 리파아제 (Novozyme 435, 871) 또는 효소, 또는 이들의 고정화 효소를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 알카레이즈에 포함된 엔도프로테아제의 비율이 상기 알카레이즈에 포함된 엑소프로테아제의 비율보다 높은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 비율은 중량비일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 엑소프로테아제(exoprotease)는 단백질의 말단으로부터 아미노산 단위로 분해하는 효소이며, 상기 엔도프로테아제(endoprotease)는 단백질을 무작위로 분해하는 기능을 한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 가수분해 효소는 분말 또는 액체, 또는 지지체 상에 고정화된 형태인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 가수분해 효소는 약 8 유닛(Unit) 내지 약 16 유닛 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 가수분해 효소는 약 8 유닛 내지 약 16 유닛, 약 10 유닛 내지 약 16 유닛, 약 12 유닛 내지 약 16 유닛, 약 14 유닛 내지 약 16 유닛, 약 8 유닛 내지 약 14 유닛, 약 8 유닛 내지 약 12 유닛, 또는 약 8 유닛 내지 약 10 유닛 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 완충 용액은 알칼리 금속-기반 완충 용액, 알칼리토금속-기반 완충 용액, 및 아민-기반 완충 용액 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 완충 용액은 포스페이트 (phosphate, pH 7.0~8.0), 암모니아(Ammonia, pH 10.0), 트리에틸암모늄 바이카보네이트 (pH 8.5±0.1), 트리에틸암모늄 아세테이트 버퍼 (pH 7.0), 및/또는 소듐 바이카보네이트/소듐 카보네이트를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 완충 용액은 pH 7 내지 pH 10 사이인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 완충 용액의 pH는 약 7, 8, 9, 또는 10일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 완충 용액은 SH-3 화합물을 3 일 이상 교반할 경우에도 가수분해가 일어나지 않는 pH 조건을 가지는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 가수분해는 약 25℃ 내지 약 50℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 가수분해는 약 25℃ 내지 약 50℃, 약 30℃ 내지 약 50℃, 약 35℃ 내지 약 50℃, 약 40℃ 내지 약 50℃, 약 25℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 35℃, 약 25℃ 내지 약 30℃, 또는 약 35℃ 내지 약 39℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 가수분해는 약 3 시간 내지 약 24 시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 가수분해는 약 3 시간 내지 약 24 시간, 약 5 시간 내지 약 24 시간, 약 10 시간 내지 약 24 시간, 약 15 시간 내지 약 24 시간, 약 20 시간 내지 약 24 시간, 약 3 시간 내지 약 20 시간, 약 3 시간 내지 약 15 시간, 약 3 시간 내지 약 10 시간, 또는 약 3 시간 내지 약 5 시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 가수분해 효소는 상기 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트 1 중량부에 대하여 0.1 중량부 내지 1 중량부 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 가수분해 효소는 상기 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트 1 중량부에 대하여 0.1 중량부 내지 1 중량부, 0.3 중량부 내지 1 중량부, 0.5 중량부 내지 1 중량부, 0.7 중량부 내지 1 중량부, 0.1 중량부 내지 0.7 중량부, 0.1 중량부 내지 0.5 중량부, 또는 0.1 중량부 내지 0.3 중량부 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트는 에틸 7-클로로-2-옥소-헵타노에이트, (s)-2,2'-디메틸사이클로프로판카르복사미드, 톨루엔, 및 톨루엔설폰산을 반응시켜 제조되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면의 방법에 따라 제조된 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산을 수산화나트륨과 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 3으로 표시되는 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법을 제공할 수 있다.
[화학식 3]
Figure 112014099245626-pat00010
본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 본원의 제 1 측면에 대해 설명한 내용은 본원의 제 2 측면에서 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.
예를 들어, 상기 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산을 제조하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 미국 등록특허공보 제7371897호 또는 대한민국 공개공보 제2006-0018641호에 개시된 방법에 의할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 제조된 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산의 순도는 99% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면의 방법에 따라 제조된 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산을 소듐 메톡사이드와 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 4로 표시되는 실라스타틴 나트륨염의 제조 방법을 제공할 수 있다.
[화학식 4]
Figure 112014099245626-pat00011
본원의 제 1 측면 및 제 2 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 본원의 제 1 측면 및 제 2 측면에 대해 설명한 내용은 본원의 제 3 측면에서 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.
예를 들어, 상기 실라스타틴 나트륨염을 제조하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 미국 등록특허공보 제7371897호 또는 대한민국 공개공보 제2006-0018641호에 개시된 방법에 의할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 제조된 실라스타틴 나트륨염의 순도는 99% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예]
이하에서는, 도 1에 개시된 실라스타틴 나트륨염의 제조과정을 나타내는 순서도를 참조하여 실시예를 기술하고자 한다.
실시예 1 : 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트 혼합물 (SH-3)의 화학적 합성 (공정 1)
에틸 7-클로로-2-옥소-헵타노에이트(SH-1) 25.0 g (0.1209 몰), (s)-2,2'-디메틸사이클로프로판카르복사미드(ES-2) 13.68 g (0.1209 몰), 톨루엔 125 ml 및 톨루엔 설폰산 0.25 g을 500 ml 플라스크에 넣고 Dean-Stark Trap을 이용하여 24 시간 동안 환류시켜 반응을 종결하였다. 이어서 톨루엔을 증류 제거하여 에틸 (E,Z)-7-클로로-2-((s)-2,2'-디메틸사이클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트를 수득하였다. 구체적인 방법은 유럽특허공보 제48301호에 기술된 방법을 참조하였다.
- HPLC: (E) : (Z) = 1:9 ~ 1:20
비교예 : 화학적 가수분해에 의한 (E, Z)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산 혼합물 (SH-4)의 제조
상기 실시예 1에서 수득한 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트 (30.1 g, 0.10 몰)를 메탄올 (110 ml)에 녹인 후 수산화나트륨용액 (220 ml, 0.06 몰)을 가하여 실온에서 약 1~3시간 교반하였다. HPLC를 통하여 Z 이성질체 및 E 이성질체의 비율이 9:1 ~20:1이 되었을 때 반응을 종결 시킨 후 디클로로메탄 (66 ml)을 이용하여 반응하지 않은 유기물을 추출해내고, 3 N 염산으로 pH를 1 내지 3으로 조절한 후, 이소프로필 에테르 (66 ml)로 1~2회 추출한 후, 유기물을 MgSO4로 물을 제거하고 농축하여 조생성물 25.1 g (92% 수율)을 수득하였다.
- HPLC: (E) : (Z) = 1:9 ~ 1:20
실시예 2 : 효소 가수분해에 의한 (Z)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산 (SH-4)의 제조 [공정 2 : Bacillus sp .의 프로테아제(사비나제) 사용]
상기 실시예 1에서 수득한 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트 (30.1 g, 0.10 몰, E:Z = 1:20~1:10)에 염기성 완충용액 (Sodium bicarbonate/Sodium carbonate concentrate, pH 10, 500 ml)을 넣은 후 프로테아제[사비나제(Savinase), Bacillus sp.의 프로테아제, 8~16 Unit]를 기질 무게의 0.1~1.0배를 가하여 37℃±2에서 10~24시간 교반하였다. TLC를 통하여 Z 이성질체가 모두 가수분해 되었을 때 1 N-HCl로 pH를 7.0 근처로 하여 반응을 종결 시킨 후, 디클로로메탄 (100 ml)을 이용하여 E 이성질체 등 반응하지 않은 유기물과 미량의 부생성물을 추출 및 제거하였다. 이어서 3 N 염산을 이용하여 pH를 1 내지 3으로 조절한 후, 에테르 류 (이소프로필 에테르, 100 ml)로 1~2회 추출한 후, 유기물을 MgSO4로 물을 제거하고 농축하여 순수한 Z 이성질체 SH-4 (75~85% 수율)을 수득하였다.
- HPLC: (Z) 이성질체 99% 이상
실시예 3 : 효소 가수분해에 의한 (Z)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산 (SH-4)의 제조 [공정 2: B.Licheniformis 의 프로테아제 (알카레이즈) 사용]
상기 실시예 1에서 수득한 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트 (30.1 g, 0.10 몰, E:Z = 1:20~1:10)에 염기성 완충용액 (Phosphate, pH 8.5, 500 ml)을 넣은 후 프로테아제 [알카레이즈(Alcalase), B.Licheniformis의 프로테아제]를 기질 무게의 0.1~1.0배를 가하여 37℃±2에서 3~24시간 교반하였다. TLC를 통하여 Z 이성질체가 모두 가수분해 되었을 때 하여 반응을 종결 시킨 후, 디클로로메탄 (100 ml)을 이용하여 E 이성질체 등 반응하지 않은 유기물과 미량의 부생성물을 추출 및 제거하였다. 이어서 3 N 염산을 이용하여 pH를 1 내지 3으로 조절한 후, 에테르 류 (이소프로필 에테르, 100 ml)로 1~2회 추출한 후, 유기물을 MgSO4로 물을 제거하고 농축하여 순수한 Z 이성질체 SH-4 (75~85% 수율)을 수득하였다.
- HPLC: (Z) 이성질체 99.5% 이상
실시예 4 : (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 (공정 3)
상기 실시예 2 또는 3의 효소반응에서 수득한 순수 (Z)-7-클로로-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산 (SH-4) (27.38g, 0.10mol)을 4N 수산화나트륨 14g을 물 100ml에 녹인 수용액(0.35mol)과 에탄올(200ml)로 녹인 후 L-시스테인·HCl·H2O(19.32g, 0.11)을 넣어 60~70℃에서 SH-4가 모두 반응할 때까지 반응을 완결시켰다. 용액을 상온으로 하여 생성된 흰색의 고체를 여과하여 제거하고, 여액을 감압 하 제거하였다. 조생성물에 증류수(80ml)를 넣어 녹인 후, 디클로로메탄(80ml)로 1회 세척하여 미반응물들을 제거한 후, 수용액의 pH를 3N 염산용액으로 pH를 3.0 내지 4.0으로 조절하여 n-부탄올로 추출하고 농축하여 케이크 형태의 조생성물을 넣었다. 다시 물과 아세토니트릴(또는 아세톤) 혼합용액(1:15~1:20, 200ml)를 넣고 50℃에서 1시간과 80℃에서 30분 가열하고 5℃로 냉각하여 흰색의 순수한 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산(SH-5)을 85%(30.47g)를 수득하였다.
본 공정에 추가적으로, 조생성 농축액을 양이온 교환 수지로 또는 실리카겔로 분리, 정제할 수도 있다.
실시예 5 : 실라스타틴 나트륨염의 제조 (공정 4)
상기 실시예 4에서 합성한 SH-5 (17.93g, 0.05mol)을 무수 메탄올(100ml)에 녹인 후 pH를 7 내지 8로 맞추면서 소듐 메톡사이드 용액 (25 wt. % in MeOH, 8g, 0.056mol)을 서서히 가한다. 상온에서 1시간 교반 후 carbon (5g)을 넣어 10분간 교반하고 여과 (0.2 micron filter)한다. 여액에 물과 아세토니트릴(또는 아세톤) 혼합용액(1:1~2:1, 50ml)를 넣어 생성된 실라스타틴 나트륨염 (SH-6)를 여과하여 고순도(99.4%)로 얻었다.
본 공정에 추가적으로, 조생성 농축액을 양이온 교환 수지로 분리, 동결건조 과정을 거쳐 제조할 수도 있다.
실시예 6 : 크로마토그래피 분석
실시예 2 또는 3과 관련하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC) 분석을 실시하였다 (컬럼: C-18, 이동상: 아세토니트릴/물(gradient), 검출기: 자외선 210nm).
먼저, (E)- 와 (Z)-SH-3 및 (E)- 와 (Z)-SH-4 의 표준 용액에 대한 HPLC를 실시하였다. 각 물질을 실리카겔 컬럼분리하여 핵자기공명분광기(NMR) 및 질량분석기(Mass)로 확인한 후, 일정량을 혼합하여 HPLC 스펙트라를 분석하였다 (도 2). 도 2에 나타난 바에 따르면, 각각의 물질의 피크가 관찰되었다.
도 3은 실시예 2 또는 실시예 3의 반응이 종결된 시점에서의 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 데이터를 나타낸 것이다. 실시예 2 또는 실시예 3의 효소반응에서 박층액체크로마토그래피(TLC)로 (Z)-SH-3이 모두 반응한 후에 분석한 HPLC 스펙트라이다. 도 3에 나타난 바에 따르면, 뚜렷한 (Z)-SH-4의 피크가 관찰되었다.
도 4는 실시예 2 또는 실시예 3의 반응이 종결된 후 간단한 전처리를 수행하여 얻은 순수한 (Z)-SH-4의 고성능액체크로마토그래피 데이터를 나타낸 것이다. 도 4에 나타난 바에 따르면, 순수한 (Z)-SH-4의 피크가 관찰되었다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트를 완충 용액 내에서 프로테아제 또는 리파아제를 첨가하여 가수분해하고, 가수분해 생성물 중 하기 화학식 2로 표시되는 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산을 수득하는 것을 포함하는, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
    [화학식 1]
    Figure 112016069921187-pat00012

    [화학식 2]
    Figure 112016069921187-pat00013
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 프로테아제는 사비나제(Savinase), 폴라자임(Polarzyme), 알카레이즈(Alcalase), 플라보자임(Flavourzyme) 및 이들의 고정화 효소를 포함하며,
    상기 리파아제는 리포자임 CAL-B 및 이의 고정화 효소를 포함하는 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 프로테아제 또는 리파아제는 8 유닛(Unit) 내지 16 유닛 첨가되는 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 알카레이즈에 포함된 엔도프로테아제의 비율이 상기 알카레이즈에 포함된 엑소프로테아제의 비율보다 높은 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 프로테아제 또는 리파아제는 분말 또는 액체, 또는 지지체 상에 고정화된 형태인 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충 용액은 알칼리 금속-기반 완충 용액, 알칼리토금속-기반 완충 용액, 및 아민-기반 완충 용액 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 완충 용액은 pH 7 내지 pH 10 사이인 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 가수분해는 25℃ 내지 50℃의 온도에서 수행되는 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 가수분해는 3 시간 내지 24 시간 동안 수행되는 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 프로테아제 또는 리파아제는 상기 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트 1 중량부에 대하여 0.1 중량부 내지 1 중량부 첨가되는 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 에틸 (E, Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵테노에이트는 에틸 7-클로로-2-옥소-헵타노에이트, (s)-2,2'-디메틸사이클로프로판카르복사미드, 톨루엔, 및 톨루엔설폰산을 반응시켜 제조되는 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    제조된 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 순도가 99% 이상인 것인, (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  14. 제 1 항, 및 제 3 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 (Z)-7-클로로-((S)-2,2-디메틸시클로프로필카르복사미도)-2-헵텐산을 수산화나트륨과 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 3으로 표시되는 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
    [화학식 3]
    Figure 112016069921187-pat00014
  15. 제 14 항에 있어서, 제조된 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산의 순도가 99% 이상인 것인, (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산의 제조 방법.
  16. 제 14 항의 방법에 따라 제조된 (Z)-7-(L-아미노-2-카르복시에틸티오)-2-((S)-2,2-디메틸시클로프로판카르복사미도)-2-헵텐산을 소듐 메톡사이드와 반응시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 4로 표시되는 실라스타틴 나트륨염의 제조 방법.
    [화학식 4]
    Figure 112014099245626-pat00015
  17. 제 16 항에 있어서, 제조된 실라스타틴 나트륨염의 순도가 99% 이상인 것인, 실라스타틴 나트륨염의 제조 방법.

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