KR101643953B1

KR101643953B1 - 눈과 관련된 질환을 검출하기 위한 방법 및 장치

Info

Publication number: KR101643953B1
Application number: KR1020107012917A
Authority: KR
Inventors: 하워드 알. 페티; 빅터 엠. 엘너
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시건
Priority date: 2007-11-13
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2016-07-29
Also published as: WO2009064911A3; WO2009064911A2; US20090143685A1; EP2219511A4; AU2008320965A1; AU2008320965B2; KR20100106965A; US20130338457A1; EP2219511A2

Abstract

본 발명은 환자의 눈에서 대사성 기능장애를 검출함으로써 검출 및 모티터링할 수 있는 질환에 관한 것이다. 장치의 하나의 구현예에서, 여기광은 여기광원에 의해 발생되어 안구 조직(예를 들어, 망막 조직)에서 자가형광을 유도하며, 여기에서 여기광은 황색단백질의 자가형광(FA)을 여기시키고 비-황색단백질의 자가형광의 여기는 최소화한다. 유도된 안구 조직 자가형광을 나타내는 적어도 단일 이미지를 포착한다. 적어도 단일 이미지를 증강시켜 안구 조직 자가형광의 신호 강도를 증가시킨다. 적어도 단일 이미지를 분석하여, 환자가 눈 손상, 눈 손상을 유발시키는 질환 중 적어도 하나를 갖는 지, 질환의 진행, 치료의 효능, 대상체에 대한 맞춤형 치료 등에 대한 내용을 산출한다.

Description

눈과 관련된 질환을 검출하기 위한 방법 및 장치 {METHOD AND APPARATUS FOR DETECTING DISEASES ASSOCIATED WITH THE EYE}

본 발명은 일반적으로 의료 기구 및 진단 방법, 더욱 상세하게는, 세포사멸과 관련된 전신성 및 안과 질환을 검출하기 위해 사용되는 의료 기구 및 방법에 관한 것이다.

망막 성분의 결핍은 실명을 유발할 수 있다. 예를 들어, 전체적 또는 부분적 실명은 망막으로의 혈액 공급의 감소에 의해 유발될 수 있으며, 이는 또한 망막정맥폐쇄와 같은 당뇨망막변증 또는 혀혈증의 결과일 수 있다. 거대세포바이러스 망막염, 녹내장, 레버 시신경위축증, 망막박리, 노인성 황반변성, 색소성 망막염 또는 광유도 실명이 망막 세포의 세포사멸 또는 예정사와 공통적으로 관련된다는 연구가 입증되었다.

미토콘드리아는 필수 세포 과정을 작동시키기 위해 아데노신 트리포스페이트 (ATP)의 형태로 에너지를 제공하는 것이 주요 기능인 중요한 세포 기관이다. 미토콘드리아는 또한 세포 예정사 또는 세포사멸의 과정에서 중요 역할을 한다.

세포사멸은 일반적으로 신경세포의 선택적 퇴화를 유발시키는 내인성 또는 외인성 자극에 의해 적어도 하나의 세포사멸 신호 경로의 활성화를 수반한다. 세포사멸은 미토콘드리아막 투과성의 신중한 상호작용을 통해 일어나며, 이는 호흡 연쇄, ATP 생성의 중지, 세포사멸 케스케이드(cascade)의 유도 및 궁극적으로 세포사의 탈공역을 유발시킨다. 세포사멸의 개시는 세포사멸 중개제의 방출 및 효소의 활성화를 유도하는 미토콘드리아 보전성 및 세포사를 유도하는 다른 경로의 손실을 특징으로 하는 미토콘드리아 기능장애 (세포 대사 활성의 변동의 표시임)에 관련되었다. 미토콘드리아 보전성의 이러한 변동은 비가역적 실명의 경우의 95%를 유발시키는 망막 장애에 관련되었다. 미토콘드리아 기능장애의 초기 검출은 이들 장애의 진단, 치료 및 모니터링을 허용할 수 있다. 세포사멸전 세포 또는 스트레스 미토콘드리아를 갖는 세포는 호흡 연쇄 또는 다른 대사 경로에서 에너지 발생 효소에 의해 손상된 전자 운반을 발달시키며, 이는 증가된 비율의 수가지 황색단백질 (FP)이 산화되게 한다. 이들 산화되거나 전자가 부족한 FP는 청색광을 흡수하고 녹색 자가형광을 방출할 수 있다.

황색단백질의 자가형광 (FA)는 비-안구 조직에서 미토콘드리아 기능장애 또는 세포 스트레스의 척도로서 인식되었다. 높은 대사 속도 및 더 많은 수의 미토콘드리아를 갖는 이들 조직으로 인해 생체외 FT가 연구된 첫 번째 조직 중에는 골격근, 간 및 심장 근육이 있다. 후속 생체내 연구는 FA가 심장 및 뇌 조직에서 허혈-재관류 손상의 세포사멸되기 쉬운 부위 및 세포사멸되기 쉬운 연골세포에서 증가됨을 제시하였다. 이들 연구에서 FA 상승은 Bcl-2 감소 및 미토콘드리아 막전위 (Φ) 불안정성과 같은 세포사멸의 다른 표시와 널리 상관하였다. 만성 진행성 외안근 마비에 걸린 환자의 단핵 세포 미토콘드리아 기능장애를 검출하도록 FA를 시험하기 위해 유동세포 연구가 또한 채택되었다. 이와 같이, 눈의 외측 조직에서, FA의 검출은 미토콘드리아 건강을 평가하는 데에 있어서 주요 방법으로서 널리 허용된다.

일상적 눈 실험에 사용되는 현재의 진단 기술은 대표적으로 망막을 가시적으로 검사하기 위한 검안경 및 안내압을 평가하기 위한 안압계를 이용한다. 검안경은 망막 퇴화를 진단하기 위해 사용될 수 있지만, 이는 단지 실질적 손상이 이미 일어난 후에만 효과적이고, 미토콘드리아 활성의 어떠한 표시도 제공하지 않는다. 안압계는 녹내장, 망막 신경절세포사 또는 허혈을 유발시킬 수 있는 안내압의 변동을 결정하기 위해 눈을 누른다. 그러나, 저압을 갖는 녹내장 퇴화가 발달한 환자 및 고압 유지 질환이 없는 환자에 의해 증명되는 바와 같이 안내압과 질환의 상관관계는 크지 않다. 더욱더, 이들 오래된 방법은 예를 들어 자연적 변동, 질환, 근시 또는 굴절 각막 수술로 인한 이상 각막 두께와 같은 생물역학 인공물의 존재하에 정확하게 설명될 수 없다.

과혈당증은 질환 발병 직후 및 병발이 임의의 현재 임상적 진단 방법에 의해 검출될 수 있기 전에 당뇨병 조직에서 미토콘드리아 스트레스 및 세포사멸성 세포사를 유도한다. 질환의 발병의 초기 지표에 대한 미토콘드리아 대사 활성을 측정하는 것이 유용하다. 당뇨병에 대한 금 표준 진단 방법은 경구당부하 시험이다. 그러나, 이 방법은 복잡하고, 종종 환자에 의해 거부된다. 이와 같이, 많은 당뇨병은 이들이 미세혈관 및 대혈관 합병증을 발달시킬 때까지 진단되지 않을 수 있다.

발명의 명칭이 "천연 망막 형광을 측정하기 위한 방법 및 장치 (Method and Apparatus for Measuring the Natural Retinal Fluorescence)"인 미국 특허 제4,569,354호에는 망막 중의 황색단백질의 형광을 측정함으로써 망막의 산소화를 결정하기 위한 방법 및 장치가 기술되어 있다. 이 특허에 따르면, 약 450 나노미터 (nm)의 파장의 여기광의 스폿이 망막을 가로질러 주사되며, 이에 반응하여 약 520 nm의 파장에서 망막 자가형광이 검출된다. 특히, 망막 방출광이 약 520 nm 및 540 nm의 2가지 파장에서 검출되어 눈에서 흡수 및 투과 변량에 대한 보상이 허용된다. 안구의 수정체의 형광을 보상하기 위해, 동공의 중심은 주사 거울 상에 이미지화되어, 여기광의 주사 빔이 안구 수정체의 중심에서 선회하게 된다. 상기 방법 및 장치는 망막의 작은 영역 (즉, 매우 제한된 수의 화소)을 한번에 주사하기 때문에, 측정된 신호의 강도는 매우 낮아서, 측정된 신호가 낮은 신호 대 잡음 (S/N) 비를 갖게 디고, 있다 하더라고 정확성이 거의 없게 된다. 추가로, 작은 주사 영역은 망막을 완전히 주사하기 위해 연장된 공정 시간을 필요로 하며, 이는 외안근 긴장도, 혈액 맥박수 및 광 오염의 자연적 불안정성으로 인한 안구 운동에 의해 유발되는 오차에 대한 가능성을 더 증가시킨다. 상기 방법 및 장치의 고유 부정확성 때문에, 정확한 진단 및 모니터링 시스템으로서 조작하는 것은 가능하지 않다.

2004년 2월 12일자로 출원된 페티 (Petty) 등의 미국 특허 출원 번호 10/777,423에는 일반적으로 안구의 세포사멸 활성을 측정하기 위해 망막의 자가형광을 측정하기 위한 장치가 기술되어 있다. 하나의 구현예에서, 자가형광 측정 장치는 여기광원 및 쵤상 장치를 포함한다. 상기 구현예에서, 촬상 소자는 여기광에 반응하여 즉시 발생되는 망막 형광 신호를 나타내는 단일 이미지를 기록한다. 상기 구현예에서, 필터는 자가형광의 통과를 최대화시키고, 이미지 증강기는 안구의 세포사멸 활성의 징후를 나타내는 초점 증폭 이미지를 제공한다.

눈에 의해 식별할 수 있는 대사 기능장애에 근거한 당뇨병과 같은 다양한 전신성 질환의 정확한 초기 진단을 제공할 수 있는 장치 및 방법이 요구된다.

요약

하나의 구현예에서, 장치는 비-황색단백질의 자가형광의 여기를 최소화하면서 황색단백질의 자가형광을 여기시키는 여기광원을 포함하며, 촬상 소자는 여기광에 반응하여 발생되는 안구 조직 (예를 들어, 망막 조직) 형광 신호를 나타내는 표적인 단일 이미지를 기록할 수 있다. 촬상 소자는 비-황색단백질의 자가형광을 약화시키면서 황색단백질의 자가형광이 약화되는 것을 최소화하는 필터 및 상기 안구 조직 형광 신호 강도를 증가시키는 이미지 증강기를 포함한다. 장치는 촬상 소자에 소통가능한 방식으로 결합된 연산 소자를 추가로 포함하며, 연산 소자는 단일 이미지에 대한 세기 변화의 표시를 발생하도록 구성된다.

또 다른 구현예에서, 방법은 여기광원에 의해 발생되며 황색단백질의 자가형광을 여기시키고 비-황색단백질의 자가형광의 여기를 최소화하는 여기광을 제공하여 안구 조직 (예를 들어, 망막 조직)에서 자가형광을 유도하고, 유도된 안구 조직 자가형광을 나타내는 단일 이미지를 포착하는 것을 포함한다. 방법은 또한 단일 이미지를 증강시켜서 안구 조직 자가형광의 신호 강도를 증가시키고, 단일 이미지를 분석하여 단일 이미지에 대한 세기 변화를 결정하는 것을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 장치는 비-황색단백질의 자가형광의 여기를 최소화하면서 황색단백질의 자가형광을 여기시키는 여기광원, 비-황색단백질의 자가형광을 약화시키면서 황색단백질의 자가형광이 약화되는 것을 최소화하는 필터, 및 필터에 결합되어 여기광에 반응하여 발생되는 안구 조직 (예를 들어. 망막 조직) 형광 신호를 검출하고 안구 조직 형광 신호의 적분 세기를 표시하는 신호를 발생시키는 광검출기를 포함한다. 장치는 또한 상기 광검출기에 결합되어 안구 조직 형광 신호를 증가시키는 광자 증강기 및 상기 광검출기에 소통가능한 방식으로 결합된 연산 소자를 포함하며, 연산 소자는 적분 세기의 표시인 신호에 근거하여, 안구 조직 손상의 정도의 표시, 안구 조직 곤란의 정도의 표시, 환자가 당뇨병 (예를 들어, 현성 당뇨병, 당뇨병 전기, 임신성 당뇨병 등)을 갖는 지의 표시, 환자가 당뇨병에 의해 유발되는 안병증을 갖는 지의 표시, 환자가 중심성 망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 당뇨망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 망막 혈관 폐쇄를 갖는 지의 표시, 환자가 유리체망막변증을 갖는 지의 표시, 환자가 망막 혈관 질환을 갖는 지의 표시, 환자가 감염성 및/또는 비감염성 포도막염 및/또는 망막염을 갖는 지의 표시, 환자가 임의의 다른 후천적 망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 노인성 황반변성을 갖는 지의 표시, 환자가 선천성 망막퇴화증을 갖는 지의 표시, 환자가 대뇌 가성종양을 갖는 지의 표시, 환자가 녹내장을 갖는 지의 표시, 환자가 갑상선 안병증을 갖는 지의 표시, 환자가 시신경염을 갖는 지의 표시, 환자가 그레이브스병을 갖는 지의 표시 및 환자가 시신경 질환을 갖는 지의 표시 중 하나 이상을 발생시키도록 구성된다.

또 다른 구현예에서, 방법은 여기광원에 의해 발생되며 황색단백질의 자가형광을 여기시키고 비-황색단백질의 자가형광의 여기를 최소화하는 여기광을 제공하여 안구 조직 (예를 들어, 망막 조직)에서 자가형광을 유도하는 것을 포함한다. 부가적으로, 방법은 유도된 안구 조직 자가형광 신호를 검출하고, 안구 조직 자가형광 신호를 증강시키고, 안구 조직 자가형광 신호를 분석하여 안구 조직 손상의 정도의 표시, 안구 조직 곤란의 정도의 표시, 환자가 당뇨병 (예를 들어, 현성 당뇨병, 당뇨병 전기, 임신성 당뇨병 등)을 갖는 지의 표시, 환자가 당뇨병에 의해 유발되는 안병증을 갖는 지의 표시, 환자가 중심성 망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 당뇨망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 망막 혈관 폐쇄를 갖는 지의 표시, 환자가 유리체망막변증을 갖는 지의 표시, 환자가 망막 혈관 질환을 갖는 지의 표시, 환자가 감염성 및/또는 비감염성 포도막염 및/또는 망막염을 갖는 지의 표시, 환자가 임의의 다른 후천적 망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 노인성 황반변성을 갖는 지의 표시, 환자가 선천성 망막퇴화증을 갖는 지의 표시, 환자가 대뇌 가성종양을 갖는 지의 표시, 환자가 녹내장을 갖는 지의 표시, 환자가 갑상선 안병증을 갖는 지의 표시, 환자가 시신경염을 갖는 지의 표시, 환자가 그레이브스병을 갖는 지의 표시 및 환자가 시신경 질환을 갖는 지의 표시 중 하나 이상을 발생시키는 것을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 장치는 비-황색단백질의 자가형광의 여기를 최소화하면서 황색단백질의 자가형광을 여기시키는 여기광원, 및 여기광에 반응하여 발생되는 안구 조직 (예를 들어. 망막 조직) 형광 신호를 나타내는 단일 이미지를 기록하는 촬상 소자를 포함한다. 촬상 소자는 비-황색단백질의 자가형광을 약화시키면서 황색단백질의 자가형광이 약화되는 것을 최소화하는 필터 및 상기 안구 조직 형광 신호 강도를 증가시키는 이미지 증강기를 포함한다. 장치는 촬상 소자에 소통가능한 방식으로 결합된 연산 소자를 추가로 포함하며, 연산 소자는 환자가 당뇨병 (예를 들어, 현성 당뇨병, 당뇨병 전기(pre-diabete), 임신성 당뇨병 등)을 갖는 지의 표시 및 환자가 당뇨병에 의해 유발되는 안병증을 갖는 지의 표시 중 하나 또는 둘 모두를 발생시키도록 구성된다.

또 다른 구현예에서, 방법은 여기광원에 의해 발생되며 황색단백질의 자가형광을 여기시키고 비-황색단백질의 자가형광의 여기를 최소화하는 여기광을 제공하여 안구 조직 (예를 들어, 망막 조직)에서 자가형광을 유도하는 것을 포함한다. 방법은 또한 유도된 안구 조직 자가형광을 나타내는 단일 이미지를 포착하고, 단일 이미지를 증강시켜서 안구 조직 자가형광의 신호 강도를 증가시키고, 단일 이미지를 분석하여 환자가 당뇨병 (예를 들어, 현성 당뇨병, 당뇨병 전기, 임신성 당뇨병 등)을 갖는 지의 표시 및 환자가 당뇨병에 의해 유발되는 안병증을 갖는 지의 표시 중 하나 또는 둘 모두를 발생시키는 것을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 방법은 여기광원에 의해 발생되며 황색단백질의 자가형광을 여기시키고 비-황색단백질의 자가형광의 여기를 최소화하는 여기광을 제공하여 안구 조직 (예를 들어, 망막 조직)에서 자가형광을 유도하는 것을 포함한다. 방법은 또한 유도된 안구 조직 자가형광을 나타내는 단일 이미지를 포착하고, 단일 이미지를 증강시켜서 안구 조직 자가형광의 신호 강도를 증가시키고, 단일 이미지를 분석하여 환자가 시신경 질환을 갖는 지의 표시를 발생시키는 것을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 장치는 비-황색단백질의 자가형광의 여기를 최소화하면서 황색단백질의 자가형광을 여기시키는 여기광원, 및 여기광에 반응하여 발생되는 안구 조직 (예를 들어. 망막 조직) 신호를 나타내는 단일 이미지를 기록하는 촬상 소자를 포함한다. 촬상 소자는 비-황색단백질의 자가형광을 약화시키면서 황색단백질의 자가형광이 약화되는 것을 최소화하는 필터 및 상기 안구 조직 형광 신호 강도를 증가시키는 이미지 증강기를 포함한다. 장치는 촬상 소자에 소통가능한 방식으로 결합된 연산 소자를 추가로 포함하며, 연산 소자는 환자가 중심성 망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 당뇨망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 망막 혈관 폐쇄를 갖는 지의 표시, 환자가 유리체망막변증을 갖는 지의 표시, 환자가 망막 혈관 질환을 갖는 지의 표시, 환자가 감염성 및/또는 비감염성 포도막염 및/또는 망막염을 갖는 지의 표시, 환자가 임의의 다른 후천적 망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 노인성 황반변성을 갖는 지의 표시, 환자가 선천성 망막퇴화증을 갖는 지의 표시, 환자가 대뇌 가성종양을 갖는 지의 표시, 환자가 녹내장을 갖는 지의 표시, 환자가 갑상선 안병증을 갖는 지의 표시, 환자가 시신경염을 갖는 지의 표시 및 환자가 그레이브스병을 갖는 지의 표시 중 하나 이상을 발생시키도록 구성된다.

또 다른 구현예에서, 방법은 여기광원에 의해 발생되며 황색단백질의 자가형광을 여기시키고 비-황색단백질의 자가형광의 여기를 최소화하는 여기광을 제공하여 안구 조직 (예를 들어, 망막 조직)에서 자가형광을 유도하는 것을 포함한다. 방법은 또한 유도된 안구 조직 자가형광을 나타내는 단일 이미지를 포착하고, 단일 이미지를 증강시켜서 안구 조직 자가형광의 신호 강도를 증가시키고, 단일 이미지를 분석하여 환자가 중심성 망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 당뇨망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 망막 혈관 폐쇄를 갖는 지의 표시, 환자가 유리체망막변증을 갖는 지의 표시, 환자가 망막 혈관 질환을 갖는 지의 표시, 환자가 감염성 및/또는 비감염성 포도막염 및/또는 망막염을 갖는 지의 표시, 환자가 임의의 다른 후천적 망막증을 갖는 지의 표시, 환자가 노인성 황반변성을 갖는 지의 표시, 환자가 선천성 망막퇴화증을 갖는 지의 표시, 환자가 대뇌 가성종양을 갖는 지의 표시, 환자가 녹내장을 갖는 지의 표시, 환자가 갑상선 안병증을 갖는 지의 표시, 환자가 시신경염을 갖는 지의 표시 및 환자가 그레이브스병을 갖는 지의 표시 중 하나 이상을 발생시키는 것을 포함한다.

부가적으로, 본 설명은 대상체의 눈에서 대사성 및/또는 미토콘드리아성 기능장애를 검출함으로써 질환을 검출하는 방법을 기술한다.

추가로, 본 설명은 또한 다른 식으로 검출될 수 있는 임상적 증상 전에 대상체의 눈의 미토콘드리아에서 변형 황색단백질의 자가형광(FA)을 검출함으로써 질환을 초기 검출하는 방법을 기술한다.

또한, 질환의 임상적 증상을 검출하기 전에 대상체의 눈의 미토콘드리아에서 FA를 검출하고, 검출 단계의 결과로서, 추가의 임상 시험을 추천하고/거나 수행함으로써 질환을 미리 선별하는 방법을 기술한다.

부가적으로, 본 설명은 제 1 시점에서 대상체의 눈에서 FA를 검출하고, 최소한 제 2 시점으로부터 FA를 검출하고, 제 1 및 제 2 시점에서 FA를 비교하고 질환의 진행을 결정함으로써 질환 진행을 모니터하는 방법을 기술한다.

추가로, 본 설명은 대상체의 눈의 미토콘드리아에서 변형된 FA를 검출함으로써 대상체 내에 존재하는 것으로 알려진 성분의 효과로 인한 안구 변화를 검출하는 방법을 기술한다.

본 설명은 질환에 걸린 대상체에게 적어도 하나의 치료제를 투여하고, 제 1 시점에서 대상체의 눈에서 FA를 검출하고, 최소한 제 2 시점에서 FA를 검출하고, 질환에 대한 치료의 효과를 결정함으로써 효과에 대해 대상체에 대한 치료를 시험하는 방법을 기술한다.

본 설명은 또한 상기와 같이 특정 대상체에 대한 효과적인 치료제를 결정하고 치료제를 대상체에 투여함에 의한 맞춤형 의료 방법을 기술한다.

본 설명은 부가적으로 대상체의 눈에서 대사성 및/또는 미토콘드리아성 기능장애를 검출함으로써 전신성 질환을 검출하기 위한 메카니즘을 포함하는 장치를 기술한다.

본 발명의 다양한 구현 중 적어도 하나 (또는 어느 것도 아님)에 의해 제공될 수 있는 다른 장점은 이들 구현이 첨부한 도면과 관련하여 고려되는 경우에 하기의 상세한 설명을 참조하여 더 잘 이해됨에 따라 쉽게 인지될 것이다.
도 1은 본 발명에 따르는 장치의 하나의 구현의 블록선도이다.
도 2는 눈 손상, 눈의 질환, 눈에 대한 손상을 유발시키는 질환 중 적어도 하나의 지표를 발생시키는 전형적 방법의 흐름도이다.
도 3은 전형적 연산 소자의 블록선도이다.
도 4는 대뇌 가성종양에 걸린 6명의 환자에 대한 임상적 및 망막 황색단백질의 자가형광 (FA) 데이터의 도표이다.
도 5A 내지 5C도는 3명의 연령별 지원자로부터 수집한 화소 세기의 망막 FA 히스토그램이다.
도 6은 적어도 하나의 눈에서 망막증을 갖고 (■), 공존 HbA1c과 비교하여 어느 한쪽눈 (하나는 이용할 수 없음)에서 망막증을 갖지 않는 (□) 도 2로부터의 21명의 당뇨병 환자 중 20명의 펼균 세기 (Al)의 그래프이다.
도 7은 연령 구분에 의해 당뇨병 환자 및 대조군에서 평균 Al 및 평균 곡선 폭 (ACW) 수준을 나타내는 표이다.
도 8은 정상 눈 및 질환에 걸린 눈에 대한 화소 대 자가형광 세기의 수의 그래프이다.
도 9A는 망막 사진이고, 도 9B는 좌측 눈의 통상적인 형광 혈관 조영 사진이고, 도 9C는 FA 곡선의 그래프이다.
도 10은 21명의 당뇨병 환자 (망막증 있음 (■) 또는 없음 (□)) 및 21명의 연령별 대조군으로부터의 망막 FA의 그래프이며; 각각의 지원자에 대해, 우측 눈과 좌측 눈에 대한 값은 쌍을 이루어 도시되고, 이들 쌍은 수직 격자선에 의해 구분된다.
도 11은 망막증이 있거나 (■) 없는 (□) 21명의 당뇨병 환자 및 21명의 연령별 대조군으로부터의 ACW의 그래프이며; 각각의 지원자에 대해, 우측 눈과 좌측 눈에 대한 값은 쌍을 이루어 도시되고, 이들 쌍은 수직 격자선에 의해 구분된다.
도 12는 2가지 연령군에서 대조군 지원자로부터의 망막 FA에 대한 평균 화소 세기 (A1)의 막대 그래프이다.
도 13A 내지 13D는 당뇨병 및 특히 당뇨망막증에서 증가된 화소 세기를 나타내는 4명의 연령별 환자로부터의 망막 FA 화소 세기의 히스토그램이다 (우측 눈 = 청색, 좌측 눈 = 적색).
도 14는 당뇨망막증 환자 (연령 56-68, n=7), 망막증 없는 당뇨병 환자 (연령 54- 67, n=7) 및 연령별 비-당뇨병 대조군 (연령 57-67, n=7)로부터의 평균 화소 세기의 막대 그래프이다.
도 15A 및 15B는 ARMD에 걸린 77세 환자 (16A) 및 ARMD의 가시적 임상적 발견이 없는 67세 환자 (16B)로부터의 망막 FA 화소 세기 히스토그램이다.
도 16A 및 16B는 양안 중심성 망막증에 걸린 49세 환자 (17A) 및 연령별 대조군 (17B)로부터의 FA 화소 히스토그램이다.
도 17A 및 17B는 망막 세포변성에 걸린 36세 환자 (18A) 및 연령별 대조군 (18B)로부터의 FA 화소 세기 히스토그램이다.
도 18A 및 18B는 사람 망막 색소 상피 (RPE) 세포에서 과산화수소 (18A) 및 C2-세라미드 (18B)에 의해 유도되는 FA 생성의 막대 그래프이다.
도 19A, 19C 및 19E도는 발병된 눈의 안저 촬영 사진이고, 도 19B, 19D 및 19F는 단안 중심성 망막증 (CSR)에 걸린 3명의 환자의 발병 및 비발병 (우측, 흑색; 좌측, 회색)의 황색단백질 형광 (FPF) 히스토그램이다.
도 20은 단안 CSR에 걸린 3명의 환자의 발병 및 비발명 눈의 망막 FPF Al 및 대조 지원자의 망막 FPF Al의 막대 그래프이며, 각각의 환자에 대해 연령별 대조군 FPF Al은 모두 환자의 연령의 1-2년 내에 3명의 지원자의 6개의 눈으로부터 얻어진다.
도 21은 대조군 환자로부터의 FA 데이터의 그래프이며, 양쪽 눈 모두의 FA의 세기 및 곡선 폭은 유사하다 (우측 눈 = 청색, 좌측 눈 = 적색).
도 22는 소견에 영향을 주는 공존 안구 또는 전신성 질환에 걸리지 않은 63세 여성 녹내장 환자로부터의 FA 데이터의 그래프이며, 좌측 눈 (적색)은 질환에 걸리고, 도 24에서 시야에 의해 추가로 예시된다.
도 23은 FA 소견이 도 22에 도시되어 있고, 초기의 감지하기 힘든 시야 결함이 좌측 눈에 있고 우측 시야는 충분한 환자의 컴퓨터화 시야이다.
도 24는 유도된 세포사 후의 세포질 히스톤-관련 DNA 단편 (모노- 및 올리고누클레오솜)의 생체외 결정의 막대 그래프이다.
도 25는 사람 망막 세포에서 과산화수소에 의해 유도되고 산화 억제제 N-아세틸-시스테인의 존재에 의해 감소되는 FA 생성의 막대 그래프이다.
도 26은 쥐의 신경 망막 세포에서 과산화수소에 의해 유도되고 산화 억제제 N-아세틸-시스테인의 존재에 의해 감소되는 FA 생성의 막대 그래프이다.
도 27A 내지 27D도는 세포사멸 자극 (과산화수소 및 C2-세라미드)에 의해 인큐베이팅된 사람 RPE 세포의 FA 및 자가형광 신호에 대한 미토콘드리아성 대사 및 황색단백질 발현을 차단하는 효과의 막대 그래프이다.

발명의 상세한 설명

본 발명에 따르는 최소한 일부 구현예에서, 환자의 질환의 존재는 환자의 망막 또는 몇몇 다른 안구 조직 또는 눈과 관련된 조직에서의 황색단백질의 자가형광 (FA)의 측정에 근거하여 결정된다.

과혈당증은 질환 발병 직후 및 병발이 임의의 현재 임상적 진단 방법에 의해 검출될 수 있기 전에 당뇨병 조직에서 미토콘드리아 스트레스 및 세포사멸성 세포사를 유도한다. 이와 같이, 미토콘드리아 대사 활성의 측정은 질환의 발병의 초기 지표로의 역할을 할 수 있다. 세포사멸 전에, 미토콘드리아는 호흡 연쇄에서 에너지 발생 효소에 의한 손상된 전자 운반을 나타내어, 상기 연쇄에서 증가된 비율의 황색단백질이 산화되도록 하고, 청색 광을 흡수하고 녹색 자가형광을 방출시킬 수 있게 된다. 이와 같이, 증가된 황색 황색단백질의 자가형광은 당뇨병 대사성 조직 스트레스의 초기 지표일 수 있다.

본원에 사용되는 바와 같은 용어 "이미지"은 본원에 기술된 전형적 장치와 같은 장치에 의해 얻어지는 실제 이미지를 의미한다. 하기의 전형적 장치를 기술하는 데에 있어서, "단일" 이미지에 대한 언급이 일반적으로 사용되지만; 각각의 구현예에서 다중 단일 이미지가 또한 얻어지거나 이용될 수 있다. 광도계 판독이 또한 본원에 기술된 전형적 장치와 같은 장치에 의해 얻어질 수 있으며, 이러한 판독은 예를 들어 이미지가 얻어지는 어느 곳에서도 얻어질 수 있다.

도 1은 당뇨병 (예를 들어, 현성 당뇨병, 당뇨병 전기, 임신성 당뇨병 등)에 의해 유발되는 눈 손상 (예를 들어, 망막 손상, 시신경 손상 등)을 검출하기 위해 사용될 수 있는 전형적 장치(80)의 블록선도이다. 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 장치(80)는 부가적으로 또는 대안적으로 환자가 당뇨병 (예를 들어, 현성 당뇨병, 당뇨병 전기, 임신성 당뇨병 등)을 갖는 지를 결정하는 데에 도움을 주기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 검출되는 눈 손상은 당뇨병의 지표일 수 있다.

장치(80)는 촬상 소자(81) 및 여기광원(84)를 포함한다. 일반적으로 말하면. 광원(84)는 망막(30)과 같은 안구 조직에서 FA를 여기시키는 광을 발생시키고, 촬상 소자(81)는 망막(30)으로부터의 FA 신호의 이미지를 포착한다. 촬상 소자(81)는 전하결합소자 (CCD) 카메라와 같은 카메라를 포함할 수 있다. CCD 카메라가 사용되는 경우, 이는 예를 들어 펠티어(Peltier) 냉각기를 포함하여 검출기의 온도를 감소시켜서 열적으로 발생된 전자 잡음 또는 암전류 잡음을 감소시킬 수 있는 냉각 CCD 카메라일 수 있다. 카메라는 망막(30)으로부터 FA의 단일 이미지를 포착하도록 최적화된 시야 (FOV)를 갖도록 선택될 수 있음이 이해될 것이다. 장치(80)는 광원으로부터의 섬광이 망막(30)으로부터 FA를 유발시키도록 구성될 수 있으며, 촬상 소자(81)는 망막 FA의 단일 이미지를 포착한다. 단일 이미지는 대상 망막(30)의 대사 활성 및/또는 건강을 나타내는 방식으로 분석될 수 있으며, 따라서 직접 및 비침입성 시술이 제공된다.

작동에서, 여기광원(84)는 초점 렌즈(86)과 연동하여 방출된 여기광(84a)을 여기 필터(88)로 향하게 한다. 여기광원(84)는 He-Cd 또는 아르곤-이온 레이저, ATTOARC™ 가변성 세기 조명기와 같은 백열성 또는 수은 램프, 발광 다이오드 (LED) 등일 수 있다. 여기 필터(88)은 예를 들어 약 467 nm에 위치한 통과대역을 갖는 통과대역 필터 (예를 들어, OMEGA OPTICAL^®에 의해 제공됨)일 수 있다. 여기 필터(88)은 FA의 여기 파장 (예를 들어, 약 467 nm 또는 그 근처의 파장)에 상응하지 않는 파장을 감소시키도록 선택될 수 있다. 여과된 광(88a)은 대상 망막(30)을 향해 재전달되도록 495 nm 장파 통과 이색 반사기와 같은 이색 반사기(90)로 전달될 수 있다.

일반적으로 말하면, 여기 스펙트럼을 약 467 nm의 FP의 여기 스펙트럼과 일치하는 범위로 제한함으로써 잠재적 신호 잡음을 감소시키는 것이 바람직하다. 이를 위해, 상기 기술된 바와 같은 여기 필터가 사용될 수 있다. 여과된 여기 수단은 부가적 분자를 자극하여 잡음으로서 작용하여 평가 기술의 전반적 정확도를 저하킬 수 있는 원하지 않는 자가형광을 발생시키지 않으면서 FP 자가형광을 자극한다. 여기 스펙트럼은 망막(30)에 인접한 주변 광을 감소시킴으로써 추가로 제한될 수 있으며, 이는 실험실 조명을 감소시킴으로써, 대상을 고글과 맞춤으로써, 또는 임의의 다른 유사한 방법에 의해 달성될 수 있다. 일부 실행에서, 여기 필터(88)은 여기광원(84)가 좁은 범위의 파장에서 광을 발생시키도록 구성되는 경우에는 생략될 수 있다.

재전달 여과 광(88b)는 현미경 대물렌즈(94) 및 콘택트렌즈(96) 또는 안저 또는 슬릿-램프 카메라 장치를 포함할 수 있는 광학 스테이지(92)를 통해 통과할 수 있다. 현미경 대물렌즈(94) 및 콘택트렌즈(96)은 대상 망막(30)의 바람직한 부위 상으로의 재전달 여과 광(88a)을 초점 맞추고, 정렬시키고 확대시키도록 작용할 수 있다. 일부 실험 조건하에서, 각막(20)을 평평하게 하거나 바람직한 형상으로 변형시켜서 더 우수하고 더 정확한 이미지화를 가능하게 하기 위해 편평한 광학적으로 투명한 렌즈 또는 평면과 같은 압평 수단이 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 대안적으로, 안저 보기를 위한 적절한 콘택트렌즈가 사용될 수 있다.

초점화(focused) 재전달 광(88c)는 망막을 조명하여 관련된 황색단백질 (FP)의 자가 형광 (즉, 황색단백질의 자가형광 (FA))를 유발시킨다. FA 신호(82a)는 대상 망막(30)으로부터 멀리 그리고 광학 스테이지(92)의 부품 및 이색 반사기(90)을 통해 예를 들어 OMEGA OPTICAL^?에 의해 제공되는 것과 같이 약 535 nm에서 통과대역을 갖는 필터와 같은 방출 필터(98)로 전달될 수 있다. 방출 필터(98)은 FA에 상응하지 않는 파장 (예를 들어, 약 535 nm 또는 그 근처의 파장)을 감소시키도록 선택될 수 있다. 여과된 FA 신호(82b)는 초점 렌즈(100)을 통해 통과할 수 있다. 촬상 소자(81) 및/또는 광학 스테이지(92)는 촬상 소자(81)의 시야 (FOV)가 단일 화상으로 망막 (또는 이의 임의의 바람직한 부분)의 이미지를 포착할 수 있을 정도로 구성되어야 한다. 하나의 특정 예로서, 적절한 FOV는 시신경 유두 또는 혈관 패턴과 같은 망막 표지를 확인하여 시준점으로서 사용하고 FOV를 조절하여 관심있는 전체 부위를 둘러쌈으로써 선택될 수 있다. 적절한 대물렌즈(들)을 사용하여, FA는 카메라 상으로 전달될 수 있다.

다른 실행에서, 여기광(88a)는 눈으로 전도될 수 있고/거나 FA 신호(82b)는 광섬유를 통해 촬상 소자(81)로 전도될 수 있다. 다르게 말하면, 여기광(88a)는 눈으로 전도될 수 있고/거나 FA 신호(82b)는 광섬유만을 통하거나 광학 렌즈 시스템과 조합하여 광섬유를 통해 촬상 소자(81)로 전도될 수 있다. 물론, 여기광(88a)는 눈으로 전도될 수 있고/거나 FA 신호(82b)는 광섬유의 사용 없이 광학 렌즈 시스템을 통해 촬상 소자(81)로 전도될 수 있다.

카메라(82)는 이미지 증강기(102)에 광학적으로 결합되어 초점 FA(82c)의 명도를 증폭시켜서 포착된 이미지의 분석을 용이하게 할 수 있다. 일부 실행에서, 이미지 증강기(102)는 CCD 카메라(82)의 검출기에 의해 포착되는 신호와 상응하는 출력 신호 사이의 비인 이득이 원래의 이미지 세기의 약 100 내지 1000배의 증가를 나타낼 정도로 선택될 수 있다. 이미지는 예를 들어 고속 PRINCETON ST-133 인터페이스, 5 nsec 내지 수분의 속도를 갖는 STANFORD RESEARCH SYSTEMS^® DG-535 딜레이 게이트 제너레이터 및 CCD 카메라를 사용함으로써 획득될 수 있다. 이 실행에서, 딜레이 게이트 제너레이터는 CCD 카메라 및 이미지 증강기(102)와 연동하여 이들 부품의 작동을 동조하거나 조절한다. 다른 실행에서, 카메라(82)의 셔터는 설정된 적분 시간, 대표적으로 1초 미만 동안 개방될 수 있다 (물론, 다른 실행에서는 다른 시간이 사용될 수 있다).

다른 실행에서, 카메라(82) 및 이미지 증강기는 통합 단위체일 수 있다. 이러한 실행에서, 촬상 소자(81)는 예를 들어 전자 증폭 전하결합소자 (EMCCD) 카메라, 증강 전하결합소자 (ICCD) 카메라 등을 포함할 수 있다.

촬상 소자(81)에 의해 얻어지는 이미지는 증강된 형태로 초점 FA 신호(82c)를 나타내며, 원하지 않는 자가형광 정보 또는 잡음은 여기 필터(86) 및 방출 필터(98)의 작동에 의해 최소화되는 것으로 이해될 것이다. 상기 방식으로, 촬상 소자(81)에 의해 포착되는 생성된 단일 이미지는 높은 S/N 비를 갖고, FA 신호(82a-82c)를 나타내는 맑고 상세한 이미지를 제공한다.

촬상 소자(81)는 연산 소자(100)에 결합될 수 있다. 연산 소자(100)는 이미지를 분석하여 눈의 다양한 질환 또는 눈 손상과 관련된 질환의 지표와 같은 적어도 하나의 지표를 발생시킬 수 있다. 연산 소자(100)에 의한 이미지 분석은 화소 또는 화소 블록과 같은 이미지의 단위에 대한 세기의 히스토그램을 발생시키는 것, 평균 세기를 결정하는 것, 세기의 변화의 표시를 결정하는 것, 적분 세기를 결정하는 것 등 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 유사하게 다중 이미지가 분석될 수 있다. 예를 들어, 환자의 양 눈 모두의 이미지는 분석될 수 있으며, 평균 세기의 차, 세기 변화의 차, 적분 세기의 차 등 중 적어도 하나과 같은 눈들 사이의 차가 결정될 수 있다.

연산 소자(100)는 예를 들어 아날로그 회로, 디지털 회로, 혼합된 아날로그 및 디지털 회로, 관련된 메모리를 갖는 프로페서, 데스크탑 컴류터, 랩탑 컴퓨터, 타블렛 PC, 개인 휴대 정보 단말기, 워크스테이션, 서버, 메인프레임 등을 포함할 수 있다. 연산 소자(100)는 유선 연결 (예를 들어, 와이어, 케이블, 유선 구내통신망 (LAN) 등) 또는 무선 연결 (BLUETOOTH™ 링크, 무선 LAN 및 IR 링크 등)을 통해 촬상 소자(81)에 소통가능한 방식으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 촬상 소자(81)에 의해 발생되는 이미지 정보는 디스크 (예를 들어, 플로피 디스크, 콤팩트 디스크 (CD), DVD, 휴대용 하드 디스크 드라이브 장치 등), 플래쉬 메모리 장치, 메모리 스틱 등과 같은 제거용 또는 휴대용 컴퓨터 판독 매체 상에 저장된 후, 컴퓨터 판독 매체를 통해 연산 소자(100)으로 전달될 수 있다. 촬상 소자(81) 및 연산 소자(100)이 도 1에서 분리 장치로 예시되어 있다 하더라도, 일부 구현예에서, 촬상 소자(81) 및 연산 소자(100)는 단일 장치의 일부일 수 있다. 예를 들어, 연산 소자(100) (예를 들어, 회로, 프로세서, 메모리 등)은 촬상 소자(81)의 한 부품이거나 그 반대일 수 있다.

또 다른 실행에서, 촬상 소자(81)는 광 검출기 및 광자 증강기로 대체될 수 있다. 광 검출기 및 광자 증강기는 광전자증배관과 같은 단일 장치로 통합될 수 있다. 이들 실행에서, 촬상 소자(81)는 FA의 적분 신호를 표시하는 신호를 발생시킬 수 있다. 연산 소자는 상기 신호를 사용하여 눈의 다양한 질환 또는 눈 손상과 관련된 질환의 지표와 같은 적어도 하나의 지표를 발생시킬 수 있다.

본원에 기술된 장치(80)의 부품은 독립 방식으로 사용될 수 있으며, 정렬은 개별 부품들의 수동 클램핑 및 고정을 통해 달성된다. 그러나, 망막 평가 장치(80)의 이미지화, 여기 및 광학 부품은 임의의 공지된 데스크탑 또는 초소형 검안경, 슬릿-램프 또는 안저(fundus) 카메라 내로 통합되어 본원에 기술된 시험 장치에 대해 쉬운 업그레이드를 가능하게 할 수 있다. 특히, 촬상 소자(81), 여기광원(84), 광학 스테이지(92) 및 관련 부품에는 각각 장치(80)의 개별 부품을 각각 상기 기술된 검안경 및 다른 장치와 일치시키도록 설계된 어댑터 (도시되지 않음)이 장착된다. 이 경우에, 표준 검안경, 안저부 및 슬릿-램프 광은 브래킷 또는 어댑터를 사용하여 검안경 프레임에 부착된 여기 수단(84)으로 대체될 수 있으며, 여기 수단(84)에 의한 광 출력은 여과되어 바람직한 여기광(84a)을 생성시킬 수 있다. 촬상 소자(81)는 장치의 프레임에 부착되고 망막(30)의 반대쪽에 정렬되어 여기광(84a)에 반응하여 발생되는 FA를 나타내는 단일 이미지를 검출할 수 있다. 상기 방식으로, 현재의 장치는 망막 자가형광을 여기시키고 평가하기 위해 공지된 진단 설비를 사용할 수 있다.

장치(80)는 다양한 기술을 사용하여 정령되고/거나 보정될 수 있다. 예를 들어, 장치(80)는 본원에 참고문헌으로 인용된 2004년 2월 12일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 10/777,423에 기술된 것과 같은 기술을 사용하여 정렬될 수 있다.

도 2는 눈 손상, 눈의 질환, 눈에 대한 손상을 유발시키는 질환 등 중 적어도 하나의 지표를 발생시키는 전형적 방법(200)의 흐름도이다. 도 1의 장치(80)는 예를 들어 방법(200)을 실행할 수 있다. 물론, 또 다른 장치가 방법(200)을 실행할 수 있으며, 장치(80)는 방법(200)과 상이한 방법을 실행할 수 있다. 설명의 용이함을 위해, 방법(200)은 도 1을 참조하여 설명될 것이다.

블록(204)에서, FA를 유발시키는 광이 발생되고, 환자의 눈 내로 전달된다. 광은 환자의 편안함을 위해 섬광으로서 그리고/또는 비교적 짧은 시간 동안 발생될 수 있다. 대표적으로, 광은 1분 미만 동안 나타날 수 있지만, 더욱 일반적으로는, 수 나노초 내지 수분 동안 나타날 수 있다. FA를 유발시키는 광은 좁은 파장 광을 발생시키는 자외선 광원에 의해 발생될 수 있다. 대안적으로, 더 넓은 파장 광은 여기 필터에 의해 여과될 수 있다. 도 1에서, 광원(84)는 여기 필터(88)에 의해 여과되는 광을 발생시킨다. 여과된 광은 거울(90) 및 광학체(92)를 통해 환자의 눈으로 전달된다.

블록(208)에서, 망막 FA 신호의 이미지가 포착될 수 있다. 이미지는 약 1분과 같이 비교적 짧은 시간 내에 포착될 수 있다. 더욱 일반적으로, 이미지는 수 나노초 내지 수분의 시간 후에 포착될 수 있다. 예를 들어, 장치(80)을 사용하여, 망막 FA 신호는 광학체에 의해 촬상 소자(81)로 전달되어, 이미지가 포착된다.

블록(212)에서, 포착된 이미지가 분석될 수 있다. 분석은 화소 또는 화소 블록과 같은 이미지의 단위에 대한 세기의 히스토그램을 발생시키는 것, 평균 세기를 결정하는 것, 세기의 변화의 표시를 결정하는 것, 적분 세기를 결정하는 것 등 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 유사하게, 이미지는 이전 시간 (예를 들어, 수주 또는 수개월 전, 약 1년 전 등)에서 얻어진 눈의 이미지, 환자의 나머지 눈 등과 같은 다른 이미지에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, 환자의 양쪽 눈 모두의 이미지가 분석될 수 있으며, 평균 세기의 차, 세기 변화의 차, 적분 세기의 차 등 중 적어도 하나과 같은 눈 사이의 차가 결정될 수 있다. 장치(80)에서, 연산 소자(100)는 포착된 이미지를 분석할 수 있다.

블록(216)에서, 눈 손상 또는 눈 손상을 유발시키는 질환의 지표는 이미지 분석 또는 임의적으로 다른 정보에 근거하여 발생될 수 있다. 지표는 눈 손상, 눈의 다양한 질환 중 하나, 눈 손상과 관련된 질환 등일 수 있다. 지표는 손상의 정도, 특정 질환의 존재의 가능성, 추가의 시험 및/또는 실험이 보장되는 지의 여부 등을 나타낼 수 있다. 지표는 단순히 평균 세기, 적분 세기, 세기 변동 등의 측정, 또는 평기 세기와 세기 변동의 일부 조합과 같은 2가지 이상의 이러한 인자의 일부 조합의 측정일 수 있다. 지표는 예를 들어 평균 세기의 하위 지표 및 세기 변동의 하위 지표와 같은 분리 하위 지표를 포함할 수 있다. 지표는 또한 수주, 수개월 또는 수년전에 수행된 적어도 하나의 이미지 분석, 눈 또는 혈액 시험과 같은 다른 시험 결과, 환자 병력 및/또는 가족력 정보, 유전 정보 등과 같은 다른 정보에 근거하여 발생될 수 있다.

또 다른 실행에서, 블록(208)은 이미지가 포착되지 않지만 오히려 FA 신호의 표시인 정보가 결정될 정도로 변형될 수 있다. 예를 들어, 광전자 증배관은 FA 신호의 총 신호 또는 집적 신호를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 실행에서, 블록(212)은 생략될 수 있으며, 블록(216)은 눈 손상 또는 눈 손상을 유발시키는 질환의 지료는 블록(208)에서 결정되는 FA 정보에 근거하여 발생될 수 있다.

도 3은 장치(80) 및/또는 방법(200)에 사용하기 위해 사용될 수 있는 전형적 연산 소자(340)의 블록선도이다. 도 3에 예시된 컴퓨터(340)은 단순히 사용될 수 있는 연산 소자의 일례인 것으로 이해되어야 한다. 상기 기술된 바와 같이, 많은 다른 유형의 연산 소자(144)가 또한 사용될 수 있다. 컴퓨터(340)은 적어도 하나의 프로세서(350), 휘발성 메모리(354) 및 비휘발성 메모리(358)을 포함할 수 있다. 휘발성 메모리(354)는 예를 들어 임의 접근 메모리 (RAM)를 포함할 수 있다. 비휘발성 메모리(358)는 예를 들어 하드 디스크, 판독 전용 메모리 (ROM), CD-ROM, 삭제 가능 프로그램 ROM (EPROM), 전기적 삭제 가능 프로그램 ROM (EEPROM), 디지털 다목적 디스크 (DVD), 플래쉬 메모리 등 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 컴퓨터(340)는 또한 I/O 장치(362)를 포함할 수 있다. 프로세서(350), 휘발성 메모리(354), 비휘발성 메모리(358) 및 I/O 장치(362)는 적어도 하나의 어드레스/데이터 부스(366)를 통해 상호 접속될 수 있다. 컴퓨터(340)은 또한 적어도 하나의 디스플레이(370) 및 적어도 하나의 사용자 입력 장치(374)를 포함할 수 있다. 사용자 입력 장치(374)는 예를 들어 적어도 하나의 키보드, 키패드, 마우스, 터치스크린 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 휘발성 메모리(354), 비휘발성 메모리(358) 및 I/O 장치(362)는 적어도 하나의 별도 어드레스/데이터 부스 (도시되지 않음) 및/또는 별도 인터페이스 장치 (도시되지 않음)을 통해 프로세서(350)에 결합되거나, 프로세세(350)에 직접 결합될 수 있다.

디스플레이(370) 및 사용자 입력 장치(374)는 I/O 장치(362)와 결합된다. 컴퓨터(340)은 I/O 장치(362)를 통해 촬상 소자(81) (도 1)에 결합될 수 있다. I/O 장치(362)는 하나의 장치로서 도 3에 예시되어 있지만, 수가지 장치를 포함할 수 있다. 부가적으로, 일부 구현예에서, 디스플레이(370), 사용자 입력 장치(374) 및 촬상 소자(81) 중 적어도 하나는 어드레스/데이터 부스(366) 또는 프로세서(350)에 직접 결합될 수 있다. 부가적으로, 상기 기술된 바와 같이, 일부 구현예에서, 촬상 소자(81) 및 컴퓨터(340)는 단일 장치 내로 통합될 수 있다.

지표를 발생시키기 위해 사용될 수 있는 상기 기술된 부가적 정보 (예를 들어, 환자의 이전 병력, 환자의 가족력, 유전 정보 등)은 사용자 입력 장치(374)를 통해 도입되고, 디스크로부터 로딩되고, 네트워크 (도시되지 않음)을 통해 수용될 수 있다. 이들 부가적 인자는 메모리(354) 및 (358) 중 적어도 하나에 저장될 수 있다. 부가적으로, 적어도 하나의 사전 측정 이미지는 디스크로부터 로딩되고, 네트워크 (도시되지 않음)을 통해 수용되고, 메모리(354) 및 (358) 중 적어도 하나에 저장될 수 있다.

예를 들어, 이미지를 분석하고/거나 지표를 발생시키기 위한 루틴은 예를 들어 비휘발성 메모리(358)에 전체적으로 또는 부분적으로 저장되고, 프로세서(350)에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 실행될 수 있다. 예를 들어, 도 2의 블록(212) 및/또는 (216)은 프로세서(350)에 의한 실행을 위해 소프트웨어 프로그램을 통해 전체적으로 또는 부분적으로 실행될 수 있다. 프로그램은 CD-ROM, 플로피 디스크, 하드 드라이브, DVD 또는 프로세서(350)과 관련된 메모리와 같은 실재 매체에 저장되는 소프트웨어에서 구현될 수 있지만, 당업자는 이의 전체 프로그램 또는 부분들이 대안적으로 프로세서와는 상이한 장치에 의해 실행되고/거나 널리 공지된 방식으로 펌웨어 및/또는 전용 하드웨어에서 구현될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다.

도 2의 블록(212) 및 (216)은 컴퓨터(340)에 의해 실행되는 것으로 상기 기술되어 있지만, 이들 블록 중 적어도 하나는 아날로그 회로, 디지털 회로, 혼합 아날로그 및 디지털 회로, 관련 메모리를 갖는 프로세서 등과 같은 다른 유형의 장치에 의해 실행될 수 있다.

장치(80)과 같은 장치 및/또는 방법(200)과 같은 방법은 질환 진행 및/또는 질환 치료를 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 발생된 지표는 안구 조직에 대한 손상 및/또는 고통의 정도를 표시할 수 있으며, 시간에 다른 다중 시험은 질환 진행 및/또는 치료를 모니터하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 발생된 지표는 질환이 악화되고/거나 안정하게 유지되고/거나 개선되는 지를 모니터하고, 약과 같은 치료제가 안구 조직에 대한 고통을 경감시키는 지를 모니터하고, 약과 같은 치료제가 질환 또는 질환의 증상을 안정화시키거나 개선시키는 지를 모니터하기 위해 사용될 수 있다.

유사하게, 장치(80)과 같은 장치 및/또는 방법(200)과 같은 방법은 질환 치료의 동물 실험에 사용될 수 있다. 예를 들어, 실험적 치료를 받은 동물에 근거하여 발생된 지표는 약과 같은 치료제가 질환 또는 질환의 증상을 안정화시키거나 개선시키는 지를 모니터하기 위해 사용될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 적어도 하나의 구현은 대상체 눈의 대사성 기능장애를 검출함으로써 질환을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 대사성 기능장애는 전신적 또는 안구이든 간에 질환이 존재하는 경우에 상기 설명된 바와 같이 눈에 존재한다. 본원에 기술된 방법은 상기 기술된 장치 또는 일부 다른 적합한 장치에 의해 수행될 수 있으며, 적절한 경우, 이들 구현 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 더욱더, 본원에 기술된 방법은 각각 임상적 또는 실험적 세팅으로 사람 및 동물 대상체를 대상으로 수행될 수 있다.

더욱 상세하게는, 대사성 기능장애는 대상체자 눈의 미토콘드리아에서 변형된 FA를 검출함으로써 검출될 수 있다. 변형된 FA는 증가된 FA 또는 감소된 FA일 수 있으며, 일반적으로 존재하는 질환에 의존한다. 예를 들어, FA는 암 및 염증과 같은 세포사멸에 대해 저항성인 질병에서 감소될 수 있다.

증가된 FA는 평균 세기 (Al), 평균 곡선 폭 (ACW), 적분 세기 및 이들의 조합과 같은 분석의 FA에서 환자의 눈 사이의 비대칭을 검출하는 것과 같이 많은 방식으로 결정될 수 있다. 대상체의 우측 눈과 좌측 눈 사이의 이들 분석 각각의 상이한 측정이 질환을 나타낼 수 있다. 대안적으로, 이들 측정은 대상체에게서 이루어질 수 있으며, 대조 대상체 또는 대조군의 데이터베이스, 즉 샘플 집단으로부터 규범적 값과 비교될 수 있다. 더욱더, 광도계 판독은 본원에 기술된 바와 같은 장치 또는 또 다른 적합한 장치에 의해 얻어질 수 있으며, 이들 판독은 상기와 같이 눈들 사이 또는 눈과 대조군 사이에서 비교될 수 있다. 이들 값 각각의 측정은 하기 실시예에서 입증된다.

본 발명에 따르는 방법의 다양한 구현에 의해 다양한 질환이 검출될 수 있다. 질환은 당뇨병, AIDS, 유육종증, 전신 홍반성 루프스, 류머티스성 관절염, 고혈압, 아테롬성 동맥 경화증, 겸상 적혈구 빈혈증, 암, 염증 및 다발성 경화증과 같은 눈 뿐만 아니라 또한 신체의 다른 부분에 영향을 주는 전신성 질환일 수 있다. 질환은 또한 중심성 망막증, 당뇨망막증, 망막 혈관 폐쇄, 유리체망막병증, 망막 혈관 질환, 감염성 및 비감염성 포도막염 및 망막염, 후천적 망막증, 노인성 황반변성, 선천성 망막퇴화 및 색소성 망막염과 같은 망막 질환일 수 있다. 질환은 또한 대뇌 가성종양, 녹내장, 갑상선 안병증, 시신경염 및 그레이브스병과 같은 시신경 질환일 수 있다. 그러나, 본 발명은 본원에 언급되는 특정 질환의 검출로 제한되지는 않는다.

최소한 일부 구현예에서, 대상체에 존재하는 질환의 심각도가 또한 결정될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 대상체의 Al, ACW, 적분 세기 또는 이들의 조합의 값은 대조군의 데이터베이스의 Al, ACW, 적분 세기 값과 비교될 수 있다. 대조군의 데이터베이스에서 Al 및 ACW 값과 비교하여 대상체의 Al 및 ACW의 더 높은 값 (또는 질환에 의존하여 더 낮은 값)은 질환의 더욱 심한 형태를 나타낼 수 있다. 이는 질환을 시기결정하고 대상체에 대한 적절한 치료를 결정하는 데에 도움을 줄 수 있다.

물론, FA를 측정하고/거나 대사성 및/또는 미토콘드리아 기능장애를 검출하는 것 이외에 다양한 다른 시험이 수행될 수 있다. 예를 들어, 대상체의 HbA1c의 수준은 검출되고, 질환의 추가의 진단을 위해 대조군의 데이터베이스와 비교될 수 있다. 또한, 질환의 존재를 결정하기 위해 사용되는 표준 임상 시험은 FA를 측정하고/거나 대사성 및/또는 미토콘드리아 기능장애를 검출하는 것과 함께 수행될 수 있다. 이는 환자에게 정확한 진단이 이루어지고 다중 공급원에 의해 확인되었다는 확신을 제공한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 질환의 초기 검출 방법은 질환의 임상적 증상이 검출될 수 있기 전에 대상체의 눈의 미토콘드리아에서 변형된 FA를 검출하는 것을 포함한다. 이 검출은 예를 들어 상기 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 많은 경우에, 대상체는 질환을 갖지만, 질환이 초기 단계에 있기 때문에 종래 시험을 사용하여 검출될 수 있는 임상적 증상을 갖지 않을 수 있다. 질환은 결국 이것이 진행된 후에 검출될 수 있지만, 그 동안, 망막, 시신경 등과 같은 조직에 대한 손상이 또한 일어날 수 있고/거나 질환의 효과를 역전시키거나 완화시키기가 더 어려워질 수 있다. 따라서, 이러한 질환을 초기 단계에서 검출하는 것이 매우 유리하다. 예를 들어, 망막 대사성 스트레스는 망막증이 검출되기 전에 대상체에게서 검출될 수 있다. 또한, 당뇨병은 공복시 혈당 스크리닝, 혈당 시험 또는 다른 스크리닝 방법의 공통 방법에 의해 검출될 수 있기 전에 대상체에게서 검출될 수 있다. 질환을 초기에 검출하는 것은 질환으로부터 회복 기회가 더 크거나 최소한 적절한 치료를 선택하고 질환이 발생하기 전에 증상을 경감시키는 것을 의미한다. 특히, 당뇨병의 초기 검출에 의해, 환자는 질환을 완화시키기 위해 식이 및 훈련 루틴을 적절히 변화시킬 수 있다.

또 다른 구현예에서, 질환의 임상적 증상을 검출하기 전에, 그리고 추가의 임상 시험을 검출, 추천 및/또는 수행하기 전에 대상체의 눈의 미토콘드리아에서 FA를 검출하는 것을 포함한다. 대상체의 눈의 FA를 분석하고 대상체가 질환을 갖는다는 양성 결과를 얻는 것은 대상체가 진단을 확인하기 위한 표준 임상 시험에 따르게 할 수 있다. 상기 구현에 따르는 방법을 사용하여, 질환의 존재는 정상 보다 빠르게 그리고 비침입성 방식으로 검출될 수 있으며, 대상체는 더 특수화된 치료 및 시험을 추구할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 질환 진행을 모니터하는 방법은 제 1 시점에서 대상체의 눈에서 FA를 검출하고, 최소한 제 2 시점에서 FA를 검출하고, 제 1 및 제 2 시점에서 FA를 비교하고, 질환의 진행을 결정하거나 질환의 진행의 표시인 지표를 발생시키는 것을 포함한다. FA의 값은 2가지 이상의 시점 (제 1 시점 및 제 2 또는 후속 시점) 동안 얻어지지만, 훨씬 더 많은 시점이 또한 평가를 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 대상체의 수명 전체에 걸쳐). 각각의 검출 사이의 시간은 1일, 1개월, 1년, 수년 등과 같은 임의의 적합한 시간일 수 있다. 예를 들어, 제 2 시점에서 FA의 값은 질환에 의존하여 상이한 값을 나타낸다. 예를 들어, 제 2 시점에서 더 높은 FA는 질환 진행의 표시일 수 있으며, 제 2 시점에서 더 낮은 FA는 질환 완화의 표시이다. 그러나, 질환이 암 또는 염증인 경우, 제 2 시점에서 더 낮은 FA는 질환 진행의 표시이고, 제 2 시점에서 더 높은 FA는 질환 완화의 표시이다. 또한, 치료는 라이프스타일 변화 (훈련), 약제, 기능식품, 수술, 화학치료, 방사선치료, 레이저 치료 등과 같이 최소한 제 2 시점에서의 FA에 근거하여 대상체에게 제공될 수 있다. 검출 및 비교는 다중 시점에 대해 수행될 수 있으며, 나중 시점에서 제공되는 치료가 평가될 수 있다. 치료가 결과를 제공하지 않는 경우, 이는 변경될 수 있거나, 치료가 결과를 제공하는 경우, 이는 연속될 수 있다. 표준 임상 시험이 또한 수행될 수 있으며, 질환 진행은 이들 표준 임상 시험의 결과에 근거하여 부가적으로 모니터될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 대상체에 존재하는 것으로 알려진 성분의 효과로 인한 안구 변화를 검출하는 방법은 대상체의 눈의 미토콘드리아에서 변형된 FA를 검출하는 것으로 포함한다. 존재하는 성분은 실시예에 기술되는 바와 같이 약제 또는 독소일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 효능에 대해 대상체에 대한 치료제를 시험하는 방법은 질환에 걸린 대상체에게 적어도 하나의 치료제를 투여하고, 제 1 시점에서 대상체의 눈에서 FA를 검출하고, 최소한 제 2 시점에서 FA를 검출하고, 제 1 및 제 2 시점에서 FA를 비교하고, 질환에 대한 치료제의 효능을 결정하거나 치료제의 효능의 지표를 발생시키는 것을 포함한다. 치료는 라이프스타일 변화 (훈련), 약제, 기능식품, 수술, 화학치료, 방사선치료, 레이저 치료 등과 같은 임의의 적합한 치료일 수 있지만 이들로 제한되지는 않는다. 상기와 같이, FA의 값은 2가지 이상의 시점 (제 1 시점 및 제 2 또는 후속 시점) 동안 얻어지지만, 비제한 시점이 또한 평가를 위해 사용될 수 있다 (즉, 대상체의 전체 수명 전체에 걸쳐). 각각의 검출 사이의 시간은 1일, 1개월, 1년, 수년 등과 같은 임의의 적합한 시간일 수 있다. 상기 방법은 연구되는 특정 질환에 대해 효과적인 것으로 알려지지 않은 치료제의 효능을 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 즉, 이는 약제 발견 방법으로서 사용될 수 있다. 그러나, 효과적인 것으로 공지된 치료제가 또한 시험될 수 있다. 이들 치료제의 조합이 시험될 수 있다. 질환에 의존하여, 제 2 시점에서의 FA의 결과는 상이할 수 있다. 예를 들어, 제 2 시점에서 더 높은 FA는 비효능의 표시일 수 있으며, 제 2 시점에서 더 낮은 FA는 효능의 표시일 수 있다. 질환이 암 또는 염증인 경우, 제 2 시점에서 더 낮은 FA는 비효능의 표시일 수 있으며, 제 2 시점에서 더 높은 FA는 효능의 표시일 수 있다.

상기 방법은 또한 맞춤형 의료 방법으로서 사용될 수 있다. 다르게 말하면, 치료 또는 치료의 조합은 상기 작용 및 상기 기술된 치료에 따라 특정 대상체에 대해 결정될 수 있다. 각각의 대상체에 대한 최선의 치료가 이들의 신체에 맞춰질 수 있다. 대상체에 대한 최선의 치료를 제공할 특정 치료가 결정되면, 투여 계획이 이루어질 수 있다.

상기 방법은 또한 사람 및 동물의 안구 질환에 대한 단일 치료 또는 치료의 조합의 선택을 최적화하기 위해 사용될 수 있다. 치료는 약제, 기능식품, 라이프스타일 변화, 화학치료, 방사선치료, 수술, 레이저 치료 등 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다르게 말하면, 치료 식이요법은 대상체가 수용하는 치료를 최적화시키기 위해 상이한 시점에서 분석될 수 있다. 치료는 추가로, 혈청 시험, 유전적 시험, 생화학적 시험, 광간섭단층촬영을 포함하는 광학 시험, 시야 시험을 포함하는 정신시력 시험, 초음파 시험, 다른 유형의 스펙트럼 분석, 안압측정, 각막계 시험, 안저 사진술, 다른 유형의 안구 이미지화, 망막전위 시험, 자기 공명 이미지화 시험, 동위원소 또는 염료 이미지화 시험 방법, 다른 진단 방법, 임의의 다른 물리적 측정 및 이들의 임의의 조합에 의해 얻어지는 것을 포함하는 다른 진단 양식 또는 이들의 데이터에 근거하여 최적화될 수 있다. 치료는 또한 환자 데이터, 환자 병력, 환자 가족력, 라이프스타일 히스토리, 환자 인구통계, 및 임의의 다른 이러한 측정 또는 이들의 조합과 조합하여 최적화될 수 있다.

본 발명의 적어도 하나의 구현에 의해 제공될 수 있는 수가지 가능한 장점이 있다. 생체내에서 FA 이미지화는 질환 실재에 대해 민감성이지만 특이적이지는 않다. 그러나, 이는 임의 현재 임상 방법이 할 수 있기 전에 대사성 기능장애의 검출을 가능하게 한다. 세포사멸의 발생 전에 세포 또는 미토콘드리아 스트레스의 인지는 비가역적 손상이 일어하기 전에 질환 상태를 인지하는 데에 매우 유익할 수 있다. 자동화 시야 시험, 다초점 ERG 및 새로운 MRI 이미지화 기술이 또한 아직 형태학적 이상성을 나타내지 않는 눈에서 기능적 이상성을 검출할 수 있다. 그러나, 이들 방법은 시간집약적이며 숙련된 기술자를 필요로 한다. 시험을 수행하는 데에 시간이 걸리므로, 이들은 연구 기간 동안 협력하고 부동을 유지할 수 없는 어린이 또는 어른에 대해서는 적합하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, FA 측정은 수행하는 데에 5분 미만을 필요로 하여, 각각의 눈의 4가지 빠른 스냅샷으로서 데이터를 얻는다. 눈 보호 전문가에 의해 얻어지는 임상 데이터와 함께 기기의 판독은 임의적으로 질환의 진단을 달성하고 심각도를 모니터하기 위해 사용된다.

실험적 실시예가 단지 예시를 위해 하기에 제공되며, 다른식으로 특정하지 않는 한은 제한으로 의도되지 않는다. 이와 같이, 본 발명은 하기의 실시예에 의해 제한되는 것으로 구성되지는 않아야 하며, 오히려, 본원에 제공된 기술의 결과로서 입증되는 임의의 그리고 모든 변동을 포함하는 것으로 구성되어야 한다.

실시예 1

세포사멸에 선행하는 대사성 스트레스를 미토콘드리아 FA를 측정함으로써 생세포에서 모니터하였다. FA가 안병증을 검출할 수 있는 것을 입증하는 것을 돕기 위해, 망막 신경절 세포 기능장애 및 사멸이 시각 손실을 유도할 수 있는 대뇌 가성종양 (PTC)를 시험하였다. 각각의 눈에서 20/30 또는 더 양호한 시력을 갖고 험프리(Humphrey) 자동 시야 시험 (AVFT) 분석 (도 4)에 대한 결함을 감지할 수 힘들거나 없는 PTC에 대해 새로 진단되고 치료되지 않은 6명의 여성 (36.3 + 5.9세)을 연구하였다. AVFT 결과를 밀도 손실에 대해 1의 값을 가장 감지하기 힘든 민감성 감소에 대한 0.75, 0.5 및 0.25로서 등급화된 더 작은 손실도로 분할함으로써 각각의 눈에 대한 모든 총 편차 단위의 합인 것으로 기록하였다. 6명의 연령별 (36.5 + 4.7세) 건강한 여성이 대조군으로서 역할을 하였다.

동공 확대 후에, 중심와에 집중한 3개의 3도 이미지를 467DF8 nm 여기 및 535 nm 방출 필터 (버몬트, 브래틀보로의 오메가 옵티칼 (Omega Optical))을 삽임하고, 흑색 조명 전자 증폭 전하 결합 장치 카메라 (아리조나, 턱손의 포토메트릭스 (Photometries))를 부착시키고, 메타뷰 (MetaView) (ON, 토론토의 MDS 어날리티칼 테크놀로지스(Analytical Technologies)) 촬상 및 리스픽스 (Lispix) (내셔널 인스티튜츠 스탠다즈 앤드 테크놀로지(National Institutes Standards & Technology)) 분석 소프트웨어가 장착된 컴퓨터를 인터페이싱시킴으로써 변형시킨 자이쓰 (Zeiss) F4 카메라를 사용하여 각각의 눈으로부터 수득하였다. 각각의 환자에 대한 총 시험 시간은 6분 미만이었다.

각각의 이미지에 대해, 화소 FA 세기 (256 단위 그레이 스케일)을 분석하여, 화소 FA 세기의 범위를 표시하는 그레이 스케일 단위 (gsu)로 평균 세기 (Al) 및 평균 곡선 폭 (ACW)를 결정하였다. 각각의 환자에 대해 차폐 방식으로 FA 데이터 및 임상 데이터를 분리적으로 수득한 후에, 눈의 Al 및 ACW를 증상, 징후 및 감지하기 힘든 AVFT 총 억제값에 의해 표시되는 임상적으로 더 이환된 눈 대 덜 이환된 "대조군" 눈의 비를 계산함으로써 비교하였다. 통계적 분석을 학생 투-테일드 티-테스트 (two-tailed t-test) 및 ANOVA를 사용하여 수행하였다.

42세 PTC 환자 (도 4, 열 1)는 20/20의 시력 및 시각 기능장애의 감지하기 힘든 임상 소견을 가졌다. AVFT는 비정상적이었지만, 눈들 사이의 현저한 차이를 나타내지 않았다. 그러나, FA 시험에서, 좌측 (적색) Al은 우측 (청색) Al의 1.75배이었다 (p<0.001). 좌측 ACW 는 또한 우측 ACW의 1.82배이었다 (p<0.001 ). 이들 FA 차트는 시력, 동공 반사 또는 AVFT 분석보다 우수한 질환 비대칭을 강조하는 것이다.

모든 PTC 환자 (도 4)는 이들의 임상적으로 더 이환된 눈에서 더 높은 Al (대조군의 1.60+0.21배) 및 ACW (대조군의 1.62+0.36배)를 가졌다. 각각의 환자에 대해, 임상적으로 더 이환된 눈의 Al 및 ACW은 덜 이환된 눈의 1.25배 이상이었다. FA 결과는 각각의 경우에 AVFT 만큼 또는 더 우수한 증상 및 징후와 상관하였다. 질환이 없는 6명의 연령별 대조군 여성은 Al 또는 ACW의 현저한 차를 나타내지 않았다. Al (대조군의 1.01+0.12배) 또는 ACW (대조군의 1.02+0.11배) 차의 부족은 PTC 환자와 비교하여 현저하였다 (p<0.01).

PTC에서, 검안경 외관은 시각 기능장애에 대해 진단적이지 않고, 이의 검출은 주된 시험, 특히 가장 민감성인 것으로 간주되는 AVFT에 의존한다. 그럼에도 불구하고, 초기 기능장애는 단파 및 운동 기술에 의해 입증되는 바와 같이 통상적인 AVFT에 의해 여전히 검출되지 않을 수 있다.

눈에서, 미토콘드리아 FA는 다른 형광단, 특히 리포푸신의 넓은 방출 스펙트럼의 쇼울더를 구성한다. 중첩 자가형광을 감소시키기 위해, 어린 환자를 선택하고, 동일한 환자의 눈을 비교하고, FA 최대에서 좁은 방출 대역을 포착하여 리포푸신 방출의 대분을 배제시켰다. 일부 형광 잡음이 유지되었지만, 이러한 시도는 20/20 눈 사이에서 그리고 통상적인 AVFT가 할 수 없는 눈 사이에서 질환 심각도를 구별하였다. 기능장애를 나타내는 FA 특징은 (1) 손상된 대사 활성으로부터의 높은 Al; (2) 상이한 정도로 개별 세포에 영향을 주는 질환으로부터의 넓은 ACW 및 (3) 동일한 환자의 누 사이의 Al 및 ACW 비대칭을 포함한다. 결과는 FA 이미지화가 안구 질환에 대한 중요한 진단 수단이 될 수 있음을 제시한다.

실시예 2

본 연구에서는, 당뇨병에 걸린 대상체의 망막 FA 수준을 질환 심각도 또는 지속기간과 무관하게 연령별 건강한 대조군과 비교하였다.

재료 및 방법

망막 FA를 측정하기 위해, 상기 기술한 바와 같이 467 nm 여기 및 535 nm 방출 필터를 포함하는 변형된 안저 카메라 (Omega Optical, Brattleboro, VT), 2개의 광도계 512B 흑색 조명 전자 증폭 전하 결합 장치 (EMCCD) 카메라 (아리조나, 턱손의 로퍼 사이언티픽(Roper Scientific)), 및 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어를 사용하였다.

확립된 타입 I 또는 타입 II 당뇨병을 갖고 망막증 이외에 안과 질환을 갖지 않는 30 내지 59세의 21명의 대상체를 일상적 안저경 시험 동안 병적에 넣었다. 혈당 (시험에서 얻어짐)을 글루코오스 산화효소 방법에 의해 평가하고, 글리코헤모그로빈 (HbA1C) 수준을 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정하였다. 정상 당부하, 정상 혈압 및 정상 지질 분포를 갖는 21명의 연령별 건강한 대상체를 대조군 집단으로서 모집하였다.

동공 확대 후에, 하나의 EMCCD 카메라를 사용하여 RS이미지 (아리조나, 턱손의 로퍼 사이언티픽) 소프트웨어를 사용하여 망막 황반을 가시화하였다. 각각의 눈에 대해, MetaVue (ON, 토론토의 MDS 어날리티컬 테크놀로지스) 소프트웨어와 인터페이싱한 제 2 EMCCD 카메라를 사용하여 각각 1 밀리초, 467 나노미터 입사 섬광에 의해 유도되는 3 내지 5가지 535 nm FA 판독값을 포착하였다. 이미지화는 환자당 5분을 필요로 하였다.

512×512 화소 파일로서 저장한 FA 이미지를 분석하여 MetaVue, Adobe Photoshop CS2 (캘리포니아, 산호세의 아도브 시스템즈(Adobe Systems)) 및 Lispix (매릴랜드, 게이터스버그의 내셔널 인스티튜트 오브 스탠다즈 앤드 테크놀로지(National Institute of Standards and Technology))를 사용하는 히스토그램을 생성시켰다. 0 내지 256 그레이스케일 단위 (gsu)의 화소 세기의 히스토그램 (도 5)를 각각의 눈에 플롯팅하여 망막 FA의 평균 세기 (Al) 및 평균 곡선 폭 (ACW)를 수득하였다. FA 이미지 평가에서 훈련한 2가지 연구 회원은 모든 이미지를 해석하였다. 불일치에 부닥치면, 기관은 일치 판독을 수행하였다. 이미지화 및 통계 분석시에, 연구 회원은 환자가 당뇨병을 갖는 지를 알았지만, 시험 검토 바이어스를 (1) 임의의 대상체 데이터르 배제시키지 않고 (2) FA 시험의 목적 결과에 의존함으로써 최소화시켰다. 학생의 t-시험 및 ANOVA를 사용하여 당뇨병 및 대조군의 Al과 ACW를 비교하였다. 당뇨병 및 대조군 사이의 눈-특이적 Al과 ACW 수준의 비교를 안내 의존도 및 연령 (적절한 경우)에 대해 조절하기 위해 혼합 선형 퇴행을 사용하여 수행하였다. SAS 9.0 소프트웨어 (노쓰 캘롤라이나의 크레이의 SAS 인스티튜트 인코포레이티드(Institute Inc.))를 모든 통계 분석을 위해 사용하였다. p-값 <0.05을 유의할 만한 것으로 고려하였다.

결과

이미지화를 위해 언급된 33명의 일련의 당뇨병 대상체 중 21명의 당뇨병 대상체가 포함 기준을 만족하였으며 이미지화되어 각각의 눈에 대한 Al 및 ACW를 결정하였다. 당뇨병 환자에 대한 평균 연령은 44.8±10.0세 (30-59세)이고, 평균 기록 당뇨병 지속 기간은 10.5±9.8년이었으며, 평균 HbA1C는 8.5±1.9%이었다. 6가지 타입 I 및 15가지 타입 II 당뇨병이 있다. 당뇨망막증이 12명의 대상체에 존재한다. 모든 21명의 일련의 모집한 대조군 지원자가 포함 기준을 만족시켰다. 대조군에 대한 평균 연령은 44.7+9.4세 (30-59세)이었다.

도 7 및 도 10에 도시된 바와 같이, 모든 3가지 연령층 (30-39, 40-49 및 50-59세)에 대해, 당뇨병의 평균 Al 수준은 대조군에서 발견된 것보다 현저히 높았다 (P<0.004). 연령에 대한 조절과 함께 모든 당뇨병 환자 대 모든 대조군에서 평균 Al 수준의 전체 비교는 각각의 연령 기준에서 발견된 결과와 일치하였다 (P<0.0001). 평균 ACW 수준에 대해 유사한 소견이 관찰되었으며 (도 7 및 도 11 참조), 이는 각각의 연령층 내에서의 당뇨병 환자 대 대조군의 비교 (P<0.006)에 대해 그리고 연령에 대한 조절과의 전체 비교 (P<0.0001)에서 현저히 더 높았다.

당뇨병 환자 및 연령별 대조군의 Al 및 ACW는 비교되어 리포푸신과 같은 다른 내인성 자가형광 분자로서 FA의 연령 의존도를 결정하고, 연령에 따라 축적하고, FA 세기에 영향을 줄 수 있다. 각각의 연령군에서, 당뇨병 환자의 Al 및 ACW는 연령에 따라 FA의 점차적인 안정한 증가를 나타내는 대조군의 Al 및 ACW 보다 높았다. 그러나, 대조군과 비교하여 당뇨병 환자에서 FA의 상대적 상승은 환자 연령과 무관한 것으로 보이며, 이는 당뇨병 환자에서 상승된 FA가 리포푸신 또는 다른 유사한 형광단으로 인한 것이 아님을 강하게 제시하는 것이다.

타입 I과 II 당뇨병 환자 사이의 FA 값의 차가 고려되지만, 15명의 타입 II 당뇨병 환자 (Al 59.5±23.6 gsu) 및 6명의 타입 I 당뇨병 환자 (Al 55.8±25.9 gsu)의 FA는 상이하지 않다 (p=0.654).

상승된 Al 및 ACW를 임의의 망막증이 당뇨망막증의 전문 안과의사에 의해 안저 시험에서 검출되었는 지와 무관하게 당뇨병 환자에서 검출하였다. 사실상, 21명의 당뇨병 중 9명은 가시적 망막증을 갖지 않았으며 (도 10), 이는 당뇨병으로 인한 망막 대사성 스트레스가 임의의 가시적 망막증 전에 존재함을 나타내는 것이다.

HbA1C, FA와 망막증의 존재 사이의 연관성 (도 6)을 연구하였다. 적어도 하나의 눈에서 망막증을 갖는 당뇨병 환자에 대한 평균 HbA1C (8.9±2.1%)는 어느 하나의 눈에서 망막증을 갖지 않는 것 (7.9±1.5%)과는 현저히 상이하지 않다 (p = 0.232). 그러나, 적어도 하나의 눈에서 망막증을 갖는 당뇨병 환자에 대한 평균 Al 및 ACW (각각 69.7±18.3 및 63.2±14.5 gsu)는 어느 하나의 눈에서 망막증을 갖지 않는 것 (각각 43.5±12.2 및 44.8±10.5 gsu)과 현저히 상이하다 (각각 p=0.002 및 p=0.005).

FA 이미지화가 만성 과혈당증의 대사 작용 보다는 혈당의 급성 변이를 측정할 가능성을 고려하기 위해, 4명의 지원자의 FA를 공복 상태에서 그리고 75g 구강 글루코오스 공격 1시간 후에 측정하였다. FA 값에서 현저한 차는 관찰되지 않았으며, 이는 혈당의 급성 상승이 망막 FA에 영향을 주지 않음을 나타내는 것이다.

당뇨병 환자의 FA 이미지화는 연령별 대조군과 현저히 상이한 결과를 유발시킨다. 진단 1년 내 및 7%의 HbA1C를 갖는 집중적으로 치료된 타입 I 당뇨병 환자인 단지 1명의 당뇨병 환자 (도 10, 좌측으로부터 첫 번째, 40-49세 군)은 연령별 대조군과 중첩된 각각의 눈의 Al 및 ACW 값을 가졌다. 이와 같이, 전형적 장치는 질환 지속기간 또는 심각도와 무관하게 대조군과 당뇨병 환자 사이의 현저한 차를 측정할 수 있었다. 수명의 대상체에서, 대조군과 당뇨병 환자 둘 모두 (도 10 및 11)은 이들의 2개의 눈 사이에서 Al과 ACW 값의 통계적 차가 있으며, 이는 FA가 하나의 눈에서 나머지 하나와 상반되게 증가된 망막 스트레스를 검출함을 제시하는 것이다. 사실상, 동일한 환자의 눈들 사이의 고도의 비대칭이 질환의 강한 지표이다. 낮은 섬광 대 섬광 변동성 및 변동성에 대한 피드백 보정을 갖는 광원을 포함하는 FA 기술의 개선은 Al 및 ACW 표준편차를 크게 감소시켜서 당뇨병에 대한 충분히 민감성인 스크리닝 수단을 이미지화시키는 FA를 만들 수 있다. 상기 시나리오에서, 고도로 보편적인 당뇨병으로 인해, 비정상적으로 높은 FA를 갖는 환자는 음성인 경우에 안구 조직 기능장애의 다른 병인에 대한 연구를 촉진시키는 당부하 시험을 일으킨다.

당뇨병 환자에 대해, FA 수준은 망막 손상의 심각도와 관련된다. 이와 같이, FA는 질환 진행 및 치료에 의한 이의 완화를 모니터하는 데에 유용할 수 있다. 사실상, 당뇨병 환자에서 FA 측정값은 HbA1C 수준 보다 망막증과 더 강하게 관련되며, 이는 현재 대사성 대조군의 가장 신뢰할 수 있는 측정값으로 고려된다. FA 이미지화의 값은 상승된 FA를 갖지만 HbA1C 수준이 낮은 망막증에 걸린 2명의 환자 (도 6)에 의해 지지된다. 이와 같이, 본 연구는 FA가 질환 진행 및 치료에 의한 이의 완화를 모니터하는 데에 유용하다. 글루코오스 모니터링과는 달리, FA의 상승은 진행중인 당뇨병 조직 손상을 반영하며, 따라서, 질환 관리를 강화시키기 위해 환자 및 보호자 동기부여를 제공할 수 있다.

안구 방출 분광법은 미토콘드리아 FA가 다른 형광 종, 특히 리포푸신의 넓은 방출 스펙트럼의 쇼울더를 구성함을 입증하였다. 최대 대사성 대조에 대해, FA 최대값에서 단지 좁은 방출 대역이 획득되어 리포푸신의 방출의 대분분을 효과적으로 배제시켰다. 리포푸신의 연령 의존성 축적으로부터 유도되는 FA 신호의 잔류 부분을 확인하기 위해, 연령별 FA 비교를 사용하여 상기 변수를 보정하였다.

사람 및 동물 당뇨병에서 신경세포 손실 및 미세혈관병증이 초기에 일어남에 따라, 조직 손상은 임상적으로 입증되거나 공복시 혈당 스크리닝에 의해 검출되기 전에 질환의 최초 단계에서 시작한다. 초기 진단 및 치료가 이러한 손상을 예방할 것이다. 여기에서의 데이터는 경시적 임상 시험에서의 평가를 포함하는 당뇨병에 대한 FA 이미지화의 발달이 질환 검출 및 관리에서 점점 더 중요해지는 수단을 결과함을 나타낸다.

실시예 3

다른 실험은 상기 기술된 바와 같은 장치 및/또는 방법이 표 1에 기재된 바와 같이 다양한 망막 및 시신경 질환을 진단하는 데에 효과적임을 입증하였다.

망막	시신경
중심성 망막증 당뇨망막증 망막혈관페쇄 유리체망막병증 망막혈관질환 감염성 및 비감염성 포도막염 및 망막염 임의의 다른 후천적 망막증 노인성 황반변성 선천성 망막퇴화	대뇌 가성종양 녹내장 감상선 안병증 시신경염 (다발성 경화증) 그레이브스병

망막 및 시신경 질환에 걸린 많은 환자에 대해 프로토타입 장치를 시험하였다. 프로토타입에 의해 수집된 데이터는 초기 질환에 걸린 환자를 구별하기 위해 측정되고 분석될 수 있는 3가지 이상의 독립 매개변수가 있음을 나타낸다. 도 8에 도시된 바와 같이, 질환에 걸린 눈은 (1) 증가된 황색단백질의 자가형광 (FA) 세기, (2) 더 넓은 범위의 FA 세기 (곡선 폭) 및 (3) 눈들 사이의 세기의 비대칭성 및/또는 세기의 범위를 나타낸다.

프로토타입 장치를 먼저 망막 질환인 중심성 망막증 (CSR)에 걸린 환자에 대해 시험하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, FA 세기를 CSR에 의해 이환된 눈에서 더 컸다. 이환된 눈으로부터 얻어지는 FA 곡선이 또한 더 넓으며, 이는 질환 과정이 개별 세포에 상이한 정도로 영향을 줌을 나타내는 것이다. 대조적으로, 비이환 눈은 더 낮은 세기의 더 좁은 곡선을 나타내었다. 이와 같이, 2가지 변수, 즉 (1) 평균 FA 세기 및 (2) 평균 FA 곡선 폭이 이환된 눈을 비이환된 눈과 구별하였다. 그 외에, 이들 2가지 변수 중 어느 하나의 비대칭이 또한 질환의 특징이다. 상기 현상은 더 낮은 패널의 그래프에서 입증되는 바와 같이 각각의 눈에서 다발성 RMlTM 반복에서 재현성이다. 더욱이, 2가지 변수 각각에 대해 p-값 < 0.001을 나타내는 비교를 가능하게 하는 통계적 데이터를 제공하였다. RMlTM 을 사용하여 하나의 눈에 영향을 주는 망막 질환 (표 1)에 걸린 다른 환자에서 대사성 스트레스를 평가하였다. 2가지 변수의 차는 지금까지 이미지화된 모든 눈에 대해 질환은 비-질환과 구별하는 알고리즘을 가능하게 한다.

프로토타입 장치를 또한 사용하여 상기 중요한 군의 공통 안구 질환 (표 1)에 대한 기술적 응용성을 입증하기 위해 시신경 질환을 연구하였다. 의료 잡지에의 발표를 위한 원고를 결과하는 대뇌 가성종양 (PTC)에 대한 연구에서, FA 값은 각각의 경우에 자동 시야 분석 뿐만 아니라 또는 이보다 더 양호한 증상 및 징후와 상관하는 것으로 밝혀졌다. 모든 경우에, 평균 FA 세기 및 평균 FA 곡선 폭의 비교는, 모두 탁월한 시력 및 단지 감지하기 힘든 초기 질환 소견을 갖는 6명의 환자 중 3명에서 자동 시야 분석에 의해 가능해지지 않을 지라도, 덜 이환된 눈으로부터의 더 이환된 눈의 구별을 가능하게 하였다.

포토타입 장치를 또한 사용하여 망막 및 시신경 질환에 대한 치료 효과를 입증하였다. 정성적 연구에서, 임상적으로 유의할 만한 당뇨망막증에 걸린 3명의 환자의 눈은 증상 및 징후와 상관된 높은 FA 세기를 가졌다. 트리암시놀론 아세토나이드 주사 후의 임상적 개선은 모든 3가지 경우에 감소된 FA 세기가 수반되었다. 4명의 환자에서, 갑상선 관련 안병증으로 인해 시신경염에 대한 외과적 감압술의 효과를 평가하였다. 모든 경우에, 이환된 눈은 손상된 시력, 색체 지각, 및 자동 시야 뿐만 아니라 높은 FA 세기를 나타내었다. 모든 4가지 경우에, 안와감압술은 수술 3일 내에 그리고 감압술의 시간 내에 RMlTM을 허용하는 하나의 환자에서 6시간 내에 FA를 감소시켰다. FA 세기의 감소는 다른 임상적 매개변수의 개선과 밀접하게 상관하지만, FA 세기는 종종 다른 매개변수가 개선을 나타내기 전에 감소되었다. 당뇨황반부종 및 감압성 시신경염에 대해 치료된 눈은 순차적으로 이미지화되고, 치료 수시간 내지 수일 내에 FA 세기의 급격한 감소를 나타내었다. 이들 감소는 치료 후 짧은 시간 간격 내에서 동일한 눈에서 관찰되므로, 이는 급격한 FA 변동이 단지 눈에서 서서히 축적되거나 안정하게 존재하는 리포푸신과 같은 다른 내인성 자가형광 분자로 인한 것이 아님을 강하게 제시하는 것이다.

지금까지의 결과는 다른 임상적 방법과 비교하여 RMlTM 기술의 진단적 및 에후적 징조를 강하게 나타낸다.

실시예 4

상기 연구에서, FA를 당뇨병에 걸린 노인 환자 및 망막 특이적 질환에 걸린 다른 환자에서 시험하여 질환 관련 망막 대사성 스트레스를 검출하는 데에 있어서의 상기 기술의 임상적 민감성을 결정하였다. 세포사멸전 상태가 망막 세포에서 FA 상승을 유도하는 것을 입증하기 위해, 생체외 FA 측정값을 비교하였다. 정상 사람 망막 색소 상피 (HRPE) 세포, HRPE에서 세포사멸을 유도하는 것으로 공지된 제제인 세라미드 또는 H₂O₂에 간단히 노출된 HRPE 세포 및 산화방지제 또는 이들 제제의 억제게의 존재하에 세라미드 또는 H₂O₂에 노출된 HRPE 세포의 배양조직을 측정하고 비교하였다.

방법

사람 대상체

23 내지 77세의 총 36명의 환자를 FA에 대해 이미지화시켰다. 7명의 연령별 대조군 지원자 (57-67세)와 함께 당뇨병의 병력을 갖는 14명의 환자 (54-68세)를 이미지화시켜서 FA에 대한 당뇨병 및 당뇨망막증의 효과를 시험하였다. 각각에 대한 연령별 대조군과 함께 노인성 황반변성 (ARMD)에 걸린 하나의 환자, 중심성 망막증 (CSR)에 걸린 하나의 환자 및 색소성 망막염에 걸린 하나의 환자를 이미지화시켰다. 당뇨병 또는 안구 질환의 병력이 없는 9명의 부가적 건강한 지원자를 이미지화시키고, 망막 FA에 대한 연령의 효과를 시험하기 위해 사용하였다.

사람에서의 망막 FA 이미지화

사람에서 FA를 측정하기 위해, 자이쓰 FF4 안저 카메라 (독일, 오베르코헨의 카를 자이쓰 코포레이션(Carl Zeiss Corporation))은 상기 기술된 바와 같이 50회를 초과하는 변형을 일으켰다. 이들은 특정 467 nm 여기 및 535 nm 방출 필터를 삽입하고, 흑색 조명 EMCCD 카메라를 부착하고 맞춤형 소프트웨어를 갖는 컴퓨터에 접속시키는 것을 포함하였다. EMCCD 칩을 -30℃로 냉각시켜서 잡음을 감소시켰다. 부가적 변형은 투광을 최적화시켜서 신호를 개선시키고 광학 배플을 위치시켜서 광 반사로 인한 잡음을 감소시키는 것을 포함하였다.

각각의 환자/지원자 동공을 1% 토피카마이드/2.5% 페닐에프린에 의해 확대시키고, EMCCD 카메라를 사용하여 각각 1 밀리초, 467 nm 입사 섬광에 의해 유도되는 4회의 535 nm FA 판독값을 포착하였다. 이미지화는 환자당 5분을 필요로 하였다. 기기의 초점 심도는 모든 망막층으로부터 FA의 포착을 유발시켰다. 이미지를 512×512 화소 16-비트 그레이스케일 TIFF 파일로서 저장하였다.

망막 FA 이미지 파일 분석

512×512 CCD 칩 (262,144개 화소)의 각각의 웰에 의해 포착되는 그레이 스케일 단위 (gsu)로 화소 세기의 히스토그램 곡선을 MetaVue, Adobe Photoshop CS2 (캘리포니아, 산호세의 아도브 시스템즈) 및 Lispix (매릴랜드, 게이터스버그의 내셔널 인스티튜트 오브 스탠다즈 앤드 테크놀로지)를 사용하여 TIFF 파일로부터 추출하였다. 0-256 그레이 스케일 단위 (gsu)의 화소 세기의 히스토그램을 각각의 눈에 플롯팅하여 망막 FA의 평균 세기 (Al) 및 평균 곡선 폭 (ACW)을 수득하였다.

재료

N-아세틸-시스테인, 과산화수소, C2-세라미드 및 디히드로세라미드 C2를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (미주리의 세인트루이스)로부터 입수하였다. 코스타 조직 배양 96-웰 검정 플레이트 (맑은 바닥을 갖는 흑색 벽)을 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) (펜실베니아, 피츠버그)로부터 입수하였다.

HPRE 세포 배양

HRPE 세포를 상기 기술된 바와 같이 효소 분해에 의해 공여자 눈으로부터 단리시켰다. 간략하게, 감각 망막을 HRPE 단층으로부터 서서히 분리시키고, HRPE 세포를 파파인과의 1시간 인큐베이션을 사용하여 브루흐막(Bruch's membrane)으로부터 제거하였다. 단리된 HRPE 세포를 5% CO2 하에 습식 인큐베이터 내에서 37℃에서 10% 소 태아혈청 (FBS), 페니실린 G (100 U/㎖), 스트렙토마이신 황산염 (100 ㎍/㎖) 및 암포테리신 B (0.25 ㎍/㎖)을 함유하는 DMEM/F12 중에서 팔콘 프리마리아 플라스크 (Falcon Primaria flask) 내로 성장시켰다. 모든 실험에서, HRPE 세포의 2 내지 4회 통과에 대해 평행 검정을 수행하였다. HRPE 세포를 동일한 모배양물로부터 동시에 동일한 밀도로 조직 배양 96-웰 검정 플레이트 (맑은 바닥을 갖는 흑색 벽 (Costar)) 내로 뿌리고, 7일 이상 동안 페놀 레드-유리 완전 DMEM/F12 중에서 성장시켰다. 모든 실험을 상이한 세포계에서 3회 이상 반복하였다.

HRPE 세포 인큐베이션

96-웰 플레이트 중의 HRPE 세포를 페놀 레드 없이 Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺를 함유하는 행크 균형 염 용액 (HBSS)로 세척하였다. HRPE 세포를 N-아세틸-시스테인 (NAC; 1 mM)의 존재 또는 부재하에 30분 동안 사전 인큐베이팅시킨 후, 사전 인큐베이션 동안 사용되는 동일한 억제제의 존재 및 부재하에 3시간 동안 과산화수소 (H₂0₂; 0.2 mM)로 자극하였다. 96-웰 플레이트 중의 다른 HRPE 세포를 디히드로세라미드 C2 (50 μM)의 존재 또는 존재하에 30분 동안 사전 인큐베이팅시킨 후, 사전 인큐베이션 동안 사용되는 동일한 억제제의 존재 및 부재하에 2시간 동안 C2-세라미드 (50 μM)로 자극하였다.

HRPE 세포 FA 측정

FA를 각각 465 nm 및 535 nm의 좁은 대역폭 여기 및 방출 필터가 장착된 광현미경으로 측정하였다.

결과

당뇨병 또는 안구 질환의 징후가 없는 9명의 대조군 지원자를 망막 FA에 대해 이미지화시켜서 연령에 따라 일어날 수 있는 망막 FA에서 가능한 변동을 시험하였다. 3가지 연령군 각각에서 3명의 대조군 지원자를 연구하고, 각각에 대한 평균 망막 FA 화소 세기를 도 12에 제공하였다. 25세, 45세 및 60세의 평균 연령군을 상기 군에 대한 평균의 1-2년 내에 있는 연령군 내에서 각각의 지원자로 연구하였다. 25세 군에서 대조군 지원자는 45세 군 (Al=31.5+5.7 gsu, p=0.04) 또는 60세 군 (Al=37.4+4.6 gsu, p=0.01) 보다 현저히 더 작은 FA (평균 화소 세기 (Al) 18.9+4 그레이 스케일 단위 (gsu))를 나타내었다. 45세 군이 60세 군 보다 더 작은 망막 FA를 나타내었지만, 이는 현저하지 않다 (p=0.24). 평균 곡선 폭 (ACW)은 또한 연령 증각에 따라 점차로 증가하였으며, 25세가 45세 (ACW=31.0+5.3 gsu) 또는 60세 (ACW=36.7+5.7 gsu; p=0.O5) 군 보다 더 좁은 곡선 (ACW=25.3+3.1 gsu)를 갖는다.

망막증을 갖지 않는 당뇨병 환자, 망막증을 갖는 당뇨병 환자 및 연령별 대조군 지원자에 대한 망막 FA에 대한 256 화소 세기 각각에 화소 카운트의 수의 대표적 히스토그램을 도 13A 내지 13D에 나타내었다. 각각의 눈에서 취한 4개의 이미지에 상응하는 4개의 히스토그램을 각각의 환자에 대해 그래프화시켰다.

도 13A는 안구 질환 또는 당뇨병의 병력이 없는 59세 대조군 지원자를 나타낸다. 도 13B는 망막 FA가 증가하였지만 비정상적인 것으로 밝혀진 혈청 글루코오스 시험을 촉지시킨, 안구 질환 또는 당뇨병의 공지된 병력을 갖지 않는 61세 환자를 나타낸다. 도 13C는 망막증 없이 당뇨병에 걸린 63세 환자를 나타낸다. 도 13D는 비증식성 당뇨망막증에 걸린 61세 환자를 나타낸다.

우측으로 이동한 곡선은 FA의 더 큰 세기를 나타낸다. 더 넓은 곡선은 이미지화된 망막의 부위 내에서 망막 세포에서 FA 세기의 더 큰 변동을 나타낸다. 망막 이미지화가 단지 망막에 대해 3도로 대하므로, 단일 눈에 대해 관찰된 중첩 히스토그램은 이미지화 동안 환자/지원자 부동화의 작은 변동을 결과하여 이미지화되는 황반의 약간 상이한 부위가 결과된다.

59세 비-당뇨병 대조군 지원자에 대한 망막 FA 히스토그램은 당뇨병에 걸린 환자 중 어느 하나와 비교하여 더 작은 평균 세기 (Al) 및 더 좁은 곡선 (ACW)을 나타내었다 (도 13). 망막증이 있는 61세 당뇨병 환자에 대한 망막 FA 히스토그램은 망막증이 없는 2명의 대표적 당뇨병 환자와 비교하여 더 높은 평균 화소 세기를 갖는 더 넓은 곡선을 나타내었다 (도 13).

당뇨병에 걸린 54-68세의 14명의 총 환자를 망막 FA에 대해 이미지화시켰다. 환자 중 1명을 제외한 모두는 타입 2 당뇨병을 가졌다. 14명의 환자 중 7명은 1명의 환자를 제외한 모두에서 양쪽성 망막 질환을 가지며 시험시에 당뇨망막증의 징후를 가졌다. 망막증에 걸린 환자는 평균 HgbA1c 수준 = 7.7+1.7%를 가지며, 망막증이 없는 환자는 평균 HgbA1c 수준 = 6.8+0.8%를 가졌다. 모든 당뇨병 눈은 망막증이 없는 환자에게서 20/200인 하나의 눈을 제외하고는 20/40 이상의 시력을 가졌다. 57-67세의 7명의 건강한 연령별 대조군 환자를 또한 망막 FA에 대해 이미지화시키고 당뇨병 환자와 비교하였다. 당뇨병을 갖지만 망막증을 갖지 않는 환자는 연령별 대조군 지원자의 평균 망막 FA 세기 (Al=36.1+6.79 gsu)와 비교하여 현저히 더 큰 평균 FA 세기 (Al=59.5+10.5 gsu)를 가졌다 (p=0.001) (도 14). 망막증을 갖는 당뇨병 환자는 망막증이 없는 당뇨병 환자의 눈과 비교하여 증가된 평균 망막 FA 세기 (Al=76.6+15.7 gsu)를 나타내었다 (p=0.O4) (도 14). ACW는 대조군 (ACW: 35.7+6.8 gsu; p=0.001)과 비교하여 망막증을 갖지 않는 당뇨병 환자 (ACW: 58.7+9.1 gsu)에서 증가하였다. 망막증을 갖는 당뇨병 환자는 망막증을 갖지 않는 당뇨병 환자 보다 더 넓은 곡선을 가졌다 (ACW: 72.1+15.9 gsu; p=0.O8). 이들 소견은 망막 FA가 당뇨병의 신뢰할 수 있는 지표일 뿐만 아니라 질환의 심각도의 지표임을 제시하는 것이다.

다른 망막 질환을 망막 FA에 대해 스크리닝하고 연령별 대조군 환자와 비교하였다. 최근에 베바시주맙 주사로 처리한, 비-삼출성 ARMD, 확장성 중심 지도형 위축 및 시력 20/400 OS, 및 시력 20/50 OD를 갖는 초점 삼출성 ARMD를 갖는 77세 환자를 망막 FA에 대해 이미지화시켰다. 상기 ARMD 환자 (도 15A)를 67세의 가장 고령의 대조군 지원자 (도 15B)의 망막 FA와 비교하였다. 각각의 환자에서 각각의 눈으로부터의 4개의 망막 히스토그램을 제공하였다. ARMD를 갖는 환자에서 양쪽 눈 모두는 대조군 지원자 (OD=39+6 gsu, OS=43+9 gsu) 보다 더 큰 Al (OD=53+27 gsu, OS=91+7 gsu)를 가졌다. 비-삼출성 질환을 더 임상적으로 확산시키는 ARMD 환자의 좌측 눈은 임상적으로 더 많은 초점 질환을 갖는 우측 눈 (ACW OD 49+22 gsu, OS 74+3 gsu) 보다 더 큰 Al 및 ACW를 나타내었다. ARMD 환자의 우측 눈에서 Al 및 ACW으 가변성은 이미지화 동안 환자의 부동화의 약간의 변동을 나타내어 황반의 약간 상이한 부위가 이미지화될 수 있게 된다.

양쪽성 중심성 망막증 OU의 병력을 갖는 49세 환자를 FA에 대해 이미지화시켰다. 상기 환자는 암슬러 그리드 시험 (Amsler grid testing)에 대해 작은 부중심암점을 나타내었다. VA는 20/20 OU 이었으며, 안저 시험은 암슬러 변동에 상응하는 방중심와 색소 분해를 나타내었다. OCT는 망막하 또는 RPE하 유체 OU를 나타내지 않았지만, 형광안저혈과조영술은 암슬러 그리드 이상성 OU의 부위에 상응하는 완만한 과형광 부위를 나타내었다. FA 이미지화는 연령별 대조군 지원자 (Al: OD=40+6 gsu, OS=37+3 gsu; ACW: OD=40+7 gsu, OS=36+2 gsu)와 비교하여 양쪽 눈 모두에서 Al 및 ACW의 현저한 증가 (Al: OD=78+6 gsu, OS=81+6 gsu; ACW: OD=70+2 gsu, OS=66+2 gsu)를 나타내었다 (도 16A 및 16B).

망막 FA 이미지화를 또한 색소성 망막염으로 진단된 36세에 대해 수행하였다. 환자는 양쪽 눈 모두에서 VA 20/20 OU, 시신경 유두 창백함, 망막 혈관 약화, 완만한 뼈침 색소 침착 및 골드만 시야 시험에 대한 윤상암점을 가졌다. 광순응 망막전위도 (ERG)를 감소되고, 간체 단리 ERG는 양쪽 눈에서 기록하기 힘들었다. 망막 FA 이미지화는 연령별 대조군 지원자 (Al; OD=17+2 gsu, OS=21+2 gsu; ACW: OD=18+3 gsu, OS=21+2 gsu)와 비교하여 양쪽 눈에서 Al 및 ACW의 현저한 증가 (Al: OD=45+10 gsu, OS=56+13 gsu; ACW: OD=44+2 gsu, OS=52+7 gsu)를 나타내었다 (도 17A 및 17B).

세포사멸전 상태가 망막 세포에서 FA 상승을 유도함을 입증하기 위해, 배양된 망막 세포는 둘 모두 이들 세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 공지된 과산화수소와 세라미드로 처리하였다. 도 18A 및 18B에 나타낸 바와 같이, 2시간 동안 각각의 제제에 대한 노출은 현저히 상승된 FA를 결과하였다. 과산화수소의 경우에, 산화방지제인 N-아세틸시스테인은 FA 상승을 완전히 차단하였다. 세라미드의 경우에, 이의 경쟁적 길항근인 디히드로세라미드가 또한 FA 증가를 완전히 차단하였다. 사실상, 억제제는 대조군 세포와 비교하여 FA를 감소시키려는 경향이 있으며, 이는 대조군 세포와 비교하여 세포의 미토콘드리아의 개선된 산화환원 상태를 제시하는 것이다. 두 가지 제제는 모두 전구 세포사멸 자극체에 단지 간단히 존재하므로, TUNEL 또는 아넥신-V 검정에 의한 세포사멸의 형태학적 징후는 발견되지 않았다. 이들 데이터는 심장, 뇌 및 연골의 세포에서 관찰되는 바와 같이, 세포사멸 상태하에서의 망막 세포가 증강된 FA를 나타냄을 제시한다.

논의

사람 및 동물 조직의 FA는 거의 40년 동안 공지되어 있으며, 골격근, 간, 심장 및 다른 조직의 대사 기능장애를 연구하기 위해 사용되어 왔다. 고유의 낮은 신호 대 잡음비로 인해, FA 모니터링의 대부분의 설명은 형광 현미경을 사용하여 생체외 세포 및 조직에 대해 수행되었다. 이들 연구는 상호 관계로 NAD(P)H 및 FAD의 산화환원 상태에 대한 FA 형광의 의존성을 입증하였다. 전자 운반이 효율적인 생리학적 조건 하에, FAD가 환원된 상태로 발견되었다. 미토콘드리아막에 끼워진 호흡 연쇄 중의 환원된 FAD 분자는 청색광에 노출되는 경우에 형광을 나타내지 않는다. 그러나, 미토콘드리아막 전위가 전구 세포사멸 상태 동안 안정하지 않거나 손실될 때에 일어나는 바와 같이 전자 운반이 결핍된 경우에, FAD 분자는 산화되게 되며, 이들의 전자는 청색 광에 의한 더 높은 에너지 상태로 간단한 여기된 후에 녹색광의 방출로 더 낮은 에너지 오비탈로 전환되려는 경향이 있게 되는 최대 공명인 것으로 여겨진다.

생체내에서 망막 세포의 FA를 검출하기 위해 맞춰진 기기를 사용한 결과는 HRPE 세포가 세포사멸을 유도하는 것으로 입증된 농도로 H₂O₂ 및 세라미드에 간단히 노출되는 경우에 증강된 신호를 나타내었다. 세포는 실험이 수행되기 5일 전에 통과하므로, 리포푸신과 같은 형광단, 증강된 당화 최종 생성물 (AGE) 또는 콜라겐이 검출되는 FA 신호에 대해 반응성인 것으로 예측하기 힘들다. 더욱더, 특정 억제제가 H₂O₂ 및 세라미드의 전구 세포사멸 효과에 질항작용을 한 경우에, 증각된 FA 신호는 검출되지 않았다. 이들 데이터는 본 연구에서 수행되는 바와 같이, 미토콘드리아막 전위 (y)의 불안정성으로 인해 FA 산화가 신호가 467 nm 광에 의한 여기시에 535 nm에서 자가형광에 대해 반응성이라는 주장을 지지한다.

망막 세포 세포사멸은 당뇨병, 노인성 황반변성 및 선천성 망막퇴화를 포함하는 많은 전신 및 망막 질환에서 주요 병리생리학적 메카니즘이다. 당뇨망막증의 동물 모델에서, 예를 들어 과혈당증은 초과산화물의 증가된 미토콘드리아성 생성에 의해 망막 미토콘드리아의 산화성 손상을 유도하여, 미토콘드리아로의 전구 세포사멸 Bax로의 전위, 카파제 3의 활성화 및 망막 혈관주위 세포 및 내피 세포의 세포사멸을 유도하는 것으로 입증되었다. 이들 효과는 산화방지제, 초과산화물 디스무타아제, 비타민 E, 및 미토콘드리이에서 생성되는 초과산화물의 수준을 감소시키는 알파-리포산에 의해 완화되어, 당뇨병 쥐에서 망막 모세혈관의 더 양호한 보존을 유도하는 것으로 입증되었다. 전신 및 망막 질환에 의한 망막 세포에 대한 초기 공격이 다양해서 내인성 또는 외인성 세포사멸 경로에 영향을 준다 하더라도, 모두 궁극적으로 미토콘드리아막 안정성에 작용하고, 막전위의 손실 및 전자 운반의 차단을 유발시키는 미토콘드리아막 공극의 개방을 유도한다. 전자 운반의 필수 성분으로서, FAD 산화는 현저한 질환 관련 세포 손실이 일어나기 전에 미토콘드리아 기능장애의 초기 표시이다.

페티 등의 미국 특허 출원 10/777,423에 기술된 것과 같은 장치는 산화된 FA의 고유의 낮은 신호 대 잡음비에도 불구하고 생체내에서도 FA의 검출을 허용한다. 실험적 동물에서 심장 근육의 허혈-재관류 손상에 대한 최근의 생체내 연구에서, FA는 재관류 유도 세포 손상 동안 증가하는 것으로 입증되었다. FA 신호 세기는 세포사멸의 측정값과 잘 상관하였다. 미토콘드리아막 공극 개방의 억제제를 사용하는 다른 연구는 전구 세포사멸 상태 동안 FA 신호의 증가가 FAD 산화를 유도하는 공극 개방에 의존함을 입증하였다. 이들 연구는 신호 대 잡음비 및 배합 형광단의 기술적 문제점이 해결될 수 있는 경우에, 대사 불안정성에 대한 마아커로서 FA의 사용에 대한 강한 지지를 제공한다.

본 발명의 최소한 일부 구현은 이들 2가지 문제점을 해결한다. 첫 번째로, 고효율 광증폭 CCD 칩 및 광증폭 검출기의 사용은 예를 들어, 청색 광에 의해 자극되는 경우에 산화된 FAD에 의해 방출되는 약한 신호를 검출하기 위한 능력을 개선시킨다. 두 번째로, 협대역 고도 기술 필터의 사용은 예를 들어 리포푸신 방출 곡선의 극단적 쇼울더에서 작은 대역폭의 선택을 가능하게 하여, 우세한 망막 형광단인 리포푸신의 방출로부터 FA 신호의 분리를 허용한다. 특정 하드웨어 및 맞춤 소트트웨어에 의한 컴퓨터 처리는 예를 들어 FA 신호의 증강을 추가로 가능하게 하여, 더 우수한 민감성 및 특이성을 갖는 생체내 질환 조직으로부터 대조군을 분리시키는 것을 허용한다.

대조군 환자의 FA 이미지화는 진행중인 생리학적 세포사멸로 인해, 그러나 가능하게는 검출한 FA 신호에서 기저 잡음의 원인이 될 수 있는 리포푸신의 연령 의존성 증가로 인한 어느 정도의 오염으로 인해 40 내지 50년의 수명 동안 가장 높은 현저한 연령 의존성 증가를 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 각각의 연령에서, 당뇨병 또는 망막 특이적 질환에 걸린 환자는 연령별 대조군과 비교하여 더 높은 FA 세기에 근거하여 대사 기능장애를 갖는 것으로 구별될 수 있다. 더욱더, 망막증이 있는 당뇨병 환자는 망막증 없는 환자 보다 현저히 더 높은 FA 신호를 가졌으며, 이는 FA가 대사성 조직 기능장애의 심각도를 모니터하는 데에 유용할 수 있음을 제시하는 것이다. 망막증을 갖는 환자에서 더 높은 FA 신호는 또한 FA 신호가 당뇨병에서 증가하는 것으로 밝혀지지 않은 형광단인 리포푸신의 축적으로 인한 것으로 예측하기 힘들게 만든다. 사실상, 넓은 여기 대역폭을 사용하는 최근의 논문의 햄머 및 공동저자는 녹색 대 적색 형과의 비가 대조군 보다 당뇨병에서 더 높음을 발견하였다. 적색이 리포푸신에 의해 방출되는 주된 파장임에 따라, 저자는 리포푸신이 증가하지 않지만, 녹색 신호가 "AGE의 힌트" 자가형광으로부터 결과됨을 가정하였다. 이는 이들의 생체내 이미지화를 위해 사용되는 대역폭이 AGE를 자극하는 데에 필요한 낮은 파장 청색/자외광을 포함하지 않음에 따라 예측하기 힘들다. 가성뇌종양에 걸린 환자에 대한 연구에 이미 보고된 바와 같이, 본 발명자들은 보고된 전신 또는 망막 질환에 걸린 환자의 눈이 또한 고도의 대칭적 FA 값을 나타내는 대조군 환자와 비교하여 FA Al 및 ACW 에서 상당한 비대칭을 나타냄을 발견하였다. 이와 같이, FA 비대칭은 망막 대사 기능장애의 중요한 지표이며, 다른 형광단의 비대칭적 축적으로 인해 예측하기 힘들다. 배양된 망막 세포에 의해 FA의 맑은 방출과 함께 취한 본원의 생체내 데이터는 FAD를 지지하며, 검출되는 신호의 기원으로서 콜라겐, AGE 또는 리포푸신을 지지하지 않는다.

실시예 5

하기의 실험은 CSR 유도 망막 대사성 스트레스의 지표로서의 FPF의 이용성을 추가로 입증하기 위한 3명의 일방성 중심성 망막증 (CSR)의 황색단백질 형광 (FPF) 분석이다.

CSR은 망막 색소 상피 (RPE)에 의해 생성되는 외부 혈액 망막 장벽의 특발성 분해를 특징으로 한다. 질환의 원인은 알려지지 않았지만, 플루오레세인 및 인도시아닌 그린 (ICG) 혈관조영 연구는 병인이 맥락 소엽 허혈 및 정맥성 울혈 뿐만 아니라 RPE 모세혈관층 기능장애를 수반한다. 광간섭단층촬영 (OCT)은 감각신경 망막 및 RPE 박리, 만성 삼출 및 망막 내의 낭성 변동을 검출한다. 저형광 또는 과형광 안저 자가 형광은 망막하 및 RPE 리포푸신 함량의 변화에 기인한다.

재료 및 방법

일방 CSR을 갖고 다른 안과 또는 전신성 질환을 갖지 않는 35, 42 및 30세의 3명의 남성은 일상적 안저경 시험 후에 망막 FPF 분석을 수행하였다.

사람에서 망막 FPF를 측정하기 위해, 안저 카메라를 상기 기술된 바와 같이 협대역 여기 및 방출 필터, 고민감성 EMCCD 카메라, 및 맞춤 소트트웨어를 갖는 부착된 컴퓨터를 사용하여 변형시켰다. 동공 확대 후에, 각각 1 ms, 467 nm 입사 섬광에 의해 유도되는 4가지 535nm FPF 습득값을 각각의 눈으로부터 3도 필드에 걸쳐 수득하였다. 초점 FPF의 기기의 심도를 모든 망막층으로부터 포착하였다. 이미지를 512×512 화소 16-비트 그레이스케일 TIFF 파일로서 저장하였다. 각각의 눈에 대한 화소 세기의 히스토그램 곡선을 추출하여 상기 기술된 방법을 사용하여 망막 FPF의 평균 세기 (Al)fmf 수득하였다. t 시험 및 ANOVA를 사용하여 각각의 대상체의 2개의 눈 사이의 Al 값을 비교하였다. SAS 9.0 소프트웨어 (노쓰 캐롤라이나, 캐리의 SAS 인스티튜트 인코포레이티드(SAS Institute Inc.))를 통계적 분석을 위해 사용하였다. P-값 <0.05이 유의할 만한 것으로 고려된다.

결과

안저경 시험, 암슬러 그리드 시험, OCT 및 형광 혈관조영술은 모두 각각의 이환된 눈에서 CSR의 소견을 나타내었으며 (도 19A-19F), 비이환된 눈은 질환의 징후를 나타내지 않았다. 좌측와에 대한 PED 측두 (19A), 우측와에 대한 PED 하측두 (19C) 및 좌측 황반에서 망막하 유체에 의한 둔한 중심와 반사 (19E)가 존재한다. 히스토그램은 대측성의 비이환된 눈과 비교하여 각각의 CSR-이환 눈에서 현저히 상승된 FPF를 나타내었다. 환자 1 및 환자 2 (35세 및 42세)의 이환된 눈의 망막 FPF Al은 3명의 연령별 대조군 대상체의 눈의 망막 FPF Al 보다 통계적으로 더 높았다 (p-값: 각각, <0.001 및 <0,05). 환자 3 (30세)의 이환된 눈의 망막 FPF Al은 연령별 대조군의 눈 보다 30% 더 높았지만, 통계성 유의성에 도달하지 않았다 (p< 0.15) (도 20). 중요하게는, 각각의 CSR 환자DML 이환된 눈과 비이환된 눈 사이에 현저한 비대칭이 존재하였다 (p-값: <0.001, <0.05 및 <0.001).

논의

산화된 황색단백질의 자가형광 검출은 주로 리포푸신으로 인한 것인 안저 자가형광을 검출하기 위한 이전에 사용된 방법과 구별된다. 상기 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 어린 환자를 선택하고, 이들의 이환된 눈을 비이환된 눈과 비교하고, FPF 최대값에서 매우 좁은 방출 대역을 사용함으로써 신호에 대한 리포푸신 또는 렌즈 자가형광의 기여를 최소화시켰으며, 이는 리포푸신의 방출 세기의 대부분을 배제시켜서 최대 대사성 대비를 얻었다.

488 nm 광에 의해 유도되는 통상적인 안저 자가형광은 CSR-이환된 눈에서 시작 수주 후에 초점 누출 자리에서 저형광을 나타낸다. 저형광은 RPE의 기계적 차단으로부터의 감소된 리포푸신, 또는 망막하 유체를 축적시킴으로써 RPE 리포푸신의 차단으로 인한 것으로 추정된다. 급성 및 만성 CSR에서의 일부 보고는 원래의 누출 지점을 둘러싸는 저형광 및 과형광을 기술하며; 과형광은 생존 RPE 세포에서 리포푸신 색소의 축적의 원인이 되며, 만성 CSR 병변에서 저형광은 광수용체가 진행성 RPE 세포 손실로부터 손실됨에 따라 감소된 병변 RPE 대사 활성으로부터 결과되는 것으로 여겨진다.

망막 FPF Al은 대측성 비이환 눈의 FPF Al과 비교하여 질환 지속 기간과 무관하게 각각의 CSR-이환된 눈에서 현저히 상승하였다. 이는 또한 연령별 대조군 눈에서 더 높았다. 질환 발병 후 1주 만큼 빠르게 CSR에서 상승된 FPF를 검출하기 위한 능력은 질환이 발병한 후 수주 까지 발달하지 않는 통상적인 안저 자가형광의 변동과 대비되며, 이는 FPF 신호가 아마도 리포푸신으로 인한 것이 아니지만, 손상된 미토콘드리아 대사 활성의 결과임을 제시하는 것이다. 이와 같이, FPF는 망막 대사 활성이 손상될 때에, 그러나 아마도 세포사멸로부터의 실질적 세포 손상이 일어나기 전에 CSR의 초기 진단에서 유익할 수 있다.

상기 연구는 질환을 포함하는 FPF의 2가지 특징, 즉 (1) 연령별 대조군 눈과 비교하여 환자의 눈에서의 상승된 망막 FPF Al (도 20), 및 (2) 대측성 눈과 비교하여 환자의 눈의 현저히 증가된 망막 FPF Al (도 19A-F 및 20)을 입증하였다. 상기 비대칭은 임의의 연령별 대조군 지원자에 존재하지 않으며, 이는 대뇌 가성종양에 대해 상기에 나타낸 바와 같이 환자의 눈 사이의 비대칭이 질환의 특징임을 나타내는 것이다. 이는 환자 3에서와 같이 눈의 망막 FPF Al이 연령별 대조군 지원자의 눈의 망막 FPF Al (도 20)과 통계적으로 상이하지 않는 경우에도 확실할 수 있다. 상기 연구는 사람 망막의 빠른 비침입성 분석이 CSR-유도 망막 기능장애를 검출하기 위해 실현될 수 있음을 제시한다.

실시예 6

2명의 녹내장 환자 및 대조군에 대한 연구를 수행하였다. 도 21은 대조군 연구를 나타낸다. 각각의 측정에 대해, 각각의 화소의 세기 (그레이 스케일 단위, gsu)를 가로좌표에서 플롯팅하였으며, 이 세기를 갖는 화소의 수를 세로좌표에 제고아였다. 환자의 우측 눈은 청색이고 좌측 눈은 적색이었다. 측정의 재현성을 예시하기 위해, 동일한 눈의 다중 그래프는 각각의 다이어그램에서 중첩되었다. 측정에서 일부 변동이 있다 하더라도, 소견은 고도로 재현성이다.

도 22 및 23은 녹내장 환자로부터의 데이터를 나타낸다. 상기 특정 환자를 그의 눈이 질환에 의해 더 이환되었기 때문에 선택하였다. 이는 임상적 소견, 뿐만 아니라, 시신경 유듀 함몰의 양이 우측 눈 보다 좌측 눈에서 훨씬 더 크다는 것을 명백히 나타내는 이미지화 연구에 의해 지지된다 (도시되지 않음). 상기 소견은 또한 시야 시험과 일치하였다 (도 23). 비대칭은 좌측 눈에 대한 내부 대조군을 제공한다. 즉, 이는 질환의 정도를 제외하고는 우측 (색, 연령, 성별 등)과 동일하다. 이 경우에, 더 이환된 눈은 55.3±1.6 gsu의 평균 세기 및 50.6±1.5 gsu의 곡선 폭을 나타내었으며, 덜 이환된 눈의 값은 각각 16.4±1.6 gsu 및 17.4±3.4 gsu이었다. 이와 같이, 변동은 상기 녹내장 환자에서 대사와 관련된 자가형광 세기 및 곡선 폭에서 검출되었다. 더욱이, 감지하기 힘든 시야 결핍 (도 23)은 FA가 신경망막에서 초기 변동을 검출하기 때문에 견고한 FA 차 (도 22)가 동반된다. 유사한 결과가 비대칭 질환을 갖는 또 다른 녹내장 환자를 사용하여 얻어졌다.

실시예 7

상기 기술된 이미지화 방법의 생체외 상관관계를 제공하기 위해, 생체내에서 RPE 세포 및 생체외에서 쥐 및 사람 망막의 새로운 조각으로 연구를 계속하였다. 망막 단편 및 RPE 세포 둘 모두 사람 망막의 우수한 생체내 모델로서 작용한다. 눈에서 일어나는 세포사멸 이벤트를 모델화시키기 위해, 세포사멸 자극제 (H₂O₂ 및 세라미드)를 이들 샘플에 첨가하였다. 이들 자극제는 산화성 분자 및 세라미드 둘 모두가 망막 세포사멸의 주요 중개제인 것으로 보고되었기 때문에 특히 신중한 선택이다. 따라서, 이들 연구는 많은 결합 안병증에서 일어나는 이벤트의 우수한 생체외 상관관계를 형성한다.

사람 및 쥐로부터의 RPE 세포 및 새로운 망막 조각은 세포사멸 자극제 (H₂O₂ 및 세라미드)의 준치사 또는 치사 농도로 처리된 경우에 상승된 황색단백질의 자가형광 (FA)을 나타낸다 (도 24-26 및 18A- 18B). 치사 수준에서, FA는 TUNEL 및 다른 검정에 의해 측정되는 세포사멸과 상관한다.

신경망막 세포사멸을 평가하기 위해, 사람 신경망막의 조각을 세포사 검출 ELISAPLUS 킷을 사용하여 분석하였다. 이러한 광도계 효소 면역검정은 유도된 세포사 후에 세포질 히스톤-관련 DNA 단편 (모노- 및 올리고누클레오솜)의 정량적 생체내 결정을 제공한다 (도 24에 도시됨). 세포사는 세포가 과산화수소에 이해 유도되는 경우에 증가하였으며, 과산화수소에 의한 세포사는 산화 억제제 N-아세틸-시스테인의 존재에 의해 약화되었다. 데이터를 하기의 표 2 및 3에 나타내었다.

사람 신경망막으로부터 6시간 데이터

P P
H₂O₂ (□M) 평균 sem n 값 값
대 대
0 대조군 1.0000 0.1019 4 대조군 H₂O₂
P <
200 H₂O₂ 4.3610 0.3171 3 0.001
200 + 1 mM P > P <
NAC H₂O₂ + NAC 1.5362 0.1219 3 0.05 0.001

주석:
n = 검정 복제물
신경망막 세포사멸을 세포사 검출 ELISA에 의해 평가하였다.

n = 6 망막, 14-16 획득
대조군과 200 μM H₂O₂ 사이의 p-값 = 0.03
대조군과 200 μM H₂O₂ + NAC 사이의 p-값 = 0.007
200 μM H₂O₂와 200 μM H₂O₂ + NAC 사이의 p-값 = < 0.001

특정 독소 (DPI 및 NaCN)은 FA 신호를 없앴으며, 이는 루테인, 리포푸신 또는 AGE와 같은 다른 고정된 형광단과 상반되게 이의 대사성 기원을 나타낸다 (도 27, P 값: 대조군과 비교하여 ^*P < 0.05, ^**P < 0.001; H₂O₂- 또는 C2-세라미드-자극 세포와 비교하여 #P < 0.05, ##P < 0.01). 이들 데이터는 세포사멸 상태 동안 망막 세포가 증강된 FA를 나타내는 것을 보여주며, 이는 다른 세포형의 연구와 일치하는 것이다.

데이터는 본 발명에 따르는 장치 및 파생 장치의 구현에 대한 신규 출원을 기술하고 있으며, 이 출원은 당뇨병, 당뇨병 전기, 당뇨망막증, 노인성 황반변성, 녹내장, 망막 혈관 질환, 감염성 및 비감염성 포도막염 및 망막염, 암, 염증, 선천성 망막퇴화, 중심성 망막증 및 다른 후천적 망막병증, 대뇌 가성종양, 그레이브스병, 시신경염 (다발성 경화증) 등의 검출, 모니터링 및/또는 치료 모니터링을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 당뇨병에 대한 소견은, CDC 통계에 따르면 미국 인구의 절반 이상이 2018년까지 당뇨병 또는 당뇨병 전기를 가지게 될 것임에 따라 특히 중요하다.

망막 자가형광 이미지화의 수가지 특정 응용이 상기에 제공되었지만, 그 응용이 상기 예시적 실시예의 상세로 제한되지 않고, 동물 및 사람에서 각막 및 수정체를 포함하는 다른 안구 조직에 사용하기 위한 변형을 포함함이 당업자들에게 명백해진다. 질환 또는 제제에 의해 유도되는 안구 또는 전신 기능장애로 인한 망막 또는 다른 안구 조직에서 변동을 표현하는 임의의 응용은 본 발명자들이 제공한 라인을 따라 검출될 수 있게 된다. 예를 들어, 고혈압 및 독소 작용을 하는 제제 (약제 포함)과 같은 인자가 포함된다. 사람 및 동물 또는 이들의 조직 또는 세포에서 질환 진행 및 치료제 (약제 포함)에 의한 완화를 모니터하기 위한 응용이 포함될 뿐만 아니라 치료제는 암 또는 염증에서와 같이 원하지 않는 세포군을 제거하는 데에 목적이 있다. 유사하게, 환자, 동물 및 이들의 조직 및 세포는 약제 효과에 대해 모니터될 수 있다. 상기 접근법은 또한 약제 발견과 같은 다른 세팅에 응용될 수 있다.

본 출원 전체에 걸쳐, 미국 특허 및 특허 출원을 포함하는 다양한 공보가 저자 및 년도 및 번호에 의한 특허에 의해 참조된다. 이들 공보 및 특허의 설명은 그 전체 내용이 본 출원에 인용되어 본 발명이 속하는 최신 기술을 더욱 충분히 설명할 수 있다.

본 발명은 예시적 방법으로 기술되었으며, 사용된 기술이 제한 보다는 설명을 목적으로 의도됨이 이해되어야 한다.

본 발명이 발명을 단지 예시하지만 제한하지 않는 것으로 의도된 특정 실시예를 참조하여 기술되었지만, 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 기술된 구현예에 대해 변경, 부가 및/또는 삭제가 이루어질 수 있음이 당업자들에게 명백해질 것이다.

Claims

눈과 관련된 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 유도되는 안구 조직 자가형광을 나타내는 하나 이상의 단일 이미지(single image)를 분석하는 방법으로서,
여기광원에 의해 발생되며 황색단백질의 자가형광을 여기시키고 비-황색단백질의 자가형광의 여기를 최소화하는 여기광을 제공하여, 상기 안구 조직에서 상기 자가형광을 유도하는 단계;
유도되는 안구 조직 자가형광을 나타내는 하나 이상의 단일 이미지를 포착하는 단계;
상기 하나 이상의 단일 이미지를 증강시켜서 상기 안구 조직 자가형광의 신호 세기를 증가시키는 단계; 및
상기 하나 이상의 단일 이미지를 분석하여 상기 하나 이상의 단일 이미지에 대한 강도 분산을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단일 이미지를 분석하여 상기 하나 이상의 단일 이미지에 대한 평균 세기 및 적분 세기 중 하나 또는 둘 모두를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단일 이미지를 분석하여 상기 하나 이상의 단일 이미지에 대한 세기 히스토그램을 결정하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 세기 변화는 세기 히스토그램에 근거하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단일 이미지를 분석하여 안병증, 안병증을 유발시키는 질환 및 안병증의 진행 중 한가지 이상을 산출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단일 이미지를 분석하여 대상체의 두 번째 눈에 상응하는 자가형광과 비교되는 대상체의 첫 번째 눈에 상응하는 자가형광의 차이를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단일 이미지를 포착하는 행위가 전하-결합 소자(CCD) 카메라를 사용하는 것을 포함하며,
상기 하나 이상의 단일 이미지를 증강시키는 행위가 CCD 카메라에서 분리되며 CCD 카메라와 광학적으로 결합된 이미지 증강기를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단일 이미지를 포착하고 상기 하나 이상의 단일 이미지를 증강시키는 행위가 전자 증폭 전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 단일 이미지를 포착하고 상기 단일 이미지를 증강시키는 행위가 증강 전하 결합 소자 (ICCD) 카메라를 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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