KR101635985B1 - 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai)에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai)에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환(liver disorders) 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 α-SMA 발현억제활성을 가짐으로써 간 섬유화를 억제할 수 있어 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 사용이 가능한 이점이 있다.

Description

바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai)에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing, Improving, or Treating Liver Disorders Comprising Substances of Fermented Soy Bean Using Bacillus aryabhattai as an Active Ingredient}

본 발명은 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai)에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

2011년 우리나라 주요 사망원인 별 사망률 추이 통계에 따르면 간 질환 관련 사망률은 10만명 당 약 13.5명 정도로 전체사망자 중 약 2.6%를 차지하며 이는 사망원인 8위에 해당하는 것으로 나타났다(Statistics Korea, 2012). 간 질환은 다양한 원인에 의해 간이 손상을 받기 시작하면 간섬유화, 간경화를 거쳐 간암으로 진행되는 것으로 알려져있다. 반복되는 간손상으로 인해 간성상세포가 자극을 받아 활성화되면서 근섬유모세포와 유사한 활성상태의 세포로 전환이 일어나며, 이때 알파-평활근액틴(α-SMA: α-smooth muscle actin)이 발현되어 교원질(collagen)과 피브로넥틴(fibronectin)의 합성을 촉진시키는 것으로 알려져있다(Mcgee & Patrick, 1972). 그러나 만성적인 간 손상은 반복적인 섬유용해(fibrolysis)와 간 손상복구를 위한 섬유생성(fibrogenesis) 과정 간의 밸런스가 무너져 세포 외 기질(ECM: Extracellular matrix)이 이상증식되는 간섬유증으로 진행된다. 정상간의 교원질은 전체무게의 약 0.5%이나, 간경변에서는 10배 이상 증가하며 간 섬유증 역시 간 내 교원질 증가가 원인인 것으로 알려져있다(Lee, 2006).

간 질환의 종착역 격인 간암에 사용되는 의약품은 현재 바이엘사의 넥사바가 거의 유일한데, 이 또한 일본에서 간부전과 간성뇌증 등의 부작용을 일으킨다는 보고가 있으며 임상시험에서 나온 결과는 치료가 아닌 생존기간의 연장(약 ~9개월)에 중점을 두고 있다고 알려져 있다(Josep et al., 2008). 이로 인해 간 질환 초기단계에 적용가능한 간보호 기능성 물질 발굴에 대한 학계와 의약업계의 노력이 계속되고 있으며 현재는 엉겅퀴과에서 분리된 실리마린(silymarin)이 간보호 작용을 하는 기능성 물질로 알려져 항바이러스제와 같이 치료에 사용되고 있다. 현재까지 간보호 기능성을 가진것으로 밝혀진 식품은 강황(curcumin), 벌꿀(CAPE, caffeic acid phenethyl ester), 브로콜리(sulphoraphane) 및 와사비(6-HITC, 6(methylsulfiny) hexylisothiocyanate) 등이 있으나(Surh, 2003), 간섬유화나 간경화를 효과적으로 저해하는 물질은 아직 개발되지 못했다. 최근에는 국내외적으로 의약품의 부작용과 식품의 안전성을 절충시킨 대체의학에 대한 관심이 증폭되면서 식품에서 그 해결책을 찾으려는 연구가 점점 늘어나고 있다(Tanaka et al., 2009; Hsu et al., 2009). 최근에는 천연물 의약품(herbal medicine)에서 간섬유화 치료 소재를 찾으려는 연구가 진행되고 있으며(Zou et al., 2008), 그 중 식물에서 추출한 제니스테인(genistein)의 항산화 효과와 연관된 약리학적 연구(Hsieh et al., 2010; Ji et al., 2011; Valsecchi et al., 2011)와 사염화탄소 투여에 의한 급성 간손상에 대한 간보호 효과(Kuzu et al., 2007) 및 HepG2의 성장 저해에 의한 괴사 유도(Chodon et al., 2007) 등의 연구결과가 다수 보고되고 있다. 특히, 피막이(Hydrocotyle sibthorpioides)로부터 추출한 제니스테인을 알코올과 같이 장기간 식이 섭취시킨 랫트 실험에서 간 효소와 관련 염증 매개인자의 수치을 감소시켰으며, 간조직 내에서 콜라겐의 퇴적과 간섬유화의 바이오마커들을 감소시키는 것으로 보고되었다(Quanfang et al., 2013).

우리나라의 전통 발효식품은 오랜역사를 가진 안전성을 대표하는 식품의 한 형태로 특히 된장은 원료인 대두로부터 전이된 다이제인(daidzein), 제니스테인(genistein)과 같은 아이소플라본(isoflavones), 그리고 토코페롤(tocopherol) 및 페놀산(phenolic acids) 등의 성분으로 인한 항산화 활성을 가지고 있는 것으로 보고되었다(Ahn et al., 2012). 이외에도 된장은 항비만효과(Bas et al., 2013; Kwon et al., 2006), 항당뇨활성(Lee et al., 2012) 및 항암활성(Lim et al., 2004) 등의 기능성이 있다고 보고되고 있지만, 간 질환과 관련된 기능성에 대한 연구는 미비한 실정이다. 이는 국내 식문화에서 차지하는 된장의 비중과 기능성 일상식(daily food)으로서의 역할을 고려할 때 연구되어질 가치가 충분한 것으로 여겨진다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은, α-SMA 발현을 억제함으로써 간 섬유화를 억제시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 전통발효식품인 메주로부터 콩 발효 활성을 가지는 신규한 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) F1253(기탁번호 KCCM 11281P) 균주를 선별하고, 상기 균주에 의한 콩 발효물을 처리한 경우 대조군 및 시판 콩 발효물을 처리한 경우보다 α-SMA 발현억제율이 현저함을 발견한 바, 간 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai)에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은, α-SMA 발현을 억제함으로써 간 섬유화를 억제시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 전통발효식품인 메주로부터 콩 발효 활성을 가지는 신규한 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) F1253(기탁번호 KCCM 11281P) 균주를 선별하고, 상기 균주에 의한 콩 발효물을 처리한 경우 대조군 및 시판 콩 발효물을 처리한 경우보다 α-SMA 발현억제율이 현저함을 발견한 바, 간 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있다는 사실을 확인하였다.

따라서 본 발명은 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 이용되는 콩의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에서 일반적으로 사용되는 어떠한 콩(soybean)도 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 콩은 대두이다.

본 명세서에서 용어 “발효”는 미생물이 자신이 가지고 있거나 생산하는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 의미하고, 당업계의 어떠한 발효 방법도 포함한다.

본 발명의 용어 “콩 발효물”은 당업계에서 콩의 발효에 의하여 생성되는 모든 물질(예컨대, 메주, 간장, 된장, 고추장, 청국장 및 낫토 등)을 포함하고, 본 발명의 일 구현예에 따르면 된장, 청국장 또는 낫토이며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면 청국장이다.

본 발명의 콩 발효물은 당업계의 어떠한 종류의 콩 발효물도 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 콩 발효물질은 콩 발효물 추출물, 콩 발효물 엑기스, 콩 발효물 농축액 또는 콩 발효물 분말이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 콩 발효물 추출물이다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 콩 발효물 추출물은 콩 발효물에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 상기 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 및 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 또는 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 상기 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 또는 THF를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 또는 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 물, 에탄올 또는 이의 조합을 콩 발효물에 처리하여 수득하고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 물을 처리하여 수득한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “추출물”은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 콩 발효물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 콩 발효물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 콩 발효물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “유효성분으로 포함하는”이란 하기의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 식품으로부터 분리한 미생물 균주 또는 천연발효물인바 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 상기 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이는 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) F1253(기탁번호 KCCM 11281P) 균주이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이는 메주로부터 분리된 균주이다.

본 발명의 주요한 특징은 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물이 α-SMA 발현억제활성을 가진다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 대조군에 대하여 α-SMA 발현을 20-50% 억제시킨다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 대조군에 대하여 α-SMA 발현을 20-40%, 25-40% 또는 25-38% 억제시킨다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 대조군에 대하여 α-SMA 발현을 25-50%, 30-50% 또는 30-40% 억제시킨다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 일반 콩 발효물을 기준으로 α-SMA 발현억제활성을 2-8배 증가시킨다. 상기 일반 콩 발효물은 공지된 청국장 발효 균주(예컨대, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis) 및 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 등)에 의한 콩 발효물이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 농도가 20-500 μg/mL이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 농도가 30-500, 40-500, 45-500, 45-400, 45-300, 45-250 또는 45-220 μg/mL이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 농도가 30-400, 40-400, 40-300, 40-250 또는 40-220 μg/mL이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 농도가 30-300, 30-250 또는 30-220 μg/mL이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 농도가 30-400, 30-300, 30-250 또는 30-220 μg/mL이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 농도가 50-200, 70-200, 70-150, 90-150 또는 90-120 μg/mL이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 농도가 100-200μg/mL이다.

본 발명에서, 상기 “간 질환”은 급성 간 질환, 만성 간 질환 또는 유전적 간 기능 손상 등을 포함하는 것으로, 구체적으로 간염, C형 간염(hepatitis C), 육종증, 약물 알레르기, 지방간, 알코올성 간 질환, 간암, 간경변증, 임신중독증, 비호지킨 림프종, 라이 증후군, 기타 신생아 황달, 가와사끼병, 루푸스, 칸디다증, 말라리아, 렙토스피라증, 뎅기열, 간흡충증, 급성 간경화, 만성 간경화, 선천성 대사 이상(inherited metabolic diseases) 및 담관질환(bile duct disease) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 간 질환은 간 섬유화에 의하여 유발된다.

본 명세서의 용어 간 질환의 예방 또는 개선은 간 질환을 야기하는 것으로 알려진 인자들에 의한 섬유성 반흔 조직의 축적같은 간 조직에서 발생하는 손상의 해로움을 예방하거나 또는 약화시키는 것을 의미하며, 상기 인자들은 알코올성 간 질환, 만성 바이러스 간염(B형 및 C형), 만성담관 차단, 윌슨병, 혈색소침착증, 약물 및 독소에의 노출, 자가면역성 간염, 낭포성 섬유증, 알파 항-트립신 결핍증, 비만 및 주혈흡충증을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서의 용어 치료(treatment 또는 treating)는 소망하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는 질병 또는 증후를 완벽하게 또는 부분적으로 예방하거나 및/또는 질병 및/또는 그 질병에 기여하는 부작용에 대해 완벽하게 또는 부분적으로 치료하는 것이다. 즉, 본 명세서에서 사용되는 용어 치료는 포유동물, 바람직하게는 인간에서 질병의 모든 치료를 의미하며, 이는 다음을 포함한다: (a) 질병에 걸리기 쉽지만 아직 진단되지 않은 대상(subject)에서 일어나는 질병을 예방하는 것; (b) 질병을 억제하는 것, 즉 질병의 발달을 어레스트하는 것; 및 (c) 질병을 회복시키는 것.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물, 식품 조성물, 기능성 식품 조성물 또는 사료 조성물이다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함된 생리활성물질인 콩 발효물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 본 발명의 콩 발효물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 콩 발효물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 기능성 식품 조성물로 제공될 수 있다.

기능성 식품이란 식품의약품안전청에서 개별인정을 통하여 약리 효과가 인정되는 식품을 의미한다.

본 발명의 기능성식품은 본 발명의 유효성분인 상기 화합물 1을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명의 기능성식품에 있어 본 발명의 콩 발효물의 첨가량은, 식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 상기 기능성식품이 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태인 경우 대상 식품에 대하여 통상 0.001-100 중량%, 0.01-100 중량% 또는 0.1-100 중량%의 범위로 첨가될 수 있다.

본 발명의 조성물은 사료 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물을 유효성분 포함하는 항알레르기용 조성물이 사료 조성물로 제조되는 경우, 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물을 그대로, 또는 사료 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제 등을 가하여 제조할 수 있다. 예컨대, 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제이다. 그 형상에는 분체, 과립, 펠릿 또는 현탁액 등이 포함된다.

본 발명의 조성물이 사료 조성물로 제조되는 경우, 육상 또는 수상 동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다. 본 발명의 사료에는 분말사료, 고형사료, 모이스트 펠릿사료, 드라이 펠릿사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 아리아바타이를 이용하여 콩을 발효시키는 단계를 포함하는 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 발효는 바실러스 아리아바타이를 콩의 0.1-3 중량%가 되도록 접종하여, 습도 60-80% 및 온도 30-45℃에서 1-5일 동안 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 발효는 바실러스 아리아바타이를 콩의 0.5-2중량%가 되도록 접종하여, 습도 65-75% 및 온도 35-40℃에서 2-4일 동안 실시한다.

본 발명의 방법은 본 발명의 바실러스 아리아바타이를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.

(b) 본 발명의 바실러스 아리아바타이에 의한 콩 발효물은 α-SMA 발현억제활성을 가짐으로써 간 섬유화를 억제할 수 있어 간 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 사용이 가능한 이점이 있다.

도 1은 α-SMA 발현억제활성의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 방법 및 실험 재료

시약

세포배양을 위한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 우태아 혈청 (FBS: fetal bovine serum), 0.05% 트립신(Trypsin) 및 페니실린-스트렙토마이신(penisillin-streptomycin)은 모두 깁코(Gibco, Life technology, 미국) 제품을 사용하였으며, SDS-PAGE와 블롯 완충액(blot buffer) 및 웨스턴 ECL 기질(western ECL substrate)은 바이오-래드社(Bio-rad, 미국), 그 외의 관련 시약들은 시그마 알드리치社(sigma aldrich, 미국)에서 구매하여 사용하였다.

균주의 분리 및 동정

균주는 재래식으로 제조된 메주로부터 분리하였다. 대두 성분을 트립톤으로 처리한 배지(TSB: Trytic soy broth, Difco 236950, 미국)에서 pH 7.3 ± 0.2, 37℃ 조건에서 배양이 가능하고 동결건조보존 또는 세포현탁액 동결을 통해 균주 보존이 가능하였으며, 16S rDNA 염기서열(서열목록 제1서열)은 시퀀싱 결과 기존의 바실러스 아리아바타이 B8W22(T)균주와 100%의 상동성을 보였는바 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai)로 동정하였다. 상기 균주를 바실러스 아리아바타이 F1253(Bacillus aryabhattai F1253)으로 명명하고, 국제미생물기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2012년 6월 14일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCCM 11281P를 부여받았다.

콩발효물 및 이의 추출물의 제조

콩발효물인 청국장 제조를 위해 대두를 세척하고 하룻밤 동안 침지한 후 물기를 제거하고 114℃에서 50분 동안 증자하였다. 증자한 후 식힌 대두 200 g에 바실러스 아리아바타이 F1253을 대두량의 1%가 되도록 접종하고 습도 70%, 온도 37℃ 항온기에서 3일 동안 발효시켜 청국장을 제조하였다. 제조한 청국장은 동결건조한 후 증류수에 녹인 다음 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 얻은 상등액을 실험에 이용하였다.

마우스 배아 섬유아세포( MEF ) 배양

서울대학교 약학대학 약물학실로부터 분양받은 마우스 배아 섬유아세포(MEF: Mouse embryonic fibroblast)를 DMEM(FBS 10% 함유) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(Sanyo, 일본)에서 세포 밀도가 80-90% 정도 될 때까지 약 2일 동안 배양하였다. 배양 상등액을 제거한 후 트립신/EDTA(0.25%/0.53 mM, Sigma, 미국)를 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 약 2분 동안 반응시켰다. 200×g에서 2분 동안 원심 분리하여 부착된 세포를 수거한 후 3×10⁵ 세포/웰이 되도록 6웰 플레이트로 옮긴 뒤 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 하루 동안 더 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 뒤, 새로운 DMEM(FBS 제외)배지에서 6-12시간 동안 스타베이션(starvation)시킨 후 시료를 농도별(50, 100 및 200 μg/mL)로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다.

웨스턴 블롯

세포를 수거하여 용해 완충액(Lysis buffer)로 저온(4℃)에서 약 30분 동안 세포 용해시켰다. 용해된 세포액을 16×g에서 15분 정도 원심분리시켜 상등액만을 분리하여 브래드포드(Bradford) 용액으로 단백질 정량을 실시하였다. 정량의 단백질을 시료 로딩 완충액(sample loading buffer)과 섞어 100℃에서 5분 동안 열처리한 뒤 10% SDS-PAGE로 단백질 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 끝난 SDS-PAGE를 PVDF 막으로 이동시킨 뒤 1% 스킴밀크로 4℃에서 O/N 블로킹을 실시하였다. 1차 항체(α-SMA(희석 1:1000), β-액틴(1:5000), Santa Cruz Biotechnology, 미국)와 4시간 동안 반응시킨 뒤 PBS 완충액으로 세척한 후, 2차 항체(염소 항-마우스 IgG-HRP, Bio-Rad, 미국)와 2시간 동안 반응시켰다. 항체반응이 끝난 뒤 PBS 완충액으로 세척 후 클래리티 웨스턴 ECL 기질(Clarity western ECL substrate, Bio-rad, 미국)로 반응시켜 케미독 XRS+ 시스템(Chemidoc XRS+ system, Bio-rad, 미국)으로 확인하였다.

실험 결과

바실러스 아리아바타이 F1253으로 제조한 청국장 추출물을 50 μg/mL 농도로 처리한 경우 대조군에 비해 α-SMA 발현억제율이 약 27%인 것으로 나타났으며, 100 μg/mL 농도로 처리한 경우 약 35%, 200 μg/mL 농도로 처리한 경우 약 33%의 대조군 대비 α-SMA 발현억제율을 나타내었다(표 1).

더불어, 바실러스 아리아바타이 F1253으로 제조한 청국장 추출물을 처리한 경우가 시중에서 판매되는 일반 청국장(참고을, 대한민국)을 처리한 경우보다 α-SMA 발현억제율이 3-3.9배 높은 것으로 확인되었는바, 이는 콩 발효물에 있어 종균의 종류가 α-SMA 발현억제활성에 영향을 미침을 의미한다.

따라서 바실러스 아리아바타이 F1253으로 청국장을 제조함으로 인하여 청국장의 α-SMA 발현억제활성이 현저히 높아지는바, 바실러스 아리아바타이 F1253에 의한 콩 발효물이 α-SMA 발현을 억제하여 간 질환의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있을 것으로 예상된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

1. McGee J, Patrick R. 1972. The role of perisinusoidal cells in hepatic fibrogenesis. Lab . Invest . 26: 429-440.

2. Lee KS. 2006. Hepatic fibrogenesis. Korean . J. Gastroenterol . 48: 297-305

3. Josep ML, Sergio R, Vincenzo M, Philip H, Edward G, Jean-Frederic B, Andre CO, Armando S, Jean-Luc R, Alejandro F, Myron S, Camillo P, Stefan Z, Luigi B, Tim FG, Peter RG, Jean-Francois S, Ivan B, Dieter H, Tom G, Minghua S, Marius M, Dimitris V, Jordi B. 2008. Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma. The New England J. Med. 359: 378-390

4. Surh YJ. 2003. Cancer Chemoprevention with dietary phytochemicals. Nat. Rev . Cancer . 3: 768-780

5. Tanaka N, Kono H, Ishii K, Hosomura N, Fujii H. 2009. Dietary olive oil prevents carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in mice. J. Gastroenterol. 44: 983-990.

6. Hsu YW, Tsai CF, Chen WK, Lu FJ. 2009. Protective effects of seabuckthorn(Hippophae rhamnoides L.)seed oil against carbon tetrachloride-induced hapatotoxicity in mice. Food and Chem . Toxicol . 47: 2281-2288

7. Zou YH, Yang Y, Li j, Wu Q, Li WP, Lu JT. 2008. Potential therapeutic effects of a traditional Chinese formulation, BJ-JN, on liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats. J. Ethnopharmacol . 120: 452-457.

8. Hsieh HM, Wu WM, Hu ML. 2010. Genistein attenuates d-galactose-induced oxidative damage through decreased reactive oxygen species and NF-B binding activity in neuronal PC12 cells. Life Sci . 88: 82?88.

9. Ji G, Yang Q, Hao J, Guo L, Chen X, Hu J, Leng L, Jiang Z. 2011. Antiinflammatory effect of genistein on non-alcoholic steatohepatitis rats induced by high fat diet and its potential mechanisms. Inter . Immunopharmacol. 11: 762?768.

10. Valsecchi AE, Franchi S, Panerai AE, Rossi A, Sacerdote P, Colleoni M, 2011. The soy isoflavone genistein reverses oxidative and inflammatory state, neuropathic pain, neurotrophic and vasculature deficits in diabetes mouse model. European J. of Pharmacol . 650: 694?702.

11. Kuzu N, Metin K, Dagli AF, Akdemir F, Orhan C, Yalniz M, Ozercan IH, Sahin K, Bahcecioglu IH. 2007. Protective role of genistein in acute liver damage induced by carbon tetrachloride. Mediators of Inflammation . 1: 363?381.

12. Chodon D, Ramamurty N, Sakthisekaran D. 2007. Preliminary studies on induction of apoptosis by genistein on HepG2 cell line. Toxicol . In Vitro . 21: 887-891.

13. Quanfang H, Renbin H, Shijun Z, Jun L, Ling W, Min H, Lang Z, Xing L. 2013. Protective effects of genisteoin isolatied from Hydrocotyle sibthorpioides on hepatic injury and fibrosis induced by chronic alcohol in rats. Toxicol . Letters . 217: 102-110.

14. Ahn JB, Park JA, Jo HJ, Woo IH, Lee SH, Jang KI. 2012. Quality characteristics and antioxidant activity of commercial doenjang and traditional doenjang in Korea. Korean J. Food & Nutr . 25: 142-148.

15. Bae CR, Kwon DY, Cha YS. 2013. Anti-obesity effects of salted and unslated doenjang supplementation in C57BL/6J mice fed with high fat diet. J. Korean Soc . Food Sci . Nutr . 42: 1036-1042.

16. Kwon SK, Lee KB, Im KS, Kim SO, Park KY. 2006. Weight reduction and lipid lowering effects of Korean traditional soybean fermented products. J. Korean Soc . Food Sci . Nutr . 35: 1194-1199.

17. Lee SY, Kim IS, Park SL, Lim SI, Choi HS, Choi SY. 2012. Antidiabetic activity and enzymatic activity of commercial doenjang certificated for traditional foods. Korea Soc . Biotech . Bioeng . J. 27: 361-366.

18. Lim SY, Rhee SH, Park KY. 2004. Inhibitory effect of methanol extract of doenjang on growth and DNA synthesis of human cancer cells. J. Korean Soc . Food Sci . Nutr . 33: 936-940.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11281P 20120614

<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE <120> Compositions for Preventing, Improving, or Treating Liver Disorders Comprising Substances of Fermented Soy Bean Using Bacillus aryabhattai as an Active Ingredient <130> PN140012 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1478 <212> DNA <213> Bacillus aryabhattai_F1253 <400> 1 caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcgaaccga cgggagcttg 60 ctcccttagg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gttagactgg 120 gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gatgcttgat tgaaccgcat ggttcaatta 180 taaaaggtgg cttttagcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg 240 aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 300 gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 360 acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaaactct 420 gttgttaggg aagaacaagt accgttcgaa cagggcggta ccttgacggt acctaaccag 480 aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540 ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg 600 gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa 660 ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 720 ctctggtctg taactgacgc tgaggcgcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 780 ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg 840 ctgcagcaaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900 ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960 gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac acccctagag atagggcttc cccttcgggg 1020 gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080 cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg 1140 actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200 cctgggctac acacgtgcta caatgggcag aacaaagggc agcgaagccg cgaggctaag 1260 ccaatcccac aaatctgctc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct 1320 ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380 caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta accttttgga 1440 gccagccgcc gaagtgggac agatgattgg ggtgagtc 1478

Claims (9)

1. 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) F1253(기탁번호 KCCM 11281P)에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환(liver disorders) 예방, 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 바실러스 아리아바타이(Bacillus aryabhattai) F1253(기탁번호 KCCM 11281P)에 의한 콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환(liver disorders) 개선용 식품 조성물.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 콩 발효물은 청국장인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 콩 발효물은 α-SMA 발현억제활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 콩 발효물은 대조군에 대하여 α-SMA 발현을 20-50% 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 콩 발효물은 농도가 20-500 μg/mL인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 간 질환은 간 섬유화에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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9. 삭제

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