KR101625927B1 - 캅산틴을 포함하는 자발운동 촉진 및 피로 회복용 기능성 식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자발운동 촉진 및 항피로 활성이 있는 기능성 식품에 관한 것으로, 보다 상세하게는 화학식 1의 캅산틴을 포함함으로써, 섭취시에 에너지원으로부터 다량의 ATP를 생성하여 자발 운동을 촉진하고 강도 높은 운동 후에도 혈청중 젖산 및 암모니아 함량의 증가가 억제되어 항피로 활성을 가지는 기능성 식품에 관한 것이다.

Description

캅산틴을 포함하는 자발운동 촉진 및 피로 회복용 기능성 식품 {Functional Food including capsanthin having enhanced capacities of spontaneous locomotor activity and anti-fatigue activity}

본 발명은 캅산틴을 포함하는 자발운동 촉진 및 피로 회복용 기능성 식품에 관한 것이다.

현재 고추에 대한 많은 연구가 진행되고 있으나, 대부분의 연구는 매운 맛의 주성분인 캅사이신(capsaicin)에 관한 연구들이다.

한편 고추, 파프리카, 피망 등에 함유된 색소성분(carotenoid) 중의 하나인 캅산틴(capsanthin)에 관한 연구는 많이 부족한 실정이다.

캅산틴의 주요 약리활성은 항산화 활성으로 잘 알려져 있으나 자발운동 촉진 및 항피로 활성에 대해서는 알려진 바 없다.

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본 발명은 자발운동을 촉진할 수 있는 기능성 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 항피로 활성을 갖는 기능성 식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 화학식 1의 캅산틴을 포함하는 자발운동 촉진용 기능성 식품:

[화학식 1]

(식 중, R 및 R'는 서로 독립적으로 수소, 라우로릴, 린오레일, 미리스토릴 또는 팔미토일임).

2. 위 1에 있어서, 상기 기능성 식품은 유산소 운동 보조제 또는 근력 운동 보조제인 기능성 식품.

3. 위 1에 있어서, 상기 자발운동은 정상적인 생리 범위 내에서 이루어지는 것인 기능성 식품.

4. 위 1에 있어서, 상기 화합물은 UCP-1(Uncoupling protein-1)의 발현을 유도하지 않는 기능성 식품.

5. 화학식 1의 캅산틴을 포함하는 피로 회복용 기능성 식품:

[화학식 1]

(식 중, R 및 R'는 서로 독립적으로 수소, 라우로릴, 린오레일, 미리스토릴 또는 팔미토일임).

6. 위 5에 있어서, 상기 화합물은 혈청 중 젖산 및 유리 암모니아의 축적을 억제하는 기능성 식품.

7. 위 1 또는 5에 있어서, 상기 화합물은 고추, 파프리카 및 피망으로 이루어진 군에서 선택된 천연물의 추출물에 포함된 것인 기능성 식품.

8. 위 7에 있어서, 상기 추출물은 캅사이신 및 캅시에이트를 포함하지 않는 것인 기능성 식품.

9. 위 1 또는 5에 있어서, 상기 기능성 식품은 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 제형을 갖는 기능성 식품.

10. 위 1 또는 5에 있어서, 상기 기능성 식품은 육류, 소세지류, 빵류, 쵸코렛류, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 면류, 껌류, 낙농제품, 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제로 이루어진 군에서 선택된 식품인 기능성 식품.

본 발명의 기능성 식품은 다량의 ATP 생성을 촉진한다. 이에 따라 ADP 결핍 상태가 발생하는 바, 축적된 ATP를 소모하여 ADP를 생산하려는 생리 반응에 의해 자발 운동이 촉진된다.

본 발명의 기능성 식품은 다량 생성되는 ATP를 이용하여 운동시 발생하는 혈청 중 젖산 및 유리 암모니아의 축적을 저하시켜 항피로 활성을 갖는다.

본 발명의 기능성 식품에 캅산틴이 유리형(free form)으로 포함되는 경우에는 그 형태의 변화 없이 흡수(비특허문헌 7)되기 때문에 지방 세포 및 그 전구체 세포와 바로 반응하여 자발운동 촉진 활성을 나타낼 수 있고, 그 활성이 에스테르형 캅산틴에 비해 현저히 높은 장점이 있다.

본 발명의 기능성 식품에 캅산틴이 에스테르형(ester form)으로 포함되는 경우에는 위장관에서 콜레스테롤 에스테라제 또는 리파아제 등의 효소에 의해 유리형(free form)으로 가수 분해(비특허문헌 8)된 후 흡수되므로 그 혈중 농도가 급격히 변하지 않고 효과가 지속되는 장점이 있다. 또한, 에스테르형의 캅산틴은 유리형 캅산틴에 비해 화학적으로 안정적이어서 변이 산물 생성이 적은 장점도 있다.

캅산틴은 고추 등의 천연물 내에서 대부분이 안정한 에스테르형으로 존재(비특허문헌 9)하기 때문에 고추 등이 김치 등의 발효 식품에 포함되어 발효되는 경우에도 그 활성을 유지할 수 있다.

캅산틴은 캅사이신과 달리 고농도에서도 매운 맛을 나타내지 않고 점막 세포에 대한 자극도 없어서 제품 개발에 특별한 장해 요인이 없다.

도 1은 실시예에서 사용된 동물용 쳇바퀴 회전수 자동측정 장치가 설치된 케이지를 나타낸 것이다.
도 2는 캅산틴 섭취에 따른 마우스의 자발운동량 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 캅산틴 섭취에 따른 마우스의 유영시간 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 캅산틴 섭취에 따른 마우스의 혈청 중 젖산량 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 캅산틴 섭취에 따른 마우스의 혈청 중 암모니아 함량 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 캅산틴 섭취에 따른 마우스의 혈청 중 ketone body 함량 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 3T3-L1세포에서 캅산틴이 지방세포에 결합하여 약리작용을 발휘하는 약리기전을 밝히기 위하여 캅산틴 및 Adrenoreceptor antagonist들의 처리에 따른 지방 축적량의 변화를 나타낸 것이다.
도 8은 캅산틴 섭취에 따른 마우스의 혈청 중 TNF-α 함량 변화를 나타낸 것이다.
도 9는 캅산틴 섭취에 따른 마우스의 체중 변화를 나타낸 것이다.

본 발명의 자발운동 촉진용 기능성 식품은 하기 화학식 1의 캅산틴을 포함한다.

[화학식 1]

(식 중, R 및 R'는 서로 독립적으로 수소, 라우로릴, 린오레일, 미리스토릴 또는 팔미토일 임).

본 명세서에서 자발 운동이란 체내 ATP(Adenosine triphosphate) 축적에 의해 자발적으로 이루어지는 운동을 의미한다. 이 운동은 개체의 운동을 하고자 하는 생리적인 욕구에 의해 수행되는 것이므로, 자기 컨디션이 허락하는 정상적인 생리 범위 내에서 수행된다.

정상적인 생리 범위 내의 운동이란 개체가 운동에 사용할 수 있는 ATP 축적량의 범위 내에서 수행되는 운동으로, 운동에 지나치게 많은 ATP를 소모하여 탈진하거나, 건강 또는 생명에 지장을 주지 않는 정도의 운동을 말한다.

본 발명자들은 상기 화학식 1로 표시되는 캅산틴이 자발운동량을 현저히 증가시킨다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이는 하기 실시예 에서와 같이 캅산틴이 발열반응(thermogenic effect)에는 관여하지 않고, 에너지원으로부터 다량의 ATP를 생성하여 ADP(adenosine diphosphate)의 결핍상태가 발생하게 되고, 그 결과로 높아진 ATP를 소모하여 ADP를 생산시키려는 생리반응의 진행에 의해 자발운동이 촉진되는 것이다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 발명자들은 캅산틴을 투여한 동물군에서 자발운동량(도 2)과 유영시간(도 3)이 늘어남과 동시에 혈청중 ketone body의 생성이 증가(도 6)되는 것에 의하여 지방산의 beta-oxidation이 촉진(비특허문헌 10)된다는 점, 동물의 white adipocyte tissue에서 UCP-1(Uncoupling protein-1)이 유도 생성되지 않는 점(표 1), 캅산틴을 처리한 3T3-L1 세포에서 캅산틴이 UCP 발현과 관련이 있는 adrenoreceptor beta-3 agonist(비특허문헌 11)가 아님을 확인(도 7)함으로써 캅산틴은 발열 반응(thermogenic effect)과는 관련이 없음을 확인하였다.

발열 반응에 관여하는 경우 에너지원인 영양소를 분해하여 열에너지로 방출하는데, 캅산틴은 발열 반응에 관여하지 않아 에너지원으로부터 온전히 ATP를 생산하여 자발 운동량을 현저히 증가시킬 수 있다.

그리고, 캅산틴을 처리한 3T3-L1 세포에서 adrenoreceptor antagonist를 이용한 실험에서 캅산틴이 adrenoreceptor beta-1 및 beta-2 agonist임(도 7)을 밝혀 지방세포에서는 지방분해(lipolysis)를 근육세포에서는 beta-oxidation(비특허문헌 12)을 촉진함을 확인하였다.

그리고, 3T3-L1 세포를 이용해 각각의 카로티노이드의 지방분해활성에 대한 IC₅₀-값을 측정한 결과(표 5), 캅산틴의 IC₅₀-값이 1.31±0.55uM 로 지방분해 활성이 다른 카로티노이드에 비해 현저하게 강력한 활성이 있음을 확인하였다. 그 외의 카르티노이드중 푸코잔틴은 54.81±9.21uM, 베타카로틴은 72.11±3.17uM, 루테인은 77.52±1.01uM의 IC₅₀-값으로 지방분해활성을 보였다. 그에 반해 아스타잔틴, 칸타잔틴, 베타크립토잔틴, 캅소루빈은 100uM 이상의 농도에서도 지방분해 활성이 미미하여, 이들 카로티노이드들은 지방의 연소를 촉진하여 ATP 다량 생성으로 인한 자발운동 촉진 및 항피로 활성을 기대하기 어렵다.

한편, 에너지원의 분해시에 탄수화물 대사와 지방 대사의 불균형으로 인해 2형 당뇨가 유발되는 일도 있으나, 캅산틴의 경우 이를 처리한 3T3-L1 세포에서 p-AMPK(phosphorylated AMP-activated protein kinase)의 양이 증가(표 2)하는 것을 확인하여, 캅산틴이 지질과 포도당 대사의 조절인자인 AMPK를 활성화시켜 ATP를 생산하는 과정(지방산 산화 또는 해당작용)을 촉진하면서도 지방산 대사와 탄수화물 대사의 균형을 유지하는 능력도 있음(비특허문헌 13)을 확인하였고, 캅산틴을 섭취한 마우스의 혈청중의 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 발현정도가 늘어나지 않음을 확인(도 8)함으로써 인슐린 민감성이 저해되어 2형 당뇨를 유발(비특허문헌 14)하는 문제점이 발생하지 않음을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 기능성 식품은 ATP 생성을 항진하므로, 유산소 운동이나 근력 운동 등 에너지를 필요로 하는 상황에서 열에너지의 생성을 촉진하지 아니하면서 ATP의 생성을 촉진함으로써 운동 능력을 향상시키는 운동 보조제로서의 사용이 가능하다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 캅산틴을 포함하는 피로 회복용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명자들은 캅산틴을 투여한 동물군에서 강도 높은 운동 후에도 혈청 중 젖산량(도 4) 및 암모니아 함량(도 5)이 대조군에 비하여 낮은 레벨로 억제되어 있음을 확인하여, 캅산틴이 항피로 활성도 가짐을 확인하였다.

본 발명에서 캅산틴은 화학적으로 합성된 것일 수도 있고, 고추, 파프리카, 피망 등 천연물로부터 분리된 것일 수도 있다. 또한, 캅산틴은 고추장, 김치 등 발효 식품에서 얻어진 것일 수도 있다.

캅산틴은 양 말단의 치환기 R 및 R'가 수소 원자인지, 팔미토일기 등의 지방산인지에 따라 유리형 캅산틴과 에스테르형 캅산틴으로 구분된다. 에스테르형은 유리형일 때보다 화학적으로 안정하다. 캅산틴은 천연물 내에서는 대부분이 에스테르형으로 존재(9)한다. 성숙한 고추, 파프리카, 피망 등에 함유된 캅산틴은 2개의 수산기 모두가 각종 지방산과 에스테르를 형성하고 있다. 에스테르형 캅산틴을 검화하여 얻은 지방산은 예컨대 라우린산 26.5%, 미리스틴산 48.3%, 팔미틴산 17.6%, 린오레인산 7.5%의 혼합물(비특허문헌 15)일 수 있다. 천연물 내에 존재하는 에스테르형 캅산틴은 동물에 경구 투여하면 위장관에서 콜레스테롤 에스테라제 또는 리파아제 등의 효소에 의해 유리형으로 가수분해된 후 흡수된다.

유리형 및 에스테르형 캅산틴을 합성, 분리, 정제 및 제조하는 방법은 특정의 것으로 한정되지 않는다. 캅산틴을 천연물로부터 분리하는 경우에는 예컨대 건조된 천연물을 잘게 분쇄한 후 분쇄물 무게의 약 2-20배의 알콜 수용액, 또는 에틸아세테이트 등의 유기용매를 사용하여 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 약탕기 추출, 초임계 추출 등의 추출 방법으로 용매 추출하고, 이 용매 추출물을 용매 분획한 후 실리카겔 컬럼으로 크로마토그래피 처리하는 방법으로 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 캅산틴 또는 이를 포함하는 천연물의 추출물은 자발운동 촉진의 목적으로 기능성 식품에 첨가될 수 있다. 캅산틴 및 이를 포함하는 천연물의 추출물이 식품 첨가물로 사용될 경우, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 억제 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 본 발명의 화학식 1의 화합물 및 이를 포함하는 천연물의 추출물은 생체 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효 성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

한편, 전술한 천연물인 고추에는 캅사이신도 포함되어 있고, 파프리카 및 피망에는 캅시에이트도 포함되어 있는데, 이들 성분의 경우 UCP-1(uncoupling protein-1)을 유도 생성시켜 발열 반응(thermogenic effect)을 촉진(비특허문헌 16)한다.

즉, 이들 성분은 에너지를 ATP 생성에 사용하는 것이 아니라 발열 반응에 사용하는 것으로서, 오히려 ATP 생성량이 감소하는 바, 하기 실시예에서 나타나는 바와 같이 자발 운동량 및 유영시간이 오히려 감소하고, 운동시에 발생하는 혈청 중 젖산량 및 유리 암모니아의 함량이 증가하여 피로를 유발하게 된다.

상기 효과를 극대화한다는 측면에서, 본 발명에 따른 천연물의 추출물은 캅사이신 및 캅시에이트를 포함하지 않는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 기능성 식품은 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형화될 수 있으며, 이들의 제제화는 통상의 기능성 식품 제조 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 캅산틴 또는 이를 포함하는 천연물의 추출물을 첨가할 수 있는 식품은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 육류, 소세지류, 빵류, 쵸코렛류, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함한다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예 1: 고추의 에틸 아세테이트 추출물 제조

고춧 가루 10kg에 에틸 아세테이트 50L을 넣고 수욕상에서 리플럭스하여 3시간 가열 추출하였다. 추출과정을 3회 반복실시 하고 식힌 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 고추의 에틸 아세테이트 추출물 1.53kg을 얻었다.

실시예 2: 파프리카의 에틸 아세테이트 추출물 제조

건조된 파프리카 분말 10kg에 에틸 아세테이트 50L을 넣고 수욕상에서 리플럭스하여 3시간 가열 추출하였다. 추출과정을 3회 반복실시 하고 식힌 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 파프리카의 에틸 아세테이트 추출물 825.2g을 얻었다.

실시예 3: 피망의 에틸 아세테이트 추출물 제조

건조된 피망 분말 10kg에 에틸 아세테이트 50L을 넣고 수욕상에서 리플럭스하여 3시간 가열 추출하였다. 추출과정을 3회 반복실시 하고 식힌 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 피망의 에틸 아세테이트 추출물 784.3g을 얻었다.

실시예 4: 고추의 에틸 아세테이트 추출물에서 캅사이신이 제거된 캅산틴 함유 추출물 제조

고추 에틸 아세테이트 추출물 1.5kg을 헥산 7L에 녹이고, 0.1N-알칼리 수용액 7L를 분액깔대기에 넣고 혼합 진탕하고 층 분리 후 알칼리-수용액 층을 제거하는 과정을 5회 반복하여 캅사이신을 완전하게 제거하였다. 캅사이신 분자 중의 페놀성 수산기가 강알칼리 수용액에서 페놀레이트 염을 형성하여 물에 녹는 성질을 이용하였다.

위와 같은 과정을 통해 얻은 헥산층을 HPLC로 분석한 결과 캅사이신이 검출되지 않았다[HPLC 분석조건: 컬럼; C8-역상 컬럼 (agilent Eclipse XDB-C8, 150×4.6mm, 5um), 전개 용매; 메탄올: 물 = 4:6), 전개 용매의 유속; 1ml/분, 캅사이신의 리텐션 타임; 18.59분, 검출; UV 흡수 230nm).

또한, 헥산 층에 남아있을 수 있는 알칼리를 제거하기 위해 0.5N 염산을 가하여 혼합 진탕 후 염산 층을 제거한 다음에 헥산 층을 포화중조수용액으로 씻고 무수망초로 탈수 및 여과 후 감압 농축하여 캅사이신이 제거된 에스테르형 캅산틴을 함유하는 추출물 1.27kg을 얻었다.

실시예 5: 파프리카의 에틸 아세테이트 추출물에서 켑시에이트(capsiate)가 제거된 캅산틴 함유 추출물 제조

파프리카의 에틸 아세테이트 추출물 800g을 실시예 4와 동일한 방법으로 켑시에이트를 제거하여 캅산틴 함유 추출물 536.3g을 얻었다.

실시예 6: 피망의 에틸 아세테이트 추출물에서 켑시에이트가 제거된 캅산틴 함유 추출물 제조

피망의 에틸 아세테이트 추출물 700g을 실시예 4와 동일한 방법으로 켑시에이트를 제거하여 캅산틴 함유 추출물 487.7g을 얻었다.

실시예 7: 캅산틴 함유 추출물에서 에스테르형 캅산틴 분리

캅산틴 함유 추출물 1kg에 무수에탄올 30L을 넣고 쏘디움메톡싸이드를 촉매량 가하여 실온에서 교반하면서 에스터교환반응(trans-esterificaition)을 했다. 이 반응이 완료되면, 빙초산을 소량 가하여 촉매(소듐메톡사이드)를 파괴하고, 이를 감압 농축하여 캅산틴의 지방산 에스테르와 지방산의 에칠에스테르 및 글리세린의 혼합물 1.03kg을 얻었다. 이때, 트리글리세라이드는 지방산의 에틸에스테르로 되지만, 에스테르형 캅산틴은 반응하지 않는다(비특허문헌 17).

위에서 얻은 혼합물 1kg을 헥산 10L에 녹여 실리카겔 2kg과 헥산으로 제작한 칼럼을 이용한 크로마토그래피를 하여 지방산의 에칠에스테르 성분이 남아 있지 않을 때까지 용출시켜 제거한 후 전개용매를 헥산 : 에틸 아세테이트 = 20 : 1로 바꾸어 용출시켜 에스테르형 캅산틴 분획물 8.75g를 얻었다.

이 분획물 8.75g을 헥산에 용해하여 4℃에 방치하여 암적색 무정형 분말인 에스테르형 캅산틴 1.54g을 얻었다.

capsanthin diester (300MHz NMR) 한국기초과학지원연구원

0.87(s, 3H), 1.08(s, 3H), 1.12(s, 3H), 1.18(s, 3H), 1.54(m, 1H), 1.58(s, 3H), 1.62(m, 1H), 1.73(s, 3H), 1.76~1.81(m, 2H), 1.96(s, 3H), 1.98(s, 6H), 1.99(s, 3H), 2.05~2.15(m, 2H), 2.41~2.48(dd, 1H), 2.95(dd, 1H), 5.02~5.12(m, 1H), 5.21~5.29(m, 1H), 6.13(s, 2H), 6.15(d, 1H), 6.25(d, 1H), 6.35(d, 1H), 6.40(d, 1H), 6.46(d, 1H), 6.55~6.58(m, 2H), 6.63~6.73(m, 4H), 7.32(d, 1H), fatty acyl ester(0.89(t, 6H), 1.26~1.33 (m, 44H?), 2.24~2.32(m, 4H))

실시예 8: 캅산틴 함유 추출물을 검화하여 유리형 캅산틴 및 유리형 캅소루빈 분리

실시예 4, 5, 6 에 의해 얻어진 캅산틴 함유 추출물 100g을 에탄올에 녹이고 NaOH/EtOH 용액을 첨가한 다음에 질소 기류 하에서 검화하였다. 이를 식힌 후 감압 농축하여 에탄올을 제거하였다.

이후, 이동상 용매에 녹여 칼럼 크로마토그래피(CHCl₃: acetone: MeOH = 5: 1: 0.1)하여 각각 유리형 캅산틴 분획물 1.3g 및 유리형 캅소루빈 분획물 200mg을 얻었다. 유리형 캅산틴 분획물 1g을 에틸 에테르에 용해하여 4℃에 방치하여 암적색 구형 결정인 유리형 캅산틴 411mg을 얻었고, 유리형 캅소루빈 분획물 100mg을 에틸 에테르에 용해하여 4℃에 방치하여 적색 구형 결정인 유리형 캅소루빈(capsorubin) 23mg을 얻었다.

free-capsanthin (500MHz NMR) 한국기초과학지원연구원

0.85(s, 3H), 1.08(s, 6H), 1.22(s, 3H), 1.38(s, 3H), 1.48(1H), 1.51(1H), 1.71(1H), 1.75(s, 3H), 1.79(1H), 1.97(s, 3H), 1.98(s, 6H), 2.00(s, 3H), 2.01~2.08(m, 2H), 2.34~2.42(m, 1H), 2.97(dd, 1H), 4.01(m, 1H), 4.52(m, 1H), 6.13(s, 2H), 6.16(d, 1H), 6.27(d, 1H), 6.35(d, 1H), 6.38(d, 1H), 6.45(d, 1H), 6.53(d, 1H), 6.58(d, 1H), 6.61~6.74(m, 4H), 7.34(d, 1H)

free-capsorubin (400MHz NMR) 한국기초과학지원연구원

0.85(s, 6H), 1.20(s, 6H), 1.37(s, 6H), 1.48(dd, 2H), 1.71(dd, 2H), 1.96(s, 6H), 1.99(s, 6H), 2.00(dd, 2H), 2.96(dd, 2H), 4.51(m, 2H), 6.36(m, 2H), 6.45(d, 2H), 6.52(d, 2H), 6.55(d, 2H), 6.64(dd, 2H), 6.69(m, 2H), 7.32(d, 2H)

실시예 9: 캅산틴 섭취에 의한 마우스의 자발운동량 측정

6주령 ICR-mouse 암컷을 구입하여 1주간 자유식이를 하였다. 최종 체중이 30(± 0.5)g인 동물들을 선별하여 7마리씩 5그룹으로 나누어 분류한 후 1일 1회, 3일 동안 캅산틴 및 캅사이신을 각각 투여하였다.

캅사이신은 SIGMA에서 구입하여 사용하였다.

사육실의 조건은 온도 24.0℃(± 1.0), 습도는 50.0%(± 2.0)이며 식이는 자유식이를 하였다.

자발운동량은 동물용 쳇바퀴 회전수 자동 측정 장치(도 1)를 케이지에 장치하여 12시간 간격으로 측정해서 기록하였다.

실험 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 대조군에 비해 캅사이신을 투여한 군은 자발운동량이 감소하는 반면, 캅산틴을 투여한 군은 캅산틴 투여량에 의존적으로 자발운동량이 현저히 증가함을 확인하였다.

실시예 10: 캅산틴 섭취에 의한 마우스의 유영시간 측정

실시예 9에 의해 사육된 마우스로 강제수영부하실험을 실시하였다.

강제수영부하실험은 캅산틴 또는 캅사이신 투여 3시간 후 마우스에 평균체중의 8%에 상당하는 중량을 부하하여 수조(크기 90× 45× 45cm, 물높이 35cm, 물온도 23~25℃)에 빠뜨려 수영시키고 각각의 동물마다 7초 이상 마우스가 잠수를 하는 경우 지쳤다고 판단하여 잠수 시작 시점까지의 유영 시간을 기록(비특허문헌 18)하여 각 군마다의 평균값을 구하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 것과 같이, 대조군에 비해 캅사이신을 투여한 군은 유영시간이 감소하는 반면, 캅산틴 투여군은 캅산틴 투여량에 의존적으로 유영시간이 증가 되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 11: 캅산틴 섭취 및 일정 시간 강제수영 후 마우스의 혈청 중 젖산량 측정

실시예 10과 같이 캅산틴 또는 캅사이신 투여 3시간 후에 강제수영부하실험을 실시하였다. 강제수영부하 120초 경과 후에 복부를 개복하고 심장에서 채혈하여 얻은 혈액을 실온에서 1시간 방치 후 원심분리(3,000rpm, 15분)하여 혈청을 분리해서 젖산량을 측정하였다.

젖산량은 Lactate assay kit(BioVision Co.)를 사용하여 측정(비특허문헌 19)하였다.

도 4에 나타낸 것과 같이, 대조군에 비해 캅사이신 투여군은 혈청중 의 젖산량이 증가하는 반면, 캅산틴 투여군은 혈청중의 젖산량이 캅산틴 투여량에 의존적으로 낮은 레벨로 억제되어 있음을 알 수 있었다.

실시예 12: 캅산틴 섭취 및 일정 시간 강제수영후 마우스의 혈청중 암모니아함량 측정

실시예 11에 의해 얻은 혈청 중의 암모니아함량을 측정하였다.

암모니아 함량은 Ammonia assay kit(BioVision Co.)를 사용하여 측정(비특허문헌 20)하였다.

도 5에 나타낸 것과 같이, 대조군에 비해 캅사이신 투여군은 혈청중 의 암모니아 함량이 증가하는 반면, 캅산틴 투여군은 혈청 중의 암모니아 함량이 캅산틴 투여량에 의존적으로 낮은 레벨로 억제되어 있음을 알 수 있다.

실시예 13: 캅산틴 섭취에 의한 마우스의 혈청중에서 ketone body 함량 분석

실시예 9에 의해 사육된 마우스에서 캅산틴 또는 캅사이신의 최종 투여 3시간 후 복부를 개복하여 심장에서 혈액을 채혈하였으며, 심장에서 채혈한 혈액은 실온에서 2시간 동안 방치한 후 원심분리(3000rpm, 15분)하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청을 이용하여 ketone body assay kit(Abnova Co.)를 이용하여 ketone body의 함량을 측정(비특허문헌 21)하였다.

실험결과 도 6에 나타낸 것과 같이, 동물에게 투여한 캅산틴의 투여량이 20ug 이하일 때까지는 혈청중의 ketone body함량증가가 미미한 반면, 30ug 이상 투여한 군에서는 혈청중의 ketone body 함량이 급격히 증가함을 확인하였다. 이는 과량의 캅산틴을 투여하는 경우 TCA-cycle의 규모는 확대되지 않는 것에 비해 캅산틴에 의해 다량 생성된 acetyl-CoA를 TCA-cycle이 충분히 처리하지 못하기 때문에 ketone body가 생성된 것이다.

실시예 14: 캅산틴 섭취에 의한 마우스의 white adipocyte tissue 에서 UCP -1(Un coupling protein -1) 함량 분석 ( western blotting )

실시예 9에 의해 사육된 마우스에서 캅산틴 또는 캅사이신의 최종 투여 3시간 후 복부를 개복하여 복부에 있는 WAT(white adipocyte tissue)를 적출하였다. WAT 중의 UCP-1을 Angela A. Wendel 방법에 따라 아래와 같은 방법으로 UCP-1 induction 양을 측정(비특허문헌 22)하였다.

액체 질소를 이용하여 얼린 WAT를 막자 사발로 분쇄 한 후 RIPA(Radioimmuno-precipitation assay) lysis buffer 5ml를 넣고 초음파 처리하여 조직을 파괴하고, 이를 원심분리(13,000 rpm, 10 min, 4℃)하여 지방층과 조직 잔존물을 철저히 제거하고 UCP-1 induction에 의하여 생성된 단백질량을 Bradford method(비특허문헌 23)로 정량하였다.

즉, 단백질 50ug에 해당하는 시료에 5x sample buffer를 혼합하고 100℃에서 10분간 가열한 후 10% SDS PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) gel에 loading하여 전기영동(steaking gel 80v, running gel 120v)을 하였다. 전기영동이 끝난 gel에서 membrane에 단백질을 transfer하였다. 5% skim milk(TBST: Tris Buffered Saline with Tween 20)를 이용하여 membrane을 상온에서 blocking(80rpm, 30min) 시킨 후 TBST로 세척(1hr 80rpm) 하였다.

1차 antibody UCP-1(santacruz, 1:1000)를 첨가하고 진탕(80rpm, 60min)하여 membrane에 반응시킨 후 TBST로 미반응 antibody를 세척(1hr 80rpm)하여 제거하고, 2차 antibody (Mouse Anti-Rabbit IgG HRP, cell signaling 5127, 1:5000)를 첨가하고 진탕(80rpm, 60min)하여 membrane에 반응시킨 후 TBST로 미반응 antibody를 세척(1hr 80rpm)하여 제거하였다.

Membrane에 ECL(Electrochemiluminescence) solution를 뿌려서 화학발광이미지분석장치(ChemiDoc) 으로 UCP-1 induction 양을 확인하였다.

표 1에 나타낸 것과 같이, 캅산틴을 투여한 동물군에서는 negative control과 비교해서 UCP-1의 발현량 차이가 보이지 않았다. positive control 인 캅사이신의 경우 10ug 에서부터 UCP-1 이 발현되는 것을 확인 할 수 있었다.

구분	Fold increased
Control	1.0
capsanthin 10ug	1.1
capsanthin 20ug	1.0
capsanthin 30ug	1.1
capsaicin 10ug	2.0

실시예 15: 캅산틴을 처리한 3 T3 - L1 세포에서 Adrenoreceptor antagonist 들을 이용한 캅산틴의 반응기작 확인

한국세포주은행에서 분양 받은 3T3-L1 세포 9 passage를 Singh의 방법에 따라 배양(비특허문헌 24)하였다.

분양받은 3T3-L1 pre-adipocyte들을 10% bovine calf serum 및 1% penicillin-streptomycin mixture를 포함한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 사용하여 25T tissue culture flask에 7일간 배양 하였다. 배양된 세포들을 8.5×10³ 세포 수/㎠이 되도록 12well에 분주한 다음 37℃, CO₂ incubator에서 배양하였다. 세포의 상태가 confluence 상태에 도달하면, 2~3일 더 배양한 후 분화용 배지인 10% fetal bovine serum, 1.7uM insulin, 0.5mM IBMX, 1uM dexamethasone을 포함한 DMEM 배지로 교체하고 capsanthin 및 Doxazosin mesyate (alpha-1 adrenoreceptor antagonist), Yohimbine hydrochloride (alpha-2 adrenoreceptor antagonist), Metoprolol tratrate (beta-1 adrenoreceptor antagonist), ICI 118,551 (beta-2 adrenergic receptor antagonist), SR 59230A (beta-3 adrenergic receptor antagonist)를 각각 20uM 농도로 넣고 2일 간격으로 배지를 바꿔 주면서 총 4일간 배양하였다. 각 시료를 처리한 지방세포의 지방량을 Negal의 방법인 지방을 Oil Red O로 염색하여 지방에 염색된 Oil Red O의 함량을 측정함으로써 각 세포의 지방 함량을 구하는 방법(비특허문헌 25)을 사용하였다.

지방세포가 배양 되고 있는 plate에서 배양액을 제거하고 PBS(phosphate buffer saline)로 세척한 다음 10% 포름알데하이드 500 ul를 1시간 정체하여 고정시켰다. 고정하고 남은 포름알데하이드는 PBS를 이용하여 제거한 후 Oil Red O를 500ul 가하여 2시간 동안 염색하였다. 염색하고 남은 Oil Red O는 PBS로 충분히 세척하여 남지 않게 하였다. Oil Red O로 염색된 지방세포에 이소프로필 알코올 1ml 가하여 10분간 지방세포 내의 Oil Red O를 추출하였다. Oil red O의 함량은 ELISA reader를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 7에 나타낸 것과 같이, 캅산틴과 함께 Metoprolol tratrate (beta-1 adrenoreceptor antagonist), ICI 118,551 (beta-2 adrenergic receptor antagonist)을 넣은 그룹에서 capsanthin의 anti-adipogenic activity가 억제 되는 것을 관찰함으로써 캅산틴은 Adrenoreceptor beta-1, beta-2 agonist 임을 확인하였다.

그리나, alpha-1, alpha-2 adrenoreceptor agonist에 대한 활성은 없었으며, UCP 발현과 관련이 있는 Adrenoreceptor beta-3 agonist 활성은 미미함을 확인하였다.

실시예 16: 캅산틴을 처리한 3 T3 - L1 세포에서 p-AMPK( phosphorylated AMP -activated protein kinase ) 함량분석

한국세포주은행에서 분양 받은 3T3-L1 세포 9 passage를 실시예 15와 같은 방법으로 capsanthin 또는 capsaicin이 포함된 배지를 1ml씩 넣어서 30분 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배지 제거 후 남은 배지를 제거하기 위해 PBS 1ml로 세척하고, trypsin 처리하여 cell을 1.5ml tube에 넣고 원심분리(3000rpm, 5min) 하였다. 상층액 제거 후 cold PBS 1ml를 가하고 교반 후 원심분리(3000rpm, 5min) 하여 남은 trypsin을 제거하였다. RIPA lysis buffer에 1mM PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride) + protease inhibitor + phosphatase inhibitor를 첨가한 후 각각의 tube를 밀봉하고 120 rpm 으로 1시간 진탕한 후 원심분리(13000rpm, 4℃, 10min)하여 상층액을 얻어 Bradford method(22)로 단백질을 정량하였다.

단백질 50ug에 해당하는 시료에 5x sample buffer를 혼합하고 100℃에서 10분간 가열한 후 10% SDS PAGE gel에 loading하여 전기영동(steaking gel 80v, running gel 120v)을 하였다. 전기영동이 끝난 gel에서 membrane에 단백질을 transfer하였다. 5% skim milk(TBST: Tris Buffered Saline with Tween 20)를 이용하여 membrane을 상온에서 blocking(80rpm, 30min) 시킨 후 TBST로 세척(1hr 80rpm) 하였다.

1차 antibody p-AMPK(Santacruz Co., 1:1000)를 첨가하고 진탕(80rpm, 60min)하여 membrane에 반응시킨 후 TBST로 미반응 antibody를 세척(1hr 80rpm)하여 제거하고, 2차 antibody (Mouse Anti-Rabbit IgG HRP, cell signaling 5127, 1:5000)를 첨가하고 진탕(80rpm, 60min)하여 membrane에 반응시킨 후 TBST로 미반응 antibody를 세척(1hr 80rpm)하여 제거하였다.

Membrane에 ECL solution (Pierce 32109)를 뿌려서 ChemiDoc으로 p-AMPK의 함량을 확인하였다. β-actin 함량분석을 하여 p-AMPK의 함량을 보정하였다.

표 2에 나타낸 것과 같이, 대조군에 비해 캅사이신 투여군 뿐만 아니라 캅산틴 투여군도 positive control군인 AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide)처리 군과 비슷한 수준으로 p-AMPK의 양이 증가함을 확인하였고, 또한, 캅산틴을 투여한 군은 농도의존적으로 p-AMPK의 양이 증가함을 확인하였다.

캅산틴이 지질과 포도당 대사의 조절인자인 AMPK를 활성화시켜 ATP를 생산하는 과정(지방산 산화 또는 해당작용)을 촉진하면서도 지방산 대사와 탄수화물 대사의 균형을 유지하는 능력도 있음을 확인할 수 있었다.

구분	Fold increased
Control	1
capsathin 5uM	0.9
capsathin 10uM	1.3
capsathin 50uM	1.9
capsathin 100uM	2.5
capsathin 200uM	2.4
capsaicin 200uM	2
AICAR 1mM	2.3

실시예 17: 캅산틴 섭취에 의한 마우스의 혈청중에서 TNF -α tumor necrosis factor-α 함량 분석

실시예 9에 의해 사육된 마우스에서 캅산틴 또는 캅사이신의 최종 투여 3시간 후 복부를 개복하여 심장에서 혈액을 채혈하였으며, 심장에서 채혈한 혈액은 실온에서 2시간 동안 방치한 후 원심분리(3000rpm, 15분)하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청을 이용하여 TNF-α assay kit(Invitrogen Co.)를 이용하여 TNF-α 함량을 측정(비특허문헌 26)하였다.

실험결과 도 8에 나타낸 것과 같이, 대조군에 비해 캅사이신을 투여한 군의 혈청중 TNF-α가 증가하지 않았고, 또한, 캅산틴을 투여한 군에서도 투여 용량에 따라 TNF-α는 증가하지 않는 것으로 나타났다. TNF-α는 염증반응과 밀접한 관계에 있으며, 인슐린 민감성을 저해하는 요인으로 TNF-α의 증가는 2형 당뇨를 유발하기도 하는데, 일부 항비만 제품을 오래 섭취할 경우 유발될 수 있는 2형 당뇨의 부작용 문제점이 보이지 않는 것을 의미한다.

실시예 18: 캅산틴 섭취에 의한 마우스의 혈장중 캅산틴 함량 분석

6주령 ICR-mouse 암컷을 구입하여 1주일간 자유식이를 하였다. 동물의 사육 온도는 24(± 1)℃, 습도 50(± 2)%, 명암은 12시간을 주기로 조절하였다. 에스테르형 캅산틴 및 유리형 캅산틴은 각각 다른 동물에게 1일 1회 15mg/kg 구강투여하였다. 단회 또는 3일간 투여 한 동물들의 혈액에서 채취한 혈장 중 캅산틴(함량 및 형태)을 HPLC로 분석하였다.

동물에서 혈액 4ml을 EDTA가 들어 있는 시험관에 채취하여 혈액응고를 방지한 다음에 원심분리(3,000rpm, 10분, 4℃)하여 상층의 플라스마 1ml을 취하였다. 이에 1% BHT(Butylated hydroxytoluene)/EtOH 1ml을 넣고 1분간 교반한 후 헥산 2ml를 넣고 다시 1분간 교반 후 원심분리(2,000rpm, 5분)하여 헥산층 1ml을 취해 HPLC로 분석하였다.

- HPLC 분석조건: 컬럼; ODS-120A컬럼(TOSOH, tsk-gel, 150× 4.6mm, 5um), 전개 용매; 아세토니트릴: 2-프로판올: 에틸아세테이트(8: 1: 1), 전개 용매의 유속; 0.8ml/min, 검출; UV detector로 480nm, Injection volumn; 10㎕, 유리형 캅산틴의 retention time; 8.2분, 에스테르형 캅산틴의 retention time; 75.47분)

혈액을 분석한 결과 유리형 캅산틴을 투여한 군과 에스테르형 캅산틴을 투여한 군 모두의 혈액에서 유리형 캅산틴만이 검출되었고, 에스테르형 캅산틴은 혈액에서 검출되지 않았다.

이 결과로부터 유리형 캅산틴은 그 자체로 흡수가 되고 에스테르형 캅산틴은 위장관에서 가수분해 되어 유리형 캅산틴으로 변화된 후에 흡수된다는 것을 알 수 있었다.

그런 이유로, 캅산틴 1회 투여(표 3) 및 반복 투여(표 4)후 혈장 중 캅산틴을 분석한 결과, 에스테르형 캅산틴을 투여한 동물보다 유리형 캅산틴을 투여한 동물이 혈장중 캅산틴의 농도가 높았음을 관찰할 수 있었고, 에스테르형 캅산틴을 투여한 동물에서 시간별로 채취한 혈장 중 캅산틴의 농도는 완만하게 상승하는 반면에 유리형 캅산틴을 투여한 동물에서 시간별로 채취한 혈장중 캅산틴의 농도는 급격히 높아짐을 관찰할 수 있었다.

단회 투여 후 채혈시간	유리형 캅산틴 투여		에스테르형 캅산틴 투여
	혈장중 유리형 캅산틴 함량	혈장중 에스테르형 캅산틴 함량	혈장중 유리형 캅산틴 함량	혈장중 에스테르형 캅산틴 함량
1 시간 후	미검출	미검출	미검출	미검출
2 시간 후	132.53	미검출	25.36	미검출
*혈장 중 캅산틴의 함량은 HPLC 피크면적(mV× sec)으로 표기

3일간 투여 중 최종 투여 후 채혈시간	유리형 캅산틴 투여		에스테르형 캅산틴 투여
	혈장중 유리형 캅산틴 함량	혈장중 에스테르형 캅산틴 함량	혈장중 유리형 캅산틴 함량	혈장중 에스테르형 캅산틴 함량
0 시간 후	미검출	미검출	미검출	미검출
0.5 시간 후	8.11	미검출	미검출	미검출
1 시간 후	100.13	미검출	47.65	미검출
2 시간 후	147.24	미검출	67.75	미검출
4 시간 후	224.17	미검출	47.47	미검출
*혈장 중 캅산틴의 함량은 HPLC 피크면적(mV× sec)으로 표기

실시예 19: 캅산틴 섭취에 의한 마우스의 체중 변화 분석

6주령 ICR-mouse 암컷을 구입하여 1주간 자유식이를 하였다. 최종 체중이 30(± 0.5)g인 동물들을 선별하여 7마리씩 5그룹으로 나누어 분류한 후 1일 1회, 14일 동안 캅산틴 및 캅사이신을 각각 투여하였다.

사육실의 조건은 온도 24.0℃(± 1.0), 습도는 50.0%(± 2.0)이며 식이는 자유식이를 하였다.

체중은 매일 측정하여 변화량을 기록하였다.

그 결과 도 9에 나타낸 것과 같이, 대조군에 비해 캅산틴 투여군은 체중의 큰 변화가 보이지 않았다.

그러나, 캅사이신을 투여한 군은 대조군에 비하여 장기간 투여시 오히려 체중이 증가함을 알 수 있었다.

이러한 이유는, 캅사이신이 UCP-1를 증강시켜 에너지원을 열에너지로 소비한다 하더라도 자발운동량의 감소로 인해 장기간 투여시 오히려 비만을 초래한 것으로 보인다.

지금까지 thermogenic effect 유발물질들은 UCP-1을 증강시켜 에너지원을 열에너지의 생성에 사용함으로써 항비만 효과가 있다고 보고하고 있지만, thermogenic effect 유발물질은 오히려 자발운동량을 감소시켜 장기간 투여시 비만을 초래함을 이번 연구 결과에 의하여 최초로 밝혀진 것이다. 기존의 연구들은 짧은 투여기간에 의해 thermogenic effect 유발물질에 대한 잘못된 항비만 효과를 보고한 것으로 생각된다.

실시예 20: 3 T3 - L1 세포를 이용한 각 카로티노이드의 지방분해 활성( IC ₅₀ ) 측정

한국세포주은행에서 분양 받은 3T3-L1 세포 9 passage를 실시예 11과 같은 방법으로 배양하였다.

세포의 상태가 confluence 상태에 도달하면, 2~3일 더 배양한 후 분화용 배지인 10% fetal bovine serum, 1.7uM insulin, 0.5mM IBMX, 1uM dexamethasone을 포함한 DMEM 배지로 교체하고 3일 동안 배양한 후 2일 간격으로 카로티노이드들을 주입하고 배지를 바꿔 주면서 5일간 배양하였다.

캅산틴과 캅소루빈은 실시예 8에 의해 얻어진 유리형 캅산틴 및 캅소루빈(capsorubin)을 사용하였고, 베타카로틴(β-carotene), 루테인(lutein), 아스타잔틴(astaxanthin), 푸코잔틴(fucoxanthin)은 SIGMA에서 구매하여 사용하였으며, 칸타잔틴(cantaxanthin), 베타크립토잔틴(β-cryptoxanthin)은 SANTA-CRUZ에서 구매하여 사용하였다.

지방 세포에서 각 카로티노이드의 지방 분해 활성을 관찰하기 위하여 Negal의 방법인 각각의 카로티노이드가 세포내의 지방을 분해한 후 남아있는 지방을 Oil Red O로 염색하여 지방에 염색된 Oil Red O의 함량을 측정함으로써 각 세포의 남아있는 지방함량을 구하는 방법을 사용하였다.

지방세포가 배양 되고 있는 plate에서 배양액을 제거하고 PBS(phosphate buffer saline)로 세척한 다음 10% 포름알데하이드 500 ul를 1시간 정체하여 고정시켰다. 고정하고 남은 포름알데하이드는 PBS를 이용하여 제거한 후 Oil Red O를 500ul 가하여 2시간 동안 염색하였다. 염색하고 남은 Oil Red O는 PBS로 충분히 세척하여 남지 않게 하였다. Oil Red O로 염색된 지방세포에 이소프로필 알코올 1ml 가하여 10분간 지방세포 내의 Oil Red O를 추출하였다. Oil red O의 함량은 ELISA reader를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

표 5에 나타낸 것과 같이, 각 시료의 지방분해 활성 IC₅₀-값을 비교한 결과 캅산틴 1.31± 0.55uM, 푸코잔틴 54.81± 9.21uM, 베타카로틴 72.11± 3.17uM, 루테인 77.52± 1.01uM의 활성을 보였다. 그에 반해 아스타잔틴, 칸타잔틴, 베타크립토잔틴, 캅소루빈은 100uM이상의 농도에서도 지방분해 활성이 미미하여 이들 카로티노이드 중 캅산틴의 지방분해 활성이 가장 강력함을 확인하였다.

구분	Lipolysis IC50(uM)
Capsanthin	1.31± 0.55
Fucoxanthin	54.81± 9.21
β-carotene	72.11± 3.17
Lutein	77.52± 1.01
Astaxanthin	> 100
Cantaxanthin	> 100
β-cryptoxanthin	> 100
Capsorubin	> 100

Claims (10)

1. 화학식 1의 캅산틴을 포함하는 자발운동 촉진용 기능성 식품:
   [화학식 1]
   

   

   
   (식 중, R 및 R'는 서로 독립적으로 수소, 라우로릴, 린오레일, 미리스토릴 또는 팔미토일임).
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 기능성 식품은 유산소 운동 보조제 또는 근력 운동 보조제인 기능성 식품.
   
3. 청구항 1에 있어서, 상기 자발운동은 정상적인 생리 범위 내에서 이루어지는 것인 기능성 식품.
   
4. 청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 UCP-1(Uncoupling protein-1)의 발현을 유도하지 않는 것인 기능성 식품.
   
5. 화학식 1의 캅산틴을 포함하는 피로 회복용 기능성 식품:
   [화학식 1]
   

   

   
   (식 중, R 및 R'는 서로 독립적으로 수소, 라우로릴, 린오레일, 미리스토릴 또는 팔미토일임).
   
6. 청구항 5에 있어서, 상기 화합물은 혈청 중 젖산 및 유리 암모니아의 축적을 억제하는 기능성 식품.
   
7. 청구항 1 또는 5에 있어서, 상기 화합물은 고추, 파프리카 및 피망으로 이루어진 군에서 선택된 천연물의 추출물에 포함된 것인 기능성 식품.
   
8. 청구항 7에 있어서, 상기 추출물은 캅사이신 및 캅시에이트를 포함하지 않는 것인 기능성 식품.
   
9. 청구항 1 또는 5에 있어서, 상기 기능성 식품은 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 제형을 갖는 기능성 식품.
   
10. 청구항 1 또는 5에 있어서, 상기 기능성 식품은 육류, 소세지류, 빵류, 쵸코렛류, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 면류, 껌류, 낙농제품, 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제로 이루어진 군에서 선택된 식품인 기능성 식품.

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