KR101598934B1 - 황금누에고치 추출물을 활성성분으로 포함하는 서브마이크론 에멀젼의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료조성물 - Google Patents

황금누에고치 추출물을 활성성분으로 포함하는 서브마이크론 에멀젼의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 황금누에고치 추출물을 서브마이크론 에멀젼화하는 방법 및 상기 에멀젼화에 의해 그 효능이 향상된 황금누에고치 추출물 함유 에멀젼을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 (A) 가온한 글리세린(glycerin) 18~21 중량%에 정제수 34~40 중량%와 황금누에고치 수용성용매 추출물 16~20 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계; (B) 유화제 4~6 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계; (C) 양이온 개질제 4~5 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계; (D) 황금누에고치 지용성용매 추출물 15~18 중량%를 첨가하여 에멀젼조성물을 제조하는 단계; 및 (E) 고압 호모게나이저(Microfluidizer)를 사용하여 100~130 nm의 크기를 가지는 서브마이크론 에멀젼을 형성하는 단계를 포함하는 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼의 제조방법이 제공된다.

Description

황금누에고치 추출물을 활성성분으로 포함하는 서브마이크론 에멀젼의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료조성물{Cosmetic composition comprising the submicron emulsion of Golden silk silkworm cocoon extract as active ingredients}
본 발명은 황금누에고치 추출물을 서브마이크론 에멀젼화하는 방법 및 상기 에멀젼화에 의해 그 효능이 향상된 황금누에고치 추출물 함유 에멀젼을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 새로운 누에품종인 황금누에(Golden Silk)의 누에고치 추출물을 서브마이크론 에멀젼화 함으로써 피부 각질층 지질의 유동성을 증가시켜 피부의 자극을 줄이면서 황금누에고치 추출물에 함유된 활성성분의 피부 투과율을 증가시키는 기술에 관한 것이다.
종래부터 천연물의 추출물을 함유하는 화장료에 관한 연구가 있어왔다. 그러한 천연물 중의 하나로서 누에고치를 들 수 있다. 일반적으로 누에고치 추출물에는 피부보습, 살균효과 등이 있음이 알려져 있어 화장료의 원료로 사용되어 왔다.
대한민국 공개특허 제2005-0015177호 "누에고치로부터 추출된 세리신 단백질을 함유하는 미용팩조성물"에는 누에고치로부터 추출한 세리신을 활성성분으로 함유하는 피부미용팩이 개시되어 있다. 대한민국 공개특허 제2007-0114953호 "생약 추출물을 포함하는 문제성 피부 개선용 조성물"에는 인삼, 천궁, 삼백초, 당귀, 어성초, 감초, 박하, 뽕잎, 녹차, 구기자, 진피, 검정콩, 검은깨, 누에고치 및 하수오 추출물을 포함하는 문제성 피부 개선용 조성물에 관하여 개시되어 있다. 상기의 누에고치 추출물은 일반누에 품종의 누에고치를 이용한 것이다.
본 발명자들은 여러 천연물들의 화장품으로의 응용 가능성을 연구하는 과정에서, 새로운 누에품종인 황금누에(Golden silk)의 누에고치를 선정하고 다양한 용매와 추출방법을 사용하여 이로부터 추출물을 제조하여, 각각에 따른 피부 항산화 효과, MMP-1 생성 억제 효과, 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 합성증진 효과, 멜라닌 생성억제 효과, 자외선 조사에 의한 세포독성완화 효과, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현억제 효과, 피부주름 개선 효과 및 피부탄력 개선 효과 등을 시험해 보았으며, 그 결과 일반 누에고치에 비하여 그 효능이 매우 우수하다는 것을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 활성성분으로서 황금누에고치 추출물을 함유하는 화장료가 피부에 오래 머무르고 피부 투과율 증가에 따라 사용시 효능이 극대화되는 방법을 찾기 위해 노력하였으며, 표면이 양이온 개질된 서브마이크론 크기의 에멀젼을 제조하여 이용하는 경우 그러한 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
그러므로 본 발명은 피부에 오래 머무르면서 피부투과율이 증대되는 황금누에고치추출물 함유 서브마이크론 에멀젼의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼을 포함하여 항산화 효과, MMP-1 생성억제 효과, 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성억제효과, 콜라겐 합성증진 효과, 피부 주름개선 효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 화장료조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면,
(A) 가온한 글리세린(glycerin) 18~21 중량%에 정제수 34~40 중량%와 황금누에고치 수용성용매 추출물 16~20 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;
(B) 유화제 4~6 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;
(C) 양이온 개질제 4~5 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;
(D) 황금누에고치 지용성용매 추출물 15~18 중량%를 첨가하여 에멀젼조성물을 제조하는 단계; 및
(E) 고압 호모게나이저(Microfluidizer)를 사용하여 100~130 nm의 크기를 가지는 서브마이크론 에멀젼을 형성하는 단계를 포함하는 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼의 제조방법이 제공된다.
상기 황금누에고치 수용성용매 추출물은 황금누에고치를 물, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올)의 용매를 사용하여 추출한 추출물이다.
상기 유화제로는 이눌린(Inulin), 이눌린 라우릴 카바메이트(Inulin Lauryl Carbamate), 글리세릴 씨트레이트/락테이트/리놀리에이트/올레이트(Glyceryl citrate/Lactate/Linoleate/Oleate), 폴리글리세릴-10 미리스테이트(Polyglyceryl-10 Myristate), 폴리소르베이트(Polysorbate), 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 포스포리피드, 하이드로제네이티드 라이소포스파티딜콜린, 하이드로제네이티드 라이소레시틴, 하이드로옥실레이티드 레시틴 및 불포화 레시틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있다.
또한, 상기 양이온 개질제로는 탈로트리모늄 클로라이드(Tallowtrimonium Chloride), 세트리모늄 클로라이드(Cetrimonium Chloride), 아몬드아미도프로말코늄 클로라이드(Almondamidopropalkonium Chloride), 바바수아미도프로팔코늄 클로라이드(Babassuamidopropalkonium Chloride), 베헨트리모늄 클로라이드(Behentrimonium Chloride), 카프릴릴알코늄 클로라이드(Caprylylalkonium Chloride), 세틸베라네이트 클로라이드(Cetyl Berainate Chloride), 디세틸다이모늄 클로라이드(Dicetyldimonium Chloride) 및 헥사디메트린 클로라이드(Hexandimethrine Chloride)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있다.
상기 황금누에고치 지용성용매 추출물은 황금누에고치를 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름 및 헥산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 추출한 추출물이다.
상기 에멀젼 조성물에는 0.5~1 중량%의 방부보존제가 추가로 포함될 수 있다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 상기 방법에 의하여 제조된 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼을 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 1 ~ 50 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 화장료 조성물은 자유라디칼을 소거하고, MMP-1 생성 억제 및 자외선 조사에 의한 MMP-1의 생성을 억제하고, 콜라겐 합성을 증진하고, 멜라닌 생합성을 억제하며, 자외선 조사에 의한 세포독성을 완화하고, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효능을 지닌 화장료로 사용될 수 있다. 상기 화장료조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 제형으로 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 황금누에고치 추출물을 활성성분으로 함유하는 서브마이크론 에멀젼을 포함하는 화장료조성물은 피부에 오래도록 머무르면서 활성성분을 안정하게 흡수시켜주므로, 자유라디칼을 소거하고, MMP-1 생성 억제 및 자외선 조사에 의한 MMP-1의 생성을 억제하고, 콜라겐 합성을 증진하고, 멜라닌 생합성을 억제하며, 자외선 조사에 의한 세포독성을 완화하고, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 일반 황금누에고치 추출물 함유 제형에 비하여 우수하다. 그러므로 항산화, 피부 주름개선 및 탄력개선, 노화방지, 미백, 자외선 조사에 의한 세포독성 완화, 피부 손상억제, 자극완화 및 보습용 화장료로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 서브마이크론 에멀젼의제타전위 측정결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 활성성분으로서의 황금누에고치 추출물을 서브마이크론 에멀젼화하여 그 효능을 극대화시킨 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 활성성분으로 담지되는 황금누에고치 추출물은 대한민국 농촌진흥청이 원종인 JS169와 CS186 누에를 교배조합(JS169×CS186)하여 육성한 새로운 품종의 누에인 골든실크(Golden Silk)잠이 튼 고치의 추출물을 의미한다[황색실크생산용 특수누에 품종 "골든실크"육성, 韓蠶學誌 49(1), 14~17(2007)].
본 발명자들은 상기 황금누에(골든실크잠)의 누에고치는 일반 누에고치와 다른 아미노산 조성을 가지며, 이에 따라 황금누에고치 추출물은 일반 누에고치 추출물에 비하여 피부자극완화 효과, 피부주름 및 탄력개선효과, 보습 효과, 미백효과, 모발의 강도강화 효과, 모발 윤기강화 효과, 모발생장 효과, 모발 자외선보호 효과, 탈모방지 효과 등이 월등히 우수하다는 것을 확인하였으며, 이에 관한 내용을 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제2012-0127442호, 제2012-0135952호).
본 발명자들은 후속 연구를 통하여 활성성분인 황금누에고치 추출물을 화장료 내에서 안정화하고, 피부에 오래 머무르면서 지속적으로 피부에 작용하여 그 효과를 극대화시킬 수 있는 방법을 찾고자 하였다. 그 결과 특정한 방법에 의하여 표면을 양이온으로 개질하고 서브마이크론 에멀젼화함으로써 이를 달성할 수 있었다.
본 발명의 황금누에(골든실크잠)고치 추출물을 활성성분으로 함유하며, 표면이 양이온으로 개질된 서브마이크론 에멀젼은 다음의 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.
먼저, (A)가온한 글리세린(glycerin) 18~21 중량%에 정제수 34~40 중량%와 황금누에고치 수용성용매 추출물 16~20 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;
(B) 유화제 4~6 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;
(C) 양이온 개질제 4~5 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;
(D) 황금누에고치 지용성용매 추출물 15~18 중량%를 첨가하여 에멀젼조성물을 제조하는 단계; 및
(E) 고압 호모게나이저(Microfluidizer)를 사용하여 100~130 nm의 크기를 가지는 서브마이크론 에멀젼을 형성하는 단계를 포함하는 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼의 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.
상기 황금누에고치 수용성용매 추출물은 황금누에고치를 물, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올)의 용매를 사용하여 추출한 추출물을 의미한다.
상기 (A)단계는 60~65℃에서 이루어지며, 이어서 유화제를 첨가하여 아지믹서(Agimixer)를 이용하여 유화를 진행시킨다. 상기 유화제로는 이눌린(Inulin), 이눌린 라우릴 카바메이트(Inulin Lauryl Carbamate), 글리세릴 씨트레이트/락테이트/리놀리에이트/올레이트(Glyceryl citrate/Lactate/Linoleate/Oleate), 폴리글리세릴-10 미리스테이트(Polyglyceryl-10 Myristate), 폴리소르베이트(Polysorbate), 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 포스포리피드, 하이드로제네이티드 라이소포스파티딜콜린, 하이드로제네이티드 라이소레시틴, 하이드로옥실레이티드 레시틴 및 불포화 레시틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있다.
이어, 에멀젼의 표면을 양이온으로 개질하여 피부에 오래동안 머무르도록 하기 위하여 양이온 개질제를 첨가한다. 상기 양이온 개질제로는 탈로트리모늄 클로라이드(Tallowtrimonium Chloride), 세트리모늄 클로라이드(Cetrimonium Chloride), 아몬드아미도프로말코늄 클로라이드(Almondamidopropalkonium Chloride), 바바수아미도프로팔코늄 클로라이드(Babassuamidopropalkonium Chloride), 베헨트리모늄 클로라이드(Behentrimonium Chloride), 카프릴릴알코늄 클로라이드(Caprylylalkonium Chloride), 세틸베라네이트 클로라이드(Cetyl Berainate Chloride), 디세틸다이모늄 클로라이드(Dicetyldimonium Chloride) 및 헥사디메트린 클로라이드(Hexandimethrine Chloride)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있다.
이어, 온도를 유지하면서 지용성 용매로 추출한 황금누에고치 추출물을 다시 첨가하여 에멀젼 조성물을 제조한다. 본 발명 에멀젼 제조방법에 있어서, 두 종류의 황금누에고치 추출물을 나누어 첨가하는 경우에 더욱 우수한 활성을 나타내었다. 상기 황금누에고치 지용성용매 추출물은 황금누에고치를 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름 및 헥산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 추출한 추출물이다.
상기 에멀젼 조성물을 제조함에 있어서, 상기 각 구성성분의 비율을 벗어나는 경우에는 에멀젼의 경시안정성이 낮아지고, 화장품 내에서의 활성도 낮게 나타남을 확인할 수 있었다. 또한 상기 에멀젼 조성물에는 0.5~1 중량%의 방부보존제가 추가로 포함될 수 있다.
이 후 고압 호모게나이져를 이용하여 황금누에고치 추출물을 함유한 서브마이크론 에멀젼을 제조한다.
이와 같이 제조된 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼은 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 1 ~ 50 중량% 함유될 수 있다. 상기 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼을 포함하는 상기 화장료 조성물은 자유라디칼을 소거하고, MMP-1 생성 억제 및 자외선 조사에 의한 MMP-1의 생성을 억제하고, 콜라겐 합성을 증진하고, 멜라닌 생합성을 억제하며, 자외선 조사에 의한 세포독성을 완화하고, 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 우수하였다.
상기 화장료조성물은 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제의 다양한 제형으로 적용될 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니며, 본 발명의 기술적 내용을 벗어나지 않는 범위 내에서 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
제조예 1: 황금누에고치 수용성용매 추출물의 제조
황금누에(골든실크잠)가 튼 고치를 분쇄한 뒤 분쇄한 조분쇄 분말 200g에 물과 에탄올의 비율을 7:3으로 조정한 70% 에탄올 1000㎖를 가하여 110℃, 6시간동안 고온고압 추출조건에서 추출하였다. 이를 여과하고 여액을 진공 농축하여 건조 추출물을 얻었으며, 추출 수율은 55.6g/1000g이었다.
제조예 2: 황금누에고치 지용성용매 추출물의 제조
추출용매로서 1,3-부틸렌글리콜을 사용하여 상기 제조예 1과 같은 방법으로 황금누에고치 지용성용매 추출물을 제조하였다.
실시예 1: 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼의 제조
하기 표 1의 조성에 따라 글리세린 20g, 정제수 36.2g, 황금누에고치 수용성용매 추출물(제조예 1) 17g을 60~65℃로 가온하여 혼합한 후에 폴리글리세릴-10 미리스테이트(Polyglyceryl-10 myristate) 5g을 넣고 20분간 아지믹서로 교반하였다. 양이온 개질제(Hexadimethrine Chloride) 5g을 넣고 5분간 교반한 후, 황금누에고치 지용성용매 추출물(제조예 2) 16g을 넣고 10분간 교반한 다음에 방부보존제 0.8 g을 넣고 혼합하였다. 고압 호모게나이저(Microfluidizer M-110F, Microfluidizer, Germany)를 이용하여 1,000bar에서 3회 통과시켜 약 105 nm크기의 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼을 제조하였다.
실시예 2 : 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼의 제조
하기 표 1의 조성에 따라 상기 실시예 1의 제조방법으로 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼을 제조하였다.
비교예 1~2 : 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼의 제조
하기의 표 1의 조성에 따라 에멀젼을 제조하였다. 상기 실시예 1에서 글리세린과 유화제의 양을 조절한 점을 제외하고는 동일하게 제조하였다.
비교예 3: 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼의 제조
하기의 표 1의 조성에 따라 에멀젼을 제조하였다. 상기 실시예 1에서 정제수와 양이온 개질제의 양을 조절한 점을 제외하고는 동일하게 제조하였다.
비교예 4: 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼의 제조
하기의 표 1의 조성에 따라 에멀젼을 제조하였다. 상기 실시예 1에서 정제수와 양이온 개질제의 양을 조절한 점을 제외하고는 동일하게 제조하였다.
단위(중량%) 실시예 비교예
1 2 1 2 3 4
글리세린 20 20 15 22 20 20
정제수 36.2 34.2 36.2 36.2 38.2 41.2
황금누에고치
물, 에탄올 혼합 추출물
(제조예 1)		 17 18 17 17 17 17
유화제
(Polyglyceryl-10 myristate)		 5 6 10 3 5 5
양이온 개질제
(Hexadimethrine Chloride)		 5 4 5 5 3 0
황금누에고치
1,3-부틸렌글리콜 추출물
(제조예 2)		 16 17 16 16 16 16
방부보존제 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
합계 100 100 100 100 100 100
시험예 1: 안정성시험
에멀젼의 경시변화
상기 실시예 1, 2 및 비교예 1~4에서 제조된 서브마이크론 에멀젼에 대하여 고온(45℃), 저온(4℃), 상온(25℃), 사이클링 챔버(4~45℃), 일광 조건에서의 경시변화를 확인하였다. 그 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.
조건 실시예 1 실시예 2 비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4
1주 고온 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎
저온 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎
챔버 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎
일광 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎
상온 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎
2주 고온 ◎ ◎ ▲ ◎ ◎ ◎
저온 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎
챔버 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎
일광 ◎ ◎ ● ▲ ◎ ◎
상온 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎
3주 고온 ◎ ◎ ● ● ● ●
저온 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ◎
챔버 ◎ ◎ ● ● ◎ ◎
일광 ◎ ◎ ▲ ▲ ▲ ▲
상온 ◎ ◎ ◎ ◎ ◎ ▲
4주 고온 ◎ ◎ ● ● ● ●
저온 ◎ ◎ ◎ ▲ ◎ ▲
챔버 ◎ ◎ ▲ ● ● ●
일광 ◎ ◎ ▲ ▲ ▲ ▲
상온 ◎ ◎ ● ● ◎ ●
(범례 ◎ 안정 ▲ 변색 및 변취 ● 층분리)
상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 에멀젼화 방법으로 제조되어진 실시예 1, 2의 서브마이크론 에멀젼은 안정성이 우수함을 알 수 있다.
제타전위측정을 통한 황금누에고치 추출물 서브마이크론 에멀젼의 안정성 확인
제타전위(Zeta Potential)를 측정하여 황금누에고치 추출물 서브 마이크론 에멀젼의 안정성을 확인하였다. 제타전위는 입자 사이의 반발력이나 인력의 크기에 대한 단위로, 제타전위측정은 분산 메커니즘을 이해하고 정전기 분산을 제어하는데 중요한 요소로서, 제타전위 값이 +30mV이상 또는 -30 mV이하가 안정한 값이다. 상기 실시예 1과 비교예 4의 황금누에고치 추출물 서브마이크론 에멀젼을 증류수에 희석하여 입도분석기로 제타전위를 측정하였다. 그 결과 각각 -40.6mV와 +22.3mV의 값을 얻음으로써 에멀젼의 안정성을 확인하였다. 또한 도 1에서 확인되는 바와 같이 본 발명은 양이온 개질제의 첨가에 의하여 서브마이크론 에멀젼의 표면이 양전하로 개질되었음을 알 수 있다.
서브마이크론 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 생리활성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 시험을 하였다.
시험예 2 : 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 NBT 법을 이용한 항산화효과 측정
서브마이크론 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C와 BHT(Butylated Hydroxytoluene) 및 상기 제조예 1에서 제조된 황금누에고치 추출물을 비교군으로 하여, NBT법으로 항산화 효과를(활성 산소 소거율) 측정하였다.
항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성 산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검 물질(에멀젼화된 황금누에고치 추출물, 비타민 C, BHT, 황금누에고치 추출물)이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거율(%)을 평가한다. 활성 산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560 nm에서 측정하는 것으로 활성 산소 소거율(%)을 측정한다.
구체적인 측정방법은 다음과 같다.
1. 0.05M Na2CO3 ------------------------------------ 2.4ml
2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml
3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml
4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml
5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml
6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml
7. 6mM CuCl2 용액----------------------------------- 0.1ml
① 바이알병에 1, 2, 3, 4, 5를 가하고 여기에 시료 용액 0.1ml를 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.
② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.
③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.
④ 시료 용액의 블랭크(Blank)는 상기 6 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 So를 측정한다.
⑤ 공시험은 상기 시료 용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.
⑥ 공시험의 블랭크(Blank)는 상기 시료 용액 및 6 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.
활성 산소 소거율(%)은 하기 식에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 3과 같다.
활성 산소 소거율(%) =〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕× 100
St : 시료 용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도
Bt : 공시험 용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도
So : 시료 용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도
Bo : 공시험 용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도
시료명 처리 농도(%, w/v) 항산화효과(%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1) 		0.01 92.0
일반 황금누에고치 추출물(제조예 1) 0.01 85.4
Vit C 0.01 85.1
BHT 0.01 90.2
상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 0.01% 농도에서 시험한 시료 모두에서 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었다. 그 중에서도 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 0.01% 농도에서 일반 황금누에고치 추출물, 비타민 C, BHT와 비교하여 더 우수한 항산화 효과를 가지고 있음이 확인되었다.
시험예 3: 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 DPPH 법을 이용한 항산화 효과 측정
에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해, 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C와 일반 황금누에고치 추출물을 비교군으로 하여 DPPH법을 이용하여 항산화 효과(자유라디칼 소거율)를 측정하였다.
DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl) 자유라디칼이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 효과를 측정한다. 피검 물질(에멀젼화된 황금누에고치 추출물, 비타민 C, 일반 황금누에고치 추출물)에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율(%)을 측정한다.
사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl 자유라디칼(Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1 mM 용액으로서 61.88 mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.
구체적인 측정방법은 다음과 같다.
① 96-웰 플레이트에 0.1 mM DPPH 용액 0.15 ml에 시료용액을 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.
② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.
③ 시료 용액의 블랭크(Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 So를 측정한다.
④ 공시험은 상기 시료용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.
⑤ 공시험의 블랭크(Blank)는 상기 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 사용하고 상기 시료용액 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 흡광도 St를 측정하는 때와 동일하게 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.
자유라디칼 소거율(%)의 결과는 하기 식에 의하여 산출하였으며, 결과는 하기의 표 4와 같다.
자유라디칼 소거율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕× 100
St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도
Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도
So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도
Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도
시료명 처리 농도(%, w/v) 항산화 효과(%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1) 		0.01 95.4
황금누에고치 추출물(제조예 1) 0.01 94.2
vit-C 0.01 91.8
상기 표 4에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 0.01% 농도에서 일반 황금누에고치 추출물과 항산화 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 비타민 C의 항산화 효과보다 더욱 우수한 항산화 효과를 가지고 있음이 확인되었다.
시험예 4: 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 세포재생 효과
24 웰 플레이트에 HaCaT 케라티노사이트(German Cancer Research Institute, Germany)를 2×105 cells/well의 밀도로 10% FBS가 첨가된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium, Gibco)으로 접종하여 가습화 된 37℃, 5% CO2 배양기에서 1일 배양하였다. 무혈청(Serum-free) DMEM으로 교환 후 에멀젼화된 황금누에고치 추출물들의 시료를 1.0%(v/v) 되게 처리하여 3일 배양하였다. 배양 후 세포생성 효과를 보기 위해 MTT assay법을 이용하여 세포의 생성 정도를 비교 평가하였으며, 양성 대조군으로 TGF-β(10ng/mL)을 적용하였으며 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
구분 Abs . at 570 nm
황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼(실시예 1) 1.117
황금누에고치 추출물(제조예 1) 1.103
양성 대조군 TGF-β(10ng/ml) 1.423
대조군 0.921
일반적으로 피부 세포 재생은 세포 활성율로 측정하는데 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 세포 재생 효과가 있음을 확인하였다. 또한 세포재생 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10ng/ml) 와의 농도차이를 감안해도 세포재생 효과가 유사한 본 실험결과를 통해 본 발명의 에멀젼화 황금누에고치 추출물은 세포재생효과가 우수함을 확인하였다.
시험예 5: 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 MMP -1 생성 억제 효과
에멀젼화된 황금누에고치 추출물이 콜라겐 분해효소인 MMP-1 생성을 억제하는 효과가 있는지의 여부를 측정하기 위해, MMP-1의 생성을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10ng/ml, Roche, 미합중국)를 비교군으로 하여 MMP-1의 생성을 억제하는 효과를 측정하였다.
인간 정상 피부 세포인 섬유아세포(한국 세포주은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)에 각 웰당 1×106 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 실시예 1의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 최종 농도 100 ㎍/㎖로 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 에멀젼화된 황금누에고치 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다.
배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기식에 따라 MMP-1 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.
MMP-1 생성억제율(%)=[1-실험군의 MMP-1의 양/대조군의 MMP-1의 양]×100
시험 물질 MMP-1 생성 억제율(%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1) 		75.1
황금누에고치 추출물(제조예 1) 71.4
양성대조군(TGF-β10ng/ml) 70.1
상기 표 6의 결과에서 나타나는 바와 같이, 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 100㎍/㎖ 농도에서 MMP-1 생성 억제율을 측정했을 때 75.1%의 억제율을 나타냈다. MMP-1 생성 억제효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(10ng/ml)와 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 실험 농도(100㎍/㎖) 차이를 감안해도, 상기와 같은 정도의 MMP-1 억제율을 나타낸 것은 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 MMP-1 생성억제효과가 우수하다는 것을 보여준다.
시험예 6: 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 자외선 유도에 의한 MMP -1 생성억제효과
일반적으로 MMP-1은 자외선에 의해 그 양이 증가되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물이 자외선에 의해 생성이 증가되는 MMP-1의 양을 억제하는지를 알아보고자 실험을 실시하였다. 자외선 유도에 의한 MMP-1 생성억제효과 측정은 시료 처리에 앞서 UVB를 일정량 처리하는 것을 제외하고는 시험예 5와 동일하게 실시하였다.
에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 MMP-1 생성억제율(%)은 상기 시험예 5의 식에 따라 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10ng/ml, Roche, 미합중국)을 비교군으로 사용하였고, 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 0.01%(w/v) 농도로 실험을 실시하였다.
시험 물질 MMP-1 생성 억제율(%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1) 		70.1
황금누에고치 추출물(제조예 1) 69.8
TGF-β 65.2
배양된 섬유아세포에 UVB 조사 후 에멀젼화된 황금누에고치 추출물 및 TGF-β배양액을 첨가한 배양액에 분비된 콜라겐 분해효소 MMP-1의 양을 측정한 결과를 상기 표 7에 나타내었다. 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 100㎍/㎖ 농도에서 MMP-1 생성 억제율을 측정했을 때 70.1%의 억제율을 나타냈다. MMP-1 생성 억제효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(10ng/ml)와 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 농도(0.01%(w/v)) 차이를 감안해도, 여러 종류의 물질이 혼합된 추출물 수준에서 상기와 같은 정도의 MMP-1 억제율을 나타낸 것은 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 MMP-1 생성 억제 효과가 우수하다는 것을 보여준다.
시험예 7: 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 콜라겐 합성 증진 효과
인간 정상 상피 세포인 섬유아세포를 48-웰 마이크로 플레이트에 각 웰당 1×106 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 최종농도 100 ㎍/㎖로 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 에멀젼화된 황금누에고치 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 콜라겐 키트(Takara, 일본)를 이용하여 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드(PICP) 양을 측정하여 ng/㎖ 환산하였으며, 이에 의해 합성된 콜라겐 양을 측정하였다.
본 실험의 비교군으로는 콜라겐 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10ng/ml, Roche, 미합중국)를 비교군으로 사용하였고, 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 0.01%(w/v) 농도로 실험을 실시하였다. 콜라겐 생합성 증가율(%)은 하기 식에 따라 계산하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다.
콜라겐 생합성 증가율(%)=(실험군의 콜라겐양/대조군의 콜라겐양-1)×100
시험 물질 콜라겐 생합성 증가율(%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1) 		89.5
황금누에고치 추출물(제조예 1) 88.9
TGF-β 89.6
표 8은 섬유아세포를 이용하여 에멀젼화된 황금누에고치 추출물 및 TGF-β를 첨가한 배양액의 콜라겐 합성 증진 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 0.01% 농도에서 콜라겐 생합성율을 측정했을 때, 89.5%의 생합성율을 나타내는 것을 알 수 있다. 콜라겐 합성 증진 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β의 농도(10ng/ml)와 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 농도(0.01%(w/v)) 차이를 감안해도, 여러 종류의 물질이 혼합된 추출물 수준에서 상기와 같은 정도의 콜라겐 생합성율을 나타낸 것은 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 콜라겐 합성 증진 효과가 우수하다는 것을 보여준다.
시험예 8: 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 B16F10 멜라닌형성세포에 대한 멜라닌생성 억제효과
에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 미백 효과를 확인하기 위해 B16F10 멜라닌 형성 세포에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단하였다. 실험에 사용된 B16F10 멜라닌 형성 세포는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다.
이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실험예에 사용된 B16F10 멜라닌 형성 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다.
B16F10 멜라닌 형성 세포의 멜라닌 생합성 억제 효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F10 멜라닌 형성 세포를 6웰 플레이트에 각 웰당 2×106 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 실시예 1에 따른 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라닌형성세포의 멜라닌생성 저해율(%)은 하기 식에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 표 9에 기재하였다. 이때 멜라닌 생성 저해 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 하이드로퀴논과 알부틴을 비교군으로 사용하였다.
멜라닌 생성저해율(%) = [(A-B)/A] × 100
A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양
B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양
시료명 처리농도
(%, w/v)		 멜라닌 생성저해율(%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1) 		0.1 0.1
황금누에고치 추출물(제조예 1) 0.1 0.04
하이드로퀴논 0.1 0.08
알부틴 0.1 0.03
상기 표 9의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 B16F10 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성을 크게 저해하는 것을 알 수 있다. 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 0.1% 농도에서 멜라닌 생성 저해율 값이 0.1%로 나타났으며, 동일한 농도에서 기존의 미백 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 알부틴 및 하이드로퀴논과 비교했을 때, 하이드로퀴논과 알부틴보다는 우수한 멜라닌 생성 저해효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 특히 멜라닌 생성 억제에 매우 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.
시험예 9: 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성 완화효과
에멀젼화된 황금누에고치 추출물의, 자외선 조사에 의한 세포 독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다.
섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5×104 개씩 넣고 24 시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 1000 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포 배양 배지(DMEM에 10 % FBS가 첨가된 것) 1 ㎖을 첨가하였다. 여기에 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24 시간이 지난 후 배지를 제거하고, 각 웰당 세포배양배지 500㎕와 MTT 용액(2.5 ㎎/㎖) 60 ㎕를 넣은 후 2 시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5 분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 ㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565 nm 흡광도를 측정하였다. 이때 양성 대조군으로 TGF-β를 사용하였다.
하기 식에 의해 세포 생존율(%)을 측정하고 자외선 조사에 의한 세포 독성 완화율(%)을 계산하였으며 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
세포 생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕× 100
Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도
자외선 조사에 의한 세포 독성 완화율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕× 100
Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율
Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율
St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율
시료명 처리 농도(%, w/v) 세포 독성 완화율(%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1)		 0.0125 69
0.025 77
0.050 90
황금누에고치 추출물(제조예 1) 0.0125 59
0.025 64
0.050 73
TGF-β 10 ng/m 85
상기 표 10에 나타나는 바와 같이, 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 0.0125% 농도에서 자외선에 의한 세포 독성 완화율은 69%, 0.025% 농도에서 77%, 0.050% 농도에서 90%를 나타내어 농도 의존적으로 세포 독성 완화율이 증가되는 양상을 보여, 자외선에 의한 세포 독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 상기 실험결과를 통해 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 자외선 조사에 의한 세포손상을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.
시험예 10: 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현억제효과
에멀젼화된 황금누에고치 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 평가하기 위한 것으로서, 사람의 표피 조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5×104개씩 넣고 24 시간 동안 부착시켰다.
각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다.
여기에 평가하고자 하는 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 에멀젼화된 황금누에고치 추출물의, 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, 양성대조군으로 IL-1α억제물질로 알려진 케토프로펜(Ketoprofen)을 사용하였다. 염증성 사이토카인(IL-1α)의 발현 억제율(%)은 하기식에 의해 계산하였으며 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕× 100
Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량
Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량
St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량
시료명 처리 농도(%, w/v) 염증성 사이토카인
발현 억제율(%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1) 		0.0125 43
0.025 52
0.050 69
황금누에고치 추출물(제조예 1) 0.0125 44
0.025 52
0.050 68
Ketoprofen 100 μg/mL 48
표 11에 나타나는 바와 같이 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.0125% 농도에서 43% 억제하고, 0.025%의 농도로 처리했을 때는 IL-1α의 생성을 52% 억제하고, 0.050%의 농도로 처리 했을 때는 IL-1α의 생성을 69% 억제하는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물은 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있다.
상기 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 유효성분으로 함유하는 다양한 제형의 화장료를 제조하였다.
제형 실시예 1: 유연화장수
하기 표 12의 조성에 따라 통상의 방법으로 유연화장수를 제조하였다.
성분 제형 실시예 1 비교 제형예1 비교 제형예2
함량(중량%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1) 		3.0 - -
히아루론산 - 3.0 -
정제수 - - 3.0
글리세린 5.1 5.1 5.1
프로필렌글리콜 4.2 4.2 4.2
토코페릴아세테이트 3.0 3.0 3.0
유동파라핀 4.6 4.6 4.6
트리에탄올아민 1.0 1.0 1.0
스쿠알란 3.1 3.1 3.1
마카다미아너트오일 2.5 2.5 2.5
폴리솔베이트60 1.6 1.6 1.6
솔비탄세스퀴롤레이트 1.6 1.6 1.6
프로필파라벤 0.6 0.6 0.6
카르복실비닐폴리머 1.5 1.5 1.5
향 미량 미량 미량
방부제 미량 미량 미량
정제수 잔량 잔량 잔량
계 100 100 100
제형 실시예 2: 수렴화장수
하기 표 13과 같은 조성으로 통상의 방법에 따라 수렴화장수를 제조하였다.
성 분 함량(중량%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1) 		1.5
글리세린 2.0
1, 3-부틸렌글리콜 2.0
알란토인 0.2
DL-판테놀 0.2
이.디.티.에이-2NA 0.02
벤조페논-9 0.04
소듐 히아루로네이트 3.0
에탄올 15.0
폴리솔베이트 20 0.3
위치하젤 추출물 2.0
구연산 미량
방부제, 향, 색소 미량
정제수 잔량
합 계 100
제형 실시예 3: 영양화장수
하기 표 14의 조성으로 통상의 방법에 따라 영양화장수를 제조하였다.
성분 함량(중량%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1)		 1.5
스테아릴 알콜 1.5
라놀린 1.5
폴리솔베이트 60 1.3
솔비탄스테아레이트 0.5
경화식물유 1.0
광물유 5.0
스쿠알란 3.0
트리옥타노인 2.0
디메치콘 0.8
초산토코페롤 0.5
카르복시비닐폴리머 0.12
글리세린 5.0
1, 3-부틸렌글리콜 3.0
소듐히아루로네이트 5.0
트리 에탄올아민 0.12
방부제, 향, 색소 미량
정제수 잔량
합계 100
제형 실시예 4: 영양크림
하기 표 15의 조성에 따라 통상의 방법으로 영양크림을 제조하였다.
성 분 제형 실시예 4 비교 제형예3 비교 제형예 4
함량(중량%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1)		 3.0 - -
아데노신 - - 3.0
친유형 모노스테아린산글리세린 2.0 2.0 2.0
세테아릴알콜 2.2 2.2 2.2
스테아린산 1.5 1.5 1.5
밀납 1.0 1.0 1.0
폴리솔베이트 60 1.5 1.5 1.5
솔비탄스테아레이트 0.6 0.6 0.6
경화식물유 1.0 1.0 1.0
스쿠알란 3.0 3.0 3.0
광물유 5.0 5.0 5.0
트리옥타노인 5.0 5.0 5.0
디메치콘 1.0 1.0 1.0
소듐마그네슘실리케이트 0.1 0.1 0.1
글리세린 5.0 5.0 5.0
베타인 3.0 3.0 3.0
트리에탄올아민 1.0 1.0 1.0
소듐히아루로네이트 4.0 4.0 4.0
방부제, 향, 색소 미량 미량 미량
정제수 잔량 잔량 잔량
합계 100 100 100
제형 실시예 5: 마사지 크림
하기 표 16의 조성에 따라 통상의 방법으로 마사지 크림을 제조하였다.
성분 함량(중량%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1)		 3.0
친유형 모노스케아린산 글리세린 1.5
스테아릴알콜 1.5
스테아린산 1.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄스테아레이트 0.6
이소스테아릴이소스테레이트 5.0
스쿠알란 5.0
광물유 5.0
디메치콘 0.5
히드록시에칠셀룰로오스 0.12
글리세린 6.0
트리에탄올아민 0.7
방부제, 향, 색소 미량
정제수 잔량
합 계 100
제형 실시예 6: 에센스
하기 표 17의 조성에 따라 통상의 방법으로 에센스를 제조하였다.
성분 함량(중량%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1)		 5.0
글리세린 10.0
베타인 5.0
피이지 1500 2.0
알란토인 0.1
DL-판테놀 0.3
이.디.티.에이-2Na 0.02
벤조페논 - 9 0.04
히드록시에칠 셀룰로오스 0.1
소듐히아루로네이트 8.0
카르복시비닐폴리머 0.2
트리에탄올아민 0.18
옥틸도데칸올 0.3
옥틸도데세스 -16 0.4
에탄올 6.0
방부제, 향, 색소 미량
정제수 잔량
합계 100
제형 실시예 7: 팩
하기 표 18의 조성에 따라 통상의 방법으로 팩을 제조하였다.
성 분 함량(중량%)
황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼(실시예 1)		 3.0
폴리비닐알콜 15.0
셀룰로오스 검 0.15
글리세린 3.0
피이지1500 2.0
사이크로덱스트린 0.15
DL - 판테놀 0.4
알란토인 0.1
글리시리진산모노암모늄 0.3
니코틴아미드 0.5
에탄올 6.0
피이지 40 경화피마자유 0.3
향, 색소, 방부제 미량
정제수 잔량
합계 100
시험예 11: 피부주름개선 효과 시험
본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유하는 화장료의 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 상기 표 15에 제시한 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유하는 영양크림(제형 실시예 4), 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 정제수로 대체한 크림(비교 제형예 3), 에멀젼화된 황금누에고치 추출물 대신 주름개선효과가 있는 것으로 알려진 물질인 아데노신을 함유하는 크림(비교 제형예 4)을 사용하였다. 60명의 여성을 대상으로 얼굴 양쪽면을 사용하여 6주 후의 주름 개선 효과를 육안으로 평가하여 주름 개선 정도를 확인하였다. 이 평가를 토대한 주름 개선 효과 결과는 하기의 표 19에 나타내었다.
주름개선효과 유효율(%)
우수 약간 없음
제형 실시예 4
(에멀젼화된 황금누에고치 추출물함유)		 18 1 1 52
비교 제형예 3(정제수) 0 1 19 3
비교 제형예 4(아데노신) 15 4 1 45
상기 표 19의 결과에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유한 제형 실시예 4의 영양크림은 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유하지 않은 비교 제형예 3의 크림에 비하여 높은 주름개선 효과를 보여주었으며, 에멀젼화된 황금누에고치 추출물 대신 아데노신을 함유하는 비교 제형예 4의 크림과 유사한 우수한 피부 주름개선 효과를 나타내었다. 또한 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유하는 화장료를 피부에 도포한 대부분의 피검자들에게서 피부 자극을 관찰할 수 없었다.
시험예 12: 피부 탄력 개선효과
본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유하는 화장료의 피부 탄력 개선효과에 대한 임상실험을 실시하였다. 임상시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.
상기 표 15에 제시한 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유하는 영양크림(제형 실시예 4), 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 정제수로 대체한 크림(비교 제형예 3), 에멀젼화된 황금누에고치 추출물 대신 주름개선효과가 있는 것으로 알려진 물질인 아데노신을 함유하는 크림(비교 제형예 4)을 사용하여, 사람을 대상으로 화장료의 사용으로 인한 피부 탄력 개선효과를 확인 및 비교 평가하였다. 실험자(30세 - 45세의 여성) 20명을 대상으로, 실험군을 두 부류로 나누어, 한 군은 얼굴 오른쪽 부위에는 제형 실시예 4의 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교 제형예 3, 다른 한 군은 비교 제형예 4의 크림을 각각 1일 2회씩 연속 8주간 도포하였다.
실험 완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2 개월간 사용 후의 피부 탄력을 각각 피부 탄력 측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하고, 실험결과를 하기 표 20에 Cutometer SEM 575의 △R8값으로 나타내었다. 이러한 △R8값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.
실험군 피부탄력효과(△R8)
제형 실시예 4
(황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼 함유)		 0.24
비교 제형예 3(정제수) 0.09
비교 제형예 4(아데노신) 0.20
상기 표 20에 나타난 바와 같이, 유효성분으로 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유한 제형 실시예 4의 크림은 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유하지 않는 비교 제형예 3의 크림에 비해 약 2.9배 이상 우수한 피부 탄력 개선 효과를 나타내었고, 아데노신을 함유하는 비교 제형예 4의 화장료 조성물과 비교하여 약 1.2배 정도 피부 탄력 개선 효과를 나타내어 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유하는 화장료 조성물이 우수한 피부 탄력 개선 효과가 있음을 알 수 있다.
시험예 13: 피부 보습력 개선효과
기기평가
본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유하는 화장료의 피부 보습력 개선효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 피부 질환이 없는 20-40대 60명을 대상으로 1조 당 20명 씩 3개조로 나누고, 각 조별로 상기 표 12의 조성으로 제조된 제형 실시예 1(황금누에고치 추출물 서브마이크론 에멀젼 함유 유연 화장료), 비교 제형예 1(에멀젼화된 황금누에고치 추출물 대신에 정제수를 포함하는 화장료), 비교 제형예 2(에멀젼화된 황금누에고치 추출물 대신에 보습효과가 있는 것으로 알려진 히아루론산을 함유하는 화장료)의 유연화장수를, 매일 2회씩 1개월간 얼굴 및 전박부에 도포하게 하였다.
미리 도포 시작 전 항온, 항습 조건(24도, 습도 40%)에서 corneometer(CM820 courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 전도도를 측정하여 기본 값을 삼고, 1주, 2주, 4주 경과 후의 피부 전도도를 측정하여 그 증가율을 평가하였다. 그 결과를 하기 표 21에 나타내었다.
시료 1 주 후 2 주 후 4 주 후
제형 실시예 1
(황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼 함유) 		58 63 60
비교 제형예 1
(정제수) 		11 13 12
비교 제형예 2
(히아루론산)		 60 58 56
상기 표 21의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼을 함유하는 화장료인 제형 실시예 1의 경우 비교 제형예 1에 비하여 피부 전도도 증가율이 매우 우수하였다. 또한 보습효과가 있는 것으로 알려진 히아루론산을 함유하는 화장료인 비교 제형예 2와 비교하여 높은 피부 전도도 증가율을 나타내었다.
일반적으로 피부 전도도는 피부 수분량에 비례하므로, 상기의 결과로부터 본 발명에 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼을 함유하는 화장료는 정제수를 함유하는 화장료에 비해 피부 수분 함량도 높게 유지한다는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼을 함유하는 화장료는 피부 보습력 개선 효과가 탁월하다.
임상평가
임상 보습 효과를 다음과 같이 측정하였다. 설문 조사를 통하여 피부가 건조하다고 느끼는 건강한 성인 남녀 20명을 선정한 후 상박을 10개 사이트로 나눈 후 각 시료를 1일 2회씩 4주간 도포하게 하였다. 보습 효과는 실사용 시험 시작 후부터 매 2주간, 그리고 종료 후의 개선 효과를 Corneometer CM 820(Corage +Khazaka, Germany)를 이용하여 평가하였다. 상기 실험 결과는 하기 표 22에 나타내었다.
구분 TEWL(g/h/m2)
초기값 사용 2주 후 사용 4주 후
제형 실시예 1
(황금누에고치 추출물의
서브마이크론 에멀젼 함유)		 32.1 47.6 57.8
비교 제형예 1(정제수) 32.6 33.6 34.6
비교 제형예 2(히아루론산) 32.3 48.0 57.0
상기 표 22에 나타난 바와 같이, 상기 표의 기기 측정에 의한 피부 보습력 개선 효과 평가 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼함유 화장료(제형 실시예 1)는 황금누에고치 추출물의 서브마이크론 에멀젼을 함유하지 않는 화장료(비교 제형예 1)에 비하여 피부 보습력 개선 효과가 매우 우수하였다. 또한, 보습효과가 있는 것으로 알려진 히아루론산을 함유하는 화장료(비교 제형예 2)와 비교했을 때에도 유사하게 우수한 보습력 개선효과가 있는 것으로 측정되었다. 또한, 사용 2주 후 및 사용 4주 후 보습력 개선 효과를 측정한 결과도 마찬가지로, 본 발명의 에멀젼화된 황금누에고치 추출물을 함유하는 화장료는 피부 보습력 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (12)

  1. (A) 가온한 글리세린(glycerin) 18~21 중량%에 정제수 34~40 중량%와 황금누에고치 수용성용매 추출물 16~20 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;
    (B) 유화제 4~6 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;
    (C) 탈로트리모늄 클로라이드(Tallowtrimonium Chloride), 세트리모늄 클로라이드(Cetrimonium Chloride), 아몬드아미도프로말코늄 클로라이드(Almondamidopropalkonium Chloride), 바바수아미도프로팔코늄 클로라이드(Babassuamidopropalkonium Chloride), 베헨트리모늄 클로라이드(Behentrimonium Chloride), 카프릴릴알코늄 클로라이드(Caprylylalkonium Chloride), 세틸베라네이트 클로라이드(Cetyl Berainate Chloride), 디세틸다이모늄 클로라이드(Dicetyldimonium Chloride) 및 헥사디메트린 클로라이드(Hexandimethrine Chloride)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 양이온 개질제 4~5 중량%를 혼합하면서 용해시키는 단계;
    (D) 황금누에고치 지용성용매 추출물 15~18 중량%를 첨가하여 에멀젼조성물을 제조하는 단계; 및
    (E) 고압 호모게나이저(Microfluidizer)를 사용하여 100~130 nm의 크기를 가지는 서브마이크론 에멀젼을 형성하는 단계를 포함하는 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 황금누에고치 수용성용매 추출물은 황금누에고치를 물 또는 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올 용매를 사용하여 추출한 추출물인 것임을 특징으로 하는 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 유화제는 이눌린(Inulin), 이눌린 라우릴 카바메이트(Inulin Lauryl Carbamate), 글리세릴 씨트레이트/락테이트/리놀리에이트/올레이트(Glyceryl citrate/Lactate/Linoleate/Oleate), 폴리글리세릴-10 미리스테이트(Polyglyceryl-10 Myristate), 폴리소르베이트(Polysorbate), 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 포스포리피드, 하이드로제네이티드 라이소포스파티딜콜린, 하이드로제네이티드 라이소레시틴, 하이드로옥실레이티드 레시틴 및 불포화 레시틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 것임을 특징으로 하는 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 황금누에고치 지용성용매 추출물은 황금누에고치를 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름 및 헥산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 추출한 추출물인 것임을 특징으로 하는 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 에멀젼 조성물에는 0.5~1 중량%의 방부보존제가 추가로 포함되는 것임을 특징으로 하는 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼의 제조방법.
  7. 제 1항 내지 제 3항 및 제 5항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 의하여 제조되는 황금누에고치 추출물 함유 서브마이크론 에멀젼을 화장료 조성물의 전체 중량에 대하여 1 ~ 50 중량% 함유하는 화장료 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 화장료조성물은 그 제형이 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 피부 점착타입의 화장료, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 샴푸, 린스, 바디크렌저, 비누, 치약, 구강청정제, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제인 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 주름 개선 및 피부탄력 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  12. 제 7항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 미백용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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