KR101596635B1

KR101596635B1 - Igfbp2를 유효성분으로 함유하는 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101596635B1
Application number: KR1020150069723A
Authority: KR
Inventors: 김재찬; 박수현; 김경우
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2015-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2016-02-23

Abstract

본 발명은 IGFBP2(insulin-like growth factor binding protein 2)를 유효성분으로 함유하는 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 IGFBP2는 안구 섬유화를 유도하는 α-SMA의 발현을 감소시키고, 각막 투명성을 유지시키는 케라토칸(keratocan), 루미칸(lumican) 및 ALDH1A1의 발현을 증가시켜 섬유화를 억제하는 것을 확인함에 따라, 본 발명에 따른 IGFBP2를 유효성분으로 함유하는 조성물을 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물로 사용할 수 있다.

Description

IGFBP2를 유효성분으로 함유하는 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical compostion for preventing or treating pterygium comprising insulin-like growth factor binding protein 2}

본 발명은 IGFBP2를 유효성분으로 함유하여 안구의 군날개 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 약학조성물에 관한 것이다.

군날개 질환은 결막이 퇴행하여 생기는 안질환으로, 익상편으로도 알려져 있다. 이러한 군날개 질환은 각막 위 결막세포의 침범에 의해 날개모양으로 형성되는 안구 표면 병변으로, 눈의 안쪽 결막부터 시작되어 혈관이 풍부한 섬유조직이 결막 및 각막의 경계부위를 넘어서는 질환이다.

군날개의 원인은 아직 정확히 밝혀지지 않았으나, 유전적인 요인 및 환경적인 요인이 영향을 끼치는 것으로 알려져 있으며, 특히, 야외 활동량이 많거나, 만성적인 자외선 노출, 건조한 공기 및 먼지 등이 발병의 원인으로 알려져 있다.

군날개는 대게 증상이 없지만 충혈이나 시력변화, 자극감이 때때로 나타나기도 하는데, 군날개의 초기단계에는 약물 치료를 하지만, 중증의 경우에는 제거술과 자가 결막이식술 등의 외과적 수술을 시행하고 있다. 그러나, 군날개 질환의 경우 높은 재발률(10-45%)과 합병증이 문제가 되고 있으며, 광범위한 군날개에 대한 수술이나 재수술의 경우에는 전술한 외과적 수술 적용이 어려운 한계가 있다.

따라서, 군날개 질환을 효과적으로 치료하고 재발을 억제할 수 있는 치료 방법의 연구가 필요한 실정이다.

미국공개특허 2012-0035067(2012.02.09)

본 발명은 IGFBP2를 유효성분으로 함유하여 각막 표면에서 근섬유세포의 과도한 증식에 의해 발병되는 군날개 질환을 효과적으로 치료하며, 재발을 억제할 수 약학조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 IGFBP2(insulin-like growth factor binding protein 2)를 유효성분으로 함유하는 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 IGFBP2는 안구 섬유화를 유도하는 α-SMA의 발현을 감소시키고, 각막 투명성을 유지시키는 케라토칸(keratocan), 루미칸(lumican) 및 ALDH1A1의 발현을 증가시키며, 상기 IGFBP2은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유될 수 있다.

본 발명에 따르면, IGFBP2는 안구 섬유화를 유도하는 α-SMA의 발현을 감소시키고, 각막 투명성을 유지시키는 케라토칸(keratocan), 루미칸(lumican) 및 ALDH1A1의 발현을 증가시켜 섬유화가 억제되는 것이 확인됨에 따라, 본 발명에 따른 IGFBP2를 유효성분으로 함유하는 조성물을 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물로 사용할 수 있다.

도 1은 정상군과 군날개 경증 및 중증도 환자군에서 α-SMA, IGFBP2 및 TGFβ의 발현 정도를 확인한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 2는 조건 배지에 IGFBP 패밀리 단백질이 분비된 수준을 확인한 결과로, 2A는 각막실질세포(keratocytes), 각막섬유아세포(corneal fibroblasts), 양막(amniotic membrane; AM) 및 양막 추출물이 배양된 각각의 조건 배지를 면역블롯 분석한 결과이며, 2B는 상용화된 사람 성장인자 항체 어레이 맵 결과이며, 2C는 각각의 조건배지에 분비된 성장 인자의 상대량을 비교한 그래프 결과이다.
도 3은 사람 중간엽줄기세포(hMSCs)에서 IGFBP2의 활성 및 α-SMA 억제 효과를 확인한 결과로, 3A는 양막 위에서 각막실질세포를 배양시켜 수집한 조건 배지(KCM)로 배양된 중간엽줄기세포의 IGFBP2 mRNA 상대적 발현량이 증가된 것을 확인한 결과이며, 도 3B는 100, 200 및 500 ng/ml IGFBP2가 처리된 중간엽줄기세포에서 IGFBP2 처리 농도에 따른 α-SMA 발현 정도를 확인한 결과이며, 도 3C는 IGFBP2를 중간엽줄기세포에 24, 48 및 72 시간 동안 처리하고 처리 시간에 따른 α-SMA 발현 정도를 확인한 결과이며, 도 3D는 100, 200 및 500 ng/ml IGFBP2가 처리된 중간엽줄기세포에서 α-SMA, IGFBP2, 케라토칸, ALDH1A1 및 루미칸의 단백질 발현 정도를 확인한 웨스턴 블롯 결과이다(***P<0.005; **P<0.01; *P<0.05).
도 4는 IGFBP2가 처리되거나, 양막 위에서 각막실질세포를 배양한 조건 배지(KCM)에서 배양된 사람 각막섬유아세포(HCF)에서 마커 단백질의 발현량을 확인한 결과로, 도 4A는 계대 배양된 횟수에 따라 각막섬유아세포(HCF)에서 α-SMA, IGFBP2, 케라토칸, ALDH1A1 및 루미칸 마커 단백질의 발현량을 확인한 결과이며, 도 4B는 500 ng/ml IGFBP2가 24, 48 및 72 시간 동안 처리된 각막섬유아세포(HCF)와 각막실질세포가 배양된 조건 배지(KCM)에서 24, 48 및 72 시간 동안 배양된 각막섬유아세포(HCF)에서 α-SMA, IGFBP2, 케라토칸, ALDH1A1 및 루미칸 마커 단백질의 발현량을 확인한 결과이며, 도 4C는 상기 마커 단백질의 발현 강도를 측정하여 단백질 발현 수준을 정량 분석한 결과이다(***P < 0.005; **P < 0.01; *P < 0.05; #, vs 각막실질세포(keratocytes); ￥ vs HCF (P8)).
도 5는 TGFβ 및 IGFBP2에 의한 근섬유아세포 및 각막실질세포 마커 단백질의 발현 변화를 확인한 결과로, 도 5A는 5, 10 및 20 ng/ml 농도의 TGFβ가 처리된 각막섬유아세포(HCF)에서 TGFβ에 의해 유도된 근섬유아세포 전분화 마커인 α-SMA의 발현 정도를 확인한 결과이며, 도 5B는 24 내지 72시간 동안 TGFβ 및 IGFBP2가 함께 처리된 각막섬유아세포(HCF)에서 α-SMA, 케라토칸 및 ALDH1A1의 발현 정도를 확인한 결과이다.
도 6은 실 모양의 α-SMA 양성 스트레스 섬유 형성 여부를 확인한 결과로, 도 6A는 TGFβ 단독처리되거나, TGFβ 및 IGFBP2가 함께 처리된 각막섬유아세포(HCF)에서 면역형광염색을 수행하여 α-SMA 발현양상을 확인한 결과이며, 도 6B는 실 모양의 α-SMA 양성 스트레스 섬유 형성 여부를 나타내는 모식도이다.

본 발명은 IGFBP2(insulin-like growth factor binding protein 2)를 유효성분으로 함유하는 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 IGFBP2는 양막 위에서 각막실질세포를 배양시켜 수집한 조건 배지(keratocyte-conditioned medium; KCM)에서 분리된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 IGFBP2는 안구 섬유화를 유도하는 α-SMA의 발현을 감소시키고, 각막 투명성을 유지시키는 케라토칸(keratocan), 루미칸(lumican) 및 ALDH1A1의 발현을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 양막 위에서 각막실질세포를 배양시켜 수집한 조건 배지(KCM)에서 사람 중간엽줄기세포(hMSCs)를 배양한 경우, 도 3A와 같이 계대배양이 진행될수록 IGFBP2의 발현이 증가되는 것이 확인되었으며, 사람 중간엽줄기세포(hMSCs)에 재조합 IGFBP2 단백질을 처리한 경우, 도 3 B 및 도 3D와 같이 섬유화를 유도하는 α-SMA의 발현이 감소된 반면, 각막 투명성을 유지시키는 케라토칸(keratocan), 루미칸(lumican) 및 ALDH1A1의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 각막섬유아세포로 분화가 유도된 각막실질세포를 KCM 배지에서 배양하거나, IGFBP2를 처리한 경우에도 도 4와 같이 α-SMA의 발현이 감소된 반면, 케라토칸(keratocan), 루미칸(lumican) 및 ALDH1A1의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 IGFBP2가 각막실질세포의 섬유아-근섬유아세포로의 분화를 억제함으로써, 각막실질세포의 특성을 유지시킬 뿐만 아니라, 분화가 진행된 세포의 상태를 회복시켜주는데도 효과적임이 확인되었다. 따라서, 이상증식 섬유화증에 의한 군날개 질환을 예방하거나 치료하는데도 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 IGFBP2은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 IGFBP2를 유효성분으로 함유하는 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 점안제, 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, IGFBP2를 유효성분으로 함유하는 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 IGFBP2의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 1> 사람 각막실질세포의 초대배양

사람 공여 각막조직을 얻어, Optisol-GC(Bausch & Lomb)에 3일 이내로 저장하였다. 이전에 보고된 연속적인 콜라게나아제 분해방법(Park SH, Kim KW, Chun YS, Kim JC. Human mesenchymal stem cells differentiate into keratocyte-like cells in keratocyteconditioned medium. Exp Eye Res . 2012;101:16-26.)으로 각막 기질에서 사람 각막실질세포를 분리하였다.

-80℃에서 DMEM과 순수 글리세롤(1:1)에 보관된 사람 양막(Amniotic Membrane; AM)을 녹이고, versene(에틸렌디아민사아세트산; Gibco)과 에틸렌디아민테트라아세틱산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA)이 1:1로 포함된 용액에 넣어 37℃에서 30분간 인큐베이션한 후, 스크랩퍼를 이용하여 양막으로부터 양막 상피를 제거하였다.

상피가 제거된 양막을 기질 막이 위로 향하도록 3 cm × 3 cm 크기의 스테인레스 조각 위에 올려놓은 후, 상기 각막 조직으로부터 추출된 각막실질세포를 재부유시킨 후, 2.5 cm × 2.5 cm 양막 위에 1×10⁵ 세포/mL를 접종하고, 10% 태아소혈청이 포함된 DMEM/F12 배지에서 15일 동안 배양하였다. 배지는 2 내지 3일마다 교체하였다.

< 실험예 2> 각막실질세포 조건배지( Collection of Keratocyte - Conditioned Medium; KCM ) 수집

상기 방법과 같이 양막 위에서 각막실질세포를 성장시킨 후 사용한 배지를 조건배지로 수집하였다. 양막 위에서 성장한 기질막세포를 PBS로 세척하고 10% 태아소혈청이 포함된 DMEM/F12 배지 13 mL을 첨가하였다. 2일 후 배지를 수거하고 원심분리하여 상청액을 수집하였다.

수집된 상청액을 0.22 μm 필터를 이용하여 여과시켜 얻은 각막실질세포 조정배지(KCM)를 사용하여 중간엽줄기세포를 배양하였다.

< 실험예 3> 사람 각막섬유아세포 ( human corneal fibroblasts ; HCFs ) 초대배양

각막실질세포가 포함된 세포 부유물을 양막의 기질 면에 접종한 후, 섬유아세포 분리를 위해, 각막 기질 조직을 6 내지 8 조각으로 자르고, 6-웰 플레이트에 넣어 10 분간 부착시킨 후, 각 절편이 잠기도록 10% 태아소혈청(FBS) 및 100 units/mL 페니실린/스트렙토마이신(WelGENE)이 포함된 DMEM/F12 배지를 첨가하였다.

그 후, 37℃, 5% CO₂ 배양기에 넣고, 4 내지 5일마다 배지를 교체하였다.

< 실험예 4> 사람 중간엽줄기세포 ( Human Mesenchymal Stem Cells ; hMSCs ) 배양

사람 태아 척추에서 얻어진 골수 유래 중간엽줄기세포(BM-MSCs; BM3.B10, provided by Dr. Seung U. Kim, Professor Emeritus of Neurology, University of British Columbia, Vancouver)를 L-글루타민, 데옥시리보뉴클레오사이드, 리보뉴클레오사이드, 10% 태아소혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 α-최소필수배지(α-MEM; Invitrogen-Gibco)에 배양하였다.

< 실험예 5> In vitro 약물 처리

배양된 사람 각막섬유아세포(HCFs)에 인슐린 유사 성장인자 결합 단백질(IGFBP2; R&D Systems Inc.)을 100 내지 500 ng/mL의 농도로 24 내지 72시간 동안 처리하였다. TGFβ1(Transforming growth factor beta 1; ProSpec-Tany Technogene Ltd.)을 이용하여 사람 각막 섬유아세포에 화학적으로 섬유화를 유도하였다.

< 실험예 6> 정량적 RT - PCR

RNAiso plus(Takara Bio, Inc.)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 RNA를 분리하였다.

정량적 RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR)을 위해, 전체 RNA를 상보적 DNA(cDNA synthesis kit; Takara Bio, Inc.)로 역전사 시켰다. 동일한 양의 시료를 사람 α-SMA 또는 IGFBP 패밀리에 대한 특이적 프라이머와 함께 cDNA의 PCR 증폭에 사용하였다.

실시간 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)을 SYBR Premix ExTaq(Takara Bio, Inc.)를 이용하여 수행하였으며, CFX96 Real-Time PCR Detection System (BioRad, Hercules, CA)과 자동 qPCR 분석 반응(autonomous qPCR assay reactions)을 통한 표준 곡선으로 cDNA 산물의 SybrGreen 형광을 정량하였다.

상대적 유전자량은 기준 유전자인 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)로 표준화한 후, 상대적 주기 임계값(cycle threshold; Ct)으로 확인하고, qRT-PCR 분석 결과를 발현된 각 유전자의 평균량을 평균 GAPDH 발현량에 대한 상대 값으로 나타내었다.

또한, 표 1과 같은 α-SMA, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IGFBP6 및 GAPDH의 특이적 프라이머를 사용하였다.

유전자		프라이머 서열	크기( bp )
α-SMA	정방향	5'-CCGTGATCTCCTTCTGCATT-3' (서열번호 1)	175
	역방향	5'-CTGTTCCAGCCATCCTTCAT-3' (서열번호 2)
IGFBP1	정방향	5'-TCAAAAAATGGAAGGAGCCCT-3' (서열번호 3)	127
	역방향	5'-AATCCATTCTTGTTGCAGTTT-3' (서열번호 4)
IGFBP2	정방향	5'-CACCGGCAGATGGGCAA-3' (서열번호 5)	136
	역방향	5'-GAAGGCGCATGGTGGAGAT-3' (서열번호 6)
IGFBP3	정방향	5'-CTACAAAGTTGACTACGAGTC-3' (서열번호 7)	139
	역방향	5'-ACTCAGCACATTGAGGAACTT-3' (서열번호 8)
IGFBP4	정방향	5'-TCGAGGCCATCCAGGAAA-3' (서열번호 9)	165
	역방향	5'-CCCCATTGACCTTCATCTT-3' (서열번호 10)
IGFBP5	정방향	5'-AGCAAGTCAAGATCGAGAGAGA-3' (서열번호 11)	154
	역방향	5'-TTCTTTCTGCGGTCCTTCTTCA-3' (서열번호 12)
IGFBP6	정방향	5'-AGAGGAGAATCCTAAGGAGAGT-3' (서열번호 13)	229
	역방향	5'-ATTGGGCACGTAGAGTGTTTGA-3' (서열번호 14)
IGF-Ⅰ	정방향	5'-ATCAGCAGTCTTCCAACCCAA-3' (서열번호 15)	102
	역방향	5'-CAGCGCCAGGTAGAAGAGAT-3' (서열번호 16)
IGF-Ⅱ	정방향	5'-ACACCCTCCAGTTCGTCTGTG-3' (서열번호 17)	248
	역방향	5'-CTGCTTCCAGGTGTCATATT-3' (서열번호 18)
GAPDH	정방향	5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3' (서열번호 19)	294
	역방향	5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3' (서열번호 20)

< 실험예 7> 웨스턴 블롯 분석

배양된 사람 각막 섬유아세포(HCFs)의 웨스턴 블롯 분석을 이전에 보고된 방법(Sharples AP, Al-Shanti N, Stewart CE. C2 and C2C12 murine skeletal myoblast models of atrophic and hypertrophic potential: relevance to disease and ageing J Cell Physiol . 2010;225;240-250.)으로 수행하였다.

사람 케라토칸(keratocan; 1:1000; MD Biosciences), 루미칸(lumican; 1:1000; MD Biosciences), ALDH1A1(1:1000; Cell Signaling Technology, Inc.) 및 a-SMA(1:1000; Millipore)에 대한 일차 마우스 단일 클론 항체를 TBS에 희석하여 막에 적용시킨 후, 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 이차 항체를 TBS에 1:2000으로 희석하여 막에 적용시키고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

그 다음, 향상된 화학발광 웨스턴 블롯 검출 키트(Pierce Biotechnology, Inc.)를 이용하여 단백질 신호를 시각화하였으며, β-액틴을 대조군으로 사용하였다. ImageJ software ver. 1.46 (National Institutes of Health)를 이용하여, 단백질 밴드의 이미지 분석을 수행하였다.

< 실험예 8> 면역세포화학( Immunocytochemistry )

커버슬립 위에 사람 각막 섬유아세포(HCFs) 배양하고, 커버슬립을 PBS로 세척한 후, 실온에서 4% 파라포름알데하이드로 15분간 고정하고, PBS로 5 분씩 세 번 세척하였다.

고정된 세포를 실온에서 0.2% 트리톤 X-100에 15분간 인큐베이션하고 PBS로 3번 세척하여, 세포의 투과성을 증가시켰다. 비특이적 결합을 예방하기 위해, 커버슬립을 블로킹 시약(2% 소혈청알부민이 포함된 PBS)에 실온에서 30분간 인큐베이션하였다.

그 다음, 커버슬립에 항-α-SMA (1:50; Millipore) 항체를 인큐베이션한 후, PBS로 5분씩 세 번 세척하고, 형광 이소티오시아네이트가 결합된 이차 항체(FITC; 1:100, Bethyl Laboratories)로 암조건에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후, 커버슬립을 PBS로 5분씩 세 번 세척하고, 핵 시각화 및 면역학표식의 퇴색을 방지하기 위해 Fluoroshield^TM 와 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole; Sigma-Aldrich)을 커버슬립 위에 올렸다.

< 실시예 1> 정상군과 군날개 환자군간의 IGFBP2 발현량 확인

결막의 비정상적인 섬유증 질환인 군날개를 정상군, 경증 및 중증도 환자군 세 그룹으로 나누어 IGFBP2 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

그 결과, 도 1과 같이 경증도 군날개 환자군의 경우, 섬유화를 유발하는 인자인 α-SMA 및 TGFβ의 발현이 낮게 나타나 있었으며, IGFBP2가 상대적으로 높게 발현된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 중증도 군날개 환자군의 경우, α-SMA 및 TGFβ의 발현이 높게 나타나며, 상대적으로 IGFBP2의 발현이 저해되어 있는 것을 확인할 수 있었는데, 대체로 재발된 군날개 질환의 경우가 이에 해당된다.

상기 결과로부터 IGFBP2의 발현이 증가될 경우, 섬유화 관련 인자의 발현이 감소되어 군날개 질환의 증상을 완화시킬 수 있으며, IGFBP2 발현이 적절하게 유지되지 못할 경우, 섬유화가 심하게 유발되는 것이 확인됨에 따라, IGFBP2가 효과적인 군날개 질환의 치료제로 제안될 수 있다.

< 실시예 2> 다양한 조건 배지에서 IGFBP 패밀리 단백질의 발현 확인

각막실질세포, 각막섬유아세포 및 양막으로부터 유래된 조건 배지 또는 양막 추출물 내의 성장인자를 확인하기 위해, 면역점 블롯 분석(Immunocytochemistry)을 수행하였다.

cytokine antibody array kit(RayBiotech)를 구입하여 사용하고, 사이토카인 에레이 막을 제조사의 설명서에 따라 분석하였다. 키트에 포함된 ECL Plus detection system^TM을 이용하여 막을 탐지하고, ChemiDoc XRS^TM (BioRad)를 이용하여 신호를 디지털화하였다.

블롯 밀도는 imaging analysis software (Quantity One^TM, Imaging Research Inc.)를 사용한 Personal Molecular Imager FX^TM (BioRad)로 측정되었다.

그 결과, 도 2A 내지 2C와 같이, IGFBP 패밀리 단백질은 배양 접시에서 성장한 사람 각막섬유아세포(hMSCs)에서 유래된 각막섬유아세포 조건 배지(CFCM)와 비교하여 양막 위에서 성장한 각막실질세포에서 유래된 조건 배지(KCM)에서 매우 높게 나타났다. 특히, 확인된 IGFBP 중 IGFBP2의 발현이 두드러지게 나타났으며, IGFBP 패밀리 이외의 다른 성장인자의 발현에서는 유의한 차이를 나타나지 않았다.

또한, 각막실질세포가 존재하지 않은 양막의 조건 배지와 양막 추출물을 비교했을 때, 각막실질세포가 독립적으로 IGFBP2를 분비하는 것을 확인할 수 있었으며, IGF-I(Insulin-like growth factor 1)의 발현에서는 유의한 차이가 확인되지 않았다. 반면, CFCM에서는 IGF-Ⅱ가 매우 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 사람 중간엽줄기세포(hMSCs)에서 IGFBP2 에 의한 각막 표현형 확인

배양접시에 사람 중간엽줄기세포(hMSCs)를 접종하고, 양막 위에서 각막실질세포를 배양시켜 수집한 조건 배지(KCM)로 배양하였다. 이때, 중간엽줄기세포(MSCs)을 KCM에서 두 번 계대 배양하였다. 그 결과, 도 3A와 같이, IGFBP2 발현 증가가 확인되었으나, 다른 IGFBP 패밀리와 IGF-I 및 IGF-II의 변화는 확인되지 않았다.

양막 위에서 각막실질세포를 배양시켜 수집한 조건 배지(KCM)로 배양된 사람 각막섬유아세포에서 IGFBP2 증가에 따른 효과를 확인하기 위해, IGFBP2 단백질을 중간엽줄기세포(MSCs)에 처리하여 중간엽줄기세포(MSCs) 및 각막실질세포의 마커들의 발현 패턴을 확인하였다.

100 내지 500 ng/mL 농도의 IGFBP2를 사람 중간엽줄기세포(hMSCs)에 처리하고 α-SMA 발현을 확인한 결과, 도 3B와 같이 α-SMA 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었으며, IGFBP2 100 ng/mL을 24 내지 72 시간 동안 처리한 결과 역시, 도 3C와 같이 α-SMA 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과, 도 3D와 같이 사람 각막실질세포에서 분비된 IGFBP2에 의해, 중간엽줄기세포 마커인 α-SMA의 발현 감소가 확인된 반면, 케라토칸(keratocan) 및 ALDH1A1를 포함한 각막실질세포 마커의 발현은 IGFBP2 농도의존적으로 증가하였다.

상기 결과로부터 IGFBP2가 α-SMA의 발현을 감소시켜 군날개 질환의 원인이되는 이상증식 섬유화를 억제하고 투명성을 유지시키는 효과를 나타낼 수 있음이 확인되었다.

< 실시예 4> 각막섬유아세포에서 IGFBP2 에 의한 각막 표현형 확인

양막에서 배양된 기질막 세포의 경우, 세포 모양 및 마커 발현이 유지되는 반면, 배양접시에서 배양된 각막 기질 세포는 수지상 형태를 빠르게 잃고 섬유아세포 모양으로 나타나는데, 각막실질세포가 전자의 경우에 해당되는 반면, 각막 섬유아세포는 후자에 해당된다.

앞선 실험과 같이 중간엽줄기세포에서 확인한 IGFBP2의 효과를 각막섬유아세포에서도 확인하기 위해, 각막섬유아세포로 분화된 사람 각막실질세포에 IGFBP2(R&D systems) 500 ng/ml를 처리하거나, KCM에서 24, 48 및 72 시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 4A와 같이 KCM 배지에서 배양된 각막실질세포(keratocyte)는 케라토칸(keratocan), 루미칸(lumican), ALDH1A1 및 IGFBP2의 발현이 강하게 나타났으며, α-SMA의 발현은 매우 약하게 나타났다. 반면, KCM 배지에서 배양된 각막 섬유아세포는 계대 배양을 진행할수록 α-SMA의 발현이 점차 증가하였으며, IGFBP2, 케라토칸(keratocan) 및 ALDH1A1 발현은 감소하였다.

그러나, 사람 각막섬유아세포로 분화가 이루어진 세포에 IGFBP2 500ng/ml을 처리한 경우, 도 4B 및 도 4C와 같이 α-SMA의 발현이 억제되고 케라토칸(keratocan) 및 ALDH1A1의 발현이 증가된 것이 확인되었으며, 이러한 결과는 KCM에서 배양된 세포와 유사한 것으로 확인되었다.

또한, IGFBP2를 처리하거나, KCM에서 배양된 사람 각막섬유아세포에서는 세포내 IGFBP2의 발현 증가를 확인할 수 있었으며, IGFBP2의 발현 증가에 따라 케라토칸(keratocan) 및 ALDH1A1의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 IGFBP2는 각막실질세포의 특성을 잘 유지시켜줄 뿐만 아니라, 분화가 진행된 세포의 상태를 회복시켜주는 효과도 나타낼 수 있다.

< 실시예 5> IGFBP2 의 각막 형태 회복 효과 확인

TGFβ1은 섬유아세포의 활성 및 근육섬유아세포로의 분화와 근육섬유아세포의 마커로 활용되는 α-SMA의 발현을 유도하는 중심 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 사람 각막섬유아세포에 5, 10 및 20ng/mL 농도의 TGFβ1를 24 내지 72시간 동안 처리하여 각막 근육섬유아세포로 분화시켰다.

그 결과, 도 5A와 같이 사람 각막섬유아세포의 α-SMA 발현은 TGFβ1의 처리 농도와는 상관없이 처리시간에 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다.

5, 10 및 20 ng/ml TGFβ1이 처리하여 분화가 유도된 사람 각막섬유아세포에 IGFBP2 500 ng/ml를 24 내지 72시간 동안 처리 또는 비처리하고 발현 마커들을 확인하였다.

그 결과, 도 5B와 같이 TGFβ1이 72시간 동안 처리된 세포군을 제외하고 TGFβ1에 의해 유도된 α-SMA의 발현이 IGFBP2에 의해 억제되었으며, TGFβ1이 처리된 사람 각막섬유아세포군에 IGFBP2를 투여한 경우, ALDH1A1 및 케라토칸의 발현 증가가 확인되었다.

상기 결과를 재확인하기 위해, 면역세포화학을 수행하여, 사람 각막섬유아세포에서 TGFβ1에 의해 형성된 스트레스 섬유를 α-SMA 염색하고 시각화하였다.

그 결과, 도 6과 같이 대조군 섬유아세포보다 TGFβ1을 처리한 근육섬유아세포에서 더 많은 스트레스 섬유가 나타났으며, 거의 모든 세포가 근육섬유아세포와 같은 모양을 나타내었으며, TGFβ1 처리기간 의존적으로 α-SMA의 발현이 강하게 나타났다.

반면, IGFBP2가 24 내지 48시간 동안 함께 처리된 경우, α-SMA-양성 근육섬유아세포에서 나타난 스트레스 섬유가 감소하는 것을 확인하였는데, IGFBP2가 24 시간 처리된 경우 스트레스 섬유가 사라졌으나, 48시간 후에는 스트레스 섬유가 희미하게 확인되었다.

상기 결과로부터 IGFBP2를 근섬유아세포 분화 초기 단계에 처리할 경우, 효과적으로 각막 섬유아세포 원래의 성질로 회복시킬 수 있음이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical compostion for preventing or treating pterygium comprising insulin-like growth factor binding protein <130> ADP-2015-0075 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-SAM sense <400> 1 ccgtgatctc cttctgcatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-SAM antisense <400> 2 ctgttccagc catccttcat 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP1 sense <400> 3 tcaaaaaatg gaaggagccc t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP1 antisense <400> 4 aatccattct tgttgcagtt t 21 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP2 sense <400> 5 caccggcaga tgggcaa 17 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP2 antisense <400> 6 gaaggcgcat ggtggagat 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP3 sense <400> 7 ctacaaagtt gactacgagt c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP3 antisense <400> 8 actcagcaca ttgaggaact t 21 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP4 sense <400> 9 tcgaggccat ccaggaaa 18 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP4 antisense <400> 10 ccccattgac cttcatctt 19 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP5 sense <400> 11 agcaagtcaa gatcgagaga ga 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP5 antisense <400> 12 ttctttctgc ggtccttctt ca 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP6 sense <400> 13 agaggagaat cctaaggaga gt 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGFBP6 antisense <400> 14 attgggcacg tagagtgttt ga 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF sense <400> 15 atcagcagtc ttccaaccca a 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF antisense <400> 16 cagcgccagg tagaagagat 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF sense <400> 17 acaccctcca gttcgtctgt g 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF antisense <400> 18 ctgcttccag gtgtcatatt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense <400> 19 tgtggtcatg agtccttcca 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense <400> 20 cgagatccct ccaaaatcaa 20

Claims

IGFBP2(insulin-like growth factor binding protein 2)를 유효성분으로 함유하여 안구 섬유화를 유도하는 α-SMA의 발현을 감소시키고, ALDH1A1의 발현을 증가시키는 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 IGFBP2은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유되는 것을 특징으로 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 약학조성물은 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 군날개 예방 또는 치료용 약학조성물.