JP5165176B2 - 成長因子複合体 - Google Patents

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Description

【0001】
(発明の属する技術分野)
本発明は、成長因子結合タンパク質とビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体に関する。詳細には、本発明は、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子結合タンパク質、およびビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体に関する。本発明はさらに、成長因子複合体の形成を促進または増強する変異型成長因子および/または成長因子結合タンパク質を含む成長因子複合体も提供する。本発明はさらに、創傷治癒、皮膚修復、美容用の皮膚の手入れ、および組織置換療法の目的で、該タンパク質複合体を投与することにより細胞増殖および/または細胞移動を調節する方法も提供する。反対に、癌、乾癬、アテローム性動脈硬化、および肥大性瘢痕化をもたらす傾向がある傷を治療する目的で、タンパク質複合体がインビボで形成されるを妨害することにより、成長因子が原因で起こる細胞増殖および/または細胞移動を抑制することも可能である。以上の処置は、医学・獣医学への用途を有し得る。
【0002】
(発明の背景)
皮膚の成長、修復および治癒は、正のシグナルと負のシグナルの両方を介して作用する複雑な生物学的制御機構を受ける。そのようなシグナルは、細胞増殖、分化、および移動を制御するレベルで作用し、一般には成長因子ポリペプチドにより媒介される。これに関する重要な成長因子として、上皮成長因子(EGF)とインスリン様成長因子(IGF−Iおよび−II)が挙げられる。
【0003】
ヒトIGF−Iは細胞増殖、分化および移動の刺激;タンパク質の分解およびアポトーシスからの保護;ならびに成長ホルモンのような内分泌系因子の調節を始めとする、広範な生物活性を発揮することが報告されている。IGF−IIはIGF−Iと同様の性質を有するが発癌および胎児または胚の発達により関連が深いようであり、IGF−Iは出生後の発達においてより大きな役割を有する。
【0004】
IGF−IとIGF−IIはいずれもI型IGF受容体(IGFR)との結合相互作用を介して作用する。そのような相互作用についてのIGFの有効性はインスリン様成長因子結合タンパク質(IGFBP1−6)によって調節される。IGFBPはIGF機能を正にも負にも調節し、また、IGF非依存的な活性を示すことが知られている。
【0005】
IGF経路の別の機能的成分は、陽イオン非依存性マンノース−6−リン酸エステル受容体(CI−MPR)として知られているII型IGFRである。IGF−IIと結合する機能的重要性は不明確であるが、II型IGFRは、IGF−IIと同様に、マンノース−6−リン酸エステル部分を備えたリソソーム酵素にも結合する多機能タンパク質である(O'Dell & Day, 1998, Int. J. Biochem. Cell Biol. 30 767; Braulke, 1999, Horm. Metab. Res. 31 242; Nykjaer et al., 1998, J. Cell. Biol. 141 815 )。
【0006】
IGFは、構造的類似性を共有し、かつ結合組織成長因子(CTGF)ならびにmac25遺伝子、nov遺伝子およびcyr6遺伝子によりコードされた産物を含む、「IGFBP関連タンパク質」と称される別のタンパク質のグループと結合することも報告されている。それらはIGFBPよりもはるかに低い親和性でIGFに結合する。
【0007】
より最近、ビトロネクチン(VN)が、構造的にIGFBPおよびIGFBP関連タンパク質と無関係な、IGF−IIには結合するがIGF−Iには結合しない細胞外基質タンパク質として確認された(lipton et al., 1999, Endocrinol. 140 2928 )。
【0008】
ビトロネクチンは血中でも見出される75kD以下のグリコシル化した細胞外基質タンパク質であり、癌、骨疾患、血管新生に関する病理学的障害に関与している(Schvartz et al., 1999, Int. J. Biochem. Cell Biol. 31 539 に概説)。血管新生や腫瘍形成のような事象におけるビトロネクチンの役割の少なくとも一部は、ビトロネクチンがインテグリンと結合してウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子系の構成成分(例えばPMI−1、uPAR、プラスミノゲン)と相互作用し、それにより細胞の増殖、接着、伝播、移動を促進するという能力にある。ビトロネクチンはより詳しくは、薬物処理に応答した腫瘍細胞アポトーシスの防止に関与している(Uhm et al., 1999, Clin. Cancer Res. 5 1587)。ビトロネクチンは、循環でのIGF−IIの担体であるようである(McMurtry et al., 1996, J. Endocrinol. 150 149 )。
【0009】
(発明の目的)
本発明者は、IGFBPがビトロネクチンと結合し、IGF−1がIGFBP結合された時にビトロネクチンと結合できることができるという、驚くべき発見をした。
【0010】
従って、本発明の目的は、単離IGFBPとビトロネクチンを含む複合体を提供することにある。
(発明の要約)
第1の態様では、本発明は、成長因子結合タンパク質とビトロネクチンを含む単離ポリペプチド複合体を提供する。
【0011】
好ましくは、単離ポリペプチド複合体は成長因子をさらに含む。
好ましい成長因子はインスリン様成長因子−I(IGF−I)である。
他の成長因子としては、上皮成長因子(EGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、オステオポンチン、PAI−1、およびトランスフェリンが挙げられる。
本発明のタンパク質複合体を形成可能な他の生物活性タンパク質には、トロンボスポンジン−1、テネイシン−C、PAI−1、プラスミノゲン、フィブリノゲン、フィブリンが含まれる。
【0012】
好ましい成長因子結合タンパク質は、IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5およびIGFBP6から成るグループから選択されたインスリン様成長因子結合タンパク質である。
【0013】
より好ましいインスリン様成長因子結合タンパク質は、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、またはIGFBP5である。
さらに好ましいインスリン様成長因子結合タンパク質はIGFBP3またはIGFBP5である。
【0014】
第2の態様では、本発明は、IGFBP関連タンパク質とビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体を提供する。
好ましくは、単離ポリペプチド複合体は成長因子、好ましくはIGF−Iをさらに含む。
【0015】
1実施形態では、IGFBP関連タンパク質は、結合組織成長因子(CTGF)、mac25遺伝子によりコードされたポリペプチド、nov遺伝子によりコードされたポリペプチド、およびcyr61遺伝子によりコードされたポリペプチドから成るグループから選択される。
【0016】
第3の態様では、本発明は、ビトロネクチン、変異型成長因子、および変異型成長因子結合タンパク質の少なくともいずれか1つを含む単離タンパク質複合体を提供する。
【0017】
1実施形態では、この態様の単離タンパク質複合体は、ビトロネクチンと、ヘパリン結合ドメイン(HBD)を含むように操作設計された変異型成長因子とを含む。
【0018】
別の実施形態では、この態様の単離タンパク質複合体は、ビトロネクチンと、非グリコシル化成長因子結合タンパク質とを含む。
さらに別の実施形態では、この態様の単離タンパク質複合体は、ビトロネクチンと、des(1−6)IGF−IIおよびdes(1−3)IGF−Iから成るグループから選択された変異型成長因子とを含む。
【0019】
上述の第1、第2、および第3の態様によれば、本発明の単離タンパク質複合体が、IGFBPと複合体を形成することができるポリペプチドである、以下にALSと称する酸不安定性サブユニットをさらに含むことも企図される。
【0020】
上述の第1、第2、および第3の態様によれば、本発明は、成長因子、成長因子結合タンパク質、IGFBP関連タンパク質、およびビトロネクチンの変異型と生物活性断片を含む単離タンパク質複合体と、そのような複合体の使用方法も企図する。生物活性断片と変異型はその範囲内に、上記成長因子、成長因子結合タンパク質、IGFBP関連タンパク質、およびビトロネクチンの類似体、突然変異型、アゴニストおよびアンタゴニストを含む。
【0021】
第4の態様では、本発明は、上述の第1、第2、および第3の態様による1または複数の単離タンパク質複合体と、医薬として許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【0022】
第5の態様では、本発明は、上述の第1、第2、および第3の態様による1または複数の単離タンパク質複合体をコードする1または複数の核酸を含む発現構築物と、医薬として許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【0023】
第6の態様では、本発明は、組換えタンパク質複合体または上述の第1、第2、および第3の態様による複合体を形成可能な組換えタンパク質を発現することができる形質転換細胞を提供する。
【0024】
第7の態様では、本発明は、動物または該動物からの単離細胞に、上述の第1、第2、および第3の態様による単離タンパク質複合体を投与するステップから成る、細胞増殖および細胞移動の少なくともいずれかを調節する方法を提供する。
【0025】
好ましくは、単離タンパク質複合体はIGFBPとビトロネクチンを含む。
好ましくは、単離タンパク質複合体はIGF−Iをさらに含む。
第8の態様では、本発明は、動物または該動物からの単離細胞に、上述の第1、第2、および第3の態様によるタンパク質複合体の形成を防止または妨害する作用物質を投与するステップから成る、細胞増殖および細胞移動の少なくともいずれかを調節する方法を提供する。
【0026】
好ましくは、作用物質はIGFBPとビトロネクチンの間の相互作用を防止または妨害する。
より好ましくは、作用物質はIGFBPとビトロネクチンの間の相互作用を防止または妨害し、タンパク質複合体はIGF−Iを含む。
【0027】
例えば、作用物質は、IGFBPとビトロネクチンの間の相互作用またはIGFBP関連タンパク質とビトロネクチンの間の相互作用に対するアンタゴニストである。
【0028】
IGFBPとビトロネクチンの複合体の形成を阻害する作用物質の例はIGF−IIである。
以下により詳述されるように、ビトロネクチンとIGFBPの間の相互作用の妨害は、腫瘍細胞の増殖を阻害するだけでなく、腫瘍転移も阻害する。それらはいずれも腫瘍病理学の中心となる事象である。
【0029】
本発明のさらなる態様は、乾癬、アテローム性動脈硬化、胃腸上皮の劣化および上皮乳癌を始めとする上皮細胞に関する疾患の治療的または予防的処置における、および/または創傷治癒、皮膚修復、潰瘍および火傷治癒、自己由来の皮膚移植のようなインビトロでの皮膚再生、骨再生、損傷したニューロン組織の修復の処置における、本発明の上述の態様による単離タンパク質複合体および方法の使用方法を提供する。
【0030】
従って、本発明は、本発明の単離タンパク質複合体を含む外科インプラントまたは補綴も提供する。外科インプラントまたは補綴は、単離タンパク質複合体により、コーティング、含浸、またはそれ以外の方法で前処理されていてもよい。
【0031】
本発明により処置される動物は、哺乳動物、好ましくはヒトであることが好ましいが、魚、爬虫類、鳥類のような非哺乳動物である脊椎動物や、それらのいずれかから単離された細胞であってもよい。
【0032】
本明細書全体にわたって、別段示さない限り、「から成る、含む、備える、有する(comprise)」とその変化形(comprises, comprising )は、排他的なものではなく包括的なものとして使用される。その結果、1つの明示された整数または複数の整数のグループは、他の明示されていない1または複数の整数や複数の整数のグループを含み得る。
【0033】
(図面と表の簡単な説明)
表1:成長因子と成長因子結合タンパク質をコードする核酸を示す参考文献のリスト。
表2:ビトロネクチンに結合したIGF−IとIGFBP−5はHaCATヒトケラチン生成細胞でのタンパク質合成を刺激する。データはH−ロイシン取り込みの測定値から得たものであり、各処理を3連で試験した1回の実験からの、24時間にわたる対照(IGF−I、IGFBP−5またはビトロネクチンなし)を超える刺激(%)として表す。IGF−Iはビトロネクチン(300ng/ウェル)の存在下(+)またはビトロネクチンの不在下(−)でIGFBP−5(5ng/ウェル)に加えた。
【0034】
図1:1ウェル当たり300ngのビトロネクチン(VN)への結合に関する、[125I]−IGF−IIと競合するインスリン(▲)またはIGF−II(◆)の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。放射標識したIGF−II(10,000cpm)をVNコートしたウェルに加え、一晩インキュベートし数回洗浄した後に結合カウント数を決定した。結合はIGF−IIまたはインスリンを加えない対照ウェルで観察された結合のパーセントとして表す。結果を、3回の実験の代表からの3つのレプリカの平均値±標準偏差として示す。
【0035】
図2:1ウェル当たり300ngのビトロネクチン(VN)への結合に関する、[125I]−IGF−IIと競合するIGF−IまたはIGF−IIの増大濃度を用いた競合結合アッセイ。放射標識したIGF−II(10,000cpm)をVN(◆)コートしたウェルかIGFBP2コートしたウェル(◆)に加え、一晩インキュベートし数回洗浄した後に結合カウント数を決定した。結合はIGFを加えない対照ウェルで観察された結合のパーセントとして表す。
【0036】
図3:1ウェル当たり300ngのビトロネクチン(VN)への結合に関する、[125I]−IGF−IIと競合するproIGF−II(■)またはIGF−II(◆)の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。放射標識したIGF−II(10,000cpm)をビトロネクチンコートしたウェルに加え、一晩インキュベートし数回洗浄した後に結合カウント数を決定した。結合はIGF−IIまたはプロIGF−IIを加えない対照ウェルで観察された結合のパーセントとして表す。結果を、2回の別個の実験からの3つのレプリカの平均値±標準偏差として示す。
【0037】
図4:1ウェル当たり300ngのビトロネクチン(VN)への結合に関する、[125I]−IGF−IIと競合するPAI−1(■)またはIGF−II(◆)の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。放射標識したIGF−II(10,000cpm)をビトロネクチンコートしたウェルに加え、一晩インキュベートし数回洗浄した後に結合カウント数を決定した。結合はIGF−IIまたはPAI−1を加えない対照ウェルで観察された結合のパーセントとして表す。結果を、3回の実験の代表からの3つのレプリカの平均値±標準偏差として示す。
【0038】
図5:ビトロネクチンに結合する時の、(A)IGF−IIおよびIGFBP3と、(B)IGF−IおよびIGFBP3の、プレインキュベーションの影響を比較する競合結合アッセイ。IGFBP3はグリコシル化せず、E.coliで生産した。IGFBP3+10,000cpm[125I]−IGF−II(A)または[125I]−IGF−I(B)の増大濃度を4時間プレインキュベートし、ビトロネクチンコートしたウェルに加えた。あるいは、IGFBP3+10,000cpm[125I]−IGF−II(A)または[125I]−IGF−I(B)を、プレインキュベートせずにビトロネクチンコートしたウェルに加えた。結合は非特異的結合のない状態で得られたcpmとして表す。結果を、3回の別個の実験の代表からの3つのレプリカの平均値として示す。
【0039】
図6:(A)IGFBP1、(B)IGFBP2、(C)IGFBP3、(D)IGFBP4、(E)IGFBP5および(F)IGFBP6の存在下でのVNコートウェルへの標識IGF−Iの結合。組換えIGFBPは哺乳動物細胞で生産した。図示したIGFBPの存在下での、結合した標識IGF−I/VNコートウェル(300ng/ウェル)の平均cpmとして表されるデータは、6回の個別の決定から得たものである。10,000cpmの放射標識IGF−Iを各ウェルに加えた。
【0040】
図7:「Gly IGFBP−3」(グリコシル化IGFBP−3)、「IGFBP−3 HBD変異型」(推定ヘパリン結合ドメインが変異したIGFBP−3、および「non−gly IGFBP−3」(非グリコシル化IGFBP−3)の存在下でのVNに対する標識IGF−Iの結合。
【0041】
図8:[125I]−IGF−Iまたは[125I]−IGF−IIとインキュベートした非グリコシル化IGFBP3と競合する、IGFおよびdesIGFの増大濃度を用いた競合結合アッセイ。30ng(A)または10ng(B)のIGFBP3+10,000cpm[125I]−IGF−II(A)またはIGF−I(B)をVNコートウェルに加えた。IGF−I、IGF−II、des(1−3)IGF−I(図示せず)およびdes(1−6)IGF−IIの増大濃度を加えて、VNへの結合に関して放射標識と競合させた。10ng(A)または30ng(B)のIGFBP3のいずれかで処理したVNコートした対照ウェルを、VNのみでコートした対照ウェルと共に示す。結合は非特異性結合のない状態で得られたcpmとして表す。結果を、3回の別個の実験の代表からの3つのレプリカの平均値±標準偏差として示す。
【0042】
図9:ヒトケラチン生成細胞におけるタンパク質合成の刺激。24時間にわたる対照(−VN、−IGF−II)を超える刺激(%)として表されるデータは、各処理各処理を3連で試験した3回の反復試験からプールしたものである。白抜きバー(VNのみの効果)と灰色バー(IGF−IIのみの効果)を組み合わせて表される理論的相加効果を、VNと予め結合させたIGF−IIで実際観察される効果(黒色バー)と比較する。試験したIGF−IIの最低濃度を除くすべての例で、実際に観察された効果は計算した相加効果よりも有意に大きい。(p<0.05)。
【0043】
図10:(A)IGFBP1、(B)IGFBP2、(C)IGFBP3、(D)IGFBP4、(E)IGFBP5および(F)IGFBP6の存在下でのVNコートウェルへの標識IGF−IIの結合。組換えIGFBPは哺乳動物細胞で生産した。図示したIGFBPの存在下での、結合した標識IGF−II/VNコートウェル(300ng/ウェル)の平均cpmとして表されるデータは、6回の個別の決定から得たものである。10,000cpmの放射標識IGF−IIを各ウェルに加えた。
【0044】
(発明の詳細な説明)
本発明の少なくとも一部は、IGFBPとビトロネクチンの間の結合相互作用によりIGF−Iがビトロネクチンと結合するという本発明者による発見から生じたものである。更に、本発明は、IGF、IGFBPおよびビトロネクチンの間の結合を増大または減小させるのに使用可能な変異型IGFおよびIGFBPについても説明する。これらの発見により、本発明者は、細胞の成長、増殖および移動に関連する付随のインビボでの生物学的事象を操作する目的で、インビトロのそれらの物質の相互作用を操作することとなった。従って、本発明は、医学と獣医学の両方の領域において、創傷治癒、皮膚の修復と手入れ、骨再生、アテローム性動脈硬化、および癌療法のような、医療処置に有用性を有する。
【0045】
本発明の目的において、「単離」とは、自然状態から除去されるか、他の方法で人の操作を受けることを意味する。単離物質は、自然状態で通常該物質に付随する成分を実質的にまたは本質的に含んでいないか、自然状態で通常該物質に付随する成分と共に人工的な状態にあるように操作設計される。
【0046】
「ポリペプチド」とは「タンパク質」をも意味し、いずれの用語もアミノ酸のポリマーを指す。
成長因子、成長因子結合タンパク質、およびビトロネクチンタンパク質を包含するタンパク質およびペプチドは、天然の形式で、化学合成の形式で、または組換え合成形式で単離され得る。
【0047】
「ペプチド」とは、50個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。
「生物活性断片」とは、タンパク質の生物活性の少なくとも1%、好ましくは少なくとも10%、より好ましくは25%、さらにより好ましくは50%を示す、タンパク質の断片、部分またはセグメントである。
【0048】
ペプチドは、組換技術または化学合成法により容易に合成することができる。例えば、Blackwell Scientific Publications より出版されたNicholson 編、題目「合成ワクチン(Synthetic Vaccines)」の刊行物に含まれている、AthertonとShephardの「ペプチド合成(Peptide Synthesis )」の第9章に例えば記載されているような、溶液合成や固相合成を参照することができる。ペプチド合成法は、引用により本明細書に組み込まれるColigan et al.編、「タンパク質科学における最新プロトコル(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)」 (John Wiley & Sons NY, 1997)の第18章にも記載されている。代替的に、ペプチドは、エンドLys−C、エンドArg−C、エンドGlu−CおよびスタフィロコッカスV8プロテアーゼのようなプロテイナーゼで本発明のポリペプチドを消化することによっても生成することができる。消化された断片は、例えば高性能液体クロマトグラフィ(HPLC)法により精製することができる。
【0049】
好ましい形式では、本発明は、ビトロネクチン、成長因子および成長因子結合タンパク質を含む単離タンパク質複合体を提供する。
「成長因子」とは、生物体の成長または該生物体の細胞の成長を刺激または促進する分子のことを意味する。好ましい成長因子は、細胞分裂、特に哺乳動物細胞の分裂を刺激するタンパク質またはペプチドである。
【0050】
好ましくは、本発明の単離タンパク質複合体は成長因子IGF−Iを含む。
単離IGFポリペプチドやIGFBPポリペプチドは、GroPep社(オーストラリア国アデレード)のような供給先から市販されており、VNポリペプチドはPromega社(アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン)のような供給先から市販されている。以下により詳述するように、組換えIGF、IGFBPおよびVNは当業者には容易に作製することができる。
【0051】
当業者に理解されるように、本発明はIGFの前駆物質形式もさらに包含する。プロIGF−Iタンパク質の例は、シグナルペプチドが除去されているが、Eドメインの開裂により完全にはプロセシングされていないIGF−Iタンパク質である。IGF−Iは、異なるmRNAスプライシングによって生じる3つの異なるEドメインを有しており。それらの前駆体タンパク質は本発明の単離タンパク質複合体中に存在し得る。
【0052】
しかしながら、本発明は、上皮成長因子(EGF;Heldin et al., 1981, Science 4 1122-1123)繊維芽細胞成長因子(FGF;Nurcombe et al., 2000, J. Biol. Chem. 275 30009-30018 )、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF;Taraboletti et al., 1997, Cell Growth. Differ. 8 471-479)、オステオポンチン(Nam et al., 2000, Endocrinol. 141 1100)、トロンボスポンジン−1(Nam et al., 2000, 前掲)、テネイシン−C(Arai et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 6099)、PAI−1(Nam et al., 1997, Endocrinol. 138 2972)、プラスミノゲン(Campbell et al., 1998, Am. J. Physiol. 275 E321 )、フィブリノゲン(Campbell et al., 1999, J. Biol. Chem 274 30215)、フィブリン(Campbell et al., 1999, 前掲)、またはトランスフェリン(Weinzimer et al., 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 1806 )のような成長因子を含む単離タンパク質複合体も企図する。
【0053】
好ましくは、オステオポンチン、トロンボスポンジン−1、テネイシン−CまたはPAI−1を含む単離タンパク質複合体は、IGFBP−5をさらに含む。
好ましくは、プラスミノゲン、フィブリノゲン、フィブリンまたはトランスフェリンを含む単離タンパク質複合体は、IGFBP−3をさらに含む。
【0054】
本発明は、ビトロネクチンが単量体または多量体の状態で存在することができるので、単量体および多量体のビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体を企図する。詳しくは、多量体VNは血管損傷領域に蓄積し、組織でのVNの支配的形式である。従って、VNの多量体形式は、2種類以上の成長因子または成長因子結合タンパク質が同時に送達されるVN複合体を形成する機会を与える。
【0055】
本発明の単離タンパク質複合体は、当業者によく理解されている「天然の」、「変性した」、または「延長した」状態のビトロネクチンを含み得ることも、当業者には理解されよう。
【0056】
本発明は、アミノ酸レベルでVNと60%の相同性を示す細胞外基質タンパク質であるネクチネプシン(neptinepsin )(Blanchert et al., 1996, 1. Biol. Chem. 271 26220-26226)。を含む、単離成長因子複合体も企図する
【0057】
本発明の単離タンパク質複合体を形成するためには、成長因子、成長因子結合タンパク質および/またはビトロネクチンの変異型を使用してもよく、それらが本明細書で述べた使用方法において有用であり得ることもさらに理解されよう。
【0058】
本明細書で使用する場合、本発明の「変異型」タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、1または複数のアミノ酸が異なるアミノ酸に置き換えられたタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドである。
【0059】
いくつかのアミノ酸を、ポリペプチドの活性の性質を変えずに広く同様の特性を有する他のアミノ酸に変え得ること(保存的置換)は、当該技術分野では周知である。
【0060】
より保存性の少ない置換を選択すると、機能の本質的な変化が起こり得る。他の置換としては非保存的置換があるが、それらは比較的ほとんど許容されないであろう。一般に、ポリペプチドの特性に最も大きな変化を生じさせる置換は、(a)親水性残基(例えばSerまたはThr)から/への疎水性残基(例えばAla、Leu、Ile、PheまたはVal)置換;(b)システインまたはプロリンから/への任意の他の残基の置換;(c)電気陽性側鎖を有する残基(例えばArg、His、またはLys)から/への電気陰性残基(例えばGluまたはAsp)の置換;または(d)嵩張った側鎖を有する残基(例えばPheまたhTrp)から/へのより小さい側鎖を有する(例えばAla、Ser)または側鎖を持たない(例えばGly)残基の置換;である。
【0061】
変異型はさらに、例えば他の化学的部分との共役または複合体生成によりまたは当該技術分野で理解されているような翻訳後修飾技術により変えられた、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドも包含する。そのような誘導体にはアミノ酸欠失および/または付加が含まれる。
【0062】
本発明によって企図される他のポリペプチドおよびペプチドの変異型には、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成中の非天然アミノ酸および/または該アミノ酸誘導体の組み込み、ならびに本発明のポリペプチドおよびペプチドの変異型に立体配座の制約を課する架橋剤または他の化学物質の使用が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明によって企図される側鎖修飾の例には、無水酢酸によるアシル化;無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化;アセチルイミド酸メチルによるアミジン化;シアン酸によるアミノ基のカルバミル化;ピリドキサール−5−リン酸によるリジンのピリドキシル化後のNaBHでの還元;アルデヒドとの反応による還元アルキル化後のNaBHでの還元;および2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸によるアミノ基のトリニトリベンジル化;ようなアミノ基の修飾が含まれる。
【0063】
カルボキシル基は、O−アシルイソ尿素形成を介するカルボジイミド活性化後に、例えば対応アミドに誘導体化することにより、修飾することができる。
【0064】
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールのような試薬による複素環縮合生成物の形成により、修飾することができる。
【0065】
スルフヒドリル基は、システイン酸への過ギ酸の酸化;4−クロロ水銀フェニルスルホン酸、4−クロロ水銀安息香酸、2−クロロ水銀−4−ニトロフェノール、塩化フェニル水銀および他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成;他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成;マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換マレイミドとの反応;ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化;ならびにアルカリpHでのシアン酸塩によるカルバミル化;のような方法により修飾することができる。
【0066】
トリプトファン残基は、例えば、2−ヒドロキシ−5−ニトロベンジルブロミドまたはハロゲン化スルホニルによるインドール環のアルキル化により、またはN−ブロモスクシンイミドによる酸化により、修飾することができる。
【0067】
チロシン残基は、テトラニトロメタンでニトロ化して3−ニトロチロシン誘導体を形成することにより、修飾することができる。
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカルボネートによるN−カルボエトキシル化により、またはヨード酢酸誘導体でのアルキル化により、修飾することができる。
【0068】
ペプチド合成中に非天然アミノ酸や誘導体を組み込む例としては、4−アミノ酪酸、6−アミノヘキサン酸、4−アミノ−3−ヒドロキシ−5−フェニルペンタン酸、4−アミノ−3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタン酸、t−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、2−チエニルアラニン、および/またはアミノ酸のD異性体の使用が挙げられるが、これに限定されるわけではない。
【0069】
修飾の範囲には、O−およびN−結合グリコシル化変異型や、自然状態ではグリコシル化しているタンパク質の非グリコシル化形式も含まれる。
変異型に関して、これらは、ランダム突然変異誘発や部位特異的変異誘発のような、ポリペプチドの突然変異誘発やコードしている核酸の突然変異誘発により作成することができる。核酸の突然変異誘発の例は、Ausubel ら「分子生物学の最新プロトコル(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)」、前掲の第9章、で与えられ、これは引用により本明細書に組み込まれる。
【0070】
生物活性に寄与するアミノ酸残基の知識が利用可能である場合には部位特異的変異誘発が最もよく行なわれることが当業者には理解されよう。多くの場合、その情報は利用可能でないか、あるいは例えば分子モデル化近似により推論できるにすぎない。
【0071】
そのような場合には、ランダム突然変異誘発が企図される。ランダム突然変異誘発には、ヒドロキシアミンによるタンパク質の化学的修飾(Ruan et al., 1997, Gene 188 35)、核酸へのdNTP類似体の組み込み(Zaccolo et al., 1996, J. Mol. Biol. 255 589 )、およびStemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 10747またはShafikhani et al., 1997, Biotechniques 23 304 に記載されているようなPCRに基づくランダム突然変異誘発が含まれ、それらの各参考文献は本明細書に組み込まれる。DiversifyTM キット(Clontech社)などのPCRに基づくランダム突然変異誘発キットが市販されていることにも留意する。
【0072】
本発明はさらに、本発明の単離タンパク質複合体を形成するためのdes(1−6)IGF−IIおよびdes(1−3)IGF−Iを始めとする成長因子変異型の使用も企図している。
【0073】
アゴニストまたはアンタゴニストとして有用な他の変異型IGFおよびIGFBPが以下に詳述される。
・組換え成長因子複合体
コード核酸を当該技術分野で周知の適切な宿主細胞中か無細胞発現系中で発現することにより、組換え成長因子、成長因子結合タンパク質および/またはビトロネクチンを使用して単離タンパク質複合体を生産できることは理解されよう。
【0074】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のmRNA、RNA、cRNAおよびDNA(cDNAおよびゲノムDNAを含む)のことを指す。
【0075】
「ポリヌクレオチド」は80個以上の隣接ヌクレオチドを有する核酸であり、「オリゴヌクレオチド」は80個未満の隣接ヌクレオチドを有する。
「プローブ」は、例えばノーザンブロッティングやサザンブロッティングで相補的配列を検出する目的で適切に標識された、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであってよい。
【0076】
「プライマー」は通常、相補的核酸鋳型にアニールすることができ、Taqポリメラーゼ、RNA依存的DNAポリメラーゼ、またはSequenaseTM のようなDNAポリメラーゼの作用により鋳型依存的様式で伸長できる、一本鎖オリゴヌクレオチド、好ましくは15−50個の隣接ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。
【0077】
IGF、EGF、IGFBP、ALSおよびVNをコードする核酸は当該技術分野で周知であり、多年にわたって利用可能である。しかしながら、そのような核酸配列の例を提供する参考文献を列挙した表1が当業者に参照される。表1の参考文献はすべて引用により本明細書に組み込まれる。
【0078】
本発明による有用な核酸は、以下の方法により調製することができる:
(i)各々が標的核酸の各部分を有する、任意で縮重しているプライマーを作製すること;および
(ii)該プライマーを核酸増幅技術と組み合わせて使用して、核酸抽出物から1または複数の増幅産物を増幅すること。
【0079】
適切な核酸増幅技術は当業者にはよく知られており、例えば引用により本明細書に組み込まれるAusubel ら、前掲の第15章に記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR);例えば引用により本明細書に組み込まれる米国特許第5,422,252号に記載されているような鎖置換増幅(SDA);例えば引用により本明細書に組み込まれるLiu et al., 1996, J. Am. Chem. Soc. 118 1587、国際出願WO第92/01813号、および国際出願WO第97/19193号に記載されているようなローリングサークル複製(RCR);例えば引用により本明細書に組み込まれるSooknanan et al.,1994, Biotechniques 17 1077に記載されている核酸配列に基づく増幅(NASBA);例えば引用により本明細書に組み込まれる国際出願第WO第89/09385号に記載されているリガーゼ連鎖反応(LCR);ならびに例えば引用により本明細書に組み込まれるTyagi et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 5395に記載されているQ−βレプリカーゼ増幅;が挙げられる。
【0080】
本明細書で使用する場合、「増幅産物」とは、核酸増幅技術によって生成された核酸生成物のことを指す。
組換えタンパク質は、当業者に周知の任意の適当な方法によって調製することができる。
【0081】
例えば、組換えタンパク質は、以下のステップを含む方法により調製することができる:
(i)1または複数の調節ヌクレオチド配列と機能的に結合した核酸を含む発現構築物を調製すること;
(ii)適切な宿主細胞を発現構築物でトランスフェクトまたは形質転換すること;および
(iii)宿主細胞中でポリペプチドを発現すること。
【0082】
宿主細胞での発現のため、組換え核酸は、発現ベクター中の1または複数の調節配列に機能的に結合される。
「発現ベクター」は、プラスミドのような自己複製する染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれであってもよい。
【0083】
「機能的に結合される」とは、調節ヌクレオチド配列が本発明の組換え核酸に対して転写を開始、調節、または別の方法で制御するように配置されていることを意味する。
【0084】
調節ヌクレオチド配列は一般に、発現に使用される宿主細胞に適している。様々な宿主細胞に対する、多くの種類の適当な発現ベクターや適当な調節配列が当該技術分野で知られている。
【0085】
一般に、1または複数の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終止配列、翻訳開始および終止配列、またはエンハンサーもしくはアクチベーター配列が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【0086】
本発明により、当該技術技術で知られている構成プロモーターまたは誘導プロモーターが企図される。プロモーターは、天然プロモーターか、2以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれであってもよい。
【0087】
好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を許容する選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は当該技術分野で周知であり、使用される宿主細胞に応じて変わる。
【0088】
本発明の組換えポリペプチドが融合パートナーとの融合ポリペプチドとして発現されるように、発現ベクターはさらに融合パートナー(通常発現ベクターにより提供される)を含んでもよい。融合パートナーの主な利点は、融合ポリペプチドの同定および/または精製を支援し、タンパク質の発現レベルと全体的な収率を増大させることである。
【0089】
融合ポリペプチドを発現するためには、融合パートナーの翻訳の読取枠と本発明のヌクレオチド配列が一致するように、発現ベクターに本発明のヌクレオチド配列をライゲートする必要がある。
【0090】
融合パートナーのよく知られている例としては、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、ヒトIgGのFc部分、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびヘキサヒスチジン(HIS)が挙げられ、これらはアフィニティクロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの単離に特に有効であるが、これらに限定されるわけではない。アフィニティクロマトグラフィーによる融合ポリペプチドの精製に関するアフィニティクロマトグラフィーのための適切なマトリクスは、それぞれグルタチオン−、アミロース−、およびニッケル−またはコバルト−共役樹脂である。多くのそのようなマトリクスが(HIS)融合パートナーに関して有用なQIAexpressTMシステム(Qiagen社)やPharmacia GST 精製システムのような、「キット」の形式で利用可能である。
【0091】
当該技術分野で周知のもう1つの融合パートナーに、緑色蛍光タンパク質(GFP)がある。この融合パートナーは、本発明の融合ポリペプチドが蛍光顕微鏡検査法またはフローサイトメトリーにより同定されることを可能にする、蛍光性の「タグ」として機能する。GFPタグは、本発明の融合ポリペプチドの細胞レベル以下での局在性を評価するときに、あるいは、本発明の融合ポリペプチドを発現している細胞を分離するのに有用である。蛍光活性化細胞選別法(FACS)のようなフローサイトメトリー法は、後者の用途に特に有用である。
【0092】
場合によっては、融合パートナーは、X因子やトロンビンに対するプロテアーゼ切断部位のような、プロテアーゼ切断部位もさらに有する。これは、関連プロテアーゼが本発明の融合ポリペプチドを部分的に消化することにより、そこから本発明の組換えポリペプチドを遊離可能にする。その後、遊離したポリペプチドは、後続のクロマトグラフィーでの分離により、融合パートナーから分離することができる。
【0093】
本発明の融合パートナーは、その範囲内に、さらに「エピトープタグ」を含む。これは、対応する特異的抗体が利用できる、通常は短いペプチド配列である。対応する特異的なモノクローナル抗体を容易に利用できるエピトープタグのよく知られている例としては、c−mycタグ、インフルエンザウィルスヘマグルチニンタグおよびFLAGタグが含まれる。
【0094】
組換えタンパク質は、例えば引用により本明細書に組み込まれるSambrook, et al., MOLECULAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 1989) 、特に第16章と17章;引用により本明細書に組み込まれるCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Ausubel et al. 編, (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999) 、特に第10章と16章;引用により本明細書に組み込まれるCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Coligan et al. 編, (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999) 、特に第1章、5章、および6章;に記載されている標準プロトコルを使用して当業者は都合よく調製することができる。
【0095】
1実施形態では、成長因子、成長因子結合タンパク質およびビトロネクチンの組換え発現は、別々に行なわれ、そこから複合体は形成される。
別の実施形態では、成長因子、成長因子結合タンパク質およびビトロネクチンの組換え発現は、同じ細胞で行われ、そこから複合体が形成される。
【0096】
上述のように、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド同族体をコードする核酸を含む発現構築物で形質転換した宿主細胞を培養することにより生産することができる。タンパク質発現に適した条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択に応じて変わるだろう。これは日常的な実験を通じて当業者に容易に確認される。
【0097】
組換え発現に適した宿主細胞には、E.coli、Clostridium 種、 Pseudomonas 種、 酵母、植物細胞、昆虫細胞(例Sf9 )、ならびに繊維芽細胞やケラチン生成細胞のような哺乳動物細胞が含まれる。
【0098】
好ましい宿主細胞はヒトケラチン生成細胞である。
誘導および非誘導発現ベクターが企図される。安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞では、いずれも本発明により企図される、メタロチオネイン(MT)誘導可能およびテトラサイクリン抑制可能(tetR)なものを含む、多くの誘導可能および抑制可能な系が創作されている。
【0099】
適当な発現ベクターの特定の例と組換えIGFBP発現の方法を、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第5,973,115号に見出すことができる。
【0100】
・ミメティック、アゴニストおよびアンタゴニスト
本発明は、成長因子、成長因子結合タンパク質およびビトロネクチンを含むタンパク質複合体の形成を促進、防止、または妨害可能な作用物質を企図している。そのような因子はミメティックであってもよい。用語「ミメティック」とは、タンパク質またはペプチドの特定の機能領域に似るように設計された分子のことを指し、その範囲内に、用語「アゴニスト」、「類似体」および「アンタゴニスト」を含んでいる。
【0101】
関連することに、国際公開WO第00/23469号に記載されるような、IGFとIGFBPの結合の原因となっているIGFとIGFBPの部分の解明がある。更に、国際公開WO第00/40612号に記載されるように、IGFBP−1またはIGFBP−3に選択的に結合するIGF−Iのアゴニスト変異型が作製されている。
【0102】
従って、IGFBPとVNの間のポリペプチド複合体の形成を妨害または防止する作用物質を操作設計できることが企図される。例として、VNまたはIGFBP上の結合部位に似せることによる、VNに対するIGFBPの結合と競合するペプチドが挙げられる。
【0103】
以下により詳述するように、IGF−IIは、IGFBPとビトロネクチンの間の結合を阻害できる作用物質である。IGF−IIのCドメインの34−40位置のRVSRRSR配列のV35またはS36残基をS39残基と共に欠失させ、それによってIGFBP3のHBD(Bが塩基性アミノ酸残基であるBXBBB)に似せることも提案される。これによりIGFBPとビトロネクチンの間の複合体の形成をより強く阻害できる作用物質が作成される。
【0104】
本発明により企図されるアゴニストの例は、ビトロネクチンに直接結合するようIGFBPのヘパリン結合ドメイン(HBD)を含むように操作設計したIGF−1である。例えば、IGF−IのCドメインのSSSRRAPQT配列は、BXBBBモチーフを有するように操作設計され得る。好ましいBXBBBモチーフはIGFBP−3のKGRKR配列(残基228−232)である。
【0105】
代わりに、IGF−IIの推定ビトロネクチン結合ドメイン:RVSRRSR(残基34−40)をIGF−Iに導入してもよい。
本発明のアンタゴニストの例は、ビトロネクチンへのIGFBPの結合を減小または防止するようにHBD(上述)の塩基性残基を変異するように操作設計されたIGFBPである。
【0106】
適切には、操作設計されたIGFBPはIGF−Iに結合することができる。
好ましくは、操作設計されたIGFBPはIGFBP−3またはIGFBP−5である。
【0107】
さらには、IGFBP類似体とVNの間の複合体の形成を可能にする、IGFBPの類似体を操作設計することも企図される。適切には、類似体はIGFにも結合する。そのような類似体の考えられる利点は、それがIGFBPよりもより容易に合成または単離され、特定の所望の生物学的半減期を有し、また、おそらくIGF−Iに特異的に結合するように操作設計されるということである。
【0108】
上述のミメティックは、所望の生物活性と半減期を有するペプチド、ポリペプチド、または他の有機分子、好ましくは小さな有機分子であってよい。
コンピュータ支援の構造データベース検索は、ミメティックを同定するための方法としてますます頻繁に利用されるようになっている。ミメティックの同定に原則的に適したデータベース検索法を、引用によりそれぞれが本明細書に組み込まれる国際公開WO第94/18232号(HIV抗原ミメティックの生産に関する)、米国特許第5,752,019号、および国際公開WO第97/4 1526号(EPOミメティックの同定に関する)に見出すことができる。
【0109】
他の方法には、分子の相互作用を同定する様々な生物物理学的技術が含まれる。これらにより、例えば候補分子がIGF−IGFBP−VN複合体の形成に影響を及ぼすか否かによる候補分子のスクリーニングが可能となる。競合放射リガンド結合アッセイ(関連する方法についてはUpton et al., 1999前掲を参照)、分析超遠心法、微量熱量測定法、表面プラスモン共鳴、および光学バイオセンサに基づく方法のような、潜在的に有用な技術に適用できる方法が、 CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Coligan et al.編, (John Wiley & Sons, 1997) の第20章に与えられている。
【0110】
・医薬組成物
本発明は、医薬組成物の形式での本発明のタンパク質複合体の投与を包含している。本発明の医薬組成物は、上述のように変異型IGFおよび/またはIGFBP、または単離タンパク質複合体の形成を妨害または防止する作用物質を含む単離タンパク質複合体を含んでよい。
【0111】
適切には、医薬組成物は医薬として許容される担体を含む。医薬組成物はさらに、上述のように定義したポリペプチド変異型、断片またはミメティックを含んでよい。
【0112】
「医薬として許容される担体」とは、全身性投与に安全に使用することができる固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に依存して、当該技術分野で周知の様々な担体を使用することができる。そのような担体は、糖、デンプン、セルロースとその誘導体、麦芽、ゼラチン、滑石、硫酸カルシウム、植物油、合成油、多価アルコール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張食塩水、および発熱物質を含まない水から選択することができる。
【0113】
いかなる適切な投与経路を、本発明の組成物を患者に提供するために使用してもよい。例えば口、直腸、非経口、舌下、頬、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮、および同様な経路を使用することができる。免疫原組成物、ワクチンおよびDNAワクチンの投与用には、例えば筋肉内注射や皮下注射が適している。
【0114】
投与形態としては、タブレット、分散剤、懸濁液、注射液、溶液、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐薬、エアゾール剤、経皮パッチ、および同様な投与形態が挙げられる。これらの投与形態には、さらに特にその目的のために設計された注射用または埋設用の制御放出デバイスや、そのような様式でさらに作用するように改変された他の形式のインプラントも含まれる。治療薬の制御放出は、該治療薬を、例えばアクリル樹脂のような疎水性ポリマー、ろう、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースを始めとするセルロース誘導体でコーティングにより達成することができる。さらに制御放出は、他のポリマーマトリクス、リポソーム、および/またはミクロスフェアの使用によっても達成することができる。
【0115】
経口または非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、粉末または顆粒として、あるいは、溶液としてまたは水性溶液、非水性溶液、水中油滴型エマルジョン、または油中水滴型エマルジョン中の懸濁物として、1または複数の所定量の治療薬を各々が含む、カプセル、サシェ、または錠剤のような個別のユニットとして与えられる。
【0116】
IGFとIGFBPを含む医薬組成物に関しては、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第5,936,064号および国際公開WO第99/62536号およびWO第99/54359号が特に参照される。
【0117】
本発明の医薬組成物は、ワクシニアなどのウイルスベクターや遺伝子治療に有用なウイルスベクターを始めとする発現ベクターをさらに含んでもよい。後者のウイルスベクターには、Braun-Falco et al.,1999, Gene Ther. 6 432 に記載されているようなアデノウイルスおよびアデノウイルス関連ウイルス(AAV)ベクター、Buchshacher et al., 2000, Blood 95 2499 に記載されているようなレトロウイルスベクターやレンチウイルスベクター、および単純性疱疹ウイルスやサイトメガロウイルスに由来するベクターが含まれる。内分泌系の遺伝子治療に有用なウイルスベクターの概説は、Stone et al., 2000, J. Endocrinol. 164 103に提供される。
【0118】
本発明は、米国特許第5,958,764号に記載されているような上皮細胞への遺伝子発現をターゲットとする特定の発現ベクターや、米国特許第5,962,427号に記載されているようなインビボの創傷治癒の用途のための特定の発現ベクターも使用することができる。
上述の刊行物はいずれも引用により本明細書に組み込まれる。
【0119】
・治療のための使用方法
本発明は、発明のポリペプチド複合体を使用する処置方法を提供する。そのような方法は、哺乳動物、特にヒトの治療的処置を目的とする。
そのような方法は、上述で定義した医薬組成物の投与から成り、米国特許第6,090,790号に記載されているような特定の組織部位への極微針注射、米国特許第6,054,122号に記載されているような創傷、火傷または潰瘍に適用される局所クリーム、ローションまたは封止剤ドレッシング、または国際公開WO第99/47070号に記載されているような組成物を放出するインプラントによるものであってよい。
【0120】
この点に関して、米国特許第5,929,040号や米国特許第5,962,427号に記載されている方法によるような、遺伝子治療も適用可能である。
所望の成長因子の発現を遺伝子操作するというように、皮膚代替物を形成するために皮膚の細胞を遺伝子操作する方法も存在する(Supp et al., 2000, J. Invest. Dermatol. 114 5 )。この分野の概説の例が、Bevan et al., Biotechnol. Gent. Eng. Rev. 16231 で与えられている。
【0121】
さらには、国際公開WO第99/11789号に記載されているように、トランスフェクト細胞または形質転換細胞をレシピエントに「接種」することも企図される。
【0122】
これらの方法は、細胞増殖を刺激することにより、創傷や火傷の治癒;潰瘍などの皮膚病変の修復;自己由来の皮膚のインビトロ培養のような組織置換法または移植;腎臓や肺のような内臓の再上皮化;ならびに損傷した神経組織の修復;を促進または進行させるために使用することができる。
【0123】
皮膚置換療法は当該技術分野でよく知られるようになってきており、例えばKehe et al., 1999, Arch. Dermatol. Res. 291 600 に記載されているような同時培養上皮/ケラチン生成細胞の細胞系統や、初代(通常自己由来)上皮、真皮、および/またはケラチン生成細胞のインビトロ培養の使用を採用することができる。これらの技術では、操作設計された生体材料や合成ポリマー「足場」をさらに利用することもできる。
【0124】
この分野の概説の例は、一般に、Terskikh & Vasiliev, 1999, Int. Rev. Cytol. 188 41およびEaglestein & Falanga, 1998, Cutis 62 1で与えられている。
【0125】
より詳しくは、頭蓋顔面外科手術に有用な置換口腔粘膜の生産が、Izumi et al., 2000, J. Dent. Res. 79 798に記載されている。胎児のケラチン生成細胞および真皮の繊維芽細胞は、Fauza et al., J. Pediatr. Surg. 33 357に記載されているように、皮膚病変を治療するグラフトのための皮膚を生産するためインビトロで拡張することができる。また、ヒアルロン酸から誘導した生体材料上でインビトロ培養した真皮および上皮皮膚成分からの皮膚代替物が、火傷の処置に潜在的に有用であることが示されている(Zacchi et al., 1998, J. Biomed. Mater. Res, 40 187)。
【0126】
上皮細胞治療の別の態様は、胃腸管の障害を治療または予防するための胃腸上皮裏層の治癒に関する。
例えばSheridan et al., 2000, J. Control Release 14 91 やFauza et al., 1998, 前掲に記載されているような置換皮膚の操作設計を容易にするためのポリマー足場や、皮膚細胞を創傷や火傷に運ぶ作用物質としてのミクロスフェア(LaFrance & Armstrong, 1999, Tissue Eng. 5 153 )も企図される。
【0127】
上述の技術は、組織置換の目的および美容用の皮膚の処置の目的で皮膚細胞の増殖を促進するために本発明の単離タンパク質複合体を使用することにより、本発明に従って容易に利用することができる。
【0128】
骨再生に関しては、本発明は、本発明の単離タンパク質複合体でコーティング、含浸、またはそれ以外の方法で前処理した外科用または補綴用インプラントを提供する。
【0129】
反対に、IGF−IGFBP−VN複合体の形成を防止または妨害することにより細胞増殖および細胞移動の阻害または抑制は、乾癬や、乳癌のような上皮癌を始めとする悪性腫瘍の予防または治療のための処置を構成し得る。
【0130】
本発明はさらに、幹細胞または前駆細胞に本発明の単離タンパク質複合体を投与することにより、幹細胞または前駆細胞を分化させる方法も企図する。変異型成長因子とIGFBPを含む単離タンパク質複合体もこの方法に適用可能である。
【0131】
この方法に従って生産された分化細胞は、上述したような治療方法に有用であり得る。
例えば、平滑筋細胞は「間充織幹細胞」であると考えられており、繊維芽細胞、間質細胞、内皮細胞、骨または脂肪細胞に分化するように駆動することができる。
【0132】
本発明が容易に理解され実際の効果をもたらすように、ここで特定の好ましい実施形態を、非限定的な以下の実施例により説明する。
ここで説明するすべての競合放射リガンド結合アッセイは、本質的にUpton et al.,1999 、前掲に説明されている通りに実行した。
【0133】
(実施例1)
ビトロネクチンとの結合に関してインスリン、proIGF−IIおよびIGF−IがIGF−IIと競合する能力を評価する競合結合アッセイ
IGFとインスリンとの間で共有される構造類似性のため、ビトロネクチンへのインスリンの結合について調べた。Upton et al.,1999、前掲によって行なわれた架橋実験は、ビトロネクチンとの結合に関してインスリンがIGF−IIと競合する可能性は、IGF−Iの場合と同様に低いことを示していた。結果として、ビトロネクチンとの結合に関してインスリンが放射標識IGF−IIと競合するかどうかを確かめるために、高濃度のインスリンが調べられた。図1に示した結果は、IGF−I(Upton et al.,1999、前掲)で本来観察された状況では、インスリンがビトロネクチンとの結合に関して[125I]−IGF−IIとあまり競合しないことを示した。
【0134】
ビトロネクチンに結合するIGF−IIの競合物質としてのIGF−Iの調査によると、IGF−Iがビトロネクチンに対する[125I]−IGF−IIの結合と競合し得ることが明らかになった。しかしながら、IGF−Iはビトロネクチンとの結合に関する放射標識IGF−IIとの競合においてIGF−IIよりは明らかに有効性が低く、同じ効果を達成するのにIGF−IIを超える約3000倍のIGF−I濃度の増加を必要とした。
【0135】
同様の研究により、proIGE−IIがビトロネクチンとの結合に関して[125I]−IGF−IIと競合し得ることが実証された(図3)。proIGE−IIはビトロネクチンとの結合に関して[125I]−IGF−IIと競合する際にIGF−IIほどには有効でなく、IC50値はそれぞれ65.6nM、9.6nMであった。従って、proIGF−II内のEドメインの存在は、ビトロネクチンへの結合を変更する構造的改変を表わす。これはproIGF−IIではIGF−IIと比較して追加ドメインによる立体障害があることによるか、またはビトロネクチンに対するproIGF−IIの親和性を変更するproIGF−II分子の構造の変化の結果である可能性がある。
【0136】
参考例2)
ビトロネクチンに対するIGF−II結合のための競合物質としてのPAI−1とuPARの検討
PAI−1とsuPARはビトロネクチンに結合することが報告されているため(Declerck et al., 1988, J. Biol. Chem. 263 15454; Wei et al., 1994, J. Biol. Chem. 269 32380; Kanse et al., 1996, Exp. Cell Res. 224 344 )、これらのタンパク質をビトロネクチンとの結合に関してIGF−IIと競合する可能性がある分子として検討した。2000nMまでの濃度で、ビトロネクチンとの結合に関する[125I]−IGF−IIとのPAI−1の競合は、約524nMのIC50値で観察された(図4)。この濃度はIC50値の点では比較的高い値であるが、そのような濃度は腫瘍に関してインビボで見出すことができる(Grondahi-Hansen et al., 1993, Cancer Res. 53 2513)。実際、Kjoller et al., 1997, Exp. Cell Res. 232 420 は、PAI−1がWISH細胞の細胞移動を阻止する能力を評価するアッセイで最大の半分の効果を達成するためには、370nMのPAI−1が必要とされることを見出した。この阻害は、ビトロネクチンとの結合に関してインテグリンおよびuPARと競合するPAI−1を介して生じると仮定された。従って、PAI−1、IGF−IIおよびビトロネクチン間で観察される相互作用は、特に腫瘍でしばしば見出されるようにIGF−IIとPAI−1が高レベルで発現している時には、実際にインビボのいくつかの機能的結果を有する可能性がある。
【0137】
PAI−1はビトロネクチンのN末端ソマトメジンBドメインに結合することが知られているが、ビトロネクチンとの結合に関してIGF−IIと有効に競合するには高濃度のPAI−1が必要であることは、そのような研究がビトロネクチン上の結合部位に対するIGF−IIの位置決定に関する何の明確な情報も提供していないことを示唆した。しかしながら、結果は2通りに解釈することが可能である。第1の可能性は、IGF−IIとPAI−1間に観察される競争が、立体障害によるソマトメジンBドメイン内のビトロネクチン上の高親和性部位での部分的競争によるということである。代わりに、競争は、PAI−1が低い親和性で結合するビトロネクチン上の部位への結合に関する、IGF−IIとPAI−1間の直接的な競争によるという可能性もある。この問題を明らかにするにはさらなる実験的研究が必要である。
【0138】
本発明者は、可溶性suPARがVNに対するIGF−IIの結合に競合することを示すことができなかったが、これは凍結乾燥suPARが国際的輸送後に使用されたという事実によるものである可能性がある。再構成suPARが再構成後に生物活性である証拠はないが、[125I]−suPARがVNに結合しなかった(データ非図示)という観察は、これらの研究で使用したsuPARが不活性であったことを支持している。
【0139】
ビトロネクチン上のPAI−1結合部位が44個のN末端アミノ酸を含むビトロネクチンの断片内にあることを同定したのと同様な技術を使用すると(Deng et al., 1995, Thromb. Haemost. 74 66 )、ビトロネクチンに対するPAI−1とIGF−II間で観察される競争が上述のいずれの可能性の結果によるものかを確認することができる。
【0140】
可溶形式のウロキナーゼ受容体(suPAR)が固定化ビトロネクチンに結合可能であることは以前に示されている(Wei et al., 1994, 前掲)。しかしながら、本明細書で報告した研究では、300nMまでの濃度でさえ、ビトロネクチンとの結合に関するsuPARと[125I]−IGF−IIの間の競争は観察されなかった。
【0141】
(実施例3)
非グリコシル化組換えIGFBP−3の存在下でのビトロネクチンへのIGE−IおよびIGE−IIの結合
IGFBPがビトロネクチンへのIGFの結合を媒介可能であるかどうかを調べるために、[125I]−IGF−Iまたは[125I]−IGF−IIの存在下でのIGFBP−3の増大濃度の効果を評価した。その結果を図5に示す。
【0142】
試験した濃度では、1ウェル当たり10ngのIGFBP−3がビトロネクチンコートしたウェルへの大量の[125I]−IGF−Iの結合を引き起こし、30ngのIGFBP−3がビトロネクチンコートしたウェルへの大量の[125I]−IGF−IIの結合を引き起こした。この効果は[125I]−IGF−Iの場合に最も顕著であった。というのは、低カウントの[125I]−IGF−Iがビトロネクチンに結合し、最も低いIGFBP−3濃度(3.7ng)でさえも、この結合は増大したからである(図5A)。反対に[125I]−IGF−IIは、11ng/100μL〜33ng/100μLの濃度に達するまで、ビトロネクチンコートしたウェルのみで得られる結合に対する増加は示さなかった(図5B)。
【0143】
125I]−IGF−Iまたは[125I]−IGF−IIのいずれかとIGFBP−3をプレインキュベーションしても、IGFBP−3と[125I]−IGF−Iまたは[125I]−IGF−IIとの非プレインキュベーション濃度に比較して、ビトロネクチンへの結合は変わらなかった。
【0144】
(実施例4)
哺乳動物細胞中で生産された組換えIGFBPの存在下でのビトロネクチンへのIGF−Iの結合
放射標識として同時添加するIGFBPの存在下でVNコートしたディッシュに[125I]−IGF−Iが結合する能力を調べる結合アッセイを、Upton et al.,1999 、前掲に記載の通りに行った。そのデータを図6に示す。IGFBP−2、−4、−5の量を増大させると、ビトロネクチンをコートしたウェルへのIGF−Iの結合が増大した。試験した最大量である5ngでは、VNは存在するがIGFBPは存在しない対照ウェルと比較して、標識IGF−Iの結合がIGFBP−2、−4、−5についてそれぞれ約2.8倍、約3.8倍、および約8倍増大した。
【0145】
0.05、0.2および0.5ng/ウェルでのIGFBP−3の存在も、VNへの標識IGF−Iの結合を増加させ、2ngおよび5ngのIGFBP−3/ウェルは放射標識の結合を阻害するように思われた。試験したすべてのIGFBP−1および−6の濃度も阻害的であった。
【0146】
これらの結果は、IGF−IIについての状況と異なり、VNへのIGF−Iの最小の直接的結合が観察されることを実証している。しかしながら、IGFBP、特にIGFBP−2、−3、−4および−5の存在は、VNコートウェルへのIGFの結合を高め、これはIGFBPがこの状況でVNへのIGF−Iの結合を媒介することを示唆している。さらにデータは、a)存在するIGFBPの種類、b)IGFBPの量に依存して、VNへのIGF−Iの結合を増強および阻害する潜在能力を有すること示唆している。
【0147】
(実施例5)
IGFBP−3変異型の存在下でのVNへの標識IGF−Iの結合
推定「ヘパリン結合ドメイン」が変異されたIGFBP−3変異型(IGFBP−3 HBD)とグリコシル部位が変異された変異型(Non−gly IGFBP−3)の存在下でのVNコートディッシュへの[125I]−IGF−Iの結合能力を調べる結合アッセイを、上述の通りに行った。そのデータを図7に示す。
【0148】
この結合研究に使用したIGFBP−3グリコシル化変異型は、位置Asn89、Asn109、Asn172にAlaに変異された3つのO−グリコシル化部位を有していた。
【0149】
IGFBP−3 HBD変異型はVNコートディッシュへの[125I]−IGF−Iの結合を増強しなかったが、これはIGFBP−3のヘパリン結合ドメインがVNへのIGFBP−3の結合に関与することを示唆している。他の研究が、推定「ヘパリン結合ドメイン」の外側のアミノ酸残基がIGFBP−3へのIGF−Iの結合の原因であることを突きとめられている。従って、結果は、IGFBP−3への標識IGF−Iの結合の減少ではなく、VNへのIGFBP−3の結合の減小を表す可能性が非常に高い(Imai et al., 2000, J Biol Chem 275:18188-18194)。
【0150】
興味深いことに、非グリコシル化IGFBP−3変異型はVNコートディッシュへの[125I]−IGF−Iの結合を有意に増大した。2ngの変異型IGFBP−3の存在下でのVNコートディッシュへの標識IGF−Iの結合の著しい20倍の増加は、興味をそそるものであり、IGFBP−3のグリコシル化がa)IGFBP−3に対するIGF−Iまたはb)VNとのIGFBP−3のいずれかの相互作用を阻害することを示唆している。あるいは、いずれの相互作用も炭水化物の存在により阻害される可能性がある。
【0151】
非グリコシル化IGFBP−3がインビボで機能的に重要であるかどうかはまだ確定していない。しかしながら、上記の発見は、VNに結合した非グリコシル化IGFBP−3が、細胞増殖の刺激のような細胞機能を強めるためにIGF−Iが要求される部位にIGF−Iを送達する有用な方法であり得る。あるいは、VNに結合した非グリコシル化IGFBP−3は、IGF−Iを過剰発現している腫瘍のように細胞増殖が要求されない状況での過剰IGF−Iを隔離する機構を提供する可能性がある。
【0152】
(実施例6)
非グリコシル化組換えIGFBP−3の存在下でVNへの結合に関して標識IGFと競合するIGF変異型の能力を評価する競合結合アッセイ
IGFとdesIGFの増大濃度がIGFBP3の存在下でのビトロネクチンへの結合に関して放射標識IGFと競合できるかどうかを決定するために、図5で示した放射標識IGFの最大結合を生じさせたIGFBP3の濃度を使用した。結果は、IGF−I、IGF−II、des(1−6)IGF−II、また、恐らく同様にdes(1−3)IGF−I(図示しない)が高濃度で、10ngのIGFBP3の存在下でビトロネクチンへの[125I]−IGF−IIの結合と競争できることを示している(図8)。これらの実験結果は、IGF−I、−IIおよびdes(1−6)IGF−IIが、30ngのIGFBP3の存在下でのみ、ビトロネクチンコートウェルへの結合に関してIGF−IIと競合できることを示した。
【0153】
(実施例7)
IGE−IIとビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体による細胞増殖の刺激
VNにIGF−IIを予め結合させるストラテジーをこの研究で使用して、インビボで細胞外環境をより正確に反映しようと試みた。ほとんどの細胞培養法は、溶液相に外因性の基質を加えるため、細胞は絶えず処理に曝されている。組織中の細胞はインビボではこのような「絶え間ない溶液相」の環境には遭遇していない。従って、この研究のために採用した方法は、VNにIGFを予め結合させること、つまり、インビボの状態をより正確に反映する状況であった。
【0154】
培養皿でVNにIGFを予め結合させた後、細胞をウェルに接種し、タンパク質合成を刺激するためにVNに対してIGFが複合体形成する能力を既に確立された方法により検討した(Francis et al., 1986, Biochem J. 233:207-2 13 )。タンパク質合成の増大は、細胞数の増加と相関しており、従って細胞増殖を反映している。VNまたはIGFが存在しない対照ウェルを超えるパーセントで表される応答により、48時間にわたって新たに合成されたタンパク質への[H]−ロイシンの取り込みを測定した。
【0155】
図9のデータを参照すると、3、10、30、100、300および1000ngのIGF−IIをVNの不在下でウェルと予め結合させると、対照ウェル(−VN、−IGF)を超える8、12、10、16、24および43%の応答がそれぞれ観察された。さらに、VNコートウェルに予め結合させた同じ濃度のIGF−IIは、それぞれ19、29、39、51、70および101%の効果でタンパク質への[H]−ロイシンの取り込みを刺激した。VNのみで得られた応答(12%)をIGF−IIのみで得られた応答(上記を参照)と組み合わせると、3、10、30、100、300および1000ngのIGF−IIに対して、それぞれ20、24、22、28、36および55%の予想された相加効果が生じる。これらの値は、試験した2つの最小量のIGF−II(3ngと10ng)を除くすべての適用量でIGF−IIをVNと予め結合させた時に観察される実際の効果とは有意に異なっていた(p<0.05)。従って、VNへのIGF−IIの事前結合は、計算された相加効果よりも5〜46%大きい範囲にわたってタンパク質合成の相乗効果を刺激する。これらの応答は、VNへのIGF−IIの直接的結合の結果であり得、IGFBPを介したVNへのIGF−IIの間接的結合からも生じ得る。HaCATケラチン生成細胞は大量のIGFBP−3を生産する(Wraight et al., 1994, J. Invest. Dermatol 103:627-631 )。
【0156】
(実施例8)
哺乳動物細胞中で生産された組換えIGFBPの存在下でのVNへの標識IGE−IIの結合
放射標識として同時添加するIGFBPの存在下でVNコートしたディッシュに[125I]−IGF−IIが結合する能力を調べる結合アッセイを、Upton et al.,1999 、前掲に記載の通りに行った。この研究に使用するIGFBPは哺乳動物細胞で生産し、グリコシル化した。図10に示すように、IGFBP−1、−3および−6の量を増加させると、用量依存的な様式でビトロネクチンコートウェルへの標識IGF−IIの結合の減小が生じた。IGFBP−2も、IGFBP−1、−3および−6よりは効果は低いが、VNへの標識IGF−IIの結合に競合するように思われた。他方、IGFBP−4はVNへのIGF−IIの結合にほとんど効果がなく、IGFBP−5はわずかな程度にIGF−IIの結合を増強するように思われた。IGFBP−3の阻害効果は、VN上の同じ結合領域へのIGF−IIの結合に、IGFBP−3が競合することから生じている可能性がある。あるいはまたはさらには、IGFBP−3の阻害効果は、IGFBP−1および−6と同様、VNに対するIGF−IIの親和性がそれらのIGFBPに対するIGF−IIの結合親和性よりも小さいことから生じている可能性がある。従って、それらのIGFBPはIGF−IIを隔離し、複合体はVNに結合しない。
【0157】
(実施例9)
IGE−I、IGEBP−5およびビトロネクチンを含む単離タンパク質複合体による細胞増殖の刺激
表2を参照すると、IGF−Iは、IGFBP−5およびビトロネクチンと共に、試験したすべての濃度でケラチン生成細胞の増殖を刺激し(新しく合成されたタンパク質へのH−ロイシンの取り込みにより測定)、試験した最大量で相乗効果が観察された。
【0158】
細胞増殖時の単離タンパク質複合体の効果は、表2に記載された比較的低量よりも高いIGFBP−5濃度ではさらに大きいことが、本発明者により提唱される。
【0159】
(実施例10)
IGFとIGEBP変異型の操作設計
ECMとの会合に重要で、推定「ヘパリン結合ドメイン」として定義された、IGFBP−3中のアミノ酸残基は、228−232位置のKGRKR残基である。同様の残基がIGFBP−5の対応する領域に見出される。本明細書で報告した結合研究で使用したIGFBP−3 HBD変異型は、IGFBP−1の対応位置に見出されるアミノ酸に基づいてMDGEAに変化したKGRKR残基を有していた。このような変化により、タンパク質のこの一部に電荷の逆転が生じる。この変異型はまだIGF−IおよびIGF−IIと高い親和性で結合するが、酸不安定性サブユニットおよび細胞表面とはあまり結合しない(Firth et al., 1998, J. Biol. Chem. 273 263 1-2638 )。
【0160】
多様なタンパク質中のヘパリン結合モチーフが、もともとCardin et al., 1989, Arteriosclerosis 9 2 1-32に記述されている。
【0161】
ヒトIGF−IIのC−ドメインは、多くの正電荷アミノ酸残基を含んでおり、特に34−40位置にアミノ酸RVSRRSRを含んでいる。正電荷アミノ酸が細胞表面へおよびVNへのIGFBPの結合を媒介するのに重要であると仮定すると、IGF−II中のこれらのアミノ酸はVNにIGF−IIを直接結合させるのに重要であり得る。にもかかわらず、S39と共にV35またはS36の欠失を備えたIGF−II変異型を作成することにより、IGFBP−3(BXBBB、Bは塩基性アミノ酸)で見出されるのと同様な「ヘパリン結合モチーフ」を導入することは、比較的単純な方法であろう。VNへのIGF−IIの結合を媒介する際の正の残基の重要性は、VNへのニワトリIGF−II変異型である(desR40)−IGF−IIの結合が減小するという本発明者の証拠によりさらに示される。
【0162】
他方、IGF−IのC−ドメインは、IGF−IIに対して上述したタンパク質の対応領域に、アミノ酸の比較的非荷電の延長部を含んでいる。このことは、なぜIGF−IがVNに直接結合しないかを説明するかもしれない。さらにインスリンは、やはりVN(またはIGFBP)に結合しないが、成熟タンパク質に開裂した時に対応するC−ドメインを有しない。
ヒトIGF−I SSSRRAPQT
ヒトIGF−II RVSRRS−−R
IGF−IへのIGF−IIのRVSRRSR配列またはIGFBP3のKGRKR配列の導入により、IGF−IをVNに直接結合することができた。
【0163】
(実施例11)
単離タンパク質複合体、細胞増殖および生存
細胞生存経路の重大な要素であるbcl−2転写は、αv−β3インテグリンを介してVNに付着した細胞で上昇する(Matter & Ruoslahti, 2001, J. Biol. Chem. 276 27757-27763)。さらにIGF−Iは、AKT依存的様式でbcl−2転写を上昇することにより、細胞をアポトーシスから保護する(Pugazhenthi et al.,1999,. J Biol. Chem. 274 27529-35)。IGF受容体は、細胞増殖への相乗効果に関して、αv−β3インテグリンと物理的に結合している(Schneller et al.,1997, EMBO J 16 5600-5607)。従って、本発明の単離タンパク質複合体は、インテグリンと成長因子受容体との療法により媒介される細胞生存シグナルを開始するための組み込みの細胞外の地点を提供するかもしれない。
【0164】
IGFBP−5は前立腺癌細胞におけるIGF−Iの抗アポトーシスおよび細胞分裂促進の効果を強めることが実証されている(Miyake et al., 2000, Endocrinol. 141 2257-2265)。さらに、神経膠腫細胞および結腸直腸腺癌によるインビボでのVNの合成は腫瘍のグレードと相関する(Uhm et al., 1999, Clin Cancer Res. 5 1587-1594; Tomasini-Johansson et al., 1994, Exp Cell Res. 214 303-312; Gladson et al., 1995, J. Cell Sci. 108 947-56; Gladson & Cheresh, 1991, J. Clin. Invest. 88 1924-32 )。
【0165】
従って、本発明によれば、インビボで形成されるIGF:IGFBP:VN複合体は、腫瘍細胞の生存と進行を促進し得ることが提案される。従って、本発明はインビボでの複合体形成を妨害する治療薬を企図する。
【0166】
VNのヘパリン結合ドメインは、フィブロネクチンマトリックスの組み立てを阻害することが報告されている(Hocking et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 27257-27264)。フィブロネクチン堆積の減少は、細胞移動速度の減小が重合したフィブロネクチンの増加レベルと関係しているため、腫瘍細胞の侵入に関係している(Morla et al., 1994, Nature 367 193-196)。従って、VNのヘパリン結合ドメインに結合したIGF:IGFBP複合体は、フィブロネクチンマトリックスの組み立てを阻止、局所結合組織の腫瘍侵入を促進する。従って、本発明は、腫瘍侵入性を減少するためにそれらのインビボ複合体を妨害する治療薬を企図する。
【0167】
単離タンパク質複合体と創傷治癒
逆の議論が、創傷修復のように細胞移動が必要とされる状況での複合体の使用を支援するために使用することができる。IGF系は創傷治癒に重要な役割を果たしており、IGF−IとIGFBP−3の両方が創傷流体中にかなりの濃度で存在する(Skottner et al., 1990, Acta Scand. Suppl. 367 63-66; Clark R (ed) 1996, Molecular and Cell Biology of Wound Repair, pp 3-50, Plenum Press, New York; Robertson et al., 1996, Endocrinol. 137 2774-2784; Vogt et al.,1998, Growth Horm. IGF Res. 8 Suppl B:107-9.)。
【0168】
IGFBPは創傷からのIGFクリアランスの速度を減小させることが実証されている。(Robertson et al., 1999,. Am J Physiol. 276 E663-71)。IGFBP−3:IGF−I複合体はインビトロでフィブリン塊に結合する。これは、この現象がインビボでも起こり、創傷部位でのIGF−Iの集中を生じさせることを示唆している(Campbell et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 30215-30221 )。同様に、ビトロネクチンはフィブリンに結合する(Podor et al., 2000, J. Biol. Chem. 275 19788-19794)。ビトロネクチン無効マウスでは創傷フィブリン溶解が増大し、微小血管の血管新生が減少することにも留意する(Jang et al., 2000, Surgery 127 696-704)。
【0169】
本発明によれば、IGFBPに結合したIGFがVNに結合でき、VNが次にフィブリン塊と結合し、創傷部位でのIGFの蓄積が起こることが提案される。従って、修復プロセスを加速するために、本発明の単離タンパク質複合体を創傷に投与することが可能である。
【0170】
本発明によって企図される創傷治癒の特定の態様は、糖尿病性の足の潰瘍を治療することに関する。糖尿病患者では創傷の治癒が遅れる。成長因子は治癒プロセスに影響を及ぼすが、特に、IGFはケラチン生成細胞増殖を刺激することが示されている。しかしながら、糖尿病患者の皮膚と足の潰瘍から得た組織の分析から、非糖尿病患者からの組織切片と比較して、基底層と繊維芽細胞でのIGF−Iの発現が欠如することが明らかとなっている。(Blakytny et al., 2000, J. Pathol. 190 589-594 )。本発明の単離タンパク質複合体は、これらの種類の創傷へIGF−Iを送達するのに有用であり得る。
【0171】
単離タンパク質複合体と骨の設計
IGFBP−5は、IGF受容体とは無関係のメカニズムにより、骨への標識IGF−Iの結合を促進し(Mohan et al.,1995,. J. Biol. Chem 270 20424-20431 )、IGF刺激される骨芽細胞の機能を増強する(Andress, 1995, J. Biol. Chem. 270 28289-28296 )。
【0172】
インプラント材料であるヒドロキシルアパタイトは多くの研究において、既存の骨との非常に高い生体適合性を有し、既存の骨によく取り込まれることが示されている。最近の証拠によると、ヒドロキシルアパタイトは、チタンやステンレス鋼のような他の一般に用いられているインプラント材料よりもより多くのVNを、血清から吸収するであろうことが見出されている。VNの吸収には骨芽細胞前駆細胞のより大きな結合が伴う(Kilpadi et al., 2001, J. Biomed. Mater. Res. 57 258-267 )。
【0173】
ナノフェーズアルミナ対従来のアルミナに対するVNの影響が最近調べられ、VNは骨芽細胞の接着を増強することがわかった(Webster et al., 2001, Tissue Eng 7 29 1-301 )。
【0174】
本発明者は、本発明の単離タンパク質複合体が上記材料に施すコーティングとして有用であり、そのために股関節置換術のような整形外科的応用での骨細胞の接着、成長および取り込みを加速することを提唱する。
【0175】
VNはウサギ骨細胞培養物中のIGF−I刺激された破骨細胞の再吸収およびプロテイナーゼ活性を増強し(Rousselle et al., 2001, Histology & Histopathology 16 727-734 )、IGFBP−5はIGF刺激された骨芽細胞の有糸分裂誘発を増強する(Andress & Birubaum, 1992, J. Biol. Chem. 267 22467-22472)。
【0176】
本発明者は、骨細胞により生産される主なIGFBPがIGFBP−5であるため、VNによるIGF効果の増強がIGFBP−5にも関与することを提唱する。
【0177】
単離タンパク質複合体とアテローム性動脈硬化の治療
IGF−Iは以前から、実験的アテローム性動脈硬化病変の発達に関与していた。さらに、αv−β3阻害剤は、アテローム性動脈硬化病変を減少させることが実証された。これはIGF−I媒介シグナル伝達の阻害に関与する(Nichols et al., 1999, Circ. Res. 851040-1045)。
【0178】
以下のことを仮定すると、
(i)IGFBP−5とVNは動脈平滑筋細胞によって合成かつ分泌され、血管壁中に存在する;
(ii)IGF:IGFBP−5:VN複合体は血管の平滑筋細胞の有糸分裂誘発と移動を促進する(Nam & Clemmons, 2000, Growth Horm. IGF Res. 1 O:A2 3);
本発明者により、IGF:IGFBP−5:VN複合体がアテローム性動脈硬化病変の形成に関与することが提唱される。従って、複合体形成を妨害する治療薬はアテローム性動脈硬化の治療の可能性を有し得る。
【0179】
明細書全体にわたり、本発明を任意の1つの実施形態や特定の特徴のまとまりに限定せずに、本発明の好ましい実施形態を説明することを目的とした。従って、当業者には、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱せずに例証した特定の実施形態に様々な改変や変更を行えることが理解されるだろう。
【0180】
言及したすべての特許、科学文献、コンピュータプログラムが引用により本明細書に組み込まれることがさらに理解される。
【0181】
【表1】
Figure 0005165176
【0182】
【表2】
Figure 0005165176

【図面の簡単な説明】
【図1】1ウェル当たり300ngのビトロネクチン(VN)への結合に関する、[125I]−IGF−IIと競合するインスリン(▲)またはIGF−II(◆)の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。
【図2】1ウェル当たり300ngのビトロネクチン(VN)への結合に関する、[125I]−IGF−IIと競合するIGF−IまたはIGF−IIの増大濃度を用いた競合結合アッセイ。
【図3】1ウェル当たり300ngのビトロネクチン(VN)への結合に関する、[125I]−IGF−IIと競合するproIGF−II(■)またはIGF−II(◆)の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。
【図4】1ウェル当たり300ngのビトロネクチン(VN)への結合に関する、[125I]−IGF−IIと競合するPAI−1(■)またはIGF−II(◆)の増大濃度を用いた競合結合アッセイ。
【図5】ビトロネクチンに結合する時の、(A)IGF−IIおよびIGFBP3と、(B)IGF−IおよびIGFBP3の、プレインキュベーションの影響を比較する競合結合アッセイ。
【図6】:(A)IGFBP1、(B)IGFBP2、(C)IGFBP3、(D)IGFBP4、(E)IGFBP5および(F)IGFBP6の存在下でのVNコートウェルへの標識IGF−Iの結合。
【図7】「Gly IGFBP−3」(グリコシル化IGFBP−3)、「IGFBP−3 HBD変異型」(推定ヘパリン結合ドメインが変異したIGFBP−3、および「non−gly IGFBP−3」(非グリコシル化IGFBP−3)の存在下でのVNに対する標識IGF−Iの結合。
【図8】[125I]−IGF−Iまたは[125I]−IGF−IIとインキュベートした非グリコシル化IGFBP3と競合する、IGFおよびdesIGFの増大濃度を用いた競合結合アッセイ。
【図9】ヒトケラチン生成細胞におけるタンパク質合成の刺激。
【図10】(A)IGFBP1、(B)IGFBP2、(C)IGFBP3、(D)IGFBP4、(E)IGFBP5および(F)IGFBP6の存在下でのVNコートウェルへの標識IGF−IIの結合。

Claims (15)

  1. インスリン様成長因子−I(IGF−I)、
    IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、およびIGFBP5から成るグループから選択される成長因子結合タンパク質、および
    ビトロネクチン、
    からなる単離タンパク質複合体。
  2. 組換え形式で生産される、請求項1に記載の単離タンパク質複合体。
  3. インスリン様成長因子結合タンパク質がIGFBP3またはIGFBP5である、請求項に記載の単離タンパク質複合体。
  4. インスリン様成長因子−I(IGF−I)、
    ビトロネクチン、および
    IGFBP3およびIGFBP5から選択された非グリコシル化IGFBP、
    からなる単離タンパク質複合体。
  5. 前記非グリコシル化IGFBPはIGFBP3である請求項4に記載の単離タンパク質複合体。
  6. 請求項1または4に記載の単離タンパク質複合体の形成を防止または妨害するための、欠失または変異したHBDを有する変異型IGFBPの使用方法。
  7. 請求項1または4に記載の単離タンパク質複合体の形成を防止または妨害するための、インスリン様成長因子−II(IGF−II)の使用方法。
  8. ビトロネクチンは多量体である、請求項1または4に記載の単離タンパク質複合体。
  9. ビトロネクチンは単量体である、請求項1または4に記載の単離タンパク質複合体。
  10. 各ビトロネクチンモノマー単量体が、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、およびIGFBP5から成るグループから選択された同じかまたは異なるIGFBPに結合される、請求項に記載の単離タンパク質複合体。
  11. 前記IGFBPはビトロネクチンへのIGF−Iの結合を媒介する請求項1または4に記載の単離タンパク質複合体。
  12. 請求項1または4に記載の単離タンパク質複合体含む、細胞増殖を刺激する組成物。
  13. 請求項1または4に記載の単離タンパク質複合体を含む、外科インプラントまたは補綴。
  14. 請求項1または4に記載の組換えタンパク質複合体を発現することができる、形質転換細胞。
  15. 細胞増殖を刺激するための請求項1または4に記載の単離タンパク質複合体のインビトロにおける使用方法。
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