KR101596123B1

KR101596123B1 - 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 억제용 신규 아자인돌계 화합물 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101596123B1
Application number: KR1020140041737A
Authority: KR
Inventors: 조성찬; 김문옥; 곽영신; 이수의; 강종순; 오수진; 김선홍; 이상구; 이현선; 이현준; 최광만; 김형기; 인현주
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2016-02-19
Also published as: KR20140124723A

Abstract

본 발명은 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2(Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2) 억제용 신규 아자인돌계 화합물 및 이의 이용 등에 관한 것이다. 본 발명의 화학식 1 내지 화학식 8로 기재되는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2 (DGAT2) 억제 물질은 DGAT2를 선택적으로 억제하는 효과를 가지고, 세포수준에서 독성이 거의 없는 최초의 물질로 비만, 당뇨, 지방간, 고지혈증, 및 심혈관질환등의 대사성질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 이에 더하여 건강기능식품 조성물로도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 억제용 신규 아자인돌계 화합물 및 이의 이용{NOVEL AZAINDOLE COMPOUNDS FOR INHIBITING DIACYLGLYCEROL ACYLTRANSFERASE 2 AND USE THEREOF}

본 발명은 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2(Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2) 억제용 신규 아자인돌계 화합물 및 이의 이용 등에 관한 것이다.

최근 경제발전에 따른 생활수준의 향상으로 위생환경이 개선되고 인스턴트 음식물의 잦은 섭취와 육식 위주의 식생활 변화는 체내에 과다한 열량 에너지의 축적을 유발한다. 그러나 이러한 현대인의 식생활 변화는 운동부족으로 인한 열량 에너지 소모의 감소까지 더해짐에 따라 비만증, 고지혈증, 당뇨병, 심혈관 질환, 관상동맥질환 등의 대사성 질환 유병률이 심각한 수준에 이르게 되었다.

특히, 비만은 현재 빠르게 증가하고 있는 질병 중의 하나로서 당뇨와 같은 대사성 질환의 원인이 되는 것으로 보고되고 있으며, 비만의 주원인이 되는 중성지방의 생합성 경로에 관여하는 효소들의 기능 조절을 통한 대사성 질환 치료제 개발이 주목받고 있다. 중성지방은 생체 내에서 에너지원으로 저장기능에 있어서 매우 중요한 역할을 하지만, 장기나 조직에 과잉으로 축척 되면 비만, 고중성지방증, 지방간 등을 야기시켜 당뇨, 동맥경화, 대사이상 및 장기의 기능저하 등의 심각한 질병을 유발한다(Unger RH. 2002 Lipotoxic diseases. Annu. Rev. Med. 53: 319-336., Friedman J. 2002. Fat in all the wrong places. Nature. 415:268-269).

중성지방의 대표적인 형태인 트리글리세라이드(triglycerides, TG)의 생합성에 있어서 결정적인 효소는 아실 코에이(acyl CoA):디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제(diacylglycerol acyltransferase, DGAT)라는 효소로서 포유동물의 다양한 조직에서 발견된다. DGAT는 중성지방 합성의 주경로인 글리세롤 포스페이트(glycerol phosphate) 경로의 마지막 단계에서 디아실글리세롤(diacylglycerol)의 하이드록실기에 지방산 아실코에이(fatty acyl-CoA)를 결합시켜 TG를 합성하는 효소이다(도 1 참조). 현재 DGAT는 2가지 이소체(isoform)인 DGAT1 및 DGAT2로 밝혀져 있고 이들의 생화학적 기능은 유사하지만 조직분포(DGAT1은 소장과 지방조직, DGAT2는 간과 지방조직에서 주로 발현) 및 속해 있는 유전자 군(DGAT1은 ACAT 패밀리, DGAT2는 MGAT 패밀리)이 달라 이들의 TG 생합성에 대한 역할이 다를 것으로 예상된다(Yen CE., Stone SJ, Koliwad S, Harris C, and Farese RV. 2008. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. J. Lipid Research. 49: 2283-2301).

동물실험을 포함한 여러 연구에서 생체 내 TG의 생합성에 DGAT2가 주로 기여하는 것으로 알려져 있다. DGAT2 녹아웃(knockout) 생쥐는 TG를 거의 합성해내지 못하고 비정상적인 피부층으로 인해서 태어난 후 얼마 지나지 않아서 죽게 되는 것과는 달리, DGAT1 녹아웃(knockout) 생쥐는 TG 수준이 약간만 감소하고 생쥐의 생존에는 문제가 없음을 보여주고 있다(Stone SJ, Myers HM, Watk Feingold KR, Elias PM, and Farese RV. 2004. J. Biol. Chem. 279: 11767-11776., Smith SJ, Cases S, Jensen DR, Chen HC, Sande E, Tow B, Sanan DA, Raber J, Eckel RH, and Farese RV. 2000. Nat. Genet. 25: 87-90).

안티센스 올리고뉴클레오타이드(Antisense oligonucleotide, ASO)를 이용해 지방간동물모델에서 DGAT1 또는 DGAT2의 발현양을 감소시켜본 결과 오직 DGAT2의 양을 감소한 경우에만 지방간 증상이 완화되고 간에서의 포도당생성률이 현저히 감소된 것으로 보아, DGAT2가 지방간을 포함한 관련 대사성 질환의 치료를 위한 분자표적으로 활용될 수 있음을 강하게 증명하고 있다(Choi CS, Savage DB, Kulkarni A, Yu XX, Liu ZX, Morino K, Kim S, Distefano A, Samuel VT, Neschen S, Zhang D, Wang A, Zhang XM, Kahn M, Cline GW, Pandey SK, Geisler JG, Bhanot S, Monia BP, Shulman GI. 2007. J. Biol. Chem. 282: 22678-88., Yu XX, Murray SF, Pandey SK, Booten SL, Bao D, Song XZ, Kelly S, Chen S, McKay R, Monia BP, Bhanot S. 2005. Hepatology. 42: 362-71., Yamaguchi K, Yang L, McCall S, Huang J, Yu XX, Pandey SK, Bhanot S, Monia BP, Li YX, Diehl AM. 2007. Hepatology. 45: 1366-74).

DGAT1은 노바티스, 화이자를 비롯한 몇몇 거대 제약회사에서 비만, 당뇨, 지방간, 및 고지혈증 등을 포함한 대사성 질환의 분자표적으로 활발히 그 억제제 개발 프로그램이 진행되어 왔으며, 현재는 그 중 일부가 임상 시험 중에 있다. 또한, 국내에서도 일부 제약회사와 정부출연연구소 등에서 DGAT1의 억제물질 개발 및 이를 이용한 대사성 질환의 치료제 개발 연구가 진행 중에 있다. 반면에 DGAT2를 분자표적으로 하는 신약개발 프로그램은 국내외에서 거의 보고되지 않은 상황이다.

한편, 대사성 질환은 일반적으로 장기적인 의약품 처방이 요구되는데, 인체에 독성을 보이지 않고 DGAT2에 선택적으로 작용해서 중성지방을 감소시키는 활성물질의 개발이 매우 중요하다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 연구하던 중, 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제 2(DGAT2) 억제 물질의 스크리닝 방법을 개발하고, 특정 구조의 화합물이 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라아제 2(DGAT2)를 억제함을 발견하여, 비만, 당뇨병, 고지혈증, 동맥경화증 등의 대사성 질환을 예방, 치료, 또는 개선하기 위해 유용하게 사용될 수 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적 허용가능한 염을 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적 허용가능한 염을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 대사성 질환의 발병 또는 발병가능성이 있는 개체에 투여하여 대사성 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적 허용가능한 염을 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 조성물을 대사성 질환의 발병 또는 발병가능성이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 화학식 1 내지 화학식 8로 기재되는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2(DGAT2) 억제 물질은 DGAT2를 선택적으로 억제하는 효과를 가지고, 세포수준에서 독성이 거의 없는 최초의 물질로 비만, 당뇨, 지방간, 고지혈증, 및 심혈관질환등의 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 이에 더하여 건강기능식품 조성물로도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1의 A는 중성지방(TG)의 생합성 과정을 나타낸 도면이고, B는 세포 내 ER(endoplasmic reticulum)막에 존재하는 중성지방의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2의 A는 sf9 세포에 바큘로바이러스(baculovirus)-DGAT2를 감염시킨 후 시간별 DGAT2 발현 양상을, B는 DGAT2 발현양의 증가에 따른 DGAT2 활성의 증가를, C는 바큘로바이러스(baculovirus)-DGAT2 감염 3일 후 세포내 지방과립(lipid droplet)의 축적을 보디피 염색법(Bodipy dye)을 이용해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 2에서 뚜렷한 억제효과를 보이는 8개의 화합물의 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 8개의 아자인돌계 화합물(H2-001 내지 H2-008)을 추출 기반 분석법(conventional extraction-based assay)을 사용하여 DGAT2에 대한 각 화합물의 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 8개의 아자인돌계 화합물(H2-001 내지 H2-008)이 간세포 내 TG 생합성에 미치는 효능 검증 및 세포독성 테스트 결과를 나타낸 도면이다.
도 6의 A는 포유동물 세포 수준에서 DGAT2 선택적 억제효능 검증하기 위해 DGAT2 또는 DGAT1이 유도 과발현된 HEK293세포에서 Lipid droplet의 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이고, B는 DGAT1 또는 DGAT2 과발현 포유동물세포에서 분리된 total membrane fraction을 이용하여 DGAT1 및 DGAT2 억제효능을 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7의 A는 미분화 지방세포인 3T3-L1에서 DGAT2 억제효과를 검증하기 위해 DGAT1 억제물질을 처리한 상태에서 DGAT2 억제물질 H2-003을 양을 증가하면서 처리한 후 lipid droplet 양을 bodipy 염색법으로 측정한 결과를 나타낸 것이고, B는 같은 방법으로 H2-005를 처리한 후 경우의 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적 허용가능한 염을 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

상기 화학식 1 내지 화학식 8로 기재되는 각 화합물은 공지된 화학적인 합성 방법으로 제조하거나, 시판되는 시약을 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명자들은 기존에 사용된 DGAT 어세이가 주로 포유동물세포의 마이크로좀 분획(microsomal fraction, ER 세포막(membrane)을 포함)을 이용하기 때문에 DGAT1 및 DGAT2를 구분하지 못하는 한계를 해결하기 위해, 곤충세포인 sf9에 인간 DGAT2만을 과발현하고 이 세포에서 분리한 세포막 분획(membrane fraction)을 이용하여 신규한 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2(Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2) 억제 물질을 발굴할 수 있는 스크리닝방법을 개발하고, 상기 스크리닝 방법을 통해 DGAT2 억제 활성을 나타내는 화합물을 발굴하였다.

구체적으로, 상기의 스크리닝 방법을 통해 발굴된 억제물질 H2-001 내지 H2-008은 각각 상기 화학식 1 내지 화학식 8을 가지는 화합물로서(도 3 참조), 상기 화합물들은 DGAT2에만 선택적으로 억제효과를 보였으며(도 4 참조), 간세포 등을 이용한 다양한 효능검증에서 TG의 형성을 억제하는 것을 확인하였다(도 5 참조). 더욱이, 본 발명에 따른 아자인돌계 화합물이 포유동물 세포뿐만 아니라 미분화 지방세포(preadipose cell)에서도 DGAT2를 선택적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조). 뿐만 아니라, 다양한 유도체들을 이용한 테스트를 통해서 화학구조 중 억제활성에 중요한 활성 부분(moiety)을 규명하여 발굴된 상기 억제 물질이 후속연구를 통해서 대사성 질환의 예방용 또는 치료용 조성물로 이용이 가능하다는 것을 확인하였다.

또한, 상기 화학식 1 내지 화학식 8로 기재되는 각 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 용어 약학적으로 허용가능한 염은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 형태를 의미한다.

약학적으로 허용가능한 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동량의 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "대사성 질환"은 생체 내 물질대사의 장애에 의해 일어나는 질환을 총칭하며, 비만, 당뇨, 지방간, 및 심혈관질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "심혈관 질환"은 혈관 내 높은 지방수준으로 유도되는 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환을 의미하는 것으로 예컨대, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 아테롬성 동맥경화증, 동맥경화증, 관상동맥 경화증 또는 대동맥류 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

구체적인 일실시예에서, 본 발명의 DGAT2 억제 물질인 화학식 1 내지 화학식 8로 기재되는 화합물은 DGAT2 활성 억제 검정에서 IC₅₀이 약 5-30 μM로 확인되었다(도 4 참조).

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 대사성 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 대사성 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명으로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 대사성 질환의 발병 또는 발병가능성이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적 허용가능한 염을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품용 조성물을 제공한다. 즉, 본 발명의 조성물은 대사성 질환의 예방 또는 개선을 위하여 대사성 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 질환의 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 상기 건강기능식품용 조성물은 지질대사 과정에서 비만, 당뇨병, 고지혈증, 동맥경화증 등과 같은 대사성 질환을 유발하는 DGAT2의 활성을 효과적으로 억제하여 지질대사와 에너지대사를 효과적으로 조절하므로, 대사성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명의 건강음료용 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품용 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2( Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2 ) 억제 물질의 스크리닝 방법

본 발명자들은 DGAT2를 선택적으로 억제하는 물질을 선택하기 위한 스크리닝 방법을 개발하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 DGAT2 특이적 효소활성을 측정할 수 있는 어세이법을 확립하기 위해서 곤충세포인 sf9 세포에 baculovirus 감염법을 이용하여 DGAT2 단백질을 발현시켰다. Human DGAT2 cDNA(NCBI accession No. NM_032564)를 pFastBac1 벡터(Invitrogen)에 클로닝하고 이 후 얻어진 재조합 bacmid DNA를 sf9 세포에 형질전환하여 human DGAT2 cDNA를 포함하는 baculovirus를 조립·증폭하였다. sf9 세포(1×10⁶ cells/ml)에 10 MOI의 바이러스를 감염시키고 72 시간 후 원심분리를 통해 세포를 회수하고, homogenization buffer(250 mM sucrose, 10 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA)를 넣고 균질화 하였다. 원심분리(600g, 15분)하여 상등액만을 취하고, 이를 다시 100,000g에서 60분 동안 원심분리 하여 얻어진 침전물을 수크로오스 완충액(sucrose buffer: 250 mM sucrose, 10 mM Tris (pH 7.4))에 현탁하여 브래드포드 방법(Bradford Method)으로 단백질의 농도를 결정하였고, -80℃에 보관한 후 실험에 사용하였다.

DGAT2 단백질은 baculovirus-DGAT2(DGAT2 유전자를 포함하는 recombinant baculovirus)를 sf9 세포에 감염한 3일 후에 최대발현 양상을 보였으며(도 2A 참조), 이때 세포내에 지방 과립(lipid droplet)이 뚜렷하게 축적되는 것을 확인할 수 있었다(도 2C 참조). 이는 DGAT2의 발현에 의해서 TG가 새롭게 과량 합성되어 지방 과립(lipid droplet)의 형태로 축적되는 것으로, 먼저 세포 전체의 Membrane을 분리해서 DGAT2 단백질을 얻어내고, 이의 효소활성을 Flashplate(PerkinElmer)를 기초로 한 방사선 신탈레이션(scintillation)법으로 정량적으로 측정하고 그 결과를 도 2B 에 나타내었다.

상기의 신탈레이션(scintillation)법은 [3H]-oleoyl CoA를 기질로하여 DGAT2에 의해서 새롭게 합성된 [3H]-TG가 소수성이 강하고 아이소프로판올(isopropanol) 용매에서 다른 물질들과 분리되어 Flashplate의 벽면에 있는 신탈란트(scintillant)에 근접하는 특성을 이용한 것으로, 기존의 매뉴얼 어세이법보다 훨씬 간편해서 초고속 스크리닝(HTS)에 적합한 방법이다. 이 방법을 통해서 측정한 결과는 도 2B에 나타내었으며, 세포내의 DGAT2 발현양이 증가함에 따라서 TG의 생합성이 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 기존 매뉴얼 어세이법에서 DGAT2 효소활성을 억제하는 것으로 알려진 단백질 산화유도물질 NEM이 flashplate를 기초로 한 본 발명의 어세이법에서도 동일한 효과 보이는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 신규한 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2( Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2 ) 억제 물질

본 발명자들은 신규한 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2(Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2) 억제 물질을 발굴하고자 하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 1의 스크리닝 방법을 이용하여 여러가지 parameter(CV, signal/noise, 및 Z-factor)에 대해서 테스트한 결과, 스크리닝에 매우 적합한 수치를 보이는 것을 확인하였다. 또한, 한 반응당 (1 well in 96 well plate) 8μg의 효소 샘플로도 충분히 높은 활성을 보이는 것을 확인하였다. 더불어, 이런 최적화된 반응조건을 이용해 20,000여개의 합성화합물의 1차 스크리닝을 수행하였고, 그 결과 총 49개(0.22 %)의 유효물질(40% 이상의 활성 증감)을 확인할 수 있었다.

또한 기존에 DGAT2 효소활성 측정법으로 널리 사용되는 추출 기반 분석법(conventional extraction-based assay)을 통해서 그 효능을 재확인한 결과, 뚜렷한 억제효과를 보이는 화합물 중 비슷한 구조를 가지는 아자인돌계 화합물 8개를 확인할 수 있었다(도 3 참조).

실시예 3. 신규한 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2( Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2 ) 억제 물질의 활성 평가

실시예 2를 통해 확인된 8개의 아자인돌계 화합물(H2-001 내지 H2-008)을 추출 기반 분석법(conventional extraction-based assay)을 사용하여 DGAT2에 대한 각 화합물의 저해 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 8개의 아자인돌계 화합물(H2-001 내지 H2-008)은 약 5-30μM의 IC₅₀을 보임을 확인할 수 있었다.

또한 DGAT2와 동일한 생화학 반응에 관여하는 isozyme인 DGAT1 효소에 대한 활성도를 테스트한 결과, DGAT1에는 거의 억제효과를 보이지 않고, DGAT2에만 선택적으로 억제효능을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

실시예 4. 신규한 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2( Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2 ) 억제 물질의 세포수준의 효능 검증

실시예 2를 통해 발굴한 신규 아자인돌계 화합물의 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2(Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2) 억제 효능을 검증하기 위해 하기와 같이 실험을 실시하였다.

즉, 실시예 2에서 발굴된 유효물질 8개의 세포수준의 효능검증을 위해서 간세포에서 새롭게 합성되는 TG에 미치는 영향을 조사하였다. 간세포(HepG2)에서 [14C]-글리세롤(glycerol)을 초기 기질로 활용해서 최종적으로 얼마나 많은 [14C]-TG가 새롭게 합성되는가를 측정하는 방식으로 유효물질의 효능을 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 발굴된 아자인돌계 화합물 8개 모두 10μM 처리 조건에서 10-40% 정도의 억제효능을 보임을 확인할 수 있었다.

또한, 8개 화합물 모두 세포의 viability를 지표로 하는 독성테스트에서 거의 영향을 주지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조)

실시예 5. 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2(Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2) 선택적 억제 효능 검증

실시예 2를 통해 발굴한 신규 아자인돌계 화합물이 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2(Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2)를 선택적으로 억제하는지를 검증하기 위해 하기와 같이 실험을 실시하였다.

본 실험은 H2-001 series 전체를 대상으로 한 lipid droplet 생성 억제 효능 평가에서 H2-003과 H2-005가 가장 두드러진 효능을 보여 이 두 가지에 대해서 국한해서 실험을 실시하였다.

즉, DGAT2가 과발현된 세포의 total membrane fraction을 분리해서 DGAT2 억제 효능을 평가하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 2를 통해 발굴한 신규 아자인돌계 화합물이 DGAT1에 대한 억제효과는 현저히 낮게 나타난 반면, DGAT2에 대해서는 현저히 우수한 억제 효능을 가짐을 확인할 수 있었고, 특히 H2-003과 005가 가장 높은 효능을 보임을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 본 발명에 따른 아자인돌계 화합물이 포유동물 세포에서도 DGAT2에 선택적으로 작용함을 알 수 있었다.

실시예 6. 미분화 지방세포(preadipose cell)에서 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2(Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2) 억제 효능 검증

중성지방의 대표적인 형태인 트리글리세라이드(triglycerides, TG) 대사 연구에 널리 활용되고 있는 미분화 지방세포인 3T3-L1세포에서 DGAT2 억제물질의 효능을 평가하였다.

보다 구체적으로, 3T3-L1세포 내에 존재하는 DGAT2의 활성변화만을 측정하기 위해서 DGAT1 활성을 억제물질로 먼저 억제한 상태에서, DGAT2 억제물질인 실시예 2를 통해 발굴한 신규 아자인돌계 화합물 양을 증가시키면서 처리하였다. DGAT2의 작용에 의해서 생성되는 TG를 반영하는 lipid droplet의 양을 bodipy 염색법을 통해서 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 한편, DGAT1 억제물질로는 Roche사의 하기와 같은 화합물을 직접 합성하여 검증한 후 사용하였다.

도 7에 나타낸 바와 같이, H2-003과 005 모두 양을 증가해서 처리함에 따라서 lipid droplet의 양이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 본 발명에 따른 아자인돌계 화합물이 미분화 지방세포에서도 DGAT2 활성을 선택적으로 억제함을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

하기의 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적 허용가능한 염을 포함하는, 비만, 당뇨, 지방간 및 심혈관 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]
제1항에 있어서,
상기 조성물은 디아실글리세롤 아실트랜스퍼레이즈 2(Diacylglycerol Acyltransferase 2, DGAT2)를 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 심혈관질환은 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 아테롬성 동맥경화증, 동맥경화증, 관상동맥 경화증, 및 대동맥류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
하기의 화학식 1 내지 화학식 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적 허용가능한 염을 포함하는, 비만, 당뇨, 지방간 및 심혈관 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]
삭제
제5항에 있어서,
상기 심혈관질환은 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 아테롬성 동맥경화증, 동맥경화증, 관상동맥 경화증, 및 대동맥류로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.