KR101590174B1 - 세포 생존능 측정용 ｃｂａ-프로모터 리포터 벡터 및 그에 의해 형질감염된 세포주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 생존능 측정용 CBA-프로모터 리포터 벡터, 그에 의해 형질감염된 세포주, 상기 벡터를 포함하는 세포 생존능 측정용 키트, 세포 생존능을 측정하는 방법 및 세포 생존능에 영향을 미치는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상술한 CBA-프로모터 리포터 벡터 및 NFκB 활성을 측정할 수 있는 NFκB 리포터 벡터에 의해 형질감염된 동물세포, NFκB 활성 및 세포 생존능 측정용 키트 및 NFκB 활성 및 세포 생존능을 동시에 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 벡터 및 형질감염 세포를 이용하면 성장 및 사멸을 신속하고 간편하게 측정할 수 있으며, NFκB 활성 및 세포 생존능을 동시에 분석할 수 있다.

Description

세포 생존능 측정용 ＣＢＡ-프로모터 리포터 벡터 및 그에 의해 형질감염된 세포주{CBA-Promoter Reporter Vector for Evaluating the Cell Viability and Cell Lines Transfected with the Same}

본 발명은 세포의 성장 및 사멸을 측정할 수 있는 CBA-프로모터 리포터 벡터 및 그에 의해 형질감염된 세포주에 관한 것이다.

세포 성장, 세포 사멸을 측정하는 방법으로 MTT 어세이 및 그것의 개선된 형태인 MTS 어세이, XTT 어세이 등이 많이 사용되고 있다. 이들 방법은 공통적으로 세포의 미토콘드리아에 의한 환원에 의해 발색되는 시약을 이용하는 방법으로서, 방법에 세포에 시약을 처리한 후, 1-4시간 배양 후 색을 띠는 침전물을 용해하거나, 혹은 그 과정 없이 특정 파장의 흡광도를 측정하는 방법이다. 이러한 방법은 비교적 간편하지만, 신약 개발을 위해 수만-수십만 개의 화합물의 활성을 측정하는 경우(high-throughput screening, HTS), 한 가지 과정을 줄이는 것도 큰 시간, 비용을 절감하는 효과를 나타낸다.

본 발명에서는 특정 활성을 지는 물질을 찾아내는 HTS 시행 시, 각 물질에 의한 세포 생존력 변화를 추가적 처리 없이 멀티플레이트 리더에서 바로 측정하기 위해 형광 단백을 이용하고자 하였다. 즉, 다른 어세이 후, 형광을 측정하여 세포 생존에 대한 정도를 추가로 얻을 수 있는 시스템을 구축하는 것이다. 이를 위하여 (1) 살아있는 세포에서 지속적으로 강하게 발현하고 (2) 세포 성장 및 다른 어세이에 영향을 주지 않고 측정이 용이한 형광 단백을 발현하는 것이 필요하다. 일반적으로 특정 유전자를 강하게 발현하기 위해서는 CMV 프로모터 등 바이러스 프로모터를 주로 사용하지만, 바이러스 프로모터는 세포 종류에 따라서는 프로모터 사일런싱(silencing)이 나타나게 된다. 따라서, 지속적으로 강하게 발현하는 프로모터를 이용해야 하며 이를 위해 본 발명에서는 짧게 변형된 형태의 CBA 프로모터를 사용하였다(1).

실험에 사용되는 형광단백은 해파리에서 발견된 GFP와 그 유도체, 산호에서 발견된 DsRed와 그 유도체로 크게 나눌 수 있다. 그 중 GFP 계통은 HTS 수행을 위한 용도로 남겨두고(본 발명에서 배제하고), DsRed 계통 중에서 세포 성장 및 다른 어세이에 영향을 주지 않는 형광단백을 선택하고자 하였다. DsRed 계통의 형광단백에는 DsRed의 아미노산 서열에 변형을 주어 더 밝고, 더 빠르게 폴딩하고, 멀티머를 이루지 않게 하고, 색을 다양하게 한 여러 유사체가 제작되었다. 이에는 DsRed2, mRFP, dTomato, tdTomato, mPlum 등 여러 가지가 있으나, 이들은 모두 세포에 유독하다는 것이 알려져 있다(2, 3). 실제로 DsRed 계열 중 가장 밝은 형광단백인 tdTomato를 본 발명자들이 시험해 본 결과 HeLa 세포에서 독성을 나타냈다(데이터 미기재). 2009년 시카고 대학교의 연구진은 세포 독성이 없는 자주빛 형광단백으로 E2-크림슨(Crimson)을 개발하였다(3). 이에 본 발명에 적합한 형광단백으로 E2-크림슨(Crimson)을 선택하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 동물세포의 성장 및 사멸을 신속하고 간편하게 측정할 수 있는 리포터 벡터를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, CBA-프로모터 및 E2-크림슨 형광 유전자를 포함하는 리포터 벡터를 제작하고 이에 의해 형질감염된 세포주를 이용하면 세포 성장 및 다른 어세이에 영향을 주지 않고 효과적으로 세포의 성장 및 사멸을 측정할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 CBA-프로모터 리포터 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 리포터 벡터에 의해 형질감염된 동물세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 리포터 벡터를 포함하는 세포 생존능 측정용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 세포 생존능을 측정하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 세포 생존능에 영향을 미치는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 CBA-프로모터 리포터 벡터 및 NFκB 리포터 벡터에 의해 형질감염된 동물세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 NFκB 활성 및 세포 생존능을 측정하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 CBA-프로모터 리포터 벡터를 제공한다:

(a) CBA(chicken β-actin)-프로모터;

(b) E2-크림슨(Crimson) 형광 유전자;

(c) IRES(internal ribosome entry site) 유전자; 및

(d) 선택 표지로서의 진핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함하는 CBA-프로모터 리포터 벡터.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터를 포함하는 세포 생존능 측정용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 동물세포의 성장 및 사멸을 신속하고 간편하게 측정할 수 있는 리포터 벡터를 개발하고자 노력하였고 그 결과, CBA-프로모터 및 E2-크림슨 형광 유전자를 포함하는 리포터 벡터를 제작하고 이에 의해 형질감염된 세포주를 이용하면 세포 성장 및 다른 어세이에 영향을 주지 않고 효과적으로 세포의 성장 및 사멸을 측정할 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 리포터 벡터는 CBA-프로모터, E2-크림슨 형광 유전자, IRES 유전자 및 항생제에 대한 내성 유전자를 포함한다.

본 발명의 가장 큰 특징은 CBA-프로모터 및 E2-크림슨 형광 유전자를 이용하는 것이다.

동물세포에서 하나의 mRNA로부터 두 가지 이상의 단백질을 동시에 발현시키고자 할 때, IRES(internal ribosome entry site)를 사용하며 이 경우 대부분 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터가 사용된다. CMV 프로모터는 바이러스 프로모터로서 단백질 발현을 강하게 유도하나 시간이 지나면 단백질 발현이 약해지며, 세포 시그널에 의해 목적 단백질의 발현양이 변동된다는 단점이 있다.

본 발명자들은 상술한 단점들을 극복하고자 발현이 일정한 액틴(actin) 단백질의 프로모터인 CBA 프로모터를 리포터 벡터에 도입하였다. CBA 프로모터를 이용하면 형광 단백질 발현양의 변화가 거의 없어 세포 생존능을 정확히 측정할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 CBA-프로모터의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열에 기재되어 있다.

세포 실험에 사용되는 DsRed 계통의 형광 단백질에는 DsRed2, mRFP, dTomato, tdTomato, mPlum 등이 있으나 이들은 모두 동물세포에서 장기간 발현 시 세포 독성을 나타내는데, dsRed의 유도체인 E2-크림슨은 세포 독성이 없는 적색 형광 단백질(Red Fluorescence Protein; RFP)로 개발되었다.

본 발명에서는 세포 독성이 없는 E2-크림슨 형광 단백질이 이용되었다. E2-크림슨 형광 단백질의 자극(Exitation) 파장 및 방사(Emission) 파장은 각각 611 nm 및 646 nm이다. 본 발명에서 이용되는 E2-크림슨 형광 단백질의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제2서열에 기재되어 있다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 푸로마이신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 카나마이신에 대한 내성 유전자일 수 있다.

CBA-프로모터 리포터 벡터는 일반적으로 진핵세포주, 바람직하게는 동물세포주, 보다 바람직하게는 포유동물 세포주에 형질감염되어 이용되는 것이므로, 필요에 따라 진핵세포에서 작동하는 복제 원점을 포함할 수 있으나 필수적인 구성은 아니다. 진핵세포의 복제 원점은 f1 복제 원점, SV 40 복제 원점, pMB1 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터 pAIN, pAIP, pAIH, pAIH-E2-Crimson에는 진핵세포에서 작동하는 복제원점을 포함하지 않고, pNFκB-Ypet-SV40P 벡터는 진핵세포에서 작동하는 복제원점을 포함하며, 이는 T antigen을 발현하는 HEK293T 등의 세포에서 벡터의 증폭을 초래하여 그 발현을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터는 원핵세포에서 증폭되어야 하므로 원핵세포에서 작동하는 복제원점을 필수적으로 포함한다. 바람직하게는 원핵세포에서 작동하는 복제원점은 ColE1 복제 원점이다. 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터는 암피실린, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 등과 같은 원핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.

또한, CBA-프로모터 리포터 벡터는 전사 종결 신호로서 폴리아데닐화 시그날 서열을 필요로 한다.

본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터는 가장 바람직하게는 첨부한 도 1에 도시된 유전자 지도를 갖는다.

본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터는 CBA-프로모터 및 E2-크림슨 형광 단백질 유전자를 이용하여 신속하고 간편하게 세포의 성장 및 사멸을 측정할 수 있도록 제작된 최초의 리포터 벡터로서 세포 생존능에 영향을 미치는 물질의 스크리닝 방법에 이용되는 안정된 형질감염 진핵세포주의 구축에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터에 의해 형질감염된 동물세포를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 (a) 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터를 동물세포에 형질감염 시키는 단계; 및 (b) 상기 형질감염된 동물세포로부터 형광 신호를 측정하는 단계를 포함하는 세포 생존능 측정 방법을 제공한다.

상기한 CBA-프로모터 리포터 벡터는 세포, 바람직하게는 진핵세포, 보다 바람직하게는 동물세포에 형질감염 될 수 있다. 동물세포로의 형질감염은 칼슘 포스페이트 공동-침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 양 이온성 리포좀 이용법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)) 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

숙주 세포내로 주입된 리포터 벡터는 무작위 재조합 기작을 통해 세포내의 염색체상에 삽입되어 세포내 숙주세포의 유전자와 동일한 양상으로, 세포의 외부 또는 내부의 변화에 반응하여 발현된다.

또한, 상기 CBA-프로모터 리포터 벡터는 동물세포에 형질감염되고, 벡터 내에 있는 항생제 내성 유전자(예: 네오마이신 내성 유전자)에 의해 형질감염되지 않은 세포와 효과적으로 선별되며, 계속적인 선별 및 배양을 통해, 상기 벡터가 숙주세포의 염색체에 삽입되어 있는 안정된 세포주를 구축하게 된다. 한편, 본 명세서에서 “안정된 세포주”는 CBA-프로모터 리포터 벡터가 세포내의 크로모좀 상에 안정되게 삽입된 세포주를 의미한다. 즉, 이런 세포주를 구성하는 모든 세포는 항상 CBA-프로모터 리포터 벡터를 세포내의 크로모좀 상에 가지게 되는 것이다.

본 발명의 일실시예로서, 본 발명은 도 1에 도시된 pAIH-E2-크림슨 벡터에 의해 형질감염된 HEKAR 세포 및 HeLaR 세포를 제공한다. 상기 본 발명의 형질감염된 세포주는 세포 생존능을 측정하는데 별도의 형질감염 과정 없이 유용하게 이용될 수 있고, 특히 세포 생존능에 영향을 미치는 물질을 스크리닝 하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, CBA-프로모터 리포터 벡터를 동물세포에 형질감염 시킨 다음, 선택 표지로서 진핵세포에 작용하는 항생제를 이용하여 형질감염 세포를 선별하여 이를 배양시킨 후, 세포 배양액을 제거한 다음 E2-크림슨 형광을 측정함으로써 살아있는 세포의 수, 즉 세포 생존능을 바로 계산할 수 있다.

종래의 세포 생존능 분석 방법(MTT 어세이)에 따르면, 세포를 배양한 다음 분석하고자 하는 시료를 처리하고 배양액을 제거한 후, 분석 용액을 일정 시간 동안 처리(약 1-20시간)하여 흡광도를 측정한다. 반면, 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터에 의해 형질감염된 동물세포를 이용하는 경우, 분석하고자 하는 시료를 상기 형질감염된 동물세포에 처리한 다음, 배양 배지를 제거한 후 바로 형광값을 측정함으로써 빠르고 간편하게 세포 생존능을 분석할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, CBA-프로모터 리포터 벡터에 의해 형질감염된 동물세포에서 세포 수에 따른 세포 생존능 정도의 차이를 확인하기 위해 세포 양을 달리하여 배양한 후 일반 동물세포(MTT 어세이) 및 본 발명의 동물세포를 비교 분석한 결과, 본 발명의 형질감염 동물세포를 이용한 경우 MTT 어세이 결과와 유사한 결과를 나타냈다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 (a) 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터를 동물세포에 형질감염(transfection) 시키는 단계; (b) 상기 형질 감염시킨 동물세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 시험 물질이 세포 생존능에 영향을 미치는지 여부를 형광 신호를 측정하여 분석하는 단계를 포함하는 세포 생존능에 영향을 미치는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터가 형질감염된 세포주를 이용하는 경우, 검사하고자 하는 시험 물질을 단순히 첨가하여 반응을 진행시킨 다음, 세포로부터 발현되는 형광 단백질 신호를 측정하여 분석함으로써 세포 생존능에 영향을 미치는 물질을 신속ㆍ정확하게 탐색할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 (a) 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터; 및 (b) 동물세포에서 작동하는 복제 원점, NFκB 유전자, Ypet 형광 유전자, SV40 프로모터 및 선택 표지로서의 진핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함하는 NFκB 리포터 벡터에 의해 형질감염된 동물세포를 제공한다.

본 발명의 NFκB 리포터 벡터는 NFκB 활성에 따라 GFP 계통의 형광 단백질인 Ypet을 발현하게 하는 리포터 벡터로 동물세포에서 작동하는 복제 원점, NFκB 유전자, Ypet 형광 유전자, SV40 프로모터 및 선택 표지로서의 진핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함한다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 푸로마이신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 카나마이신에 대한 내성 유전자일 수 있다.

NFκB 리포터 벡터는 일반적으로 진핵세포주, 바람직하게는 동물세포주, 보다 바람직하게는 포유동물 세포주에 형질감염되어 이용되는 것이므로, 진핵세포에서 작동하는 복제 원점을 필요로 하고, 진핵세포의 복제 원점은 f1 복제 원점, SV 40 복제 원점, pMB1 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 NFκB 리포터 벡터가 원핵세포에서 이용되는 경우도 있으므로, 바람직하게는 pUC 복제 원점과 암피실린, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 등과 같은 원핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다.

또한, NFκB 리포터 벡터는 전사 종결 신호로서 폴리아데닐화 시그날 서열을 필요로 한다.

본 발명의 NFκB 리포터 벡터는 가장 바람직하게는 첨부한 도 4에 도시된 유전자 지도를 갖는다.

본 발명에 따르면, 본 발명에서 이용되는 NFκB 리포터 벡터는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.

본 발명의 일실시예로서, 본 발명은 도 1에 도시된 pAIH-E2-크림슨 벡터 및 도 4에 도시된 pNFκB-Ypet-SV40P 벡터에 의해 형질감염된 HEKAR-NFκB-Ypet 세포를 제공한다.

본 발명의 NFκB 리포터 벡터에 의해 발현되는 Ypet 형광 단백질의 자극(Exitation) 파장 및 방사(Emission) 파장은 각각 517 nm 및 530 nm으로 CBA-프로모터 리포터 벡터의 E2-크림슨 형광 단백질과 방사 파장이 중복되지 않는다. 따라서, NFκB 리포터 벡터 및 CBA-프로모터 리포터 벡터를 형질감염 시킨 동물세포를 이용하여 시료의 NFκB 활성과 세포 독성을 독립적으로 스크리닝 할 수 있다. 또한, NFκB 관련 HTS(High Throughput Screening) 시 세포 독성에 의한 거짓 양성(false positive) 및 거짓 음성(false negative)을 쉽게 판별할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터 및 NFκB 리포터 벡터로 형질감염된 동물세포에 TNFα를 처리하여 NFκB의 활성화를 유도한 다음, NFκB 리포터 벡터에 의해 발현되는 Ypet 형광을 측정함으로써 NFκB의 활성을 분석하였으며 동시에 E2-크림슨 형광을 측정하여 세포 생존능을 분석하였다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 (a) 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터; 및 (b) NFκB 리포터 벡터를 포함하는 NFκB 활성 및 세포 생존능(viability) 측정용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 (a) 본 발명의 CBA-프로모터 리포터 벡터 및 NFκB 리포터 벡터를 동물세포에 형질감염 시키는 단계; 및 (b) 상기 형질감염된 동물세포로부터 형광 신호를 측정하는 단계를 포함하는 NFκB 활성 및 세포 생존능 측정 방법을 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 세포 생존능 측정용 CBA-프로모터 리포터 벡터, 그에 의해 형질감염된 세포주, 상기 벡터를 포함하는 세포 생존능 측정용 키트, 세포 생존능을 측정하는 방법 및 세포 생존능에 영향을 미치는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 상술한 CBA-프로모터 리포터 벡터 및 NFκB 활성을 측정할 수 있는 NFκB 리포터 벡터에 의해 형질감염된 동물세포, NFκB 활성 및 세포 생존능 측정용 키트 및 NFκB 활성 및 세포 생존능을 동시에 측정하는 방법을 제공한다.

(c) 본 발명의 벡터 및 형질감염 세포를 이용하면 성장 및 사멸을 신속하고 간편하게 측정할 수 있으며, NFκB 활성 및 세포 생존능을 동시에 분석할 수 있다.

도 1은 CBA-프로모터 리포터 벡터의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 HEKAR 세포에서 E2-크림슨 어세이와 MTT 어세이를 비교한 결과이다.
HEKAR 세포를 96-웰 플레이트에 100, 50, 25, 12.5% 양으로 플레이팅함. 같은 플레이트를 두 개 만들어 하나는 E2-크림슨 어세이를 시행하고, 하나는 MTT 어세이를 시행하였음.
도 3은 HeLaR 세포에서 E2-크림슨 어세이와 MTT 어세이를 비교한 결과이다.
HeLaR 세포를 96-웰 플레이트에 100, 50, 25, 12.5% 양으로 플레이팅함. 같은 플레이트를 두 개 만들어 하나는 E2-크림슨 어세이를 시행하고, 하나는 MTT 어세이를 시행하여 비교함.
도 4는 NFκB 리포터 벡터의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 HEKAR 세포에서 E2-크림슨 어세이와 MTT 어세이를 비교한 결과이다.
HEKAR 세포를 96-웰 플레이트에 배양한 후, TNFα와 시클로헥시미드를 함께 처리하여 세포 사멸을 유도하였음. TNFα는 10 ng/mL로 고정하고, 시클로헥시미드의 농도를 다양하게 하여 다양한 정도의 세포 사멸을 유도하였고, 이후 E2-크림슨 어세이와 MTT 어세이를 수행하여 비교하였음.
도 6은 HEKAR-NFκB-Ypet 세포로 NFκB 활성과 세포 생존력을 동시에 측정한 결과이다.
HEKAR-NFκB-Ypet 세포를 유리바닥 디쉬에 배양하여 TNFα를 넣은 세포와 그렇지 않은 세포의 Ypet 형광, E2-크림슨 형광을 공초점 현미경에서 측정함.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 플라스미드 제작

[CBA] [MCS] [IRES] [PuroR], [CBA] [MCS] [IRES] [NeoR], [CBA] [MCS] [IRES] [HygroR]의 발현 카세트를 지닌 플라스미드를 제작하여 각각 pAIP, pAIN, pAIH로 명명하였다(CBA: chicken beta actin, MCS: multiple cloning site, IRES: internal ribosomal entry site, PuroR: puromycin resistance gene, NeoR: neomycin resistance gene, HygroR: hygromycin resistance gene). 그 중 pAIH에 E2-크림슨(Crimson)을 삽입하여 pAIH-E2-크림슨을 제작하였다[CBA 프로모터-E2-Crimson-IRES-HygroR](도 1d).

NFκB 활성에 따라 GFP 계통 형광단백인 Ypet을 발현하게 하는 리포터인 pNFκB-Ypet-SV40P를 제작하였다(도 4).

실시예 2: 세포주 제작

pAIH-E2-크림슨 플라스미드를 HEK293A 세포, HeLa 세포에 형질감염 한 후 48시간부터 2주일간 하이그로마이신(hygromycin)으로 선별하였다. 이렇게 만들어진 다클론 안정세포(polyclonal stable cell)를 각각 HEKAR, HeLaR로 명명하였다. 또한, HEKAR 세포에 pNFκB-Ypet-SV40P를 형질감염 한 후, 푸로마이신(puromycin)으로 선별한 HEKAR-NFκB-Ypet 세포를 제작하였다.

실시예 3: HEKAR, HeLaR 세포에서 E2-크림슨 어세이와 MTT 어세이의 비교

MTT 어세이

세포를 96-웰 플레이트에 배양하여 적절한 처리가 끝난 후, 배양액을 흡인(suction)하고 미리 데워둔 MTT 용액(10% FBS를 포함하는 DMEM에 1 mg/mL)을 100 μL 넣었다. 2 시간 배양 후, 배지를 흡인하고 100 μL MTT 용해 용액(12.5% 디메틸 포름아미드에 5% SDS, pH 7.4)을 넣어 15시간 더 배양하여 형성된 포르마잔 크리스탈을 녹인 다음, 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포가 없는 웰을 세포 생존력 0%, 아무런 처리를 하지 않은 웰을 100%로 하여 세포 생존력을 계산하였다.

E2-크림슨 어세이

세포를 96-웰 플레이트에 배양하여 적절한 처리가 끝난 후, 배지를 흡인하고 자극(Exitation) 파장 611 nm 및 방사(Emission) 파장 646 nm에서 형광을 측정하였다. 계산은 MTT 어세이와 동일하다.

세포 양에 따른 세포 생존력 정도가 반영되는 것을 확인하기 위해 세포의 양을 100, 50, 25, 12.5%로 달리하여 배양한 후, MTT 어세이, E2-크림슨 어세이를 비교하였다. 그 결과, HEKAR 세포, HeLaR 세포 모두 MTT 어세이와 E2-크림슨 어세이가 같은 성능을 나타내었다(도 2, 3).

세포가 죽는 경우, 거기에서 발생되는 잔해들이 어세이에 영향을 미칠 수 있으므로 세포사멸을 일으키는 자극인 TNFα 및 사이클로헥시미드의 공동처리로 HEKAR 세포 사멸을 유도한 후, MTT 어세이와 E2-크림슨 어세이를 비교하였다. 그 결과 MTT 어세이와 E2-크림슨 어세이가 같은 추세를 반영함을 알 수 있다(도 5).

실시예 4: HEKAR-NFκB-Ypet 세포로 NFκB 활성과 세포 생존력을 동시에 측정

본 연구의 결과 실제로 적용한 예로서 HEKAR-NFκB-Ypet 세포를 제작하였다. 이 세포는 Ypet 형광(Ex 517/Em 530)으로는 NFκB 활성을 측정하고, E2-크림슨 형광(Ex 611/Em 646)으로는 세포 생존력을 측정할 수 있게 고안된 세포이다. 이 세포에 TNFα를 처리한 후, Ypet 형광과 E2-크림슨 형광을 측정한 결과, Ypet은 5배 증가하였으나, E2-크림슨은 차이가 없었다. 이를 공초점 현미경으로 측정한 결과는 도 6과 같다.

참고문헌

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3) Strack RL, Hein B, Bhattacharyya D, Hell SW, Keenan RJ, and Glick BS, Biochemistry, 48, 8279-8281 (2009).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation Yonsei University <120> CBA-Promoter Reporter Vector for Evaluating the Cell Viability and Cell Lines Transfected with the Same <130> PN130621 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6653 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAIH-E2-Crimson Vector <400> 1 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 240 gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc 300 cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 360 ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 420 cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc 480 ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa 540 ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg 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Claims (10)

1. (a) CBA(chicken β-actin)-프로모터; (b) E2-크림슨(Crimson) 형광 유전자; (c) IRES(internal ribosome entry site) 유전자; 및 (d) 선택 표지로서의 진핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함하는 세포 생존능(viability) 측정용 CBA-프로모터 리포터 벡터.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 CBA-프로모터 리포터 벡터는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 벡터.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항의 CBA-프로모터 리포터 벡터에 의해 형질감염된 동물세포.
   
4. 제 1 항 또는 제 2 항의 CBA-프로모터 리포터 벡터를 포함하는 세포 생존능(viability) 측정용 키트.
   
5. 다음 단계를 포함하는 세포 생존능 측정 방법:
   (a) 제 1 항 또는 제 2 항의 CBA-프로모터 리포터 벡터를 동물세포에 형질감염(transfection) 시키는 단계; 및
   (b) 상기 형질 감염된 동물세포로부터 형광 신호를 측정하는 단계.
   
6. 다음 단계를 포함하는 세포 생존능에 영향을 미치는 물질을 스크리닝하는 방법:
   (a) 제 1 항 또는 제 2 항의 CBA-프로모터 리포터 벡터를 동물세포에 형질감염(transfection) 시키는 단계;
   (b) 상기 형질 감염시킨 동물세포에 시험 물질을 접촉시키는 단계; 및
   (c) 상기 시험 물질이 세포 생존능에 영향을 미치는지 여부를 형광 신호를 측정하여 분석하는 단계.
   
7. 다음 리포터 벡터에 의해 형질감염된 동물세포:
   (a) 제 1 항 또는 제 2 항의 CBA-프로모터 리포터 벡터; 및
   (b) 동물세포에서 작동하는 복제 원점, NFκB 유전자, Ypet 형광 유전자, SV40 프로모터 및 선택 표지로서의 진핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함하는 NFκB 리포터 벡터.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 NFκB 리포터 벡터는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 동물세포.
   
9. 제 7 항의 CBA-프로모터 리포터 벡터 및 NFκB 리포터 벡터를 포함하는 NFκB 활성 및 세포 생존능(viability) 동시 측정용 키트.
   
10. 다음 단계를 포함하는 NFκB 활성 및 세포 생존능 측정 방법:
    (a) 제 7 항의 CBA-프로모터 리포터 벡터 및 NFκB 리포터 벡터를 동물세포에 형질감염(transfection) 시키는 단계; 및
    (b) 상기 형질 감염된 동물세포로부터 형광 신호를 측정하는 단계.

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