KR101588949B1

KR101588949B1 - 플루나리진을 유효성분으로 함유하는 뇌암에 대한 항암 활성 보조제

Info

Publication number: KR101588949B1
Application number: KR1020140029647A
Authority: KR
Inventors: 최경숙; 김인영
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2014-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2016-01-29
Also published as: KR20150107936A

Abstract

본 발명은 플루나리진을 유효성분으로 함유하는 뇌암의 항암활성 보조제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 프로테아좀 저해제 단독으로 뇌암 세포에서 항암효과를 나타내지 못하지만, 플루나리진을 함께 투여하거나, 플루나리진을 함께 포함하는 조성물로 제공되면 프로테아좀 저해제의 뇌암 세포 사멸을 효과적으로 유도하며 고농도의 프로테아좀 저해제에 의한 부작용을 감소시키면서 뇌암의 항암효과를 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 프로테아좀 저해제 및 플루나리진 혼합조성물은 뇌암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 플루나리진은 프로테아좀 저해제를 이용한 뇌암 치료 시 항암 보조제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

플루나리진을 유효성분으로 함유하는 뇌암에 대한 항암 활성 보조제{Anti-cancer supplement agent comprising flunarizine for glioma}

본 발명은 혈액암 환자에게 고농도로 사용할 경우에 효과적인 치료제이지만,고형암에는 항암 효과가 없는 보테조밉, 칼필조밉, MLN9708, 에폭소마이신 및 MG132와 같은 프로테아좀 저해제에 플루나리진을 항암활성 보조제로 함께 투여하여 뇌암에 대한 항암효과를 유도한 뇌암 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 세포 내에서 단백질 분해 역할을 하여 세포 내 항상성을 유지하고 세포의 운명을 조절하는 신호기전으로 유비퀴틴은 수명이 다한 단백질에 달라붙어 분해되어야 할 단백질을 표지하는 인체 내 단백질이며 프로테아좀은 실제 단백질을 분해하는 효소이다.

유비퀴틴은 수명이 다한 단백질에 꼬리표처럼 달라붙는데 이것을 프로테아좀이 인지하고 단백질을 분해시킨다. 이후 유비퀴틴은 떨어져 나와 똑같은 역할을 되풀이 한다. 이러한 유비퀴틴-프로테아좀 시스템이 의해 분해된 단백질은 작은 펩타이드나 아미노산이 되어 다른 단백질 합성에 재사용된다.

또한 유비퀴틴-프로테아좀 시스템은 외부 항원을 분해시켜 격퇴하는 면역 시스템과 세포 분열 과정에도 관여하는데, 프로테아좀 시스템의 손상은 분해되지 않은 단백질이 뉴론(neuron)에 축적되어 발생하는 헌팅톤병(Huntington diseases)과 같은 퇴행성 신경질환의 병인 기전으로 의심되고 있다. 이렇듯 프로테아좀 시스템이 단백질 분해과정에 중요한 역할을 하기 때문에 이들의 구조나 역할이 밝혀지면 여러 질환의 치료제를 개발할 수 있을 것으로 기대되고 있다.

암과 관련해서는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템이 박스-베타(box-beta) 또는 녹사(Noxa)와 같이 세포사멸을 유도하는 세포내 단백질을 분해시켜 세포 사멸의 진행을 억제하여 암세포가 계속 증식하게 된다. 이러한 프로테아좀을 저해하는 약물은 암세포의 세포 사멸을 촉진시킬 것으로 기대되어 졌으며, 실제로 보테조밉이 프로테아좀 저해제로서는 첫 번째로 , 칼필조밉이 두 번째로 FDA 승인을 받았다.

보테조밉(N-(2-피라진)카보닐-L-페닐알라닌-L-류신 보론산; Velcade^TM로 시판, Millennuim Pharmaceuticals)은 여러 신 종양 질환(neoplastic disease)의 치료, 특히 재발성 골수종(relapsed multiple myeloma) 및 외투막 세포 림프종(mantle cell lymphoma) 치료에 사용이 승인된 26S 프로테아좀 저해제이다.

상기 보테조밉은 보테조밉 내 붕소 원자가 프로테아좀의 촉매 자리에 결합하여, 프로테아좀 활성을 저해하고 아폽토시스 촉진 인자(pro-apoptotic factor)의 분해를 감소시켜 세포의 아폽토시스를 촉발시키는 것으로 보고되어 졌다.

한편, 한국공개특허 제10-2007-7027765호에서는 암 및 기타 질병의 치료 및 관리를 위해 프로테아좀 억제제를 이용하는 방법 및 조성물을 개시하면서, 다수의 항암제 중 보테조밉을 개시하고 있으며, 보테조밉이 다발성 골수종과 임파선 암에만 효과를 보이는 반면, 다른 백혈병이나 고형암에 대한 항암 효과는 입증하지 못하고 있다.

본 발명자들은 다양한 프로테아좀 저해제를 이용하여 고형암에서도 암세포 증식을 막고 세포 사멸을 촉진시킬 수 있는 방법에 대해 연구하던 중, 프로테아좀 저해제 보테조밉, 칼필조밉, MLN9708, 에폭소마이신 또는 MG132 중 어느 하나와 편두통 약으로 사용되고 있는 플루나리진을 병용투여 할 경우 플루나리진이 프로테아좀 저해제의 항암효과를 감작하여 뇌암에서 암세포 사멸을 효과적으로 유도함으로써 매우 우수한 항암효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 보테조밉과 같은 다양한 프로테아좀 저해제를 사용하여 뇌암에서 효과적으로 암세포 사멸을 유도할 수 있는 병용 가능한 약물로 플루나리진을 유효성분으로 함유하는 항암보조제 또는 뇌암 치료용 약학조성물을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플루나리진을 유효성분으로 함유하는 뇌암에 대한 항암활성 보조제를 제공한다.

상기 플루나리진은 프로테아좀 저해제의 항암제 내성을 감소시킬 수 있다.

상기 프로테아좀 저해제는 보테조밉, 칼필조밉, MLN9708, 에폭소마이신 및 MG132로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명은 프로테아좀 저해제와 플루나리진을 유효성분으로 함유하는 뇌암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 약학조성물은 프로테아좀 저해제 1 내지 50 중량% 및 플루나리진 50 내지 99 중량%를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 프로테아좀 저해제와 플루나리진을 뇌암세포에 병용투여 하는 것을 특징으로 하는 뇌암 세포 사멸 증진 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 프로테아좀 저해제 또는 플루나리진을 뇌암 세포에 각각 단독으로 처리할 경우 뇌암 세포의 사멸을 유도하지 않았으나, 병용 처리할 경우 서로 상승적으로 뇌암 세포 사멸을 효과적으로 유도하였다. 또한 프로테아좀 저해제와 플루나리진을 유효성분으로 함유한 조성물 또는 병용투여는 저농도의 프로테아좀 저해제로도 효과적인 뇌암 세포 사멸을 유도하였다.

따라서, 플루나리진은 고농도의 프로테아좀 저해제에 대한 의한 부작용을 감소시키고 뇌암 세포에 대한 항암 효과를 증진시킬 수 있는 항암활성보조제 또는 뇌암 치료용 약학조성물로 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 플루나리진과 병용 투여된 프로테아좀 저해제의 종류 및 각각의 화학식을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 보테조밉(BZ)과 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암 효과를 뇌암 세포인 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에서 확인한 세포생존도 분석 결과이다.
도 3은 본 발명의 보테조밉(BZ)과 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암 효과를 뇌암 세포인 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에서 확인한 아이소볼로그램 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 칼필조밉(Car.)과 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암 효과를 뇌암 세포인 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에서 확인한 세포생존도 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 칼필조밉(Car.)과 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암 효과를 뇌암 세포인 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에서 확인한 아이소볼로그램 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 MLN9708(MLN)과 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암 효과를 뇌암 세포인 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에서 확인한 세포생존도 분석 결과이다.
도 7은 본 발명의 MLN9708(MLN)과 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암 효과를 뇌암 세포인 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에서 아이소볼로그램 분석 결과로 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 에폭소마이신(Epo.)과 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암 효과를 뇌암 세포인 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에서 확인한 세포생존도 분석 결과이다.
도 9는 본 발명의 에폭소마이신(Epo.)과 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암 효과를 뇌암 세포인 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에서 확인한 아이소볼로그램 분석 결과이다.
도 10은 본 발명의 MG132와 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암 효과를 뇌암 세포인 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에서 세포생존도 분석 결과로 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 MG132와 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암 효과를 뇌암 세포인 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에서 확인한 아이소볼로그램 분석 결과이다.

본 발명은 플루나리진을 유효성분으로 함유하는 뇌암에 대한 항암활성 보조제를 제공한다.

보다 상세하게는 플루나리진은 도 1의 화학식 2와 같이 표시될 수 있다.

보다 상세하게는 보테조밉, 칼필조밉, MLN9708, 에폭소마이신 및 MG132는 도 1의 화학식 1과 같이 표시될 수 있다.

이때, 본 발명에 따른 약학조성물에서 상기 프로테아좀 저해제는 상기 함량범위를 벗어나 과량으로 함유되면 저혈압의 급성 발현과 혈소판 감소 등의 문제가 야기될 수 있고, 소량으로 함유되면 약제 효과 부족의 문제가 야기될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 프로테아좀 저해제 1.0 mg/m²/day 내지 1.3 mg/m²/day 및 플루나리진 2 mg/day 내지 6 mg/day의 양을 주 2회 1~4 주기로 투여할 수 있다.　

또한, 이러한 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물을 구성하는 프로테아좀 저해제와 플루나리진은 이미 다른 의학적 용도에 처방되고 있어 안전성이 확보되어 있는 물질이다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이. 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물은 뇌암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

하기의 실험예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

<실험예>

1. 세포 배양

본 발명에서 사용된 뇌암 세포 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주는 ATCC (American Type Culture Collection, USA)에서 분양받았다. 뇌암 세포 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주는 배양과 유지를 위해 10% FBS (fetal bovine serum), L-그루타민 (2 mM), 페니실린 (100 i.u./ml) 및 스트렙토마이신 (10 mg/ml)이 포함되어 있는 DMEM 배지를 사용하여 배양하였으며, 배양 조건은 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 수행하였다.

2. 화학물질

프로테아좀 저해제인 보테조밉, 칼필조밉, MLN9708은 셀레켐 (Selleckchem, Houston, TX, USA)에서 구입하였으며, 에폭소마이신, MG132, 플루나리진은 씨그마(Sigma Chemical Corporation)에서 구입하였다.

칼세인-AM (calcein acetoxymethyl ester)와 EthD-1 (ethidium homodimer)는 인비트로젠(Invitrogen , Carlsbad, CA)에서 구입하였다.

3. 세포생존도 측정

각종 뇌암 세포주에 대한 프로테아좀 저해제와 플루나리진 단독 빛 병합 처리에 의한 세포 생존도를 측정하기 위하여, 각각의 세포주를 24 웰 플레이트에 웰 당 세포 수가 T98G 3x10⁴, U87MG 5x10⁴, U251MG 5x10⁴또는 U373MG 4x10⁴이 되도록 접종하고, 다양한 농도의 프로테아좀 저해제 및 0 내지 100μM 플루나리진을 각각 단독으로 또는 병용하여 12 시간 동안 처리하였다. 그 다음 2 μM 칼세인-AM과 4 μM EthD-1을 이용하여 세포를 염색하고 형광 현미경(Axiovert 200M, Carl Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 세포 생존도를 측정하였다.

4. 아이소볼로그램 분석

T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에 각 프로테아좀 저해제와 플루나리진 단독 또는 병합처리 시 항암 효과를 확인하고 각 화합물의 효과적인 농도를 결정하기 위하여 아이소볼로그램 분석을 진행하였다. 각 프로테아좀 저해제와 플루나리진의 상호작용은 전형적인 아이소볼로그램에 따른 조합 지수(CI)를 측정하여 정량하였다.

아이소볼로그램 정량법은 CI = (D)₁/(Dx)₁ + (D)₂/(Dx)₂로 여기서 (Dx)₁과 (Dx)₂는 각 프로테아좀 저해제와 플루나리진의 효과를 나타내는데 필요한 개별 용량이며, (D)₁과 (D)₂는 각 프로테아좀 저해제와 플루나리진을 병합처리 하였을 때 동등한 효과를 나타낼 수 있는 용량을 나타낸다. 이러한 분석을 통하여 두 약물의 병합효과를 CI < 1은 상승작용, CI = 1은 가중, CI > 1 길항작용으로 나타내었다.

5. 통계분석

모든 데이터는 적어도 3번의 반복 실험 결과를 ±표준편차(SD)로 나타내었으며, t-테스트를 통하여 약물 처리군과 대조군간의 세포 생존도 차이를 평가하였다.

여러 그룹의 결과는 본펠로니 다중비교법(Bonferroni multiple comparison test)에 따라 일원 분산 분석하였으며, P < 0.05를 의미 있는 값으로 보았다.

< 실시예 1> 뇌암 세포에서 보테조밉과 플루나리진의 병용 투여에 따른 항암효과 확인

T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에 플루나리진(Flunarizine)과 보르테조밉(BZ)을 도 2에 표시된 농도로 12시간 동안 단독 또는 병합처리하고 칼세인-아세톡시메틸 에스테르와 에티듐 동종이중체-1(ethidium homodimer-1)를 이용하여 세포생존도를 측정하고 도 3과 같이 아이소볼로그램 분석을 수행하였다.

그 결과 표 1과 같이 T98G 세포는 보테조밉 단독 처리 시에는 20 nM 농도 까지 뚜렷한 암 세포 독성을 나타내지 않았으며, 플루나리진 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 4% 감소하였다. 보테조밉과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

또한 표 2와 같이 U87MG 세포는 보테조밉 단독 처리 시에는 30 nM 농도에서 세포생존도가 약 24% 감소하고, 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 11% 감소한 반면, 보테조밉과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

표 3과 같이 U251MG 세포는 보테조밉 단독 처리 시 30 nM 농도에서 세포생존도가 약 25% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 12% 감소한 반면, 보테조밉과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

표 4와 같이 U373MG 세포는 보테조밉 단독 처리 시 30 nM 농도에서 세포생존도가 약 28% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 9% 감소한 반면, 보테조밉과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

또한 도 3의 아이소볼로그램 분석에서도 보테조밉과 플루나리진을 병합 처리한 경우 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포 모두에서 시너지를 나타내며 효과적으로 암세포 사멸을 유도하는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 보테조밉과 플루나리진의 병용 투여가 뇌암 세포의 보테조밉에 대한 저항성을 극복하고 향상된 항암 효과가 있음을 확인하였다.

T98G
플루나리진	대조군	세포생존도
		보테조밉 첨가군
		15 nM	20 nM
0 μM	100	100	99.73
80 μM	98.63	46.01	34.99
100 μM	96.70	35.36	25.76

U87MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		보테조밉 첨가군
		15 nM	30 nM
0 μM	100	82.81	76.54
80 μM	94.20	57.58	33.82
100 μM	89.76	28.15	12.12

U251MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		보테조밉 첨가군
		20 nM	30 nM
0 μM	100	81.04	74.68
80 μM	99.44	28.49	16.76
100 μM	88.98	21.20	14.63

U373MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		보테조밉 첨가군
		20 nM	30 nM
0 μM	100	89.57	72.17
80 μM	97.55	57.95	45.41
100 μM	91.09	42.20	27.00

< 실시예 2> 뇌암 세포에서 칼필조밉과 플루나리진 병용 투여에 따른 항암 효과 확인

T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에 플루나리진 (Flunarizine)과 칼필조밉 (Car)을 도 4에 표시된 농도로 12시간 동안 단독 또는 병합처리하고 칼세인-아세톡시메틸 에스테르와 에티듐 동종이중체-1(ethidium homodimer-1)를 이용하여 세포생존도를 측정하고 도 5와 같이 아이소볼로그램 분석을 수행하였다.

그 결과 표 5와 같이 T98G 세포는 칼필조밉 단독 처리 시에는 300 nM 농도에서 세포생존도가 약 20% 감소하고, 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 4% 감소한 반면, 칼필조밉과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

또한 표 6과 같이 U87MG 세포는 칼필조밉 단독 처리 시에는 500 nM 농도에서 세포생존도가 약 21% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 15% 감소한 반면, 칼필조밉과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

표 7과 같이 U251MG 세포는 칼필조밉 단독 처리 시에는 1000 nM 농도에서 세포생존도가 약 15% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 12% 감소한 반면, 칼필조밉과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

표 8과 같이 U373MG 세포는 칼필조밉 단독 처리 시에는 1000 nM 에서 세포생존도가 약 17% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 9% 감소한 반면, 칼필조밉과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

또한 도 5의 아이소볼로그램 분석에서도 칼필조밉과 플루나리진을 병합 처리한 경우 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포 모두에서 시너지를 나타내며 효과적으로 암세포 사멸을 유도하는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 칼필조밉과 플루나리진의 병용 투여가 뇌암 세포에서 칼필조밉에 대한 저항성을 극복하고 향상된 항암 효과가 있음을 확인하였다.

T98G
플루나리진	대조군	세포생존도
		칼필조밉 첨가군
		200 nM	300 nM
0 μM	100	95.31	79.82
80 μM	98.63	38.23	20.36
100 μM	96.70	19.11	13.77

U87MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		칼필조밉 첨가군
		250 nM	500 nM
0 μM	100	87.29	78.86
80 μM	94.20	30.30	22.51
100 μM	84.76	13.76	2.34

U251MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		칼필조밉 첨가군
		750 nM	1000 nM
0 μM	100	98.06	85.12
80 μM	99.44	55.78	34.83
100 μM	88.98	26.45	16.55

U373MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		칼필조밉 첨가군
		750 nM	1000 nM
0 μM	100	88.88	83.19
80 μM	97.55	37.46	31.90
100 μM	91.09	29.20	23.31

< 실시예 3> 뇌암 세포에서 MLN9708 과 플루나리진 병용 투여에 따른 항암 효과 확인

T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에 플루나리진 (Flunarizine)과 MLN9708 (MLN)을 도 6에 표시된 농도로 12시간 동안 단독 또는 병합처리하고 칼세인-아세톡시메틸 에스테르와 에티듐 동종이중체-1(ethidium homodimer-1)를 이용하여 세포생존도를 측정하고 도 7과 같이 아이소볼로그램 분석을 수행하였다.

그 결과 표 9와 같이 T98G 세포는 MLN9708 단독 처리 시에는 600 nM 농도에서 세포생존도가 약 1% 감소하고, 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 4% 감소한 반면, MLN9708과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

또한 표 10과 같이 U87MG 세포는 MLN9708 단독 처리 시에는 1000 nM 농도에서 세포생존도가 약 25% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 10% 감소한 반면, MLN9708과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

표 11과 같이 U251MG 세포는 MLN9708 단독 처리 시 1500 nM 농도에서 세포생존도가 약 6% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 11% 감소한 반면, MLN9708과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

표 12와 같이 U373MG 세포는 MLN9708 단독 처리 시 1500 nM 농도에서 세포생존도가 약 15% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 9% 감소한 반면, MLN9708과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

또한 도 7의 아이소볼로그램 분석에서도 MLN9708과 플루나리진을 병합 처리한 경우 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포 모두에서 시너지를 나타내며 효과적으로 암세포 사멸을 유도하는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 MLN9708과 플루나리진의 병용 투여가 뇌암 세포의 MLN9708에 대한 저항성을 극복하고 향상된 항암 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

T98G
플루나리진	대조군	세포생존도
		MLN9708 첨가군
		400 nM	600 nM
0 μM	100	100	99.55
80 μM	98.63	62.74	40.97
100 μM	96.70	53.36	37.43

U87MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		MLN9708 첨가군
		750 nM	1000 nM
0 μM	100	90.65	74.49
80 μM	94.20	28.96	26.72
100 μM	84.76	1.42	0.71

U251MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		MLN9708 첨가군
		1000 nM	1500 nM
0 μM	100	95.13	94.09
80 μM	99.44	45.53	43.80
100 μM	88.98	22.07	11.64

U373MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		MLN9708 첨가군
		1000 nM	1500 nM
0 μM	100	87.47	85.28
80 μM	97.55	65.60	51.98
100 μM	91.09	51.68	34.57

< 실시예 4> 뇌암 세포에서 에폭소마이신과 플루나리진 병용 투여에 따른 항암 효과 확인

T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에 플루나리진 (Flunarizine)과 에폭소마이신 (Epo)을 도 8에 표시된 농도로 12시간 동안 단독 또는 병합처리하고 칼세인-아세톡시메틸 에스테르와 에티듐 동종이중체-1(ethidium homodimer-1)를 이용하여 세포생존도를 측정하고 도 9와 같이 아이소볼로그램 분석을 수행하였다.

그 결과 표 13과 같이 T98G 세포는 에폭소마이신 단독 처리 시에는 30 nM 농도에서 세포생존도가 약 8% 감소하고, 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 4% 감소한 반면, 에폭소마이신과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

또한 표 14와 같이 U87MG 세포는 에폭소마이신 단독 처리 시에는 60 nM 농도에서 세포생존도가 약 6% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 11% 감소한 반면, 에폭소마이신과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

표 15와 같이 U251MG 세포는 에폭소마이신 단독 처리 시 40 nM 농도에서 세포생존도가 약 10% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 12% 감소한 반면, 에폭소마이신과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

표 16과 같이 U373MG 세포는 에폭소마이신 단독 처리 시 60 nM 농도에서 세포생존도가 약 19% 감소하고 에폭소마이신 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 9% 감소한 반면, 에폭소마이신과 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

또한 도 9의 아이소볼로그램 분석에서도 에폭소마이신과 플루나리진을 병합 처리한 경우 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포 모두에서 시너지를 나타내며 효과적으로 암세포 사멸을 유도하는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 에폭소마이신과 플루나리진의 병용 투여가 각종 뇌암 세포의 에폭소마이신에 대한 저항성을 극복하고 향상된 항암 효과가 있음을 확인하였다.

T98G
플루나리진	대조군	세포생존도
		에폭소마이신 첨가군
		15 nM	30 nM
0 μM	100	97.30	92.58
80 μM	98.63	68.46	41.30
100 μM	96.70	52.07	35.12

U87MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		에폭소마이신 첨가군
		45 nM	60 nM
0 μM	100	95.01	94.13
80 μM	94.20	43.98	38.70
100 μM	89.76	28.15	19.64

U251MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		에폭소마이신 첨가군
		20 nM	40 nM
0 μM	100	96.50	90.63
80 μM	99.44	53.82	37.93
100 μM	88.98	24.83	18.43

U373MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		에폭소마이신 첨가군
		40 nM	60 nM
0 μM	100	90.45	81.81
80 μM	97.55	38.54	36.90
100 μM	91.09	37.72	32.45

< 실시예 5> 뇌암 세포에 MG132 과 플루나리진 병용 투여에 따른 항암 효과 확인

T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포주에 플루나리진 (Flunarizine)과 MG132 (MG)를 도 10에 표시된 농도로 12시간 동안 단독 또는 병합처리하고 칼세인-아세톡시메틸 에스테르와 에티듐 동종이중체-1(ethidium homodimer-1)를 이용하여 세포생존도를 측정하고 도 11과 같이 아이소볼로그램 분석을 수행하였다.

그 결과 표 17과 같이 T98G 세포는 MG132 단독 처리 시에는 1.5 μM 농도에서 세포생존도가 약 16% 감소하고, 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 4% 감소한 반면, MG132와 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

또한 표 18과 같이 U87MG 세포는 MG132 단독 처리 시에는 1.5 μM 농도에서 세포생존도가 약 34% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 12% 감소한 반면, MG132와 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

표 19와 같이 U251MG 세포는 MG132 단독 처리 시 1.5 μM 농도에서 세포생존도가 약 5% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 12% 감소한 반면, MG132와 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

표 20과 같이 U373MG 세포는 MG132 단독 처리 시 1.5 μM 농도에서 세포생존도가 약 23% 감소하고 플루나리진 단독 처리 시에는 100 μM 농도에서 세포생존도가 약 9% 감소한 반면, MG132와 플루나리진 병합 처리 시에는 각각의 단독 처리에 비해 유의적으로 암세포 사멸이 증가하였다.

또한 도 11의 아이소볼로그램 분석에서도 MG132와 플루나리진을 병합 처리한 경우 T98G, U87MG, U251MG 및 U373MG 세포 모두에서 시너지를 나타내며 효과적으로 암세포 사멸을 유도하는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 MG132와 플루나리진의 병용 투여가 각종 뇌암 세포의 MG132에 대한 저항성을 극복하고 향상된 항암 효과가 있음을 확인하였다.

T98G
플루나리진	대조군	세포생존도
		MG132 첨가군
		1 μM	1.5 μM
0 μM	100	92.85	84.34
80 μM	98.63	49.87	16.76
100 μM	96.70	22.89	13.95

U87MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		MG132 첨가군
		1 μM	1.5 μM
0 μM	100	78.58	66.27
80 μM	94.20	21.24	6.40
100 μM	89.76	5.39	2.09

U251MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		MG132 첨가군
		1 μM	1.5 μM
0 μM	100	98.06	95.12
80 μM	99.44	55.78	34.83
100 μM	88.98	26.45	16.55

U373MG
플루나리진	대조군	세포생존도
		MG132 첨가군
		1 μM	1.5 μM
0 μM	100	85.88	77.98
80 μM	97.55	62.85	58.65
100 μM	91.09	55.12	38.73

이하, 본 발명의 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예 1> 주사제의 제조

보테조밉 3.5 mg, 플루나리진 4 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎, 메틸파라벤 0.8 ㎎, 프로필파라벤 0.1 ㎎ 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후, 2 ㎖용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

< 제제예 2> 정제의 제조

보테조밉 3.5 mg, 플루나리진 4 mg, 유당 100 ㎎, 전분 100 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

보테조밉 3.5 mg, 플루나리진 4 mg, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

Claims

플루나리진을 유효성분으로 포함하며, 상기 플루나리진이 보테조밉, 칼필조밉, MLN9708, 에폭소마이신 및 MG132로 이루어진 군에서 선택된 프로테아좀 저해제의 항암활성을 증진시키는 뇌암에 대한 항암활성 증진용 약학조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 플루나리진은 프로테아좀 저해제의 항암활성에 대한 내성을 감소시켜 프로테아좀 저해제의 항암활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 뇌암에 대한 항암활성 증진용 약학조성물.
삭제
보테조밉, 칼필조밉, MLN9708, 에폭소마이신 및 MG132로 이루어진 군에서 선택되는 프로테아좀 저해제와 플루나리진을 유효성분으로 함유하는 뇌암 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
청구항 4에 있어서, 상기 약학조성물은 프로테아좀 저해제 1 내지 50 중량% 및 플루나리진 50 내지 99 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌암 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제