CN112274509B - 西达本胺联合bcl2抑制剂在双表达型b细胞淋巴瘤中的应用 - Google Patents

西达本胺联合bcl2抑制剂在双表达型b细胞淋巴瘤中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及西达本胺联合BCL2抑制剂在双表达型B细胞淋巴瘤中的应用，通过组成一种组合物，包含西达本胺和BCL2抑制剂，特别是例如所述BCL2抑制剂可以选择ABT‑199、ABT‑737、ABT‑263中的至少一种。本发明通过将西达本胺与BCL2抑制剂配伍制成组合物，提出了对MYC/BCL2双表达型B细胞淋巴瘤具备协同作用的治疗方案应用，并通过体外细胞实验、分子机制研究以及临床实验验证了西达本胺联合BCL2抑制剂方案治疗MYC/BCL2双表达型B细胞淋巴瘤的协同性，所述应用能够更高效的治疗该双表达型B细胞淋巴瘤患者。

Description

西达本胺联合BCL2抑制剂在双表达型B细胞淋巴瘤中的应用
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体涉及西达本胺联合BCL2抑制剂的应用及联合药物。特别是一种用于治疗MYC/BCL2双表达型B细胞淋巴瘤的药物组合物。
背景技术
MYC/BCL2双表达型(DEL)弥漫性大B细胞淋巴瘤是一类较为特殊的弥漫性大B细胞淋巴瘤，其特征为MYC/BCL2在蛋白水平的同时过表达。临床上DEL比例约占DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)的30％。该类患者具有肿瘤分期高、国际淋巴瘤预后指数(IPI)高、生存期短、预后差、复发难治等临床病例特征。临床治疗发现双表达型DLBCL较非双表达型DLBCL有更差的治疗效果，且患者多复发耐药。研究显示，经过淋巴瘤常规治疗方案(R-CHOP等)，双表达型B细胞淋巴瘤患者的完全缓解率明显低于非双表达型患者，同时双表达型B细胞淋巴瘤患者总体生存期较短，表明针对双表达型B细胞淋巴瘤患者的治疗方案亟待提高。
西达本胺(Chidamide，爱谱沙)是微芯生物自主研发的具全球专利保护的全新分子体，国际首个亚型选择性组蛋白去乙酰化酶(HDAC)口服抑制剂，可靶向抑制HDAC1、2、3、10，主要用于治疗血液肿瘤中的复发及难治性的外周T细胞淋巴瘤(PTCL)。目前，已获得临床批准用药，适用于既往至少接受过一次全身化疗的复发或难治的外周T细胞淋巴瘤(PTCL)患者。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有双表达型B细胞淋巴瘤患者治疗方案有效性亟待提高的情况下，提供更有效的西达本胺联合BCL2抑制剂用于治疗MYC/BCL2双表达型B细胞淋巴瘤的联合药物方案。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种组合物，包含西达本胺和BCL2抑制剂。
本发明采用西达本胺和BCL2抑制剂进行配伍，两种药物能够实现协同作用，发挥出更好的肿瘤治疗作用。特别是在双表达型淋巴瘤中具有协同作用，其可能的分子生物学机理是西达本胺可有效杀伤MYC过表达的肿瘤细胞，同时BCL2抑制剂可有效杀伤BCL2过表达的肿瘤细胞，两者共同作用于双表达型淋巴瘤细胞发挥出显著的药效协同促进增强作用，对于复杂的肿瘤患者治疗药物提供具有巨大潜力的组合物配方。
本发明通过将西达本胺与BCL2抑制剂配伍制成组合物，特别是西达本胺和ABT-199或ABT-737或ABT-263配伍，在淋巴瘤细胞系实验和临床试验结果中发现西达本胺与BCL2抑制剂具有较好的协同抗肿瘤效果。
西达本胺作为表观遗传基因HDAC家族(HDAC1/2/3/10)的靶向抑制剂可对肿瘤中的异常表观遗传功能实现调控作用，抑制肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡，同时可通过调节机体细胞免疫系统诱导免疫细胞介导的肿瘤杀伤作用。在本发明具体实施例中，发现在西达本胺处理B细胞淋巴瘤细胞系实验结果中西达本胺对淋巴瘤细胞具有一定杀伤作用。在11种不同淋巴瘤患者来源的细胞系中，相对于空白对照组，西达本胺药物处理组细胞存活率降低，但不同细胞系对西达本胺的敏感程度不同，我们通过实验和转录组测序(RNA-seq)出乎意料地发现细胞对西达本胺的敏感程度与细胞内的MYC表达量呈现正相关，淋巴瘤细胞对西达本胺的药物敏感度随着MYC表达量的升高而增强，同时西达本胺处理后的细胞中MYC通路下调、MYC正调控的信号通路下调、MYC负调控的信号通路上调。
BCL2抑制剂可特异靶向BCL2并抑制其抗凋亡功能，从而介导肿瘤细胞的凋亡行使肿瘤细胞杀伤功能。BCL2抑制剂之一的ABT-199(Venetoclax，维奈托克)是全球第一个针对蛋白-蛋白相互作用(PPI)的小分子抑制剂，是一种高效，有选择性和口服活性的BCL2抑制剂，已于2016年批准上市。现有研究表明BCL2抑制剂对肿瘤的杀伤效果依赖于细胞中BCL2的表达，肿瘤细胞对BCL2抑制剂的药物敏感度随着BCL2表达量升高而增强。
基于西达本胺对肿瘤细胞杀伤效果与MYC表达量之间的正相关性，BCL2抑制剂对肿瘤杀伤效果与BCL2表达量之间的正相关性，同时基于MYC/BCL2双表达型B细胞淋巴瘤具有MYC和BCL2的同时高表达，本发明发现西达本胺与BCL2抑制剂在MYC/BCL2高表达淋巴瘤细胞中具有协同作用，有较好的细胞杀伤效果。同时，采用本发明的联合用药方案一个月后，临床双表达型B细胞淋巴瘤患者(西达本胺和ABT-199联合用药)淋巴瘤病灶显著缩小直至消失。本发明细胞实验结果与临床试验结果显示西达本胺与BCL2抑制剂具有较好的协同作用，可使双表达型B细胞淋巴瘤患者的疗效显著提高。
进一步，所述BCL2抑制剂是ABT-199、ABT-737、ABT-263中的至少一种。西达本胺与ABT-199、ABT-737或ABT-263配伍的组合物在淋巴瘤中具有较好的协同作用，联合用药比单独用药可更有效的杀伤肿瘤细胞。
进一步，所述组合物在制备药物中的应用。
进一步，所述组合物在制备用于治疗淋巴瘤的药物中的应用。
优选地，所述淋巴瘤是双表达型淋巴瘤，为弥漫大B细胞淋巴瘤类中的一种。
优选地，所述组合物在制备用于治疗弥漫大B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
进一步，所述组合物在制备用于治疗MYC基因过表达的淋巴瘤的药物中的应用。
进一步，所述组合物在制备用于治疗MYC基因和BCL2基因的过表达的双表达型淋巴瘤的药物中的应用。
进一步，所述组合物在制备用于治疗MYC基因和BCL2基因的过表达的双表达型B细胞淋巴瘤的药物中的应用。
进一步，所述组合物在制备用于治疗BCL2基因过表达的淋巴瘤的药物中的应用。
进一步，所述药物组合物中还包括其他互不影响的活性成分和/或制剂辅料。
进一步，所述药物中含有效量的西达本胺。
进一步，所述药物中含有效量的ABT-199。
本发明所述的“有效量”是指包含足以改善或预防医学病症的症状或疾病的量。在用于特定患者或医学受试者以后，可以产生以下变化：待治疗的病症、患者的总体健康情况等改善。有效量还可以是至避免显著副作用或毒性作用的最大剂量以下的剂量方案。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、西达本胺与ABT-199药物在淋巴瘤中具有较好的协同作用，联合用药可更有效的杀伤肿瘤细胞。
2、两种药物在MYC/BCL2双表达型B细胞淋巴瘤中具有协同作用的机制是西达本胺可有效杀伤MYC过表达的肿瘤细胞同时BCL2抑制剂(如ABT-199、ABT-737、ABT-263)可有效杀伤BCL2过表达的肿瘤细胞。通过两种药物配伍后的协同作用，可以发挥出更好的肿瘤细胞杀伤作用。
附图说明：
图1是第一次实验的结果，显示多种人源淋巴瘤细胞系对西达本胺敏感。
图2、图3、图4是第二次实验的结果，显示多种人源淋巴瘤细胞系对西达本胺敏感。
图5和图6显示MYC基因表达量和细胞系对药物的敏感程度呈正相关(MYC基因表达量越高的细胞系对西达本胺越敏感)，细胞系对药物的IC50(IC50越低，药物敏感度越高)与MYC的表达量呈负相关。
图7和图8显示西达本胺处理后Jeko1细胞转录组测序(RNA-seq)结果，药物处理后细胞中MYC表达水平降低，MYC下游基因下调，MYC相关通路下调
图9显示在药物处理72h后实验组Karpas细胞比对照组细胞对西达本胺更加敏感。
图10显示在药物处理后72h后过表达MYC的Karpas细胞相比空载质粒对照组细胞对西达本胺更加敏感。
图11显示在西达本胺浓度为0.5μM和1μM浓度时过表达MYC的Karpas细胞相比空载质粒对照组细胞对西达本胺的敏感度显著增加。
图12显示在连续培养中过表达MYC基因的Karpas细胞系对西达本胺的敏感性有所增加。
图13显示Granta淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-199联合用药表现出良好的敏感性。
图14显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物具有较好的协同作用。
图15显示RI-1淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-199联合用药表现出良好的敏感性。
图16显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物具有较好的协同作用。
图17显示DHL-4淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-199联合用药表现出良好的敏感性。
图18显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物组合对于DHL-4淋巴瘤细胞具有协同作用。
图19显示DHL-6淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-199联合用药表现出良好的敏感性。
图20显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物组合对于DHL-6淋巴瘤细胞具有协同作用。
图21显示Jeko1淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-199联合用药表现出良好的敏感性。
图22显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物对于Jeko1淋巴瘤细胞具有协同作用。
图23显示Granta淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-737联合用药表现出良好的敏感性。
图24显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物对于Granta具有较好的协同作用。
图25显示Jeko1淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-737联合用药表现出良好的敏感性。
图26显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物对于Jeko1淋巴瘤细胞具有协同作用。
图27显示DHL-4淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-737联合用药表现出良好的敏感性。
图28显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物组合对于DHL-4淋巴瘤细胞具有协同作用。
图29显示Granta淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-263联合用药表现出良好的敏感性。
图30显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物对于Granta具有较好的协同作用。
图31显示Jeko1淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-263联合用药表现出良好的敏感性。
图32显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物对于Jeko1淋巴瘤细胞具有协同作用。
图33显示DHL-4淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-263联合用药表现出良好的敏感性。
图34显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现两种药物组合对于DHL-4淋巴瘤细胞具有协同作用。
图35是淋巴瘤患者D0(用药前)病灶大小照片。
图36是淋巴瘤患者D29(用药后)病灶大小照片。
具体实施方式
可以选择的，所述西达本胺和ABT-199BCL2抑制剂的摩尔比例为0.125μM～32μM：1nM～10μM。
例如，所述西达本胺和BCL2抑制剂ABT-199的摩尔比例为(0.125μM、0.25μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、8μM、16μM或32μM)：1nM～10μM。
再例如，所述西达本胺和BCL2抑制剂ABT-199的摩尔比例为0.125μM～32μM：(1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1000nM或10000nM)。
再例如，所述西达本胺和BCL2抑制剂ABT-199的摩尔比例为0.125μM～8μM：1nM～1000nM。优选为0.125μM～8μM：1nM～100nM。
在本发明的一个具体实施案例中，所述组合物可以应用于植被药物。其中，所述药物的剂型可以是口服给药制剂、肠胃外给药制剂、局部给药制剂、吸入/鼻内给药制剂、直肠/阴道内给药制剂、眼/耳给药制剂。
其中，所述口服给药制剂可以是片剂、颗粒剂、胶囊、酊剂、锭剂、咀嚼片、凝胶、固体溶液、脂质体、喷雾剂、液体制剂。
肠胃外给药制剂可以是针剂、注射剂、注射液、粉剂等。
局部给药制剂可以是凝胶、水凝胶、洗剂、溶液、霜剂、巴布剂、皮肤贴剂、植入物等。
直肠/阴道内给药制剂可以是栓剂、阴道栓、灌肠机等。
眼/耳给药制剂可以是悬浮液、滴剂等。
在本发明的一个具体实施案例中，所述组合物中含有效量的西达本胺。其中，西达本胺可以是小分子活性化合物，也可以是西达本胺的盐作为活性成分。或者，应用西达本胺的盐和西达本胺混合物作为活性成分。
优选地，西达本胺的盐是指西达本胺和以下至少一种酸加成盐的产物，包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、硫酸氢盐、硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、葡萄酸盐、葡萄醛酸盐、六氟磷酸盐、苯甲酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、碘酸盐、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、2-萘磺酸盐、盐酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、糖质酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐。
下面对本发明作详细的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
使用不同浓度的西达本胺(0.125μM～32μM)对多种人源淋巴瘤细胞系进行给药处理，发现淋巴瘤细胞系对西达本胺敏感，多次重复实验具有一致性。
实验方法/实验过程：实验前对所有细胞系进行细胞计数后按照每孔10000-40000个细胞将细胞铺在96孔板内，药物处理中每个药物浓度设置3个技术重复，药物浓度设置使用梯度稀释法，从最高浓度(32μM)按1:2(图1)或1:4(图2至图4)比例进行梯度稀释到最低浓度，其中Vehicle组中加入与药物处理组等量的药物溶剂DMSO，总DMSO含量为1/10000，加药后将细胞放入37度孵箱培养48h后对每个孔进行细胞计数并计算Cell viability。
实验所用人源淋巴瘤细胞系包括：Namalwa，Karpas，Romas，Daudi，SU-DHL-4，SU-DHL-6，RI1，Granta，Jeko-1，CA46，Raji。
实验结果如图1至图4所示，图中纵坐标Cell viability(％)是：药物处理组活细胞数量/空白组(Vehicle)活细胞数量。
图1是第一次实验的结果，显示多种人源淋巴瘤细胞系对西达本胺敏感。
图2至图4是第二次实验的结果，显示多种人源淋巴瘤细胞系对西达本胺敏感。
不同细胞系对西达本胺敏感程度不同，根据细胞对不同浓度西达本胺的反应计算出每种细胞系对西达本胺药物的IC50(半抑制浓度，细胞总数被杀伤一半的药物作用浓度，IC50越低，药物敏感度越高)，结果如下表所示。
表1不同细胞系对西达本胺敏感程度
DHL-4 DHL-6 Jeko-1 CA46 Karpas299 Namalwa Romas Daudi RI1 Granta Raji
IC50(μM) 4.687 4.57 0.9832 0.3908 4.257 0.4206 1.739 1.576 3.364 7.171 0.9812
实施例2
通过数据库中大数据和qPCR两种方法分析，如图5、图6所示，发现MYC基因表达量和细胞系对药物的敏感程度呈正相关(MYC基因表达量越高的细胞系对西达本胺越敏感)，细胞系对药物的IC50(IC50越低，药物敏感度越高)与MYC的表达量呈负相关。
同时将对西达本胺较为敏感的细胞系Jeko1进行RNA-seq测序分析，如图7所示，发现西达本胺处理后可显著降低MYC基因表达，同时MYC靶向的下游基因在西达本胺药物处理组也具有下调；如图8所示，发现西达本胺处理后的细胞中MYC相关通路具有下调，表明西达本胺对双表达型淋巴瘤细胞具有杀伤作用的分子机制是西达本胺可靶向肿瘤细胞中过表达的MYC蛋白，抑制其功能并杀伤肿瘤细胞。
故设计实验进行验证
选择人源淋巴瘤细胞系Karpas，通过引入插入MYC基因序列的质粒实现MYC基因过表达。
试验组：在质粒载体上插入MYC基因编码序列(hMYC)从而实现MYC基因的过表达。
对照组：用未插入MYC基因序列的空白载体(pmig)作为阴性对照组。以GFP插入质粒当中作为绿色荧光标记物，设计验证试验。
实验方法：实验前对两种细胞(阴性对照pmig组与实验组hMYC过表达组)进行计数后按照每孔10000个细胞将细胞铺在96孔板内，两种细胞均设置对照组与药物处理组，每组设置3个技术重复，药物处理使用浓度梯度稀释法，从最高浓度(32μM)按1:4比例进行梯度稀释到最低浓度(0.125μM)，其中Vehicle组中加入与药物处理组等量的药物溶剂DMSO，总DMSO含量为1/10000，加药后将细胞放入37度孵箱培养72H后对每个孔进行细胞计数并计算Cell viability。
实验结果如图9、图10、图11所示，图中曲线说明：
*Karps-pimg-P1:空载质粒对照组总活细胞数
*Karps-hMYC-P1：过表达MYC实验组总活细胞数
*Karps-pimg-GFP：对照组GFP+(绿色荧光阳性-空载)细胞数
*Karps-hMYC-GFP：实验组GFP+(绿色荧光阳性-过表达MYC)细胞数
结果显示在西达本胺药物低敏感度的淋巴瘤细胞系Karpas中过表达MYC基因表达，西达本胺药物处理72H后计算活细胞数量发现过表达MYC基因的Karpas细胞系对西达本胺的敏感性有所增加，尤其在西达本胺浓度为0.5μM、1μM时，在细胞中过表达MYC蛋白表达可显著增加细胞对西达本胺的敏感度(图11)。
实施例3
在西达本胺药物低敏感度的淋巴瘤细胞系Karpas中过表达MYC基因表达，用2μM和4μM西达本胺对细胞进行连续药物处理。
实验方法：实验前对两种细胞(阴性对照pmig组与实验组hMYC过表达组)进行计数后按照每孔10000个细胞将细胞铺在96孔板内，实验设置对照组(vehicle组)与实验组(2μM和4μM西达本胺)，每组设置3个技术性重复，其中Vehicle组中加入与药物处理组等量的药物溶剂DMSO，总DMSO含量为1/10000，加药后将细胞放入37度孵箱进行培养，并在加药后第2天、第4天、第6天对每个组进行细胞计数并计算Cell viability。
结果如图12所示，过表达MYC基因的Karpas细胞系对西达本胺的敏感性有所增加。
实施例4
西达本胺和ABT-199联用
临床上的双表达型B细胞淋巴瘤(Double-Expressor BCL)中具有MYC基因和BCL2基因的过表达现象(临床上属于高危型淋巴瘤，治疗效果差，预后不良)，将西达本胺和BCL2靶向抑制剂ABT-199进行联用治疗B细胞淋巴瘤。
实验思路
选取5种人源淋巴瘤细胞系(MYC和BCL2表达量均具有过表达，但过表达程度不同)，用不同浓度的西达本胺(0.125μM～32μM)和ABT-199(1nM～10μM)对细胞进行给药处理，对结果利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用。
实验方法：实验前对所有细胞系进行计数后按照每孔10000个细胞将细胞铺在96孔板内，设置对照组与药物处理组，每组设置3个技术重复，两种药物处理均使用浓度梯度稀释法，西达本胺从最高浓度(32μM)按1:4比例进行梯度稀释到最低浓度(0.125μM)，ABT-199从最高浓度(10μM)按1:10比例进行梯度稀释到最低浓度(1nM)，其中Vehicle组中加入与药物处理组等量的药物溶剂DMSO，总DMSO含量为1/10000，加药后将细胞放入37度孵箱培养48h后对每个孔进行细胞计数并计算Cell viability。
结果如图13至图22所示，图中标记说明：*Cell viability(％)：药物处理组活细胞数量/Vehicle组活细胞数量；*人淋巴瘤细胞系名称：Granta，RI1，SU-DHL-4，SU-DHL-6，Jeko-1；*Fa:药物对细胞抑制率(抑制率越高，药效越好)；*CI:药物协同系数，(CI>1为拮抗作用，CI＝1为相加作用，CI<1为协同作用)。
对淋巴瘤细胞系Granta采用0.125-32μM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-199进行处理。结果如图13、图14所示，图13显示Granta淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-199联合用药表现出良好的敏感性，图14显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表2 CI-Granta淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000111
对淋巴瘤细胞系RI-1采用0.125-32μM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-199进行处理。结果如图15、图16所示，图15显示RI-1淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-199联合用药表现出良好的敏感性，图16显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表3 CI-RI-1淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000112
Figure BDA0002814187780000121
对DHL-4淋巴瘤细胞采用0.125-32μM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-199进行处理。结果如图17、图18所示，图17显示DHL-4淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-199联合用药表现出良好的敏感性，图18显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，统计数据如下表所示，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表4 CI-SU-DHL-4淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000122
对DHL-6淋巴瘤细胞采用0.125-32μM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-199进行处理。结果如图19、图20所示，图19显示DHL-6淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-199联合用药表现出良好的敏感性，图20显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，统计数据如下表所示，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表5 CI-SU-DHL-6淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000123
Figure BDA0002814187780000131
对Jeko1淋巴瘤细胞采用0.125-32uM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-199进行处理。结果如图21、图22所示，图21显示Jeko1淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-199联合用药表现出良好的敏感性，图22显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，统计数据如下表所示，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表6 CI-Jeko1淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000132
通过对于5种淋巴瘤细胞系应用不同浓度的西达本胺(0.125μM～32μM)和ABT-199(1nM～10μM)处理，发现西达本胺和ABT-199具有较好的协同作用，可以作为联用配伍的组合物应用于治疗淋巴瘤疾病。
根据上述实验结果，西达本胺和ABT-199组成药物组合物中，西达本胺可以选择应用的浓度范围包括是0.5μM～8μM，ABT-199可以选择应用的浓度范围包括是10nM～1μM。
实施例5
西达本胺和ABT-737联用
临床上的双表达型B细胞淋巴瘤(Double-Expressor BCL)中具有MYC基因和BCL2基因的过表达现象(临床上属于高危型淋巴瘤，治疗效果差，预后不良)，将西达本胺和BCL2靶向抑制剂ABT-737进行联用治疗B细胞淋巴瘤。
实验思路
选取5种淋巴瘤细胞系(MYC和BCL2表达量均具有过表达，但过表达程度不同)，用不同浓度的西达本胺(0.125μM～32μM)和ABT-737(1nM～10μM)对细胞进行给药处理，对结果利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用。
实验方法：实验前对所有细胞系进行计数后按照每孔10000个细胞将细胞铺在96孔板内，设置对照组与药物处理组，每组设置3个技术重复，两种药物处理均使用浓度梯度稀释法，西达本胺从最高浓度(32μM)按1:4比例进行梯度稀释到最低浓度(0.125μM)，ABT-737从最高浓度(10μM)按1:10比例进行梯度稀释到最低浓度(1nM)，其中Vehicle组中加入与药物处理组等量的药物溶剂DMSO，总DMSO含量为1/10000，加药后将细胞放入37度孵箱培养48h后对每个孔进行细胞计数并计算Cell viability。
结果如图23-28所示，图中标记说明：*Cell viability(％)：药物处理组活细胞数量/Vehicle组活细胞数量；*人淋巴瘤细胞系名称：Granta，RI1，SU-DHL-4，SU-DHL-6，Jeko-1；*Fa:药物对细胞抑制率(抑制率越高，药效越好)；*CI:药物协同系数，(CI>1为拮抗作用，CI＝1为相加作用，CI<1为协同作用)。
对淋巴瘤细胞系Granta采用0.125-32μM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-737进行处理。结果如图23、图24所示，图23显示Granta淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-737联合用药表现出良好的敏感性，图24显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表7 CI-Granta淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000141
对淋巴瘤细胞系Jeko-1采用0.125-32μM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-737进行处理。结果如图25、图26所示，图25显示Jeko-1淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-737联合用药表现出良好的敏感性，图26显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表8 CI-Jeko-1淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000151
对SU-DHL-4淋巴瘤细胞采用0.125-32μM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-737进行处理。结果如图27、图28所示，图27显示DHL-4淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-737联合用药表现出良好的敏感性，图28显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，统计数据如下表所示，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表9 CI-SU-DHL-4淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000152
通过对于3种淋巴瘤细胞系应用不同浓度的西达本胺(0.125μM～32μM)和ABT-737(1nM～10μM)处理，发现西达本胺和ABT-737具有较好的协同作用，可以作为联用配伍的组合物应用于治疗淋巴瘤疾病。
根据上述实验结果，西达本胺和ABT-737组成药物组合物中，西达本胺可以选择应用的浓度范围包括是0.5μM～8μM，ABT-737可以选择应用的浓度范围包括是10nM～1μM。
实施例6
西达本胺和ABT-263联用
临床上的双表达型B细胞淋巴瘤(Double-Expressor BCL)中具有MYC基因和BCL2基因的过表达现象(临床上属于高危型淋巴瘤，治疗效果差，预后不良)，将西达本胺和BCL2靶向抑制剂ABT-263进行联用治疗B细胞淋巴瘤。
实验思路
选取5种淋巴瘤细胞系(MYC和BCL2表达量均具有过表达，但过表达程度不同)，用不同浓度的西达本胺(0.125μM～32μM)和ABT-263(1nM～10μM)对细胞进行给药处理，对结果利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用。
实验方法：实验前对所有细胞系进行计数后按照每孔10000个细胞将细胞铺在96孔板内，设置对照组与药物处理组，每组设置3个技术重复，两种药物处理均使用浓度梯度稀释法，西达本胺从最高浓度(32μM)按1:4比例进行梯度稀释到最低浓度(0.125μM)，ABT-263从最高浓度(10μM)按1:10比例进行梯度稀释到最低浓度(1nM)，其中Vehicle组中加入与药物处理组等量的药物溶剂DMSO，总DMSO含量为1/10000，加药后将细胞放入37度孵箱培养48h后对每个孔进行细胞计数并计算Cell viability。
结果如图29-34所示，图中标记说明：*Cell viability(％)：药物处理组活细胞数量/Vehicle组活细胞数量；*人淋巴瘤细胞系名称：Granta，RI1，SU-DHL-4，SU-DHL-6，Jeko-1；*Fa:药物对细胞抑制率(抑制率越高，药效越好)；*CI:药物协同系数，(CI>1为拮抗作用，CI＝1为相加作用，CI<1为协同作用)。
对淋巴瘤细胞系Granta采用0.125-32μM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-263进行处理。结果如图29、图30所示，图29显示Granta淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-263联合用药表现出良好的敏感性，图30显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表10 CI-Granta淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000171
对淋巴瘤细胞系Jeko-1采用0.125-32μM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-263进行处理。结果如图31、图32所示，图31显示Jeko-1淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-263联合用药表现出良好的敏感性，图32显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表11 CI-Jeko-1淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000172
对SU-DHL-4淋巴瘤细胞采用0.125-32μM西达本胺和1nM-10000nM的ABT-263进行处理。结果如图33、图34所示，图33显示DHL-4淋巴瘤细胞对于西达本胺和ABT-263联合用药表现出良好的敏感性，图34显示利用Chou-Talalay药物协同计算方法的CompuSyn软件进行统计发现这两种药物具有较好的协同作用，统计数据如下表所示，图中CI为药物协同系数，CI<1为协同作用。
表12 CI-SU-DHL-4淋巴瘤细胞
Figure BDA0002814187780000173
Figure BDA0002814187780000181
通过对于3种淋巴瘤细胞系应用不同浓度的西达本胺(0.125μM～32μM)和ABT-263(1nM～10μM)处理，发现西达本胺和ABT-263具有较好的协同作用，可以作为联用配伍的组合物应用于治疗淋巴瘤疾病。
根据上述实验结果，西达本胺和ABT-263组成药物组合物中，西达本胺可以选择应用的浓度范围包括是0.5μM～8μM，ABT-263可以选择应用的浓度范围包括是10nM～1μM。
实施例7
临床用药实验记录
对一名自体移植后复发难治的双表达型淋巴瘤患者进行西达本胺+Venex-100(ABT-199)联合用药治疗(在患者知情且同意后进行)，患者在联合用药进行治疗前(D0)后(D30)的淋巴瘤包块检查照片如图35、图36所示，用药1个月后复查包块明显缩小。本临床结果显示西达本胺联合BCL2抑制剂对双表达型B细胞淋巴瘤病人具有显著疗效。
本申请所引用的各专利、专利申请和出版文的说明全部纳入本申请参考。引用的任何参考文献不应认为是允许这些参考文献可以用来作为本申请的“现有技术”。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种包含西达本胺和BCL2抑制剂的组合物在制备用于治疗MYC基因和BCL2基因的过表达的双表达型B细胞淋巴瘤的药物中的应用；所述BCL2抑制剂是ABT-199、ABT-737、ABT-263中的至少一种。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述淋巴瘤是弥漫大B细胞淋巴瘤类中的一种。
3.如权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述药物中含有效量的BCL2抑制剂。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述药物中含有效量的西达本胺。
5.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述药物中还包括其他互不影响的活性成分和/或制剂辅料。
6.如权利要求4所述应用，其特征在于，西达本胺是小分子活性化合物；或者是西达本胺的盐作为活性成分；或者，应用西达本胺的盐和西达本胺混合物作为活性成分。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述BCL2抑制剂是ABT-199，西达本胺应用的浓度范围是0.5μM~8μM，ABT-199应用浓度的范围是10nM~1μM。
8.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述BCL2抑制剂是ABT-737，西达本胺应用的浓度范围是0.5μM~8μM，ABT-737应用的浓度范围是10nM~1μM。
9.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述BCL2抑制剂是ABT-263，西达本胺应用的浓度范围是0.5μM~8μM，ABT-263应用的浓度范围是10nM~1μM。
10.如权利要求6所述应用，其特征在于，西达本胺的盐是指西达本胺和以下至少一种酸加成盐的产物，包括乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐、碳酸盐、硫酸氢盐、硫酸盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚酸盐、葡萄酸盐、葡萄醛酸盐、六氟磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、碘酸盐、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、2-萘磺酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、糖质酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐。
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