KR101586833B1

KR101586833B1 - 패니바실러스 렌티모르부스 sd-10 균주를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물

Info

Publication number: KR101586833B1
Application number: KR1020140025188A
Authority: KR
Inventors: 이광수; 정남준
Original assignee: 이광수
Priority date: 2014-03-03
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2016-01-19
Also published as: KR20150103585A

Abstract

본 발명은 패니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus) SD-10(KCTC 12339BP) 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주 배양물로부터 추출한 항균활성물질을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 다양한 버섯 병원균에 대한 항균활성을 나타내며, 버섯 생장에 부정적인 어떠한 영향도 나타내지 않는다. 본 발명의 항균용 조성물은 버섯 병원균의 생장을 억제함으로써 버섯 생산을 증가시키는 목적으로 유용하게 이용 가능하다.

Description

패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물{Antimicrobial Composition Comprising Paenibacillus lentimorbus SD-10 As an Active Ingredient}

본 발명은 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.

버섯은 맛과 향기가 좋고 옛날부터 불로장수의 약으로 귀하게 여겨지고 있으며 혈액 중의 콜레스테롤 저하작용과 항암작용이 우수하여 성인병에도 효과가 있는 것으로 밝혀져 있다. 또한 저칼로리 식품으로서 단백질, 무기질 및 비타민 B1 등을 다량 함유하고 있어 건강식품으로서 주목을 받으면서 버섯에 관한 연구가 활발히 진행되어 지고 있으나 버섯을 재배하는 생산농가에서는 버섯질병에 대한 문제점으로 많은 어려움을 겪고 있는 실정이다.

버섯의 질병은 세균성갈색무늬병과 푸른곰팡이 병이 주축을 이루고 있는데, 전자는 버섯의 갓 부분을 갈색으로 변화시켜 버섯의 양적 질적인 저하를 초래함과 동시에 상품의 가치를 떨어뜨려 버섯재배 농가에 막대한 경제적 피해를 주고 있는 질병으로 주로 Pseudomonas tolaasii가 분비하는 톨라신(tolaasin)이라고 하는 독소에 의해서 발병한다. 후자인 푸른곰팡이 병은 균상배지에서 병원균의 균사가 자란 다음 포자가 형성되어 푸른색을 띄는 경우 모두 푸른곰팡이 병이라 부르고 있는데 국내의 느타리버섯 균상에 피해를 주는 푸른곰팡이 병원성 균은 Gliocladium sp., Trichoderma virence, T. harzianum 및 T. koningii 등 4종이고 그 중에서 Gliocladium sp에 의한 피해가 가장 큰 것으로 알려져 있다. 이러한 버섯의 질병은 배지의 수분과다 및 부족, 고온, 배지불량 등 버섯재배환경에 의해서 발생되지만, 본 발명자들은 버섯이 잘 생육할 수 있는 버섯의 항균성 배지가 확립된다면 버섯재배 기술상에 약간의 오류가 발생하여도 튼튼한 버섯을 잘 생육시킬 수 있을 것으로 판단되기 때문에 어느 정도 질병의 퇴치뿐만 아니라 병원성 잡균의 번식이 억제되어 버섯의 생산증가에 크게 기여하게 되어 버섯 농가의 피해를 줄일 수 있을 것으로 사료된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 버섯에서 질병을 일으키는 병원균의 생육을 억제할 수 있는 항균활성을 갖는 세균을 분리 및 동정하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 버섯재배농가의 폐면배지로부터 항균활성을 갖는 세균을 분리 동정하였고, 이 균주(균주, 균주 배양물 및 균주 배양물로부터 추출한 항균활성물질)가 버섯 병원균에 대해 항균 활성을 가지고 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 패니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus) SD-10(KCTC 12339BP) 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주 배양물로부터 추출한 항균활성물질을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 패니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus) SD-10(KCTC 12339BP) 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주 배양물로부터 추출한 항균활성물질을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 버섯에서 질병을 일으키는 병원균의 생육을 억제할 수 있는 항균활성을 갖는 세균을 분리 및 동정하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 버섯재배농가의 폐면배지로부터 항균활성을 갖는 세균을 분리 동정하였고, 이 균주(균주, 균주 배양물 및 균주 배양물로부터 추출한 항균활성물질)가 버섯 병원균에 대해 항균 활성을 가지고 있음을 규명하였다.

본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함되는 균주는 미생물의 지방산 조성을 분석한 결과 패니바실러스(Paenibacillus) 균주에 속하는 신규 미생물로 동정되었으며, 이를 “패니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus) SD-10 균주”라 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 2012년 12월 18일자로 기탁하였고, 기탁번호 KTCT 12339BP를 부여받았다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 항균용 조성물은 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10(KCTC 12339BP) 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주 배양물로부터 추출한 항균활성물질을 유효성분으로 포함한다.

하기 본 발명의 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 균주는 카르복시메틸셀룰라아제(carboxymethylcellulase) 활성 및 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성을 나타내며(도 1), 다양한 버섯 병원균에 대해 항균활성을 발휘한다. 본 발명의 균주는 다양한 미생물, 특히 슈도모나스 속 세균 및 트리코데르마 속 세균에 대해 항균 활성을 나타내고(도 2), 버섯 생장에는 영향을 미치지 않는다. 또한, 본 발명의 균주는 버섯 병원곰팡이의 균사 생장 및 포자 발아를 억제하는 항균활성물질을 생산한다.

하기 본 발명의 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 균주는 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균 또는 트리코데르마(Trichoderma)속 세균에 대해 항균활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 균주는 슈도모나스 톨라시(P. tolaasii), 슈도모나스 아가리시(P. agarici), 슈도모나스 푸티다(P. putida), 슈도모나스 세파시아(P. cepacia), 슈도모나스 글라디올리 아가리시콜라(P. aladioli pv. agaricicola) 또는 슈도모나스 플루오르센스(P. fluorescens) 균주에 대해 항균 활성을 갖는다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 균주는 트리코데르마 비렌스(T. virence), 트리코데르마 하르지아니움(T. harzianium), 트리코데르마 코닌기(T. koningii) 또는 트리코데르마 하마텀(T. hamatum) 균주에 대해 항균 활성을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함되는 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주의 배양물은 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주를 20℃-50℃ 온도 조건에서 25-45 시간 배양하여 수득한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함되는 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주의 배양물은 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주를 30℃-45℃ 온도 조건에서 30-40시간 배양하여 수득한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함되는 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주의 배양물로부터 추출한 항균활성물질은 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주 배양물에 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 클로로포름, 헥산, 디에틸에테르 및 1,3-부틸렌 글리콜로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 유효성분으로 포함되는 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주의 배양물로부터 추출한 항균활성물질은 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주 배양물을 감압농축한 다음 메탄올을 처리하여 분획물을 수득하고 이 분획물을 실리카겔로 충진된 컬럼에 주입한 후 클로로포름 및 메탄올 혼합용매로 용출하여 수득한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 항균용 조성물을 버섯 배지에 첨가하여 버섯 병원균의 생장을 억제함으로써 버섯 생산을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 패니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus) SD-10(KCTC 12339BP) 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주 배양물로부터 추출한 항균활성물질을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 조성물은 다양한 버섯 병원균에 대한 항균활성을 나타내며, 버섯 생장에 부정적인 어떠한 영향도 나타내지 않는다.

(ⅲ) 본 발명의 항균용 조성물은 버섯 병원균의 생장을 억제함으로써 버섯 생산을 증가시키는 목적으로 유용하게 이용 가능하다.

도 1은 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주의 CMCase 및 아밀라아제 활성 측정 결과를 나타낸 사진이다. (A) 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10의 CMCase 활성, (B) 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10의 아밀라아제 활성.
도 2는 슈도모나스 속 버섯 병원균에 대한 분리균주의 항균활성 측정 결과를 나타낸 사진이다. (A) P. tolaasii ATCC-14340, (B) P. tolaasii ATCC -51312, (C) P. tolaasii, SD-1, SD-4, SD-10, SD-11, SD-15, SD-16(발효 버섯 배지로부터 분리한 미생물).
도 3은 트리코데르마 속 버섯 병원균에 대한 분리균주의 항진균 활성 측정 결과를 나타낸 사진이다. A-1; T. virence, A-3;T . harzianum, E-2; Trichoderma spp.. SD-1, SD-10, SD-11, SD-15, SD-16(발효 버섯 배지로부터 분리한 미생물).
도 4는 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 배양온도에 따른 생육과 상대 항균활성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 배양시간에 따른 생육과 상대 항균활성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주 배양 상등액의 버섯 병원곰팡이 Trichoderma virens 생장 억제를 확인한 결과이다. A; 대조군(E. coli JM109 균주 배양 상등액, 50 μL), B; 10 μL, C; 30 μL, D; 50 μL.
도 7은 Paenibacillus lentimorbus SD-10(1)와 Escherichia coli JM109(2, 대조군) 균주 배양 상등액의 버섯 병원곰팡이 Trichoderma virens 포자형성 억제를 확인한 결과이다. A; 0%, B; 1%, C; 5%, D; 10%.
도 8은 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주 배양 상등액에서 분리된 항균활성 물질의 실리카겔 칼럼크로마토그래피 결과이다.
도 9는 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주 배양 상등액에서 분리된 항균활성 물질(UPX-1)의 ¹³C-NMR 결과이다.
도 10은 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주 배양 상등액에서 분리된 항균활성 물질(UPX-1)의 ¹H-NMR 결과이다.
도 11은 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주 배양 상등액에서 분리된 항균활성 물질(UPX-1)의 구조이다.
도 12는 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주 배양 상등액에서 분리된 항균활성 물질(UPX-1)의 버섯 병원곰팡이 Trichoderma virens 생장 억제를 확인한 결과이다. A; 0 μL, B; 10 μL, C; 30 μL, D; 50 μL.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

균주

본 실험에서 사용하는 버섯은 느타리버섯, 새송이, 애느타리버섯을 경남 농업진흥원으로부터 구입하여 사용하였으며, 느타리버섯에 세균성 갈색무늬병을 일으키는 병원성 미생물은 Pseudomonas tolaasii ATCC-33618는 농촌진흥청 응용미생물과에서 분양 받아 사용하였고, 버섯에 푸른곰팡이 병을 일으키는 병원성 곰팡이는 실험실에 보관 중인 Trichoderma virence을 사용하였다. 그리고 항균 활성 물질을 생산하는 미생물은 직접 순수 분리한 Paenibacillus lentimorbus SD-10을 사용하였다.

사용배지 및 배양

느타리버섯의 세균성 갈색무늬병균의 생육을 위해 NA(Nutrient agar) 배지를 사용하였으며, 버섯 및 트리코더마 병원성 푸른곰팡이의 생육을 위해서는 PDA(Potato dextrose agar) 배지를 사용하여 25℃, 상대습도 60%의 생장 챔버에서 배양하였다. 항균 활성이 있는 미생물의 배양은 CMC(carboxymethyl cellulose) 1%, NaCl 0.3%, KH₂PO₄ 0.2%, 효모 추출물 0.1%, MgSO₄ 7H₂O 0.05%, FeSO₄ 7H₂O 0.002%, MnSO₄ 7H₂O 0.001%, CaCl₂ 2H₂O 0.04%의 구성 성분으로 조성된 배지를 사용하여 37℃에서 배양하였다.

Paenibacillus lentimorbus SD-10의 항균 활성 물질 분리 및 동정

Paenibacillus lentimorbus SD-10의 배양액 15 L을 70℃에서 감압 농축시켜 진한 갈색 혼합물(25 Brix%) 8.3 g을 얻은 다음, 100 mL의 메탄올을 첨가하여 용해된 분획물만 회수하였다(3회 반복 실시). 회수한 용액을 모두 혼합하여 45℃에서 다시 감압 농축시켜 메탄올 분획물 3.2 g을 얻은 후, 이 분획물을 230-400 메쉬의 실리카겔로 충진된 컬럼(3x30 cm)에 주입하여 클로로포름/메탄올의 조건으로 메탄올의 비율을 순차적으로 높여(0-100%)가며 칼럼크로마토그래피를 수행하였다. 칼럼크로마토그래피의 분리액은 150 mL씩 분획 회수(분획물 1-25)하여 모든 분획물에 대한 항균 활성을 검토한 다음, 항균 활성이 있는 분획물 12-16을 회수하여 감압 농축시켜 항균 혼합물 180 mg을 회수하였다. 항균 혼합물 180 mg을 클로로포름/메탄올의 1:1 조건에서 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 실시하여 흰색 분말 112 mg을 회수하여 UPX-1이라 명명하고, ¹H-NMR과 ¹³C-NMR을 통하여 항균물질의 구조 분석을 수행하였다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR 스펙트럼은 Bruker AW500(500 MHz) 분광기를 사용하였으며 내부 기준 물질로 TMS(tetramethylsilane)을 사용하였다.

Paenibacillus lentimorbus SD-10의 배양 및 효소활성

삼각플라스크(300 ml)에 LB배지 100 ml를 넣고 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 전배양액 5 ml를 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 배양액을 8,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 얻은 상등액을 조효소액으로 하였다. CMCase 활성은 조효소액 0.25 ml와 0.75 ml의 1% CMC 용액을 혼합하여 50℃에서 10분간 반응시킨 후 3.5-디니트로살리실산(DNS)법에 따라 DNS 1 ml를 첨가하여 5분간 끓인 다음 냉각하여 510 nm에서 환원당을 정량하였고 효소활성의 단위는 μg D-글루코오스/ml/분으로 표시하였다. 글루코아밀라아제의 활성측정은 1% 수용성 전분을 함유한 0.05 M 아세트산 버퍼(pH 4.8) 5 ml에 동일의 완충액 2 ml를 가하고 30℃에서 수분간 보온하였다. 여기에 조효소액 1 ml를 가하고 30분간 반응시킨 후 그 액 1 ml를 취하여 DNS법에 따라 반응 전후 액 중 환원당의 양을 측정하고 양자의 차이로부터 효소반응에서 생성된 환원당의 양을 산출하였다. 글루코아밀라아제의 1 유닛(unit)은 1분간에 1 μM의 글루코오스를 생성하는 효소의 양으로 하였다.

Paenibacillus lentimorbus SD-10의 항균 활성 물질의 항균 활성

세균성 갈색무늬병균에 대한 분리균주의 항균력 검토는 Pseudomonas tolaasii를 0.7% 소프트 아가 배지에 잘 혼합하여 NA 평판배지에 중층시킨 후 분리 미생물을 획선으로 접종하여 25℃에서 배양하면서 항균력의 정도를 투명환의 크기로 관찰하였다.

버섯 푸른곰팡이 병원균인 Trichoderma virens에 대한 항균 활성 물질의 항균 활성 능력은 PDA 평판배지 중앙에 화염 멸균된 코크보르 No.3(직경 5 mm)을 이용하여 회수한 병원성 곰팡이를 접종한 다음, 접종되어진 중앙으로부터 1 cm 거리 사방에 화염 멸균된 코르크볼 No.3(직경 5 mm)을 이용하여 PDA 평판 배지를 천공하여 원형의 배지는 제거하고 각각의 원형 부위에 Paenibacillus lentimorbus SD-10 배양액을 원심 분리한 후에 회수한 상청액만 10, 30, 50 ㎕씩 실험군으로 주입하였고 대조군으로 Paenibacillus lentimorbus SD-10 배양 배지만 50 ㎕를 주입하였다. Paenibacillus lentimorbus SD-10의 항균 활성 물질의 항균 활성 능력을 확인하기 위하여 25℃에서 배양하면서 곰팡이의 균사 성장 억제 정도를 조사하였다. 더불어 푸른곰팡이 병원균인 Trichoderma virens에 대한 항균 활성 물질의 포자 형성 억제 활성 능력을 확인하기 위하여 Paenibacillus lentimorbus SD-10 배양액을 원심 분리한 후에 회수한 상청 액만을 PDA 평판배지에 0, 1.0, 5.0, 10.0% 첨가한 후에 푸른곰팡이 병원균인 Trichoderma virens의 포자 형성 정도를 조사하였다.

실험결과

미생물의 분리 및 효소활성

버섯배지의 주성분은 섬유성물질로 구성되어 있으며 부 재료로 첨가하는 미강 등은 전분의 성분도 다량 함유되어 있다. CMCase 및 글루코아밀라아제 효소활성이 높고 CMC 함유 평판배지 상에서 헤일로 존의 크기가 크고 뚜렷하게 나타나면서 성장속도가 빠른 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 특성을 표 1에 나타내었다. 표 1에서 보는 바와 같이 SD-10 균주는 CMCase 활성 및 글루코아밀라아제 효소활성이 높은 것으로 나타났다. 그 중에서 SD-10 균주는 CMC 및 전분함유배지 상에 나타나 헤일로 존은 뚜렷하고 큰 클리어 존을 형성하였다(도 1).

Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 일반적인 특성

스트레인	생장율¹⁾	CMCase	아밀라아제	헤일로 존²⁾
SD-10	+++	2.4	16.8	+++

¹⁾생장율: + 느림, ++ 중간, +++ 빠름.

²⁾CMCase에 의한 헤일로 존 사이즈 : + 낮음, ++ 중간, +++ 높음.

Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 항균력

섬유성물질 및 전분분해효소의 생산성이 우수한 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주가 느타리버섯의 갈색무늬병원성균의 생육에 미치는 영향을 검토하기 위해서 슈도모나스 톨라시(P. tolaasii)에 대한 항균력을 검토하여 도 2에 나타내었다. P. tolaasii를 액체배양하여 멸균수에 희석한 후 NA 평판배지에 도말한 다음 분리한 균주를 획선으로 접종하여 두 균주 사이의 생육상태를 검토한 결과 SD-10 및 SD-11균은 P. tolaasii ATCC-14340, P. tolaasii ATCC-51312 및 P. tolaasii의 병원균에 대하여 강한 길항작용을 나타내었다(도 2-A, B, C). 도 3은 버섯의 푸른곰팡이 병을 유발하는 Trichoderma sp.에 대한 분리균주의 항균력 결과를 나타낸 것이다. 도 3에서 보는 바와 같이 SD-10은 버섯의 푸른곰팡이 병을 유발하는 T. virence, T. harzianium 및 다른 Trichoderma sp.의 생육을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다.

이상의 결과에서 CMCase 및 아밀라아제의 효소활성이 높고 헤일로 존의 크기가 크고 뚜렷하여도 병원성세균 및 푸른곰팡이 병원성균에 대한 항균력에는 많은 차이를 나타내고 있음이 확인되었고 SD-10은 세균성 갈색무늬병과 푸른곰팡이병을 유발하는 병원균의 생육억제에도 효과적으로 활성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 병원균과 길항세균 사이에 영양분의 경합이 이루어져 사멸하거나 또는 길항세균이 생성한 효소에 의해서 P. tolaasii가 생성한 독성물질이 분해된다는 보고가 있다.

Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 배양온도에 따른 항균활성에 미치는 영향

분리 동정한 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 생육 및 항균물질의 생산에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위하여 배양온도를 15℃에서 55℃의 범위로 변화시키면서 24시간 180 rpm으로 진탕 배양한 결과는 배양 온도에 따른 미생물의 생육과 상대적인 항균 활성의 유형을 나타내었다(도 4). 배양미생물 생육은 25℃ 이하와 50℃ 이상의 온도에서 현저하게 떨어졌으나 30-40℃의 범위에서는 왕성하게 생육하여 35℃에서 4.5의 U.O.D 값을 나타내었다. 그리고 각 배양온도에서 배양한 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 배양액이 나타내는 Trichoderma virens의 생육에 대한 항균활성은 20℃ 이하에서는 상대 항균활성이 60%로 낮게 나타났으나 25℃에서는 86%, 30-45℃에서는 95% 이상의 상대 항균활성이 나타났다. 그러나 50℃ 이상에서는 항균활성이 급격하게 감소하는 경향이 나타났다. 이상의 결과로 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 배양온도는 균주의 생육정도 및 항균활성의 생성에 큰 영향을 미치는 것으로 판단되었다. 이로 인한 느타리버섯 배양 적정온도인 25-30℃에서 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 상대 항균활성이 86-95%로 버섯 병원 곰팡이 병해관리용 농업자재 제형에 적합한 배양 온도로 조사되었다.

Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 배양시간에 따른 항균활성에 미치는 영향

미생물의 배양시간이 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 생육 및 항균활성물질 생산량에 미치는 영향을 조사하였다(도 5). Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주는 배양 5시간까지는 유도기를 나타내었으며 그 이후부터 급격하게 균체의 증식이 이루어져 배양 20시간 전후로 정상기에 도달하였고 25시간 이후부터는 균체수가 천천히 감소하기 시작하였다. 그러나 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 상대 항균활성은 배양 10시간 후에 약 상대 항균활성이 15%를 나타내었으나 그 이후로부터 급격하게 상대 항균활성이 증가하여 15, 20, 및 25시간에 각각 40, 65, 및 90% 정도의 활성을 나타내었으며 배양 30-40시간에 가장 높은 상대 항균활성을 나타내었다. 이로 인한 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 배양 시간은 30-40시간 범위에서 상대 항균활성이 가장 높은 95% 이상이므로 버섯 병원 곰팡이 병해관리용 농업자재 제형에 적합한 배양 시간으로 조사되었다.

버섯 병원곰팡이 Trichoderma virens의 생육 저해 농도

버섯의 생육에 전혀 영향을 미치지 않으면서 버섯의 푸른곰팡이 병원균의 생육을 억제하는지 확인하기 위해 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주를 37℃에서 36시간 배양한 배양액의 농도가 Trichoderma virens의 생육에 미치는 영향을 조사하였다(도 6). 대조군은 E. coli JM109 균주의 배양액을 0.2 μL 크기의 막 여과지로 여과한 후에 디스크 페이퍼(직경 8 mm)에 50 μL 흡착시켜 사용하였는데 Trichoderma virens의 생육에는 전혀 영향을 미치지 못하였다. 그러나 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 배양액을 E. coli JM109 균주의 배양액과 동일하게 처리한 후 10, 30, 및 50 μL씩 농도별로 각각 처리한 실험군에서는 처리 농도가 높을수록 Trichoderma virens의 생육이 현저하게 억제되었다. 10 μL를 접종한 실험군에서는 약간의 저해를 나타내었지만 30 μL를 접종한 실험군과 50 μL를 접종한 실험군에서는 버섯병원곰팡이 Trichoderma virens의 생육을 현저하게 저해하였다.

버섯 병원곰팡이 Trichoderma virens의 포자 발아 억제력

Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 배양액이 버섯 병원곰팡이 Trichoderma virens의 포자 발아에 미치는 영향을 조사하였다. Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주와 대조군 E. coli JM109 균주 배양액을 각각 0.2 μL 크기의 막 여과지로 여과한 후에 그 여과액을 미리 멸균하여 준비해 둔 평판배지 성분에 각각 0, 1, 5, 및 10%씩 농도별로 첨가하여 잘 혼합한 후에 평판배지에 분주한 다음, Trichoderma virens의 포자 현탁액을 100 μL씩 도말하여 30℃의 항온기에서 배양하면서 버섯 병원곰팡이 포자의 발아 억제력을 조사하였다(도 7). 대조군 E. coli JM109 균주 배양액을 처리한 경우에는 농도 변화에 관계없이 버섯 병원곰팡이 포자의 발아가 모두 왕성한 반면에 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주 배양액을 1% 처리한 실험군에서는 약간의 저해가 일어났으며 5%와 10%를 처리한 실험군에서는 버섯 병원곰팡이 Trichoderma virens의 포자가 전혀 발아가 일어나지 않음을 조사하였다. 이상의 결과로 Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주는 버섯 병원곰팡이의 균사 생장과 포자 발아도 억제하는 항균활성물질을 생산하는 것으로 확인하였다.

항균 활성 물질의 분리 및 동정

Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주가 생산하는 항균활성물질을 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 이용하여 최종적으로 클로로포름/메탄올의 1:1 조건에서 분리한 물질(UPX-1 명명, 도 8)을 ¹H-.¹³C-NMR을 통하여 구조를 분석·동정하였다. 분리된 활성화합물에서 22개의 탄소피크가 ¹³C-NMR 스펙트럼에서 나타났으며(도 9) 아노머-탄소가 1개 존재하는 2탄당에서 관찰되는 전형적인 양상을 나타내었다. 또한 ¹³C-NMR 스펙트럼에서 관찰된 101.9 ppm의 피크는 알데히드-탄소에서 기인한 것으로 조사되었으며 97.2와 92.9 ppm의 피크는 아노머-탄소가 1개 있음을 나타내는 것으로 조사되었다. ¹H-NMR 스펙트럼에서 나타난 5.16, 5.10, 및 4.78 ppm의 피크 역시 아노머-탄소와 알데히드-탄소가 각각 1개씩 있음을 나타내었다(도 10). 이상의 분광학적인 자료를 종합하면 탄소 6개를 가지는 당 2개가 2탄당 구조로 존재하는 화합물인 것으로 추정되었다(도 11).

¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD): d=3.27(m), 3.30(m), 3.42(m), 3.51(m), 3.60(m), 3.82(m), 4.48(d, J=7.8), 5.10(m), 5.15(m)

¹³C-NMR (500 MHz, CD₃OD): d=61.2, 61.4, 61.76, 61.8, 70.5, 70.6, 70.7, 72.5, 73.2, 73.3, 73.7, 73.76, 74.1, 74.14, 74.9, 75.7, 76.9, 80.4, 80.9, 92.9, 97.2, 101.9

항균 활성 물질의 항균 활성

Paenibacillus lentimorbus SD-10 균주의 배양액으로 항균활성물질 UPX-1을 순수 분리하여 버섯 병원곰팡이 Trichoderma virens에 대한 항균력을 조사하였다(도 12). 순수 분리한 항균활성물질 UPX-1을 5 μL를 처리한 실험군에서는 약간의 균사 생장 억제가 나타났으나 10 μL와 50 μL를 처리한 실험군에서는 버섯 병원곰팡이 Trichoderma virens의 균사 생육이 완전히 억제되었다. 이상의 결과로 항균활성물질 UPX-1은 버섯의 재배에서 빈번하게 발생하는 푸른곰팡이병을 유발하는 원인 대표 미생물인 Trichoderma virens의 균사 생장 억제에 탁월한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었고 천연물 버섯 병해관리용 방제약재로서 가치가 있을 것으로 판단되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원 생물자원센터

KCTC12339BP

20121218

<110> Farmnuri <120> Antimicrobial Composition Comprising Paenibacillus lentimorbus SD-10 As an Active Ingredient <130> PN140027 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1460 <212> RNA <213> Paenibacillus lentimorbus strain SD-10 16S ribosomal RNA <400> 1 tgcctaatac atgcaagtcg agcggagcga cggttccctt cggggaaccg ttagcttagc 60 ggcggacggg tgagtaatac gtaggtaacc tgcccttaag accgggataa ctcacggaaa 120 cgtgggctaa taccggatag gcgatttcct cgcatgaggg aatcgggaaa ggcggttccg 180 awtaatcggg gctgccactt atggatggac ctacggcgca ttagctagtt ggtggggtaa 240 cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact 300 gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgcaa 360 gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaag ctctgttgcc 420 agggaagaac gctatggaga gtaactgctc tataggtgac ggtacctgag aagaaagccc 480 cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggg gcaagcgttg tccggaatta 540 ttgggcgtaa agcgcgcgca ggcggtcatg taagtctggt gtttaaaccc ggggctcaac 600 tccgggtcgc atcggaaact gtgtgacttg agtgcagaag aggaaagtgg aattccacgt 660 gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctttctgggc 720 tgtaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780 ccacgccgta aacgatgaat gctaggtgtt aggggtttcg atacccttgg tgccgaagtt 840 aacacattaa gcattccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 900 cggggacccg cacaagcagt ggagtatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta 960 ccaggtcttg acatcccact gaccgctcta gagatagagc ttcccttcgg ggcagaggag 1020 acaggtggtg catggttgtc gtcggctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1080 gagcgcaacc cttaacttta gttgccagca ttgagttggg cactctagag tgactgccgg 1140 tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgcaccttat gacctgggct 1200 acacacgtac tacaatggct ggtacaacgg gaggcgaagc cgcgaggtgg agcgaatcct 1260 aaaaagccag tctcagttcg gattgcaggc tgcaactcgc ctgcatgaag tcggaattgc 1320 tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggtcttgta cacaccgccc 1380 gtcacaccac gagagtttac aacacccgaa gtcggtgggg taaccgcaag gagccagccg 1440 ccgaaggtgg ggtagatgat 1460

Claims

패니바실러스 렌티모르부스(Paenibacillus lentimorbus) SD-10(KCTC 12339BP) 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주 배양물로부터 추출한 항균활성물질을 유효성분으로 포함하는 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균 또는 트리코데르마(Trichoderma)속 세균에 대한 항균용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 서열목록 제1서열의 16S rRNA 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 균주 배양물은 상기 패니바실러스 렌티모르부스 SD-10 균주를 20℃-50℃ 온도 조건에서 25-45 시간 배양하여 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 항균활성물질은 상기 균주 배양물에 메탄올을 처리하여 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 카르복시메틸셀룰라아제(carboxymethylcellulase) 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 균주는 글루코아밀라아제(glucoamylase) 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균은 슈도모나스 톨라시(P. tolaasii), 슈도모나스 아가리시(P. agarici), 슈도모나스 푸티다(P. putida), 슈도모나스 세파시아(P. cepacia), 슈도모나스 글라디올리 아가리시콜라(P. aladioli pv. agaricicola) 또는 슈도모나스 플루오르센스(P. fluorescens)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 트리코데르마(Trichoderma)속 세균은 트리코데르마 비렌스(T. virence), 트리코데르마 하르지아니움(T. harzianium), 트리코데르마 코닌기(T. koningii) 또는 트리코데르마 하마텀(T. hamatum) 인 것을 특징으로 하는 조성물.