KR101579054B1 - 포도필로톡신 아세테이트를 유효 성분으로 포함하는 방사선치료 증진제 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 포도필로톡신 유도체인 포도필로톡신 아세테이트의 방사선 치료 증진제로서의 새로운 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 본 발명은 생체 내 암을 치료하기 위하여 암세포에 방사선을 조사하기 전 투여하여 방사선 치료 증진 효과를 나타낼 수 있는 하기 화학식 1의 포도필로톡신 아세테이트의 새로운 용도에 관한 것이다.
[화학식 1]

상기 화합물은 암 조직에서 방사선 치료 효율을 증진시키므로, 방사선 치료의 선량을 낮추면서도 고선량 처리와 동일한 효과를 얻을 수가 있고, 고선량 방사선 치료시 나타나는 부작용인 정상세포의 손상을 현저히 줄일 수 있는 효과가 있으므로, 방사선 치료의 효율을 극대화할 수 있다.

Description

포도필로톡신 아세테이트를 유효 성분으로 포함하는 방사선치료 증진제{Radiosensitizer containing podophyllotoxin acetate as the active ingredient}

본 발명은 포도필로톡신 아세테이트의 방사선 치료 증진제로서의 새로운 용도에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 생체 내 암을 치료하기 위하여 암세포에 방사선을 조사하기 전 투여하여 방사선 치료 증진 효과를 나타낼 수 있는 포도필로톡신 아세테이트를 유효 성분으로 포함하는 방사선치료 증진제에 관한 것이다.

주지된 바와 같이 대표적인 항암 치료법에는 외과적 수술, 화학 항암제 투여 및 방사선 치료법의 3가지 방법이 주로 사용되는데, 현재 국내 고형암 환자의 50% 가량이 방사선 치료를 받고 있으며, 새로운 방사선 치료기기의 개발 및 설치를 통하여 방사선 치료를 받는 암환자의 수가 매년 증가하고 있는 추세이다. 또한 암환자 복지의 차원에서, 암환자들의 화학 항암제 부작용 및 외과적 수술에 의한 통증 및 신체 기능 상실에 대한 부담감으로 인하여, 상대적으로 고통이 덜하며 비침습적 치료 방법인 방사선 치료에 대한 선호도가 증가함에 따라 암치료에 있어 방사선 치료의 중요성 및 그 효율성 증대가 요구되어 지고 있다.

이와 같이 방사선 치료는 현재 다양한 종류의 고형암에 필수적인 치료 방법으로 알려져 있으나 방사선 내성 획득으로 인한 재발 및 전이 발생, 방사선 치료 부위의 정상 조직의 손상 등으로 인한 화상 및 섬유화 발생 등 부작용등의 문제점이 대두되어 왔다. 따라서 이러한 문제점들을 해결하기 위해서는 상대적으로 저선량 방사선을 사용한 방사선 치료의 효율 증대가 필요하며 이의 달성을 위한 증진제 개발 연구가 계속 진행되고 있는 실정이다.

특허출원 제10-2001-55544호 특허출원 제10-2006-136639호 특허출원 제10-2010-98596호

본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하고자 발명된 것으로서 정상세포에 방사선에 의한 부작용을 줄일 수 있는 방사선 치료 증진제를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

이러한 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 포도필로톡신 아세테이트를 유효성분으로서 포함하는 방사선 치료 증진제를 제공함에 그 특징이 있다.

[화학식 1]

상기 포도필로톡신 아세테이트의 농도는 10nM인 것을 특징으로 하는 방사선 치료 증진제를 제공함에 그 특징이 있다.

이상에서와 같이, 포도필로톡신 아세테이트는 방사선 치료 효율을 세포 수준 및 생체 수준에서 증진시킬 수 있는 효율 높은 방사선 치료 증진제로의 이용이 가능하므로 방사선에 의한 암치료 효과를 증대시킬 수 있다.

도 1은 인체 폐암 세포 NCI-H460에서 포도필로톡신 아세테이트의 단독 처리시 폐암세포 사멸 증가 및 IC50 값을 나타낸 그래프이고,
도 2는 인체 폐암 세포 NCI-H1299 에서 포도필로톡신 아세테이트의 단독 처리시 폐암세포 사멸 증가 및 IC50 값을 나타낸 그래프이고,
도 3은 인체 폐암 세포 NCI-H460에서 포도필로톡신 아세테이트의 방사선 민감도 상승율을 나타낸 그래프이고,
도 4는 인체 폐암 세포 NCI-H460에서 포도필로톡신 아세테이트의 방사선 민감도에 의한 암세포 군집 형성 억제를 나타낸 사진이고,
도 5는 인체 폐암 세포 NCI-H460에 대하여 포도필로톡신 아세테이트 및 방사선의 복합 처리시 Sub-G1기 폐암세포의 세포 사멸 증가를 나타내는 그래프이고,
도 6은 인체폐암세포 NCI-H1299에 대하여 포도필로톡신 아세테이트 및 방사선의 복합처리시 Sub-G1기 폐암세포의 세포사멸 증가를 나타내는 그래프이고,
도 7은 폐암세포 NCI-H460를 이식한 누드 생쥐에 대하여 포도필로톡신 아세테이트 및 방사선의 복합 처리를 실시한 결과를 보여주는 비교 사진이고,
도 8은 폐암세포 NCI-H460를 이식한 누드 생쥐에게 포도필로톡신 아세테이트 및 방사선의 복합 처리 후 배양 일수에 따라 암세포의 크기를 관찰하여 나타낸 그래프이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 포도필로톡신 아세테이트(Podophyllotoxin Acetate)를 유효성분으로서 포함하는 방사선 치료 증진제를 제공한다.

[화학식 1]

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명자들은, 다양한 암세포에 대하여 상기한 바와 같은 포도필로톡신 아세테이트를 투여하여 방사선 치료를 행하여 본 결과, 포도필로톡신 아세테이트를 투여하지 않은 경우에 비하여, 방사선에 의한 암세포 살상능이 증진됨으로써 방사선 치료 효율을 극대화할 수 있다는 것을 밝혀내었다.

본 발명의 방사선 치료 증진제로서 사용 가능한 포도필로톡신 아세테이트은 하기 화학식 1과 같은 구조를 갖는 화합물로서, 포도필로톡신의 유도체이다. 포도필로톡신은 매자나무과 식물 Podophyllum peltatum(북미산)과 P. emodi(히말라야, 카시밀산)의 근경에 들어 있는 알칼로이드로서 글루코시드형으로 존재하며 세포내 튜브린과 결합하여 그의 활성을 저해하여 항암제 후보로서 알려져 있으며 방사선 치료 증진제로서의 기능은 전혀 알려져 있지 않다.

상기의 화합물 포도필로톡신 아세테이트는 천연물로 분리되어진 화합물로서 구조적으로 안정하며 암세포로의 흡수가 가능한 구조이며 방사선 치료 증진제로서의 기능은 보고되어 있지 않다.

본 발명의 방사선 치료 증진제로서 사용할 수 있는 포도필로톡신 아세테이트는 일반적으로 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다.

이와 같이 얻어진 포도필로톡신 아세테이트가 방사선 치료의 증진 효과를 갖는지 확인하기 위하여 하기하는 시험예와 같은 테스트를 하였다.

방사선 치료의 주요 대상이 되는 고형암중의 하나이며 치사율이 가장 높은 폐암세포를 치료 표적으로 하기 위하여, MTT 실험을 수행하여 도 1 및 도 2에서 제시된 결과를 획득하였다. 비소세포성 폐암주인 NCI-H460 및 NCI-H1299를 이용하여 포도필로톡신 아세테이트에 의한 암세포 사멸 효과를 테스트한 결과 NCI-H460의 경우에는 IC50 값이 10.23 nM이었고, NCI-H1299에서는 4.52 nM의 IC50 값을 보여 포도필로톡신 아세테이트가 저농도에서도 폐암세포를 살상할 수 있는 능력을 지니고 있음을 보였다. 또한 상기 두가지 암세포주를 활용하여 포도필로톡신 아세테이트 처리와 방사선 치료의 병용 효과를 테스트한 결과 방사선 단독 처리군에 비하여 방사선에 의한 암세포 살상능을 40% 이상 현저히 증가시켰다. 또한, 면역결핍 생쥐를 이용한 암세포 이식 동물실험의 결과에서도 본 포도필로톡신 아세테이트는 방사선과 병용 처리시 방사선 단독 처리와 비교할 때 암세포 증식을 월등히 감소시키는 것으로 나타났다.

이러한 결과로부터, 포도필로톡신 아세테이트가 유도체가 저선량의 방사선 치료에서도 인체 방사선 치료 효율을 현저하게 증진시키는 효과가 있다는 것을 알 수 있었으며, 방사선 치료 증진제의 활성 성분으로 유효하게 이용할 수 있다는 것을 확인하였다.

이하, 포도필로톡신 아세테이트 유도체의 약리학적 작용에 대하여 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다.

[시험 예]

폐암 세포에 포도필로톡신 아세테이트(미국, MicroSourceDiscovery사 에서 구입)를 방사선과 함께 처리하여 방사선 치료 증진효과를 다음과 같이 시험하였다.

인체 폐암세포인 NCl-H460을 10%의 FBS와 페니실린/스트렙토마이신이 들어 있는 RPMI 1640 배지에서 배양하여 사용하였다.

1. 콜로니 형성 실험

인체 폐암 세포인 NCl-H460에 대하여 각각 다음과 같이 콜로니 형성 실험을 행하였다. 암 세포 약 100 개를 60mm 디쉬에 넣고 37℃의 CO₂ 배양기에서 하루 정도 배양한 후 본 발명의 포도필로톡신 아세테이트를 7nM과 10nM의 2가지 농도로 18시간 전처리후 방사선을 처리하고, 콜로니가 형성될 때까지 계속 배양하였다. 적당한 콜로니가 형성되면, 트리판 블루(trypan blue)를 메탄올로 녹인 용액으로 고정 및 염색을 실시하였고 콜로니 수를 세어 콜로니 형성정도를 비교하였다.

분석 결과

상기와 같은 콜로니 형성 실험을 통하여, 인체 폐암 세포에 대해 포도필로톡신 아세테이트와 방사선에 의한 암세포 살상 증진 효과를 조사하여 도 3과 도 4에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이 인체 폐암 세포에 대한 포도필로톡신 아세테이트와 방사선 병용 처리에 의한 민감도 증가는, 콜로니 형성 비율 0.1을 달성하기 위한 방사선 단독 처리시 방사선량은 5.12Gy였으나 포도필로톡신 아세테이트 포도필로톡신 아세테이트, 10nM의 병용 처리시에는 3.6Gy가 필요한 것으로 나타나, 방사선 민감도 상승비율이 10nM의 병용 처리시에는 1.41로 10nM의 포도필로톡신 아세테이트 병용처리군에서 방사선 민감도 상승 효과를 나타내었다.

또한 도 4에 나타난 바와 같이 방사선 단독보다는 방사선과 포도필로톡신 아세테이트를 병용처리하였을 경우, 폐암 세포의 성장이 억제되는 것이 관찰되었으며, 10nM의 포도필로톡신 아세테이트 병용처리군에서 가장 탁월한 효과를 나타내었다.

또한 인체 폐암 세포주 NCI-H460 및 NCI-H1299에 대하여, 방사선 단독 처리시, 포도필로톡신 아세테이트 단독 처리시, 방사선 및 포도필로톡신 아세테이트의 병용 처리시의 세포 사멸을 프로피디움 요오드 (Propidium iodide)를 이용한 세포 염색체 염색법으로 측정하였다. 그 결과 도 5의 결과에서 나타내고 있는바와 같이 NCI-H460의폐암 세포주는 10nM의 포도필로톡신 아세테이트의 18시간 전처리후 5Gy의 방사선 병용 처리후 72시간 경과후에 가장 높은 세포 사멸 병용 증가 효과를 보였으며, 이때 포도필로톡신 아세테이트 단독 처리시보다는 1.9배, 5Gy의 방사선 단독 처리시보다는 3배의 세포 사멸 증가를 나타내었다. 또한 도 6에서 나타내어지는 바와 같이, NCI-H1299를 이용한 방사선 병용 처리시 세포 사멸 효과에서도 포도필로톡신 아세테이트는 방사선 병용처리시 높은 세포 사멸 증가 효과를 보이고 있는데, 7nM의 포도필로톡신 아세테이트의 18시간 전처리후 5Gy의 방사선 병용 처리 72시간 경과 후에 가장 높은 세포 사멸 병용 증가 효과를 보이고 있고, 이때 포도필로톡신 아세테이트 단독 처리시보다는 1.8배, 5Gy의 방사선 단독 처리시보다는 2.5배의 세포 사멸 증가를 나타내었다.

2. 동물실험

상기와 같은 세포수준에서의 포도필로톡신 아세테이트에 의한 방사선 증진 효과가 실제로 생체수준에서도 일어나는지를 동물 실험을 통하여 검증하고자 하였다. 누드 마우스 대퇴부에 인간 폐암 세포주 NCI-H460를 이식하여 이종 이식체 종양을 형성하게 한 후, 종양크기가 100-150mm³에 이르면 포도필로톡신 아세테이트 (10mg/kg)를 1회 종양 부위에 주사로 투여한 후 6시간뒤에 방사선 10Gy를 1회 조사하였다. 대조군, 포도필로톡신 아세테이트 단독군, 방사선 단독군, 포도필로톡신 아세테이트와 방사선 병용처리군 각각에서 3일 간격으로 종양의 부피를 측정하였다.

결과

도 7에 나타난 바에 같이 인체 폐암세포를 이식한 누드 생쥐 (종양크기 100-150mm³)에 방사선과 포도필로톡신 아세테이트를 병용 처리하고 28일 경과하였을 때, 방사선단독이나 포도필로톡신 아세테이트 단독 처리군보다 암세포의 크기가 크게 감소되어짐을 확인하였다.

또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 총 30일간의 실험 기간 중, 누드 생쥐의 배양 일수가 증가함에 따라 대조군 및 포도필로톡신 아세테이트 단독 처리군은 모두 배양일수 의존적으로 종양의 크기가 빠르게 증가하였고, 방사선만 처리한 군은 상대적으로 대조군 및 포도필로톡신 아세테이트 단독 처리군에 비해 느리게 성장하였으며 포도필로톡신 아세테이트와 방사선 병용 처리군이 가장 느리게 성장하였다. 종양 크기 1500 mm³을 기준으로 하여 이 크기에 각 실험군의 종양이 자라는 기간을 계산해 보면 대조군이 약 15.7일, 포도필로톡신 아세테이트 단독 처리군이 약 13.1일, 방사선 단독 처리군이 약 17.4일, 그리고 포도필로톡신 아세테이트와 방사선 병용처리군이 약 25.1일이 소요되었음을 알수 있으며, 방사선 단독 처리군과 포도필로톡신 아세테이트와 방사선 병용처리군의 비교시에는 약 7.7일의 종양 성장 지체 (Growth delay)일수가 나타남을 알 수 있는데, 이 지체 일수는 마우스 평균 수명이 2년임을 감안하고, 인간의 평균 수명을 70세로 가정할 시, 인간으로 환산하면 약 9개월에 해당하는 일수이다. 따라서 포도필로톡신 아세테이트는 배양세포 수준에서뿐만 아니라 생체 수준에서도 방사선 치료 증진 작용을 나타내는 것으로 관찰되었다.

Claims (3)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 포도필로톡신 아세테이트를 유효성분으로서 포함하는 방사선 치료 증진제.
   [화학식 1]
   

   

   
   
2. 제1항에 있어서, 상기 방사선 치료는 방사선에 의한 폐암 치료인 것을 특징으로 하는 방사선 치료 증진제.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 포도필로톡신 아세테이트의 농도는 10nM인 것을 특징으로 하는 방사선 치료 증진제.
   

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