KR101552009B1

KR101552009B1 - 황반변성 위험도 예측을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주

Info

Publication number: KR101552009B1
Application number: KR1020130071301A
Authority: KR
Inventors: 이상섭; 장인진; 양재욱; 박정순
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-21
Filing date: 2013-06-21
Publication date: 2015-09-09
Also published as: KR20150000037A

Abstract

본 발명은 황반변성의 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 표준 세포주에관한 것으로, 보다 구체적으로는 EBV(Epstein-Barr virus) 바이러스 감염된 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) 유래의 B 임파구성 세포 (LCL, Lymphoblastoid Cell Line)를 이용하여 황반변성 질환 유전자를 포함하는 불멸화 표준 세포주를 제작함으로써 황반변성의 위험도를 예측하기 위한 유전자 진단에 표준 물질을 확보 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

황반변성 위험도 예측을 위한 표준 유전자 불멸화 세포주{An Immortalized Standard Cell Lines for Diagnosing a Risk of Age-related Macular Degeneration}

본 발명은 황반변성의 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 표준 세포주에관한 것으로, 보다 구체적으로는 EBV(Epstein-Barr virus) 바이러스 감염된 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) 유래의 B 임파구성 세포 (LCL, Lymphoblastoid Cell Line)를 이용하여 황반변성 및 당뇨망막병증 질환 유전자를 포함하는 불멸화 표준 세포주를 제작함으로써 황반변성 및 당뇨망막병증의 위험도를 예측하기 위한 유전자 진단에 표준 물질을 확보 및 이의 용도에 관한 것이다.

눈의 안쪽 망막의 중심부에 위치한 신경조직을 황반이라고 하는데, 빛 자극에 반응하는 시세포의 대부분이 이곳에 모여 있고 물체의 상이 맺히는 곳도 황반의 중심이므로 시력에 대단히 중요한 역할을 담당하고 있다. 연령관련 황반변성(AMD: Age-related Macular Degeneration)은 황반의 망막색소상피와 부르크막 및 맥락막모세혈관의 변성을 특징으로 하는 만성 질환이다. 해부학적으로 감각신경망막은 망막색소상피의 앞쪽에 위치하며 영양, 지지, 재순환 및 노폐물의 처리를 망막색소상피에 의존한다. 브루크막은 5층으로 된 구조물로 맥락막과 망막색소 상피 사이에 끼어 있다. 가장 안쪽 층은 망막색소상피의 기저막이고 가장 바깥쪽은 맥락막 모세혈관 내피세포의 기저막이다. 즉, 망막색소상피와 부르크막 및 맥락막 모세혈관 복합체에 발생한 변성 질환이다.

이 질환은 50세 이상의 연령층에서 주로 발생하는데, 이미 서구에서는 60세 이상의 인구에서 실명의 가장 주된 원인이며 우리나라에서도 점점 증가하는 추세이다. 나이관련 황반변성의 원인에 대해서는 아직 정확히 밝혀지지는 않았으나 위험인자로 알려져 있는 것은 나이(특히 75세 이후 가파른 증가를 보인다), 가장 주목받는 환경적 요인인 흡연 외에도 고혈압, 비만, 유전적 소인, 과도한 자외선 노출, 낮은 혈중 항산화제 농도 등이 있다.

황반변성에는 건성(비삼출성) 황반변성과 습성(삼출성) 황반변성의 두 유형이 있다. 건성 황반변성(dry AMD, nonexudative AMD, nonneovascular AMD)은 노폐물이 망막하에 드루젠(drusen)이라는 황색 침전물을 형성하여 쌓이게 되는데 이것이 커지게 되면 망막 특히 황반으로의 혈류를 방해하고 시야를 가리게 되어 시력에 장애가 오기 시작한다. 건성 황반변성은 급격한 시력 상실을 유발하지는 않지만 습성 황반변성으로 진행할 수 있다. 망막의 아래에는 섬유조직 내에 파묻힌 혈관 집합을 포함하는 맥락막 및 맥락막층을 덮고 있는 색소상피가 있다.

습성 황반변성(wet AMD, exudative AMD, neovascular AMD)은 망막 아래 맥락막 부분에서 신생혈관이 자라서 생긴다. 이러한 약한 신생혈관이 터져서 출혈이 발생하고 삼출을 일으켜서 망막의 황반영역에 변성을 일으켜 시력장애가 발생하는 것이다. 습성 황반변성은 진행속도가 매우 빨라서 수주 안에 시력이 급속히 나빠지기도 하고 2개월 ~ 3년 사이에 실명을 초래하기도 하는 것으로 알려져 있다.

진행성 황반변성 발생의 70%가 유전적 특성(CFH, ARMS2등)에 의해 결정되고, 나머지 30%가 흡연, 습관과 같은 환경적 요인에 의해 결정된다고 한다.

황반변성 및 당뇨망막병증의 발생위험과 관련성이 임상적으로 검증된 주요 위험유전자로 CFH I62V, CFH Y402H와 ARMS2 A69S 변이 등이 있다. 또한,AMD의 발병 또는 진행과 관련된 다중 다형성이 확인되었다 (예를 들어, 문헌 [Despriet et al. (2007) Arch. Ophthalmol. 125:1270-71]; [Seddon et al. (2007) JAMA 297:1793-99, 2585]; [Boon et al. (2008) Am. J. Human Genet. 82:516-23]). 이전의 연구는 보체 인자 H (CFH) 유전자의 아미노산 위치 402에서의 특정 다형성이 AMD에 대한 베르테포르핀으로의 PDT 또는 오프-라벨 베바시주맙 요법에 대한 반응과 관련되어 있다는 것을 보여주었다 (문헌 [Brantley et al. (2008) Eye published online 22 February, pp. 1-6]; [Brantley et al. (2007) Ophthalmology 114:2168-73]). 또한 당뇨망막병증의 경우에도 상기 일부 유전자의 변이에 따라 발생위험이 달라진다는 사실이 알려져 있다.

이처럼, 황반변성 및 당뇨망막병증 질환의 발병과 관련되거나 안전성을 예측할 수 있는 유전자형의 확인을 이용하고자 하는 요구가 늘고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 피험자의 혈액으로부터 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) 분리를 한 후 Epstein-Barr virus (EBV) 바이러스를 감염시켜 활성화된 영구 증식 가능한 B 임파구성 세포 (LCL, Lymphoblastoid Cell Line)의 불멸화 세포주를 제조함으로써, 이를 황반변성 및 당뇨망막병증 관련 변이 유전자 분석을 위한 표준물질로 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

1. Despriet et al. Arch. Ophthalmol. 125:1270-71, 2007. 2. Brantley et al. Ophthalmology 114:2168-73, 2007.

본 발명의 목적은 황반변성 및 당뇨망막병증 질환 관련 유전자 변이의 유전형 분석을 위한 불멸화된 세포주 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 불멸화된 세포주를 표준물질로써 이용하여 유전형을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전형 분석을 통해 황반변성 및 당뇨망막병증 위험도 예측 또는 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은

(a) 혈액에서 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells)를 분리하는 단계;

(b) 상기 말초혈액단핵세포(PBMC)에 헤르페스 바이러스를 감염시키는 단계;

(c) B 임파구성 세포 (LCL, Lymphoblastoid Cell Line)를 분리하는 단계; 및

(d) 세포 스탁(cell stock)을 제조하는 단계

를 포함하는 황반변성 및 당뇨망막병증 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 표준 세포주를 제작하는 방법 및 이에 따라 수득된 불멸화 표준 세포주를 제공한다.

이 때, 상기 혈액은 인간 유래인 것이 바람직하고, 상기 헤르페스 바이러스는 EBV(Epstein-Barr virus)인 것이 가장 바람직하다.

또한, 상기 방법은 이스코브 변형된 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 둘베코 변형된 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagles medium, DMEM), 알파 MEM 배지 및 RPMI 배지로 구성된 군에서 선택되는 동물 세포 배양용 배지에서 수행하는 것이 좋다.

즉, 본 발명은 상기 방법으로 수득된, EBV(Epstein-Barr virus) 바이러스 감염된 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) 유래의 B 임파구성 세포 (LCL, Lymphoblastoid Cell Line)인 것을 특징으로 하는, 황반변성 및 당뇨망막병증 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 표준 세포주를 제공한다.

특히, 본 발명의 세포주는 황반변성 및 당뇨망막병증 위험도와 관련한 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자가 포함되어 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 황반변성 및 당뇨망막병증 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 표준 세포주의 다양한 용도를 제공한다.

일 구체예로서, 상기 불멸화 세포주를 표준물질로 이용하여 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 분석하는 방법 및 이에 사용될 수 있는 키트 등을 제공할 수 있다.

이 때, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역 전사효소-PCR (RT-PCR), 제자리 PCR, 정량적 PCR (q-PCR), 제자리 하이브리드 형성, 서던 블롯, 노던 블롯, 서열 분석, 마이크로어레이 분석, 리포터 유전자의 검출, 또는 기타 DNA/RNA 하이브리드 형성 기반 방법 등의 공지의 다양한 방법을 사용할 수 있지만, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 유전자 분석 방법으로 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 방법을 사용하였고, 이 때, PCR을 위한 프라이머는 하기 실시예에 기재된 표 1 및 표 4에 기재된 프라이머를 사용하였다.

이러한 황반변성 및 당뇨망막병증 관련 유전자 분석은 아시아인, 예를 들어 한국인을 대상으로 하는 경우 더욱 효과적이다.

이와 같이, 본 발명은 특정 유전자, 바람직하게는 황반변성 및 당뇨망막병증 위험도 관련 유전자들을 효과적으로 분석할 수 있는 불멸화 세포주 표준 물질, 이의 제조방법, 그리고 이와 관련된 용도를 모두 제공한다.

본 발명에서 제조한 불멸화된 세포주는 황반변성 및 당뇨망막병증의 발생과 밀접하게 관련된 질환 유전체의 유전자 분석을 위해 표준 물질로 유용하게 사용될 수 있으므로 황반변성 및 당뇨망막병증 질환과 관련된 유전자 변이를 신속 정확하게 검출할 수 있으므로, 황반변성 및 당뇨망막병증의 진단, 예후, 치료경과 추정 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 혈액에서 PBMC를 분리하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 CFH (rs3753394) -331CT 타입을 나타낸다.
도 3은 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 CFH (rs800292) 20986AG 타입, 62IV 타입을 나타낸다.
도 4는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 CFH (rs1061170) 37990TT 타입, 402YY타입을 나타낸다.
도 5는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 CFH (rs1410996) 75686GA 타입을 나타낸다.
도 6은 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 CFH (rs1329428) 81563TC 타입을 나타낸다.
도 7는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 HTRA1 (rs11200638) -625GA 타입을 나타낸다.
도 8은 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 ARMS2 (rs2736911) 112TT 타입, 38XX 타입을 나타낸다.
도 9는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 ARMS2 (rs10490924) 205GG 타입, 69AA을 나타낸다.
도 10은 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 C2 (rs9332739) 8275GG 타입, 186EE 타입을 나타낸다.
도 11은 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 C2 (rs547154) 15409GG 타입을 나타낸다.
도 12는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 CFB (rs4151667) 26TT 타입, 9LL 타입을 나타낸다.
도 13는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 CFB (rs641153 )182GG 타입, 32RR을 나타낸다.
도 14는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 C3 (rs2230199) 2214CC 타입, 102RR 타입을 나타낸다.
도 15는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 C3 (rs2241394 ) 35371CC 타입을 나타낸다.
도 16는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 REST (rs1713985) 9646GT 타입을 나타낸다.
도 17는 왼쪽 그림은 자동염기서열 분석 chromas 데이터, 오른쪽 그림은 고속염기서열 분석 데이터로 VEGFA (rs3025039) 13553CT 타입을 나타낸다.

본 발명은 황반변성 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 세포주, 이의 제조방법 및 이의 황반변성 질환 분석용 표준물질로의 용도에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

'불멸화된', '불멸화된 세포' 및 '불멸화된 세포주'는 각각의 출발 세포에 적어도 200 계대, 바람직하게는 제한되지 않는 수의 계대, 즉 불멸에 대한 능력을 부여하는 특정 기능적 DNA 서열에 의해 트랜스펙션된/형질전환된 세포 또는 세포주에 관한 것이다.

'표준물질(reference material)'이란 측정값의 교정, 측정방법의 평가, 물질 참값의 부여에 있어 널리 사용되는 물질로서, 분석 측정의 정확성과 정밀도를 유지하기 위해 반드시 필요할 뿐만 아니라, 특히 결과를 검증하고 보정할 때 부정확한 결과를 방지하는데 중요하다. 최근에는 분석 기술이 향상되면서 분명한 추적성 정보 측면에서 인증된 표준 물질의 중요성이 더 커지고 있다.

'유전자형'이라는 용어는 세포 또는 조직 샘플에서 특정 유전자의 특이적 대립유전자를 지칭한다. 상기 예에서, CC, CT 또는 TT가 Y402H CFH 다형성에서의 가능한 유전자형이다.

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST, VEGFA 등의 유전자들과 관련되어 있는 질환을 대상으로 하는데, 본 명세서에서는 이에 대해 "황반변성 및 당뇨망막병증" 또는 "황반변성"으로 혼용하여 기재하고 있다.

황반변성의 발생위험과 관련성이 임상적으로 검증된 주요 위험유전자로 CFH I62V, CFH Y402H와 ARMS2 A69S 변이 등이 있다

"진단용 마커(diagnosis marker)란 황반변성 및 당뇨망막병증 질환 관련 상태를 정상 상태와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 상이한 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 황반변성 및 당뇨망막병증 진단 마커는 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST, VEGFA 등의 유전자들이다. 이 때, '마커'는 좌위 또는 연관된 좌위를 확인할 때 기준점으로 사용되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 코딩 생성물 (예를 들어, 단백질)을 지칭하는데, 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.

'유전적 다형성(genetic polymorphism)'은 인구집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. DNA에서 한 개의 뉴클레오티드의 삽입, 소실, 또는 치환이 일어나는 것을 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 이라고 한다. SNP에 의한 염기서열의 변이가 아미노산의 변화를 초래하는 경우를 nonsynonymous SNP라고 하고, 아미노산의 변화를 일으키지 않는 경우를 silent SNP 또는 synonymous SNP라 한다

'핵산'은 데옥시리보핵산(DNA), 및 적절하다면 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체(예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 서술된 구체예에 적용된대로, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에서는 '핵산'이라는 용어와 '뉴클레오티드'가 병용하여 쓰이고 있다.

'프라이머'는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

'다형성과 연관된 질환 및 상태'는 다양한 질환 또는 상태, 즉 하나 이상의 대립유전자의 동일화에 근거한 피험체에서 표시될 수 있는 감수성을 나타낸다.

'위험'은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다. 본 발명에서는 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST, VEGFA 등의 유전자들과 관련되어 있는 질환의 위험도를 예측하고자 하는데, 본 명세서에서는 상기 질환에 대해 "황반변성 및 당뇨망막병증" 또는 "황반변성"으로 혼용하여 기재하고 있다.

'표현형'은 유전형에 의해서 결정되는 개체의 형태학적, 생리학적,또는 생화학적 특징을 표현형이라 한다. 유전형이란 표현형과 구별되는 것으로, 개인의 유전자 구성을 뜻하며, 보다 좁은 의미로는 한 유전자 위에 존재하는 대립 유전자들(alleles)을 말한다.

'대상' 또는 '환자'는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.

'조직 또는 세포 샘플'은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

'유효량'은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

'치료하는'이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

불멸화 세포주 및 이의 제조방법

본 발명은 일 관점에서, 황반변성 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 세포주 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 불멸화 세포주는 EBV(Epstein-Barr virus) 바이러스 감염된 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) 유래의 B 임파구성 세포 (LCL, Lymphoblastoid Cell Line)인 것을 특징으로 한다.

"1차 세포"는 배양물 중에서 성장할 수 있는 한정된 능력을 갖는 세포로서 특징화되는 것이 일반적이다. 1차 세포는 온전한 조직으로부터 단리되고 배양되는 세포이다. 1차 세포는 배양물 중에서 제한된 수명을 나타내어, 결과적으로 노화된다. 노화시에 세포는 분할이 중단되고, 시간이 경과함에 따라 사멸된다. 이러한 1차 세포의 불멸화 및 형질전환을 초래하는 기작은 잘 기재되어 있다 (Hahn, W. C. et al., Nature 400: 464-8 (1999)). 정상적인 세포는 자연적으로 또는 바이러스의 감염, 뮤타젠(mutagen) 처리 등의 인공적인 방법에 의하여 불멸화할 수 있다.

본 발명에서는 EBV(Epstein-Barr virus)를 이용하여 바이러스 형질전환(viral transformation)을 통해서 불멸화 세포를 제작한다.

이하, 이의 제조방법을 설명하면서 상기 황반변성 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 세포주도 함께 설명하도록 한다.

일 구체예로써 이하와 같은 방법을 이용하여 제작할 수 있다:

(b) 상기 말초혈액단핵세포(PBMC)에 EBV 바이러스를 감염시키는 단계;

(d) 세포 스탁(cell stock)을 제조하는 단계.

상기 (a)단계에서 혈액은 바람직하게는 인간의 혈액을 사용한다.

본 발명의 신규한 불멸화된 세포주를 제작하기 위해, 먼저 인간의 혈액으로부터 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)를 수득하고 형질감염을 위해 단리한다. 수득한 조직샘플을 잘게 쓴 후, 트립신으로 분해하고, 현탁액 중의 단일 세포 또는 단층 배양물로 작지만 온전한 조직샘플로서 형질감염을 위해 단리할 수 있다. 그러나, 단리방법은 이로 한정되는 것은 아니며 당업자들에게 널리 공지된 다양한 단리방법이 이용될 수 있다.

그 후 단리한 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)에 바이러스 벡터를 이용하여 형질감염시킨다.

세포를 형질감염시키기 위한 방법은 본 기술분야에서 잘 확립되어 있다. 형질감염을 위한 재조합 바이러스 벡터의 사용도 또한 본 기술분야에서 잘 확립되어 있다. 포유동물 세포감염성 바이러스 벡터로서는 특별히 제한은 없지만, 숙주에 대한 독성이 낮고, 도입유전자의 높은 발현이 얻어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 벡터로서 사용될 수 있는 바이러스 벡터로서는, 예를 들면 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반(adeno-associated) 바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 셈리키 삼림 바이러스(Semliki forest virus) 벡터, 신드비스바이러스(Sindvis virus) 벡터, 백시니아바이러스(Vaccinia virus) 벡터, 계두바이러스(fowl pox virus) 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 헤르페스바이러스 벡터, 가장 바람직하게는 그 중에서도 EBV(Epstein-Barr virus)를 사용한다.

상기 EBV는 헤르페스 패밀리(herpes family)에 속하는 인간 바이러스로서 170kb의 게놈으로 구성되어 있고, EBV가 감염되는 세포는 주로 B cell이며, EBV는 제한적 target cell-tropism을 나타낸다.

그 후, 상기 EBV 감염된 PBMC를 CO₂(0.5%) 인큐베이터 등에서 배양한다.

이 때, 동물 세포의 배양에 적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용가능한 배지를 사용할 수 있다. 상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 이스코브 변형된 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 둘베코 변형된 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagles medium, DMEM), 알파 MEM (지브코, Gibco), RPMI 1640, 또는 임의의 기타 적절한 시판 배지를 포함한다. 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다.

이러한 공정을 통해 B 임파구성 세포 (LCL, Lymphoblastoid Cell Line)가 생성된다.

B 세포의 경우 EBV의 주요 당단백질인 gp350과 보체의 수용체인 CD21의 상호 결합이 우선적으로 일어나며 뒤이어 EBV의 gp42가 B 세포 표면의 HLA class II 분자에 결합해 바이러스와 B 세포 표면이 더 가까워져서 최종적으로 EBV gHgL 복합체가 바이러스 외피와 세포막 간의 융합을 매개한다. 즉, B 세포의 경우 EBV에 의한 감염이 비교적 용이하게 일어나서 LCL(lymphoblastoid cell line)을 형성하는 것이다. (c) 단계에서, 상기 B 임파구성 세포 (LCL, Lymphoblastoid Cell Line)를 분리하여 배양한다.

그리고, 상기 배양된 세포로 세포 스탁(cell stock)을 제조한다.

바이러스 스탁을 생산하기 위하여, 세포들은 조직배양 플라스크, 롤러 바틀, 스터 배양기내로, 실관 반응기내로, 또는 기타 대량배양 시스템 내로 접종되어질 수 있다. 바이러스 스탁 증식을 개시하기 위한 감염 다중도 (MOI)(세포당 감염성 바이러스의 비율)는 바이러스 균주에 따라 달라질 것이다. 바이러스학 분야 및 특정한 바이러스/바이러스 균주의 증식 분야에 있어서의 통상의 지식을 가진 자는, 과도한 실험 없이도 감염 다중도, 온도, 배지 변형 등의 기준 조작기술을 이용하여 바이러스 스탁 수율을 최대화할 수 있다.

또한 감염성 바이러스 스탁을 수확하기 위하여 세포를 감염시킨 후에 바이러스를 회수하는 방법도 당업자가 바이러스 균주에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 외막을 가진 바이러스는 비외막 바이러스보다도 훨씬 천천히 배양배지내로 방출된다. 배양 배지만으로부터 또는 조절된 배지에 고인 세포 용해질(lysate)로부터 바이러스 스탁(virus stock)이 회수되어질 수 있다. 용균성 바이러스(바이러스 방출시에 세포를 용균시키는데 효율적인 바이러스들)에 있어서는, 세포 잔해물을 제거하기 위하여 원심분리 단계를 실시한 후에 조절된 배양배지(즉, 바이러스를 함유한 다 써버린 배지)를 회수하는 것으로 충분하다.

불멸화 세포주

불멸화 과정을 통해 만들어진 불멸화 세포주 DNA는 유전형 분석시에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 특정 SNP(single nucleotide polymorphism)이나 특정 반수체형(haplotype) 등을 분석하는데도 사용할 수 있다.

본 발명에서는 상기 방법에 의해 제조된 B-lymphoblastoid cell line(BLCL)을 이용하여 황반변성 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 표준 세포주 및 이의 용도를 제공한다.

본 발명의 방법에 의한 불멸화 과정이 제대로 진행되면 PBMC 세포의 크기와 모양이 변하는데, 안정된 불멸화 세포주들은 연장된 수명(extended life span), 안정적인 유전자형(stable genotype), 조직에 따른 마커 들의 일정한 발현 등을 특징으로 가지게 된다.

특히, 본 발명의 불멸화 표준 세포주는 황반변성 위험도 예측 또는 진단을 위한 특정 유전자들인 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST, VEGFA 등을 포함되어 있는 것을 특징으로 한다.

불멸화 세포에 있어서, 특정 단백질의 발현을 암호화하는 핵산을 도입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

핵산 분자는 재조합 DNA 기술 (예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성법의 이용으로 제조될 수 있는데, 황반변성 위험도 예측 또는 진단을 위한 특정 유전자들인 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST, VEGFA 등에 대한 코딩 부위 각각에 대한 핵산 서열 또한 종래 기술에 공지되어 있으므로 문헌 등을 참조하여 이용할 수 있다. 유사하게, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 아미노산 서열 또한 종래 기술을 참조하여 이용할 수 있다.

상기 핵산 분자는 천연 핵산 분자 및 이의 상동체, 비제한적인 예로서, 뉴클레오티드가 변형에 의해 소정의 효과를 제공하는 방식으로 삽입, 결실, 치환 및/또는 역전된 천연 대립유전자 변이체 및 변형된 핵산 분자를 포함한다.

표준물질

본 발명은 다른 관점에서 상기 불멸화된 세포주를 표준물질로서 이용하는 아시아인종의 유전자의 유전형을 분석하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 황반변성 위험도 예측 관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서의 '표준물질'이란 황반변성 위험도 관련 유전자 변이를 분석하기 위한 기준이 되는 시료로서, 이는 일반적으로 본 발명의 불멸화 세포를 배양하여, 황반변성 위험도와 관련된 유전적 및 생물학적 마커에 대하여 평가하는 것을 포함한다. 세포의 유전자형 또는 표현형 특징에서의 변화의 검출에 대한 각종 방법은 종래 기술에 공지되어 있다.

유전자 서열 또는 발현을 측정하거나 검출하기 위해 이용될 수 있는 방법의 비제한적인 예로서, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역 전사효소-PCR (RT-PCR), 제자리 PCR, 정량적 PCR (q-PCR), 제자리 하이브리드 형성, 서던 블롯, 노던 블롯, 서열 분석, 마이크로어레이 분석, 리포터 유전자의 검출, 또는 기타 DNA/RNA 하이브리드 형성 기반을 들 수 있다.

단백질 수준의 측정 방법의 비제한적인 예로서, 웨스턴 블롯, 면역블롯, 효소 결합 면역흡수 측정법 (ELISA), 방사선면역측정법 (RIA), 면역침전, 표면 플라스몬 공명, 화학발광, 형광 편광, 인광, 면역조직화학 분석, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 (MALDI-TOF) 질량 분석법, 미세흐름세포측정, 마이크로어레이, 현미경검사, 형광 활성화 세포 분류법(FACS), 흐름 세포측정, 및 DNA 결합, 리간드 결합, 기타 단백질 파트너와의 상호 작용, 세포 신호 형질도입, 효소 활성, 및 가용성 인자 또는 단백질의 분비 등의 어세이를 들 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 표준물질과 분석시료로부터 얻은 PCR 산물을 비교하는 것은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 실시간 중합효소연쇄반응 (이하, Real-Time PCR)을 이용하는 것일 수 있다.

Real-Time PCR을 이용할 경우, 내재유전자 및 도입유전자의 DNA에 특이적으로 결합하는 양 방향 프라이머와 검출용 프로브를 이용하여 PCR 증폭과정에서 발색되는 형광의 양을 측정함으로써 내재 및 도입유전자를 비교 분석할 수 있다. 이 때 상기 검출용 프로브로서, Real-Time PCR 수행시 분석을 위한 형광물질이 염기서열에 도입되어 있는 프로브를 사용할 수 있고, 이러한 검출용 프로브의 종류는 유전자의 종류에 따라 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 구체적인 예로서, 상기 황반변성 위험도 관련 유전자 변이 검출에 사용되는 프라이머, 및 이를 포함하는 유전자 마커 검출용 키트 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명에서 사용되는 황반변성 진단용 유전자 마커를 증폭하기 위한 적절한 프라이머를 적절한 방법을 사용하여 디자인할 수 있다. CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST, VEGFA 등의 유전자 서열 및 다형성 위치를 사용하여, 당업자는 적절한 프라이머를 구축할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 사용된 프라이머 세트는 실시예 2에 기재되어 있다.

상기 키트는 본 발명의 앞서 설명한 프라이머쌍 세트, 필요에 따라 DNA 중합효소 및 dNTP(dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP) 등을 포함할 수 있다. 그리고, 이러한 키트의 사용에 있어서, 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석중 용이하게 동정할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예로서는 방사능 표지, 효소,형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 자성 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등이 있다.

본원에서 기술하는 황반변성 분석용 키트를 사용하여 얻어지는 정보는 피험체가 황반변성 관련 질환 또는 상태를 보유하거나 발병 가능성이 있는지를 결정하는 데 유용하다.

뿐만 아니라, 이 정보는 질환 또는 상태의 개시 또는 진행을 예방하는 방법을 더욱 체계화할 수 있다. 예를 들어 이러한 정보에 의하면 의사는 질환 또는 상태의 분자적 기초를 다루는 치료법을 더욱 효과적으로 처방할 수 있다. 따라서, 황반변성 진단 및 치료를 위한 키트 또한 본 발명의 일 태양이다.

본 발명의 상기 방법은 유전자 레벨에서뿐만 아니라, 핵산서열에 의해 코딩되는 단백질(아미노산) 수준에서도 사용될 수 있다.

그러므로, 본 발명은 특정 유전자, 예를 들어 황반변성 및 당뇨망막병증 관련 유전자들을 정량적으로 분석할 수 있는 방법 및 이와 관련된 모든 용도를 포함한다. 즉, 황반변성 및 당뇨망막병증 관련 질환의 진단, 예후, 치료경과 추정에 사용되는 용도 및 치료제 스크리닝 등에 사용되는 용도 또한 포함된다.

이와 같이, 본 발명의 방법으로 제작된 불멸화 세포주의 유전물질을 표준 물질로 하여 황반변성 및 당뇨망막병증 위험도를 효과적으로 예측 및 진단할 수 있으므로, 본 발명은 바람직하게는 한국인을 포함하는 아시아인에서의 황반변성 및 당뇨망막병증 진단, 예후, 치료경과 추정에 사용될 수 있는 유전체 연구에 매우 유용할 것이다.

<실시예>

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌측에서 우측으로 5'→3' 배향으로 기록된다. 명세서 내에서 열거된 수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함하고, 정의된 범위 내의 각각의 정수 또는 임의의 비-정수 분획을 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

재료

인간혈액, Ficol-Histopaque(HISTOPAQUE　-1077) (Sigma, Cat. No.1077-1), RPMI-1640 배지 (Hyclone, Cat. No.SH30027.01), Fetal Bovine Serum (FBS) (Hyclone, Cat. No.), 페니실린/스트렙토마이신 (Hyclone, Cat. No.SV30010), Cyclosporin A (Sigma, Cat. No. C3662), Minisart filter 0.45μm (Sartorius stedim, Cat. No. 16555)를 준비하였다.

실시예 1 : 혈액에서 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 불멸화 세포주 제작

1-1 : 혈액에서 말초혈액단핵세포 ( PBMC ) 분리

50ml 튜브에 혈액 10ml과 PBS 15ml을 섞어주었다. 새 50ml cornical tube에 Ficol-Histopaque(HISTOPAQUE　-1077)을 15ml 분주하였다. Ficol 위로 PBS와 섞은 혈액을 Ficol과 섞이지 않게끔 천천히 분주하였다. 400g에서 30분간 원심 분리하였다 (브레이크 설정: 0). 원심분리 후, 가장 위(Plasma)층을 조금만 남겨두고 따서 버리고 말초혈액 단핵 세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells)층을 1ml pipet으로 5~6mL 정도 조심스럽게 취하였다 (도 1 참조).

말초혈액단핵세포(PBMC)에 RPMI(FBS 0%, PS 무첨가) 배지를 30ml이 되게 넣고, 부유하고, 400g에서 10분간 원심분리하였다(브레이크 설정: 9). 상등액은 버린 후 cell pellet에 RPMI(FBS 20%, PS 첨가) 배지를 2ml 넣고 부유했다. Hemocytometer를 이용하여 cell 개수를 셌다 (최적 : 1X10⁷~2X10⁷,최소 : 5X10⁶). T25 culture flask에 총 배지 6ml이 되도록 넣었다

1-2 말초혈액 단핵세포 ( PBMC ) 불멸화세포 제작

필터(0.45mm)한 EBV 바이러스 2ml을 첨가한 후 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였다. 2시간 뒤에 Cyclosporin A(stock 100mg/ml) 80ml를 첨가하여 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였다.

4일째, RPMI(FBS 20%, Penicillin-Streptomycin 첨가) 배지 2mL을 더 첨가하고, 7일째, PBMC를 T75 culture flask로 옮겼다. 세포가 자라는 것을 지켜보며, RPMI(FBS 20%, Penicillin-Streptomycin 첨가) 배지를 더 첨가했다. 세포가 충분히 모였으면, cell stock을 만들거나 DNA를 뽑았다.

1-3 세포 스탁 ( Cell stock ) 제조

2mL cryo tube에 라벨링하고, 50ml 튜브에 셀을 넣고 1,000rpm에서 3분간 원심 분리했다. 배지를 버리고, Cell pellet에 FBS를 넣고 셀을 부유시켰다. 10%의 DMSO를 넣고, 2mL cryo tube에 나누어서 분주하였다. -70℃에서 하룻동안 보관하고, 액체질소 탱크로 옮겨서 보관하였다.

실시예2 : 불멸화세포주의 DNA 를 이용한 유전형 분석 방법

우선, 실시예 1에서 제작한 불멸화된 세포주를 이용하여, Qiagen 사의 genomic DNA 분리 키트를 사용하여 DNA를 분리하였다. 그리고, 상기 분리된 DNA를 이용하여 아래와 같은 황반변성 관련 유전자 리스트를 이용하여 PCR 프라이머를 제작하였다. 수득한 PCR 산물은 자동염기서열 분석기로 확인하였다.

2-1 황반변성 관련 대표유전자 선정

아래와 같은 공지 문헌을 참조하여, 황반변성 관련 위험도 예측 유의 유전자를 프라이머를 이용해서 PCR 생성물을 생성하였다. 유전자 선정은 이미 위험성을 나타내고 있다고 보고가 되어 있는 유전자를 선정했으며, 다음과 같은 논문을 참고 문헌으로 이용하였다.

(1) Association between complement factor H gene polymorphisms and neovascular age-related macular degeneration in Koreans. Kim NR, Kang JH, Kwon OW, Lee SJ, Oh JH, Chin HS. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 May;49(5):2071-6.

(2) Genome-wide association study identifies two susceptibility loci for exudative age-related macular degeneration in the Japanese population. Arakawa S, Takahashi A, Ashikawa K, Hosono N, Aoi T, Yasuda M, Oshima Y, Yoshida S, Enaida H, Tsuchihashi T, Mori K, Honda S, Negi A, Arakawa A, Kadonosono K, Kiyohara Y, Kamatani N, Nakamura Y, Ishibashi T, Kubo M. Nat Genet. 2011 Sep 11;43(10):1001-4.

(3) A69S and R38X ARMS2 and Y402H CFH gene polymorphisms as risk factors for neovascular age-related macular degeneration in Poland - a brief report. Teper SJ, Nowi-ska A, Wyl?gała E. Med Sci Monit. 2012 Feb;18(2):PR1-3.

(4) Association between complement factor H gene polymorphisms and neovascular age-related macular degeneration in Koreans. Kim NR, Kang JH, Kwon OW, Lee SJ, Oh JH, Chin HS. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 May;49(5):2071-6.

(5) LOC387715/HTRA1 polymorphisms, smoking and combined effects on exudative age-related macular degeneration in a Korean population. Lee SJ, Kim NR, Chin HS. Clin Experiment Ophthalmol. 2010 Oct;38(7):698-704.

(6) Significance of C2/CFB variants in age-related macular degeneration and polypoidal choroidal vasculopathy in a Japanese population. Nakata I, Yamashiro K, Yamada R, Gotoh N, Nakanishi H, Hayashi H, Akagi-Kurashige Y, Tsujikawa A, Otani A, Saito M, Iida T, Oishi A, Matsuo K, Tajima K, Matsuda F, Yoshimura N. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2012 Feb 16;53(2):794-8.

(7) A common complement C3 variant is associated with protection against wet age-related macular degeneration in a Japanese population. Yanagisawa S, Kondo N, Miki A, Matsumiya W, Kusuhara S, Tsukahara Y, Honda S, Negi A. PLoS One. 2011;6(12):e28847.

(8) Genome-wide association study identifies two susceptibility loci for exudative age-related macular degeneration in the Japanese population. Arakawa S, Takahashi A, Ashikawa K, Hosono N, Aoi T, Yasuda M, Oshima Y, Yoshida S, Enaida H, Tsuchihashi T, Mori K, Honda S, Negi A, Arakawa A, Kadonosono K, Kiyohara Y, Kamatani N, Nakamura Y, Ishibashi T, Kubo M. Nat Genet. 2011 Sep 11;43(10):1001-4.

(9) Homozygosity for the +674C>T polymorphism on VEGF gene is associated with age-related macular degeneration in a Brazilian cohort. Almeida LN, Melilo-Carolino R, Veloso CE, Pereira PA, Miranda DM, De Marco LA, Nehemy MB. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2012 Feb;250(2):185-9.

이 밖에도 다른 문헌 등을 통해서 추가 유의 유전자 분석 또한 불멸화 세포주를 이용하여 표준물질로서 분석이 가능하다.

2-2 프라이머 및 PCR

각 PCR에 사용한 프라이머 쌍은 다음과 같다. (A, T, G, C는 각각 Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine을 의미함)

그리고, 각 PCR 생성물에 대한 반응 조건은 다음과 같다.

각 프라이머의 위치와 PCR 산물의 크기는 다음과 같다. 또한, 뉴클레오타이드의 위치는 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)따라 기재하였다.

CFH RefSeqGene NG_007259.1

ARMS2 RefSeqGene NG_011725.1

HTRA1 RefSeqGene NG_011554.1

CFB RefSeqGene NG_008191.1

C2 RefSeqGene NG_011730.1

C3 RefSeqGene NG_009557.1

REST RefSeqGene NG_029447.1

VEGFA RefSeqGene NG_008732.1

(번역 개시 코돈 ATG의 A는 numbered +1.)

2-2. 황반변성 관련 유전자 염기서열 분석

각 얻어진 PCR 산물은 자동염기서열 분석기로 확인하였다. 또한, 고속 변이 검색(Snapshot assay)을 위한 시퀀싱 프라이머는 아래와 같다.

이는 본 발명의 불멸화 세포주를 이용하여 황반변성 및 당뇨망막병증 관련 변이 유전자인 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST, VEGFA 등을 정확하고 효율적으로 검출할 수 있으므로, 상기 황반변성 및 당뇨망막병증 관련 질환의 위험도를 효과적으로 예측할 수 있음을 시사한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

황반변성 및 당뇨망막병증 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 표준 세포주를 제작하는 방법으로서,
상기 방법은
(a) 혈액에서 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells)를 분리하는 단계;
(b) 상기 말초혈액단핵세포(PBMC)에 헤르페스 바이러스를 감염시키는 단계;
(c) B 임파구성 세포(LCL, Lymphoblastoid Cell Line)를 분리하는 단계; 및
(d) 세포 스탁(cell stock)을 제조하는 단계를 포함하고,
상기 세포주는 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 황반변성 및 당뇨망막병증 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 표준 세포주를 제작하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 혈액은 인간 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 헤르페스 바이러스는 EBV(Epstein-Barr virus)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 이스코브 변형된 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 둘베코 변형된 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagles medium, DMEM), 알파 MEM 배지 및 RPMI 배지로 구성된 군에서 선택되는 동물 세포 배양용 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
EBV(Epstein-Barr virus) 바이러스 감염된 말초혈액단핵세포(PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) 유래의 B 임파구성 세포 (LCL, Lymphoblastoid Cell Line)인 것을 특징으로 하는, 황반변성 및 당뇨망막병증 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 표준 세포주로서,
상기 세포주는 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 황반변성 및 당뇨망막병증 위험도 예측 또는 진단을 위한 불멸화 표준 세포주.
삭제
제5항의 불멸화 표준 세포주를 이용하여 CFH, ARMS2, HTRA1, C2, C3, CFB, REST 및 VEGFA로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 분석하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 방법은 아시아인을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 유전자를 분석시 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.