KR101545705B1 - Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커 - Google Patents

Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커 Download PDF

Info

Publication number
KR101545705B1
KR101545705B1 KR1020100090766A KR20100090766A KR101545705B1 KR 101545705 B1 KR101545705 B1 KR 101545705B1 KR 1020100090766 A KR1020100090766 A KR 1020100090766A KR 20100090766 A KR20100090766 A KR 20100090766A KR 101545705 B1 KR101545705 B1 KR 101545705B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mcm7
leu
arg
ala
gene
Prior art date
Application number
KR1020100090766A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20120028748A (ko
Inventor
서상범
김동욱
김지영
김기범
Original Assignee
중앙대학교 산학협력단
대한민국(관리부서 질병관리본부장)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 중앙대학교 산학협력단, 대한민국(관리부서 질병관리본부장) filed Critical 중앙대학교 산학협력단
Priority to KR1020100090766A priority Critical patent/KR101545705B1/ko
Publication of KR20120028748A publication Critical patent/KR20120028748A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101545705B1 publication Critical patent/KR101545705B1/ko

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407Specifically defined cancers
    • G01N33/57438Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118Prognosis of disease development
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커 및 이의 의학적 용도에 관한 것으로, 간흡충에 감염될 경우 Mcm7 유전자 및 단백질의 발현 수준이 증가되므로, 개체에서 Mcm7 유전자 및 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 신속하고 간편하며 정확하게 간흡충 감염을 진단할 수 있고, 더 나아가 간암의 초기 진단에도 유용하게 사용할 수 있다.

Description

Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커{Marker for diagnosing of clonorchiasis and liver cancer comprising Mcm7 gene}
본 발명은 간흡충 감염 또는 간암을 진단하는 유용한 Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 간흡충 감염시 간흡충 분비배설항원(ESP)이 히스톤에 아세틸화를 증가시키면서 Mcm7 유전자 및 단백질의 과발현을 유발하므로, 이러한 Mcm7 유전자의 간흡충 감염 또는 간암에 관한 진단 마커로의 용도에 관한 것이다.
최근까지는 DNA 염기서열의 변화와 재조합에 의해 형질의 변화가 발생한다고 알려졌으나 DNA의 염기서열이 변하지 않더라도 유전자 기능이 변함으로써 형질의 변화가 발생할 수 있으며, 이러한 변화가 자손에게도 전달될 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 후성유전학은 바로 이러한 현상, 즉 DNA 염기서열의 변화없이 유전발현과 같은 기능의 변화가 일어나는지를 알아내는 새로운 영역의 학문으로 최근에는 유전자의 CpG 메틸화, 다양한 히스톤 단백질의 메틸화 및 아세틸화에 의해 형성된 다양한 후성유전체의 구조에 따라 유전자발현이 결정된다고 보고되었는데, 소위 히스톤 암호화는 이러한 후성유전체의 형성과 유전자발현을 조절하는 표식으로 알려져 있다.
지난 수년간 핵 구조화 관련 기능과 더불어 전사조절 시 후성유전학적 변형의 역할에 관한 관심이 급격히 고조되었고, 그 결과 특이 DNA 잔기, 히스톤 변형 집단 및 다양한 히스톤 변형 효소들이 밝혀졌다. 현재까지 다양한 히스톤 변형 효소로 알려져 있는 것은 히스톤 디아세틸아제, 히스톤 메틸전이효소, 히스톤 키나아제 및 DNA 메틸전이효소들이 보고되고 있다. 이러한 유전적 또는 후성유전학적 기작에 의한 암 억제자의 불활성화는 암 형성화의 주원인으로 알려져 있다. 암 억제자의 후성유전학적 불활성화는 히스톤 디아세틸전이효소 뿐만 아니라 히스톤 메틸전이효소들에 의한 것으로 추정되어지고 있다.
한편, 현재까지 간흡충 단백질분해효소의 특성 규명에 대한 연구는 우리나라, 일본, 중국 및 동남아시아를 중심으로 부분적으로 진행되어 왔다. 그러나 단백질분해효소의 제한적인 생화학적 특성 및 진단 항원으로써의 유용성 관련 연구가 일부 진행되었을 뿐 간흡충 단백질분해효소의 구체적인 생화학적 특성 및 생리학적 기능 연구를 통한 간흡충-숙주 상호작용 연구 및 진단제/백신 후보 물질로써의 연구는 매우 미흡하다.
따라서, 보다 쉽고 정확하게 간흡충 감염을 진단을 하기 위하여 현재까지 유의성이 높은 진단 마커의 개발이 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 간흡충 분비배설항원(ESP)에 의해 과발현되는 Mcm7 유전자 및 단백질을 간흡충 감염 또는 간흡충 감염 유래 간암의 진단용 마커로 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 간흡충 분비배설항원(ESP)에 의해 과발현되는 Mcm7 유전자 및 단백질을 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단키트를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커를 제공한다.
본 발명자들은 간흡충에 의해 감염되었을 때 Mcm7 유전자의 발현양이 증가하는 것을 확인하였고, 간흡충에 노출 되었을 때 시간이 증가할수록 Mcm7 유전자의 발현양과 단백질의 발현양이 증가하였고, 이는 히스톤 아세틸전이효소의 아세틸화로 인해 이루어지는 것을 밝혀냈다. 이를 통해 간흡충에 감염되었을 때 Mcm7 유전자의 발현양상이 정상세포에 비해 증가함을 확인함으로써 간흡충 감염 진단에 효과적으로 사용할 수 있으며, 더 나아가 간암의 발병을 초기에 진단함으로써 간암 발생을 억제할 수 있다.
보다 상세하게는, 상기 Mcm7 유전자는 담관암 세포에 간흡충 분비배설항원(ESP)을 처리하게 되면 발현양이 증가하게 되며, 이때 Mcm7 유전자의 프로모터 주위에는 히스톤 아세틸전이효소인 PCAF가 증가하게 되고 이는 결국 Mcm7 유전자의 프로모터를 아세틸화 시킴으로써 Mcm7 유전자의 발현양을 증가시키게 된다. 따라서, 간흡충에 감염이 되었을 때 Mcm7 유전자의 세포 내 발현 수준을 측정하여 간흡충 감염을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단키트를 제공한다.
본 발명의 진단키트는 Mcm7 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하거나, Mcm7 유전자에 상보적인 프로브를 포함하거나, Mcm7 유전자에 의해 코딩되는 Mcm7 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 간흡충 감염 또는 간암을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에서 서열번호 1의 염기서열을 갖는 Mcm7 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 발현 수준을 정상대조군의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간흡충 감염 또는 간암 진단방법을 제공한다.
본 발명에서 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간흡충 감염 또는 간암 여부를 확인하는 것이다. 하나의 양태로서, 본 발명은 간흡충 감염 또는 간암을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 Mcm7 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하고, 이를 정상대조군 시료의 발현 수준과 비교하여 간흡충 감염 또는 간암 여부를 진단할 수 있다.
본 발명에서 "mRNA 발현 수준 측정"이란 간흡충 감염을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 Mcm7 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상대조군에서의 mRNA 발현량과 간흡충 감염 또는 간암을 예방하거나 치료할 필요가 있는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, Mcm7 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현양의 증가여부를 판단하여 간흡충 감염 의심 환자의 실제 간흡충 감염 환자 여부를 진단할 수 있다. mRNA 발현 수준 측정은 바람직하게는, Mcm7 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR법을 이용할 수 있다. RT-PCR은 P. Seeburg(Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, Pt 1:669-677)에 의해 RNA를 분석하는데 도입된 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석한다. 이때 증폭 단계에서 Mcm7 유전자에 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하며, RT-PCR 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 Mcm7 유전자의 mRNA 발현 여부와 발현 수준을 확인할 수 있고 이를 정상대조군과 비교함으로써, 간흡충 감염 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.
본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, Mcm7 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산일 수 있고, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 한, 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 간흡충 감염을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 Mcm7 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, Mcm7 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있고, Mcm7 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 간흡충 감염여부를 확인할 수 있다.
또한, 바람직하게는, Mcm7 단백질에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동을 하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로오즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 Mcm7 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 간흡충 감염여부를 확인할 수 있다.
상기 검출 방법은 간흡충이 감염되지 않은 정상대조군에서의 Mcm7 유전자의 발현양과 간흡충에 의해 감염된 시료에서의 Mcm7 유전자의 발현양을 조사하는 방법으로 이루어질 수 있고, mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 Mcm7 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하며, Mcm7 단백질에 대한 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명의 항체는 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 단클론 항체 또는 다클론 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당 분야에 공지된 효소 면역측정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역 측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯팅 또는 면역 블롯팅 등의 방법에 의해 생물학적 시료 중에 Mcm7 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 진단할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 Mcm7 유전자를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명에 따르면, 간흡충에 감염될 경우 Mcm7 유전자 및 단백질의 발현 수준이 증가되므로, 개체에서 Mcm7 유전자 및 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 신속하고 간편하며 정확하게 간흡충 감염을 진단할 수 있고, 더 나아가 간암의 초기 진단에도 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 간흡충 분비배설항원(ESP)에 의한 Mcm7 단백질의 발현 증가를 간담도암 세포에서 확인한 사진이고,
도 2는 간흡충 분비배설항원(ESP) 처리시 단백질의 히스톤 아세틸전이효소 및 히스톤 아세틸화의 증가를 나타낸 사진이고,
도 3은 간흡충 분비배설항원(ESP) 처리시 Mcm7의 프로모터 부위에 따른 전사활동의 차이를 나타낸 사진이고,
도 4는 다양한 히스톤 아세틸전이효소에 의한 Mcm7의 전사조절을 서로 다른 길이의 Mcm7 프로모터를 사용하여 검토한 사진이고,
도 5는 간흡충 분비배설항원(ESP) 처리시 Mcm7의 프로모터 부위에 히스톤 아세틸전이효소가 결합함으로써 아세틸화 정도 및 전사조절을 하는 것을 크로마틴 면역침강법을 이용한 사진이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : ESP 처리에 따른 Mcm7 발현 변화 검토
(1) 세포주 배양 및 ESP 처리
담관암 세포주인 HuCCT-1을 10% 우태아혈청(FBS, Gibco)과 페니실린-스트렙토마이신(50units/ml)을 함유한 RPMI1640(Gibco)에서 ESP 처리 이전에 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포들을 항생제가 함유되지 않은 RPMI1640 배지로 세척하고, 800 ng/ml 농도의 ESP를 시간(1, 3, 9, 15, 24 시간)별로 처리하였다.
(2) 역전사 전이효소를 이용한 실시간 중합연쇄반응 (Q-PCR)
Q-PCR 반응은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 즉, 5μg의 RNA 시료를 취하여 20μl 반응부피에서 역전사시키고, 증류수를 첨가하여 100μl로 희석하였다. 희석된 역전사 산물을 2μl 취하여 주형으로 이용하고, Mcm7 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 존재 하에 SYBR green이라는 형광물질과 함께 25μl 반응 부피에서 30회의 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 산물 중 ESP를 처리하지 않은 샘플과 비교하여 각 시간별로 Mcm7 유전자의 발현양을 측정할 수 있다. 이때, 사용된 Mcm7 유전자에 특이적인 프라이머 쌍은 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍(정방향 ; 5'-ACCGAGACAATGACCTACGG-3', 역방향; 5'-CTAGCTGTCTGCCCCTTGTC-3')을 사용하였다.
Mcm7을 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 이용하여 실시간-RT-PCR을 수행한 결과, Mcm7의 mRNA의 발현이 최대 약 2배의 발현이 증가됨을 확인하였다.
(3) 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)
담관암 세포주인 HuCCT-1에 ESP를 시간별로 처리한 다음 total 단백질을 분리하였다. 이를 12% SDS-PAGE에 전기영동을 한 뒤 3% 소혈청알부민(BSA)이 섞인 TBST 버퍼(10mM Tris-HCl pH 7.4, 100mM NaCl, 및 0.1%(V/V) Tween 20)로 12시간 이상 블록킹을 하였다. 여기에 항-Mcm7 항체(sc-65469, Santa Cruz Biotechnology)를 2시간 동안 상온에서 인큐베이션 시킨 후 TBST 버퍼로 5분간 3번씩 세척해 주었다. 그 뒤 HRP가 접합되어있는 항-래빗 항체(sc-2004, Santa Cruz Biotechnology)를 2시간 동안 인큐베이션 시켜 주고 동일한 TBST 버퍼로 5분간 3번씩 세척해 주었다. 이를 Luminol 시약(LR 01-01, Animal Genetics)을 사용해 Mcm7의 단백질 양을 정량하였다.
Mcm7 특이 1차 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 앞선 mRNA 발현 증가와 마찬가지로 최대 약 2.5 배 단백질 수준이 증가됨을 확인하였다(도 1 참조).
실시예 2 : ESP 처리에 의한 히스톤 아세틸화 변화
기 확보되어있는 ESP 처리에 의해 변화하는 히스톤 아세틸화 변화와 히스톤 변형 단백질의 발현변화에 대한 결과를 토대로 ESP 처리가 Mcm7 유전자의 발현조절에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로는 다음과 같이 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다.
담관암 세포주인 HuCCT-1에 ESP를 시간별로 처리한 다음 total 단백질과 히스톤을 분리하였다. 이를 12% 또는 14% SDS-PAGE에 전기영동을 한 뒤 3% BSA가 섞인 TBST 버퍼로 12시간 이상 블록킹을 하였다. 히스톤을 분리한 샘플에는 항-히스톤 H3 항체와 항-히스톤 아세틸 H3 항체(06-755 및 06-599, Millipore)를 2시간 동안 상온에서 배양시키고 total 단백질 샘플에는 히스톤 아세틸트랜스퍼레이즈(HAT)인 항-PCAF 항체, 항-p300 항체 또는 항-CBP 항체(sc-8999, sc-585 및 sc-369, Santa Cruz Biotechnology)를 12시간 동안 4℃에서 배양하였다. 이를 TBST 버퍼로 5분간 3번씩 세척해준 뒤 HRP가 접합되어있는 항-래빗 항체(sc-2004, Santa Cruz Biotechnology)를 2시간 동안 배양시켜주고 동일한 TBST 버퍼로 5분간 3번씩 세척해 주었다. 이를 Luminol 시약(LR 01-01, Animal Genetics)을 사용해 Mcm7의 단백질 양을 정량하였고, 그 결과를 도 2에서 나타내었다.
실시예 3 : ESP에 의한 Mcm7 유전자의 프로모터 부위에서의 전사조절 영향 검토
ESP가 세포 내에서 Mcm7 유전자의 전사활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해서, HuCCT-1 세포주에 Mcm7 유전자의 프로모터를 과발현시켰다. 이때 Mcm7 프로모터에는 루시퍼라제(luciferase)를 발현시키는 리포터 유전자(reporter gene)도 함께 발현할 수 있는 시스템을 갖추고 있다. 구체적으로는 다음과 같이 루시퍼라제 분석(Luciferase Assay) 실험을 수행하였다.
HuCCT-1 세포들을 48-well 배양접시에서 배양하고, 루시퍼라제 각각의 돌연변이 리포터 벡터 (A0, A2, A8) 리포터 유전자 (100ng)를 형질감염시켰다. 형질감염 후 24시간 경과 후, ESP를 800ng/ml의 농도로 처리한 후 0, 3, 15, 24 시간이 경과한 후에 세포들을 5X 리포터 용해 버퍼(reporter lysis buffer, E1531, Promega)를 이용하여 용해시켰다. 세포 추출액은 Lumat LB 9501 Berthold Luminometer (Promega)를 활용하여 루시퍼라제 리포터 분석(luciferase reporter assay)을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 리포터 유전자의 루시퍼라제 활성과 ESP를 함께 형질 감염시켰을 때와 비교해보면 가장 긴 Mcm7 유전자의 프로모터를 포함하고 있는 A0 벡터를 형질감염시킨 실험군에서 시간에 따른 전사활성이 증가되는 양상을 보인 반면 A2, A8의 경우 ESP 처리와 시간 경과에 따른 전사활성이 유도되지 않았다.
따라서, ESP 처리에 의해 Mcm7 유전자의 전사활성이 유도됨을 확인하였으며 -558에서 -382 부분이 ESP의 조절을 받는 부분임을 알 수 있었다.
실시예 4 : Mcm7 유전자의 프로모터에 히스톤 아세틸전이효소 (HAT)들의 전사조절 영향 검토
ESP가 세포내에서 Mcm7 유전자의 전사활성을 증가시킬 때 히스톤 아세틸전이효소가 실제로 Mcm7 전사조절에 관여하는지 확인하기 위하여, HuCCT-1 세포주에 Mcm7 유전자의 프로모터를 과발현시켰다. 이때 Mcm7 프로모터에는 루시퍼라제(luciferase)를 발현시키는 리포터 유전자(reporter gene)도 함께 발현할 수 있는 시스템을 갖추고 있다. 구체적으로는 다음과 같이 루시퍼라제 분석(Luciferase Assay) 실험을 수행하였다.
루시퍼라제 각각의 Mcm7 프로모터가 크기별로 클로닝된 A0, A2, A8 리포터 벡터 리포터 유전자 (100ng)와 PCAF, CBP, p300을 발현시키는 벡터의 양(50, 100, 200 ng)을 증가시키면서 HuCCT-1 세포에 형질감염시켰다. 형질감염후 24시간 경과 후, ESP를 800ng/ml의 농도로 처리한 후 0, 3, 15, 24 시간이 경과한 후에 세포들을 5X 리포터 용해 버퍼(reporter lysis buffer, Promega)를 이용하여 용해시켰다. 세포 추출액은 Lumat LB 9501 Berthold Luminometer (Promega)를 활용하여 루시퍼라제 리포터 분석(luciferase reporter assay)을 수행하였다.
그 결과, -558~-382 부위를 포함하고 있는 A0에서 HAT들에 의해 전사활성이 유도되었으며, 3 종류의 HAT들 중 PCAF가 Mcm7의 유전자전사활성을 가장 높게 유도하는 것이 확인되었다.
실시예 5 : Mcm7 유전자의 특정 프로모터 부위에 PCAF의 존재 여부 및 이로 인한 히스톤 아세틸화 유도 검토
ESP처리에 의해 Mcm7 유전자의 프로모터 부위에 PCAF 등의 HAT들의 recruitment를 통해 Mcm7의 전사 조절을 확인한 결과를 토대로 PCAF가 실제로 ESP를 처리하였을 때 Mcm7 유전자의 특정 프로모터 부위에 존재하는지를 확인하기 위해 앞서 사용한 Mcm7 프로모터 A0와 A2 리포터 벡터를 HuCCT1 세포에 형질감염 시킨 후 PCAF 항체를 이용하여 다음과 같이 크로마틴 면역침강법(chromatin immunoprecipitation)을 수행하였다.
HeLa 세포주를 100mm 플레이트에 24시간 동안 배양시킨 후에 실험군으로 RE-IIBP를 대조군으로 pcDNA를 세포에 형질감염시켰다. 각각 48시간을 37℃에서 인큐베이션 시킨 후 37% 포름알데하이드를 처리해서 단백질과 DNA를 서로 교차결합시킨 후 10X 글라이신을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 세포를 SDS 세포 융해액으로 모은 다음 초음파처리를 9초씩 16번해서 DNA가 작은 절편으로 끊어질 수 있도록 하였다. 원심분리 한 후 상층액의 일부를 항-메틸 라이신 항체와 항-PCAF, 항-아세틸-히스톤 H3 또는 항-아세틸-히스톤 H4 항체와 대조군으로 사용한 항-IgG 항체를 적당량 (5㎍)을 첨가해 4도에서 20시간 동안 배양시켰다. 면역침강을 하기 위해 여기에 단백질A/G 아가로오즈 비드를 첨가해 1시간 동안 배양시킨 후 항체와 결합한 단백질을 침강시켰다. 단백질과 DNA가 서로 결합되어 있기 때문에 여기에 Tris-HCl과 EDTA를 넣어줌으로써 DNA만을 추출하였다. 이렇게 추출한 DNA을 주형으로 해서 Mcm7의 프로모터 부위의 특이적인 프라이머를 사용해서 PCR을 하였다. 이때, 사용된 Mcm7 유전자에 특이적인 프라이머 쌍은 서열번호 5 및 서열번호 6의 A0 프라이머 쌍 (정방향; 5'-GGATCCTGCGACACAGGCTG-3', 역방향; 5'-GGGCGGGGTAGTGCAGGCGC-3', positions -558 to -258)과 서열번호 7 및 서열번호 8의 A2 프라이머 쌍 (정방향; 5'-CGGGCCTGCCCCGCCCTGCG-3', 역방향; 5'-CTGTGGCCGGCCAACCGAAA-3', positions -382 to -81)을 사용하였다.
각각의 A0, A2 Mcm7 프로모터를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 이용한 PCR을 수행한 결과, A0에서 ESP를 처리하였을 때 PCAF가 ESP를 처리하지 않았을 때보다 더 많이 존재하고 있는 것을 확인하였다. 반면에, A2의 경우에는 ESP 처리하기 전과 처리 한 후의 동일한 양의 PCAF가 존재함을 확인하였다.
본 발명은 상기 특정 구현예에 관해서 기술할지라도, 첨부된 청구항에 의해 정의된 범위 내에서 본 발명의 다양한 변형은 당해 기술 분야에서 숙련된 자들에 의해 얼마든지 가능하다.
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation Korea Center for Disease Control and Prevention <120> Marker for diagnosing of clonorchiasis and liver cancer comprising Mcm7 gene <130> DP-2010-0453 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2160 <212> DNA <213> Homo sapiens minichromosome maintenance complex component 7(MCM7) <400> 1 atggcactga aggactacgc gctagagaag gaaaaggtta agaagttctt acaagagttc 60 taccaggatg atgaactcgg gaagaagcag ttcaagtatg ggaaccagtt ggttcggctg 120 gctcatcggg aacaggtggc tctgtatgtg gacctggacg acgtagccga ggatgacccc 180 gagttggtgg actcaatttg tgagaatgcc aggcgctacg cgaagctctt tgctgatgcc 240 gtacaagagc tgctgcctca gtacaaggag agggaagtgg taaataaaga tgtcctggac 300 gtttacattg agcatcggct aatgatggag cagcggagtc gggaccctgg gatggtccga 360 agcccccaga accagtaccc tgctgaactc atgcgcagat ttgagctgta ttttcaaggc 420 cctagcagca acaagcctcg tgtgatccgg gaagtgcggg ctgactctgt ggggaagttg 480 gtaactgtgc gtggaatcgt cactcgtgtc tctgaagtca aacccaagat ggtggtggcc 540 acttacactt gtgaccagtg tggggcagag acctaccagc cgatccagtc tcccactttc 600 atgcctctga tcatgtgccc aagccaggag tgccaaacca accgctcagg agggcggctg 660 tatctgcaga cacggggctc cagattcatc aaattccagg agatgaagat gcaagaacat 720 agtgatcagg tgcctgtggg aaatatccct cgtagtatca cggtgctggt agaaggagag 780 aacacaagga ttgcccagcc tggagaccac gtcagcgtca ctggtatttt cttgccaatc 840 ctgcgcactg ggttccgaca ggtggtacag ggtttactct cagaaaccta cctggaagcc 900 catcggattg tgaagatgaa caagagtgag gatgatgagt ctggggctgg agagctcacc 960 agggaggagc tgaggcaaat tgcagaggag gatttctacg aaaagctggc agcttcaatc 1020 gccccagaaa tatacgggca tgaagatgtg aagaaggcac tgctgctcct gctagtcggg 1080 ggtgtggacc agtctcctcg aggcatgaaa atccggggca acatcaacat ctgtctgatg 1140 ggggatcctg gtgtggccaa gtctcagctc ctgtcataca ttgatcgact ggcgcctcgc 1200 agccagtaca caacaggccg gggctcctca ggagtggggc ttacggcagc tgtgctgaga 1260 gactccgtga gtggagaact gaccttagag ggtggggccc tggtgctggc tgaccagggt 1320 gtgtgctgca ttgatgagtt cgacaagatg gctgaggccg accgcacagc catccacgag 1380 gtcatggagc agcagaccat ctccattgcc aaggccggca ttctcaccac actcaatgcc 1440 cgctgctcca tcctggctgc cgccaaccct gcctacgggc gctacaaccc tcgccgcagc 1500 ctggagcaga acatacagct acctgctgca ctgctctccc ggtttgacct cctctggctg 1560 attcaggacc ggcccgaccg agacaatgac ctacggttgg cccagcacat cacctatgtg 1620 caccagcaca gccggcagcc cccctcccag tttgaacctc tggacatgaa gctcatgagg 1680 cgttacatag ccatgtgccg cgagaagcag cccatggtgc cagagtctct ggctgactac 1740 atcacagcag catacgtgga gatgaggcga gaggcttggg ctagtaagga tgccacctat 1800 acttctgccc ggaccctgct ggctatcctg cgcctttcca ctgctctggc acgtctgaga 1860 atggtggatg tggtggagaa agaagatgtg aatgaagcca tcaggctaat ggagatgtca 1920 aaggactctc ttctaggaga caaggggcag acagctagga ctcagagacc agcagatgtg 1980 atatttgcca ccgtccgtga actggtctca gggggccgaa gtgtccggtt ctctgaggca 2040 gagcagcgct gtgtatctcg tggcttcaca cccgcccagt tccaggcggc tctggatgaa 2100 tatgaggagc tcaatgtctg gcaggtcaat gcttcccgga cacggatcac ttttgtctga 2160 2160 <210> 2 <211> 719 <212> PRT <213> DNA replication licensing factor MCM7 isoform 1 [Homo sapiens] <400> 2 Met Ala Leu Lys Asp Tyr Ala Leu Glu Lys Glu Lys Val Lys Lys Phe 1 5 10 15 Leu Gln Glu Phe Tyr Gln Asp Asp Glu Leu Gly Lys Lys Gln Phe Lys 20 25 30 Tyr Gly Asn Gln Leu Val Arg Leu Ala His Arg Glu Gln Val Ala Leu 35 40 45 Tyr Val Asp Leu Asp Asp Val Ala Glu Asp Asp Pro Glu Leu Val Asp 50 55 60 Ser Ile Cys Glu Asn Ala Arg Arg Tyr Ala Lys Leu Phe Ala Asp Ala 65 70 75 80 Val Gln Glu Leu Leu Pro Gln Tyr Lys Glu Arg Glu Val Val Asn Lys 85 90 95 Asp Val Leu Asp Val Tyr Ile Glu His Arg Leu Met Met Glu Gln Arg 100 105 110 Ser Arg Asp Pro Gly Met Val Arg Ser Pro Gln Asn Gln Tyr Pro Ala 115 120 125 Glu Leu Met Arg Arg Phe Glu Leu Tyr Phe Gln Gly Pro Ser Ser Asn 130 135 140 Lys Pro Arg Val Ile Arg Glu Val Arg Ala Asp Ser Val Gly Lys Leu 145 150 155 160 Val Thr Val Arg Gly Ile Val Thr Arg Val Ser Glu Val Lys Pro Lys 165 170 175 Met Val Val Ala Thr Tyr Thr Cys Asp Gln Cys Gly Ala Glu Thr Tyr 180 185 190 Gln Pro Ile Gln Ser Pro Thr Phe Met Pro Leu Ile Met Cys Pro Ser 195 200 205 Gln Glu Cys Gln Thr Asn Arg Ser Gly Gly Arg Leu Tyr Leu Gln Thr 210 215 220 Arg Gly Ser Arg Phe Ile Lys Phe Gln Glu Met Lys Met Gln Glu His 225 230 235 240 Ser Asp Gln Val Pro Val Gly Asn Ile Pro Arg Ser Ile Thr Val Leu 245 250 255 Val Glu Gly Glu Asn Thr Arg Ile Ala Gln Pro Gly Asp His Val Ser 260 265 270 Val Thr Gly Ile Phe Leu Pro Ile Leu Arg Thr Gly Phe Arg Gln Val 275 280 285 Val Gln Gly Leu Leu Ser Glu Thr Tyr Leu Glu Ala His Arg Ile Val 290 295 300 Lys Met Asn Lys Ser Glu Asp Asp Glu Ser Gly Ala Gly Glu Leu Thr 305 310 315 320 Arg Glu Glu Leu Arg Gln Ile Ala Glu Glu Asp Phe Tyr Glu Lys Leu 325 330 335 Ala Ala Ser Ile Ala Pro Glu Ile Tyr Gly His Glu Asp Val Lys Lys 340 345 350 Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Gly Gly Val Asp Gln Ser Pro Arg Gly 355 360 365 Met Lys Ile Arg Gly Asn Ile Asn Ile Cys Leu Met Gly Asp Pro Gly 370 375 380 Val Ala Lys Ser Gln Leu Leu Ser Tyr Ile Asp Arg Leu Ala Pro Arg 385 390 395 400 Ser Gln Tyr Thr Thr Gly Arg Gly Ser Ser Gly Val Gly Leu Thr Ala 405 410 415 Ala Val Leu Arg Asp Ser Val Ser Gly Glu Leu Thr Leu Glu Gly Gly 420 425 430 Ala Leu Val Leu Ala Asp Gln Gly Val Cys Cys Ile Asp Glu Phe Asp 435 440 445 Lys Met Ala Glu Ala Asp Arg Thr Ala Ile His Glu Val Met Glu Gln 450 455 460 Gln Thr Ile Ser Ile Ala Lys Ala Gly Ile Leu Thr Thr Leu Asn Ala 465 470 475 480 Arg Cys Ser Ile Leu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Tyr Gly Arg Tyr Asn 485 490 495 Pro Arg Arg Ser Leu Glu Gln Asn Ile Gln Leu Pro Ala Ala Leu Leu 500 505 510 Ser Arg Phe Asp Leu Leu Trp Leu Ile Gln Asp Arg Pro Asp Arg Asp 515 520 525 Asn Asp Leu Arg Leu Ala Gln His Ile Thr Tyr Val His Gln His Ser 530 535 540 Arg Gln Pro Pro Ser Gln Phe Glu Pro Leu Asp Met Lys Leu Met Arg 545 550 555 560 Arg Tyr Ile Ala Met Cys Arg Glu Lys Gln Pro Met Val Pro Glu Ser 565 570 575 Leu Ala Asp Tyr Ile Thr Ala Ala Tyr Val Glu Met Arg Arg Glu Ala 580 585 590 Trp Ala Ser Lys Asp Ala Thr Tyr Thr Ser Ala Arg Thr Leu Leu Ala 595 600 605 Ile Leu Arg Leu Ser Thr Ala Leu Ala Arg Leu Arg Met Val Asp Val 610 615 620 Val Glu Lys Glu Asp Val Asn Glu Ala Ile Arg Leu Met Glu Met Ser 625 630 635 640 Lys Asp Ser Leu Leu Gly Asp Lys Gly Gln Thr Ala Arg Thr Gln Arg 645 650 655 Pro Ala Asp Val Ile Phe Ala Thr Val Arg Glu Leu Val Ser Gly Gly 660 665 670 Arg Ser Val Arg Phe Ser Glu Ala Glu Gln Arg Cys Val Ser Arg Gly 675 680 685 Phe Thr Pro Ala Gln Phe Gln Ala Ala Leu Asp Glu Tyr Glu Glu Leu 690 695 700 Asn Val Trp Gln Val Asn Ala Ser Arg Thr Arg Ile Thr Phe Val 705 710 715 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer specific for Mcm7 gene <400> 3 accgagacaa tgacctacgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer specific for Mcm7 gene <400> 4 ctagctgtct gccccttgtc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer specific for A0 Mcm7 promoter <400> 5 ggatcctgcg acacaggctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer specific for A0 Mcm7 promoter <400> 6 gggcggggta gtgcaggcgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer specific for A2 Mcm7 promoter <400> 7 cgggcctgcc ccgccctgcg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer specific for A2 Mcm7 promoter <400> 8 ctgtggccgg ccaaccgaaa 20

Claims (7)

  1. Mcm7 유전자의 전사활성 수준을 분석하는 것으로서, 상기 분석은 Mcm7 유전자의 프로모터 부위에 PCAF(P300/CBP-associated factor) 단백질의 동원(recruitment) 여부를 분석하며, 상기 프로모터 부위는 Mcm7 유전자의 전사개시 코돈으로부터 -558 내지 -382 부위로 이루어진 것을 특징으로 하는 간흡충 감염 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 Mcm7 유전자의 전사활성 수준 분석은 (i) Mcm7 유전자의 프로모터 부위에 PCAF(P300/CBP-associated factor) 단백질의 동원(recruitment) 여부를 분석하는 단계; 및 (ii) 상기 PCAF 단백질에 의한 상기 프로모터 부위의 아세틸화 여부를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간흡충 감염 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 프로모터 부위는 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성된 프라이머 세트를 이용하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 간흡충 감염 진단에 유용한 정보를 제공하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
KR1020100090766A 2010-09-15 2010-09-15 Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커 KR101545705B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100090766A KR101545705B1 (ko) 2010-09-15 2010-09-15 Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100090766A KR101545705B1 (ko) 2010-09-15 2010-09-15 Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20120028748A KR20120028748A (ko) 2012-03-23
KR101545705B1 true KR101545705B1 (ko) 2015-08-25

Family

ID=46133499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100090766A KR101545705B1 (ko) 2010-09-15 2010-09-15 Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101545705B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112442500A (zh) * 2019-08-30 2021-03-05 恩智(广州)医药科技有限公司 抑制MCM7的siRNA、组合物及其应用
CN115747310A (zh) * 2022-10-27 2023-03-07 吉林大学 一种基于rpa-lfd检测的荧光探针及其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009032915A2 (en) 2007-09-06 2009-03-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Arrays, kits and cancer characterization methods

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009032915A2 (en) 2007-09-06 2009-03-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Arrays, kits and cancer characterization methods

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Parasitol. Res. 2009, vol. 104, no. 5, pp. 1035-1046.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120028748A (ko) 2012-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2003219959B2 (en) Novel compositions and methods for cancer
JP2010525362A (ja) 免疫調節剤のスクリーニング方法
WO2008104953A2 (en) Methods and targets for identifying compounds for regulating rhinovirus infection
KR102047502B1 (ko) 포타슘 채널 단백질을 이용한 암 진단용 조성물
KR101545705B1 (ko) Mcm7 유전자를 포함하는 간흡충 감염 또는 간암 진단용 마커
CA2470844A1 (en) Novel compositions and methods for cancer
AU2010200731A1 (en) Novel compositions and methods in cancer associated with altered expression of PRLR
KR101358810B1 (ko) 방사선 피폭 진단용 마커 igfbp-5, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법
KR101270761B1 (ko) 방사선 피폭 진단용 마커 트랜스알돌라아제, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법
CA2425643A1 (en) Cancer-linked genes as targets for chemotherapy
KR101117799B1 (ko) 아토피성 피부질환 진단용 마커
EP2757373A1 (en) Method for measuring anti-wt1 antibody
CA2465921A1 (en) Novel compositions and methods for cancer
US6649342B1 (en) Methods of diagnosing breast cancer, compositions, and methods of screening for breast cancer modulators
CN109536596B (zh) 影响脂肪代谢和儿童生长发育的基因slc22a18
KR101883936B1 (ko) 림프절 전이 예측용 마커 및 이를 이용한 림프절 전이 예측 방법
WO2003071933A2 (en) Novel compositions and methods for cancer
KR102307043B1 (ko) Wasf2 자가항체를 이용한 간세포암종 조기진단용 조성물
KR101232228B1 (ko) 방사선 피폭 진단용 마커 포스포글리세레이트 키나제, 그 마커의 발현수준을 측정하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 그 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트, 및 그 마커를 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법
KR100966165B1 (ko) Ubc9 유전자 또는 UBC9 단백질을 이용한 유방암진단용 키트
AU2003218331B2 (en) Novel compositions and methods in cancer associated with altered expression of PRDM 11
KR101245110B1 (ko) Hmg17 유전자 또는 그 발현 단백질, 또는 상기 유전자 발현 감소에 의해 조절되는 단백질을 포함하는 세포증식 감수성 마커
US20040072192A1 (en) Cancer-linked genes as targets for chemotherapy
JP2005520536A (ja) Mcm3apの変更された発現に関連する癌における新規組成物および方法
AU2008201683A1 (en) Diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of HIPK1

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20130724

Effective date: 20141023

S901 Examination by remand of revocation
GRNO Decision to grant (after opposition)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180625

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190701

Year of fee payment: 5