KR101540191B1

KR101540191B1 - 로라타딘을 포함하는 항염증용 조성물

Info

Publication number: KR101540191B1
Application number: KR1020140179093A
Authority: KR
Inventors: 조재열; 백광수; 양우석; 정덕; 박재광
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2014-02-24
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2015-07-28
Also published as: WO2015126048A1

Abstract

본 발명은 로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate)을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 염증관련 인자인 NO 및 PGE₂의 생성을 감소시켜 우수한 소염 효과를 가진다. 또한 저농도로 처리하여도 점액 분비나 소화액 분비 억제에 있어서도 효과를 보이고, 고농도로 처리한 경우에도 세포독성을 보이지 않아서 의약품, 식품 및 화장료에 안전하게 적용할 수 있다. 따라서 항염증제로서 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

로라타딘을 포함하는 항염증용 조성물 {Composition comprising Loratadine for anti-inflammation}

본 발명은 로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate)을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.

염증성질환은 감염 및 비감염을 포함한 인체 내의 반응이다. 염증의 증후로는 발열, 홍조, 부종, 통증 등이 있으며, 염증과정의 후반에는 염증부위로부터 백혈구의 이주 및 사이토카인(cytokine), 분해효소(degradative enzyme), 생활성지질 중간체(bioactive lipid intermediate), 일과성 반응적인 산화물질(transient reactive oxygen species), 림프구(sensitized lmphocyte)의 생성 등 세포내의 변화가 일어난다. 더불어 만성적인 염증 질환에서는 백혈구의 침윤에 의해 세포활성(cell activation) 및 세포사멸이 일어난다. 염증반응의 화학매개물 중 프로스타글란딘(prostaglandins)과 산화 질소(nitric oxide, NO)는 발암 및 염증의 진행과정에 중요한 매개물질이다.

염증이나 통증을 조절하는 약물 중 하나인 비스테로이드계 염증질환제 (nonsteroidal antiinflammatory drugs)는 체내에 프로스타글란딘(prostaglandin, PG)을 생성하는 COX를 저해함으로써 약리작용을 나타낸다. COX는 COX-1과 COX-2의 두 가지 이성체(isoform)으로 존재한다는 것이 밝혀졌는데, 이중 COX-1은 정상상태에서 위장관 점막과 혈소판, 신장에서 세포 보호 작용과 조절 작용에 관여하는 PG류 생성에 관여하는 효소인데 반해, COX-2는 정상세포에서는 그 농도가 매우 낮으나 염증관련세포에서 여러 자극(cytokine, endotoxin,mitogen)에 의해 유도 발현되어 통증이나 염증에 관여하는 PG류 생성에 관여한다.

또한 산화질소(nitric oxide, NO)는 혈관의 긴장도(vascular tone), 신경전달(neurotransmission), 세균 및 암세포의 사멸 조절에 관여한다. 또한 높은 농도의 NO는 순환기 쇼크(circulatory shock), 염증(inflammation), 발암(carcinogenesis) 등의 생리반응에서 나타난다. 신경성 NO(Neuronal NO)와 내피성 NO(endothelial NO)는 정상적인 상태에서도 존재하며, 반면 iNOS(NOS type2)는 LPS, 사이토카인(cytokine) 등에 의해 유도되어 발현된다. 염증이나 통증을 조절하는 약물 중 상기 비스테로이드계 염증질환제 는 인체 내에서 염증 반응에 관여하는 PG류 이외에 위점막 보호, 혈소판기능과 관련된 PG의 생성도 억제하여, 위장관 장애나 출혈 등의 부작용도 함께 나타나게 된다. 따라서 부작용이 없는 염증성 질환의 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 로라타딘(Loratadine)은 항히스타민제(Anti-histamine)로 시판중인 약물로서, 기존에는 약물의 비염 및 두드러기의 치료 목적으로 이용되었다. 종래 기술에서, Loratadine의 약리작용은 히스타민의 발현 억제에 대해서만 한정적으로 연구되어 왔고(한국 특허공개번호 10-1992-7000033), 급성염증 등에 대한 효과에 대해서는 연구된 바 없다.

본 발명은 종래 항염증 제제들의 한계를 극복하기 위해 안출된 것으로, Loratadine 또는 그 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 식품 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate) 또는 그 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서, 상기 조성물은 일산화질소(Nitric Oxide, NO) 또는 PGE₂(Prostaglandin E₂)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 염증은 위궤양, 십이지장궤양, 간염, 식도염, 위염, 장염, 췌장염, 대장염, 복막염, 신장염, 전신부종 및 국소부종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate) 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate) 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증질환의 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다.

아울러, 본 발명은 로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate) 또는 그 약제학적으로 허용되는 염의 염증질환의 치료용도를 제공할 수 있다.

본 발명의 Loratadine을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물은 염증관련 인자인 PGE₂, NO의 생산을 감소시켜 우수한 염증 치료 효과를 가진다. 또한 고농도로 처리한 경우에도 세포독성을 보이지 않고, 소화액의 분비를 감소시키거나, 위 점막을 손상시키지 않는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 조성물은 의약품, 식품 및 화장료에 모두 안전하게 적용할 수 있다. 따라서 항염증제로서 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 로라타딘(Loratadine, C₂₂H₂₃ClN₂O₂, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate, CAS number 79794-75-5)이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포내에서 일산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 종래 염증치료제인 Ranitidine이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포내에서 일산화질소(NO) 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 Loratidine이 LPS를 처리한 RAW264.7 세포내에서 PGE₂ 생성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 Loratidine이 세포 생존률에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 위염을 유발시킨 마우스에서 Loratidine 또는 Ranitidine을 투여한 후 위를 적출하여 미란성 점막 부식 병소를 관찰한 사진이다.
도 6은 위염을 유발시킨 마우스에서 Loratadine 또는 Ranitidine을 각각 투여한 후 위를 적출하여 미란성 점막 부식 병소 넓이(㎟)를 픽셀-계수기로 측정하여 비교한 도이다.
도 7은 무수에탄올로 염증을 유발시킨 랫트에서 Loratadine 또는 Sucralfate를 각각 투여한 후 위를 절제하여 점액분비량을 측정하여 비교한 도이다.
도 8은 Loratadine 또는 Sucralfate를 각각 투여한 랫트를 대상으로 유문결찰한 후 위를 절제하여 소화액의 억제 효과를 측정하여 비교한 도이다.
도 9는 복막염을 유발시킨 마우스에서, Loratadine 또는 Loratadine의 vehicle을 투여한 후, 복강 내 체액에서의 산화질소 양을 측정하여 비교한 도이다.
도 10은 간염을 유발시킨 마우스에서, Loratadine 또는 D-gel을 투여한 후, 혈액 내에서의 AST(aspartate aminotransferase)의 농도를 측정하여 비교한 도이다.
도 11은 RAW264.7 세포에서, Loratadine 농도(0, 20, 30, 40μM)에 따른 iNOS mRNA 발현량을 측정한 도이다.
도 12는 RAW264.7 세포에서, Loratadine 농도에 따른 COX-2 mRNA 발현량을 측정한 도이다.
도 13은 RAW264.7 세포에서, Loratadine 농도에 따른 IL-1β mRNA 발현량을 측정한 도이다.
도 14는 RAW264.7 세포에서, Loratadine 농도에 따른 IL-6 mRNA 발현량을 측정한 도이다.
도 15는 NF-кB Luciferase(0.8μg) 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 HEK 293 세포에서, Loratadine 농도에 따른 NF-кB Luciferase 활성을 측정한 도이다.
도 16은 NF-кB Luciferase(0.3μg), TRIF(0.3μg), 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 HEK 293 세포에서, Loratadine 농도에 따른 NF-кB Luciferase 활성을 측정한 도이다.
도 17은 NF-кB Luciferase(0.3μg), MyD88(0.3μg), 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 HEK 293 세포에서, Loratadine 농도에 따른 NF-кB Luciferase 활성을 측정한 도이다.
도 18은 AP-1 Luciferase(0.8μg) 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 HEK 293 세포에서, Loratadine 농도에 따른 AP-1 Luciferase 활성을 측정한 도이다.
도 19는 AP-1 Luciferase(0.3μg), TRIF(0.3μg), 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 HEK 293 세포에서, Loratadine 농도에 따른 AP-1 Luciferase 활성을 측정한 도이다.
도 20은 AP-1 Luciferase(0.3μg), MyD88(0.3μg), 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 HEK 293 세포에서, Loratadine 농도에 따른 AP-1 Luciferase 활성을 측정한 도이다.
도 21은 RAW264.7 세포의 Nuclear 분획에서, Loratadine 처리에 의한 표적 단백질 항체 (p65, p50, c-Jun, Lamin A/C)의 발현을 Western blot을 통하여 확인한 도이다.

로라타딘(Loratadine, C₂₂H₂₃ClN₂O₂, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate, CAS number 79794-75-5)의 구조식은 하기 화학식 1과 같다.

[화학식 1]

본 발명자들은 Loratadine이 염증과 관련된 다양한 인자들에 미치는 영향을 분석하여 항염효과를 확인하였다. RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증관련 단백질들의 생산을 증가시킨 후 Loratadine의 영향을 확인하였다. LPS(lipopolysaccharide)는 그람 음성균의 세포벽 구성성분으로서 내독소로 작용하고, 대식세포를 활성화시키는 물질이다.

즉, 본 발명의 목적은 로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate) 또는 그 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 일구현예로, 상기 로라타딘은 일산화질소(Nitric Oxide, NO) 또는 PGE₂(Prostaglandin E₂)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 로라타딘은 NF-кB 또는 AP-1의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 염증의 종류는 위궤양, 십이지장궤양, 간염, 식도염, 위염, 장염, 췌장염, 대장염, 복막염, 신장염, 위암, 전신부종 또는 국소부종일 수 있으나, 상기 염증의 종류는 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일 예로 1일 유효성분을 기준으로 하였을 때 0.1 mg/kg(체중)내지 500 mg/kg(체중), 0.1 mg/kg(체중) 내지 400 mg/kg(체중) 또는 1 mg/kg(체중)내지 300 mg/kg(체중)으로 투여할 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

아울러, 로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate) 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

즉, 본 발명의 조성물은 염증의 예방 및 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.

또한, 본 발명의 조성물은 염증의 예방 및 개선을 목적으로 화장료에 첨가될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 기초 화장료, 메이크업 화장료, 바디 화장료, 두발용 화장료, 두피용 화장료, 면도용 화장료 또는 구강용 화장료의 용도로 제공될 수 있다. 상기 유효성분은 상기 화장료 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하기로는 0.01 내지 20 중량%일 수 있으나, 상기 함량은 제형 또는 화장료 조성물에 함유되는 유효성분 외의 성분의 함량에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 상기 함량에 의해 본 발명에 포함되는 유효성분의 함량이 제한되는 것은 아니다.

따라서, 본 발명은 로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate) 또는 그 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분을 투여하여, 염증질환을 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 로라타딘의 새로운 용도로, 염증질환 치료 용도를 제공할 수 있다.

실시예 1은 Loratadine이 NO 생산에 미치는 영향을 확인한 것이다. 그 결과, 종래 염증치료제인 Ranitidine에 비해 뛰어난 NO 생성 억제 효과가 있다는 것을 확인하였다.

NO는 혈관을 확장시키는 역할을 하는 대표적인 염증에 관련된 인자 중 하나이다. 대식세포가 자극을 받으면 iNOS(inducible nitric oxide synthase)라는 효소에 의해 L-알기닌이 L-시트룰린으로 변하는 과정에서 일산화질소(NO)가 생성됨으로써 대식세포로부터 NO가 생성된다.

실시예 2는 Loratadine이 PGE₂에 미치는 영향을 확인한 것이다. 그 결과, Loratadine을 첨가한 경우 저농도에서도 PGE₂의 농도를 급격하게 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

프로스타글란딘 E₂(PGE₂)는 포스포리파제 A2(phospholipase A2)의해 유리된 아라키돈산이 COXs(cyclooxygenaes)라고 불리우는 효소의 촉매작용을 받아 형성되는 물질이다. PGE₂는 통증, 발열 등의 염증반응, 면역반응, 그리고 혈관생성(angiogenesis)을 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.

실시예 3은 Loratadine이 세포생존률에 미치는 영향을 확인한 것으로, Loratadine의 처리가 세포 생존률에 미치는 영향이 없으므로, 염증치료시 안전한 조성물로 이용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 4는 에탄올/염산을 이용하여 염증을 유발시킨 동물 모델에서 Loratadine의 염증치료 효과를 확인한 것으로서, Loratadine이 위 손상을 현저히 감소시킨다는 것을 확인하였다.

실시예 5는 Loratadine이 점액 분비에 미치는 영향을 확인한 것이다. 일반적으로, 염증치료제를 투여할 경우, 위 점막을 보호하는 위의 점액의 발생량을 줄이는 부작용을 보이는데, 실시예 5의 결과에 따르면 종래 위염치료제인 Sucralfate에 비교하여, 본 발명의 Loratidine을 사용할 경우 점액의 분비가 줄어들지 않는 효과를 보인다.

실시예 6은 Loratadine이 소화액 분비에 미치는 영향을 확인한 것이다. 실시예 6의 결과에 따르면 종래 위산 분비 억제 작용을 가진 항히스타민제인 Cimetidine과 비교하여, 본 발명의 Loratidine을 사용할 경우 보다 우수한 위산 분비 억제 작용을 가진다.

실시예 7 내지 8은 복막염 또는 간염 동물모델에서, Loratadine의 치료효과를 확인한 것으로서, Loratadine 처리에 의한 복강 내 채액에서의 산화질소 양의 감소및 혈중 AST(aspartate aminotransferase) 농도의 감소를 확인하였다.

실시예 9 내지 11은 Loratadine의 항염증의 기전을 확인한 것으로서, Loratadine 처리에 의하여, 염증 관련 인자인 iNOS, COX-2, IL-1β, 및 IL-6의 감소 및 염증 관련 전사인자인 NF-кB 또는 AP-1의 활성 억제를 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : RAW264.7 세포내에서 NO의 생성 측정

1-1. 세포배양

쥐의 대식세포 세포주(RAW264.7 세포)를 100 U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신과 10% FBS로 보충된 RPMI1640 배지 내에서 유지시켰다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 습한 공기에서 배양하였다.

1-2. RAW264.7 세포 내에서 Loratadine의 일산화질소(NO)의 생성 억제 효과

RAW264.7 세포(1×10⁵ cells/well) 를 24시간 동안 배양시킨 후, 배양된 세포를 Loratadine(0, 20, 30, 40μM)으로 60분 동안 처리한 다음, LPS(1㎍/㎖)와 함께 24시간 동안 더 배양하였다. 상등액을 모으고, 상등액 내 일산화질소(NO)의 농도를 Griess 시약으로 측정하였다. 대조군으로는 Loratadine의 vehicle인 DMSO를 주입하였다.

결과는 도 1에 나타내었다. NO 생성 억제 효과는 아무런 시료를 첨가하지 않은 대조군(control)에 대한 백분율로 표시하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, Loratadine은 LPS 처리에 의해 증가된 NO 생성을 억제하였고, 20 uM 처리한 경우 아무 처리도 하지 않은 대조군과 비교하여 약 50% 정도의 NO 생성량이 감소되었으며, 농도 의존적으로 계속하여 NO 함량이 감소하여, 40 uM를 처리한 경우 90% 이상 감소한 것을 확인 하였다.

1-3. 비교실험 : RAW264 .7 세포 내에서 Ranitidine 의 일산화질소( NO )의 생성 억제 효과

Loratadine과의 효과를 비교하기 위해서, Ranitidine을 사용하여 일산화질소의 생성 억제 효과를 확인해 보았다. RAW264.7 세포(1×10⁵ cells/well) 를 24시간 동안 배양시킨 후, 배양된 세포를 Ranitidine(0, 10, 20, 40, 80, 160μM)으로 60분 동안 처리한 다음, LPS(1㎍/㎖)와 함께 24시간 동안 더 배양하였다. 상등액을 모으고, 상등액 내 일산화질소(NO)의 농도를 Griess 시약으로 측정하였다. 대조군으로는 Loratadine의 vehicle인 DMSO를 주입하였다.

결과는 도 2에 나타내었다. NO 생성 억제 효과는 아무런 시료를 첨가하지 않은 대조군(control)에 대한 백분율로 표시하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, Ranitidine은 NO 생성을 전혀 억제하지 못한다는 것을 확인하였다.

실시예 2. RAW264.7 세포내에서 프로스타글란딘 E ₂ (PGE ₂ )의 생성 억제 효과

RAW264.7 세포(1×10⁵ cells/well) 를 24시간 동안 전배양시킨 후, 전배양된 세포를 Loratadine 40μM 및 Ranitidine 160μM으로 60분 동안 처리하였다. 상등액을 모으고, 상등액 내 PGE₂의 농도를 EIA 키트로 측정하였다. 대조군으로는 Loratadine의 vehicle인 DMSO를 주입하였다.

결과는 도 3에 나타내었다. PGE₂ 생성 억제 효과는 LPS만을 첨가한 대조군(control)에 대한 백분율로 표시하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, Loratadine을 첨가한 경우 저농도에서도 PGE₂의 농도를 급격하게 감소시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 3. RAW264.7 세포에서의 세포 독성 측정

RAW264.7 세포(1×10⁵ cells/well) 에 상기 Loratadine(5, 10, 20, 30, 40μM)를 가하여, 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 Loratadine의 vehicle인 DMSO를 주입하였다. 그 다음 세포독성 효과를 일반적인 MTT 어세이로 측정하였다. 즉, 배양 종료 3시간 전에 10㎖의 MTT 용액(인산염 완충액 중 10㎎/㎖, pH 7.4)을 가하고 분석 종료까지 세포를 계속 배양하였다. 15% SDS(sodium dodecyl sulphate)를 각 웰에 가하고 포마잔을 녹여 배양을 중지시킨 후, Spectramax 250 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570~630㎚(OD570-630)에서 흡광도를 측정하였다.

결과는 도 4에 나타내었다. 세포의 생존율은 아무런 시료를 첨가하지 않은 대조군(control)에 대한 백분율로 표시하였다.

도 4에 나타난 바와 같이 Loratadine을 처리한 경우에도 LPS를 처리한 RAW264.7 세포 생존률의 감소가 거의 나타나지 않아 세포독성이 없음을 확인하였다.

실시예 4 : 생체 내 에탄올/염산-유도 염증 모델에서 Loratadine의 항염증 활성 확인

4-1. 위염 유발 및 Loratadine 및 Ranitidine 투여

공지된 방법에 따라 에탄올/염산으로 ICR 마우스의 위의 염증을 유발하였다 [Lee et al., 2010; Okabe et al.]. 금식시킨 ICR 마우스 (7마리)에게 Loratadine(10 및 4 ㎎/㎏) 또는 Ranitidine (40 ㎎/㎏)을 3일 동안 1일 2회 경구 투여하였다. 대조군으로는 Loratadine의 vehicle인 0.5% CMC를 주입하였다. Loratadine의 마지막 투여 30분 후, 150mM의 염산에 60% 에탄올 400㎕ 넣어 마우스에게 경구 투여하였다. 각각의 실험 동물을 마취시키고 괴사제 투여 1시간 후에 우레탄을 치사량 투여하여 희생시켰다.

4-2. 병소 부위 관찰

위를 절개한 후 조심스럽게 흐르는 수돗물로 헹구어내었다. 대만부를 따라 위를 열고 보드 위에 펼친 후, 미란성 점막 부식 병소의 넓이(㎟)를 픽셀-계수기를 이용하여 측정하였다. 또한, 점막 부식 병소의 사진을 찍어 육안으로 관찰하였다.

결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다. 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, Loratadine은 위염이 유발된 마우스에서 에탄올/염산에 의한 위 손상을 현저히 감소시켰고, Ranitidine과 비교하여도 우수한 위 손상 감소 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 5 : 생체 내 무수에탄올-유도 염증 모델에서 Loratadine의 점막 보호 효과 확인

5-1. 위염 유발 및 Loratadine 및 Sucralfate 투여

실험에 앞서 24시간동안 금식시킨 랫트(자유 급수)를 대상으로 Loratadine(50 mg/kg) 및 Sucrafate(375 mg/kg)을 경구 투여하였다. 30분 후에, 무수 에탄올로 위 병변을 유발시켰다. 대조군으로는 Loratadine의 vehicle인 0.5% CMC를 주입하였다. 한시간 후 랫트를 희생시키고, 위의 점액분비량을 측정하여 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, Loratadine을 저용량으로 투여하더라도, 종래 점막 보호 약물로 알려진 Sucralfate에 비해 점액 분비량이 줄어들지 않는다는 것을 확인하였다.

실시예 6 : 생체 내 무수에탄올-유도 염증 모델에서 Loratadine의 위액 분비 확인

위염 유발 및 Loratadine 및 Cimetidine 투여

실험에 앞서 24시간동안 금식시킨 랫트를 대상으로 Loratadine(10 mg/kg) 및 Cimetidine(250 mg/kg)을 십이지장 내에 투여하였다. 대조군으로는 Loratadine의 vehicle인 0.5% CMC를 주입하였다. 유문결찰(pyloric ligation) 시키고 4시간 후, 랫트를 희생시키고, 위를 절제하여 10분 동안 1050 x g로 원심분리하였다. 상기 원심분리된 용액에서 소화액의 총 량, pH 및 위산량(mEq/mL)은 methyl orange를 지시약으로 사용하여 0.1M NaOH에서 소화액을 적정하여 측정한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, Loratadine을 저용량으로 투여하여도 보다 뛰어난 위산분비 억제 효과를 가지므로, 본 발명의 Loratadine이 위염 치료 또는 예방에 보다 우수한 효과를 보인다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 7 : 복막염 동물모델에서 Loratadine의 복막염 치료효과 확인

7-1. 복막염 유발 및 Loratadine 투여

우선, C57BL/6 mouse를 세 군 (Normal, LPS, LPS+Loratadine)으로 분류한 뒤, 1mL의 3% 티오클리콜레이트(Thioglycolate)를 복강 내로 주사하였다. 이 후, 두 군(Normal, LPS)은 Loratadine의 vehicle인 0.5% CMC을, 나머지 한 군(LPS+Loratadine)은 Loratadine을 5일간 경구 투여하였다. vehicle을 처리한 군 중 한 군(Normal)은 복막염을 유발시키지 않았으며, 나머지 두 군(LPS, LPS+Loratadine)은 LPS(lipopolysaccharide)를 복강 내 주사하여 복막염을 유발시켰다.

7-2. 복강 내 체액에서의 산화질소 양 측정

세 군의 마우스(Normal, LPS, LPS+Loratadine)를 희생시켜 복강 내 채액을 채취하였으며, 복막염의 치료 또는 예방효과를 확인하기 위하여, 복막염에 의해 발생한 산화질소 양을 측정하였다. 보다 구체적으로 Griess 용액 (0.5% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 5% sulfanilamide, 25% H₃PO₄)을 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준 물질로 sodium nitrite (0 에서 100 μM) 를 사용하여 검량선을 작성하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 복막염을 유발시킨 두 군(LPS, LPS+Loratadine)의 복강 내 체액에서 산화질소의 양이 현저하게 증가하였으며, Loratadine을 처리한 군은 대조군(LPS)과 비교하여 복막염에 의해 유발된 산화질소 양이 감소함를 확인하였다. 상기 결과는 본 발명의 Loratadine이 복막염의 치료 또는 예방에 우수한 효과를 보인다는 것을 의미한다.

실시예 8 : 간염 동물모델에서 Loratadine의 간염 치료효과 확인

8-1. 간염 유발 및 Loratadine 투여

우선, ICR mouse를 세 군 (Normal, LPS+D-gel, LPS+D-gel+Loratatine)으로 분류한 뒤, 두 군(Normal, LPS+D-gel)은 Loratadine의 vehicle인 0.5% CMC를, 나머지 한 군(LPS+D-gel+Loratatine)은 Loratadine을 5일간 경구 투여하였다. vehicle을 처리한 군 중 한 군(Normal)은 간염을 유발시키지 않았으며, 두 군(LPS+D-gel, LPS+D-gel+Loratatine)은 LPS(lipopolysaccharide)와 D-gel를 복강 내 주사하여 급성 간염을 유발시켰다.

8-2. 혈액 내에서의 AST의 농도 측정

세 군의 마우스(Normal, LPS+D-gel, LPS+D-gel+Loratatine)를 희생시켜 혈액을 채취한 후, 혈청만을 분리하였다. 간염의 치료 또는 예방효과를 확인하기 위하여, 간염의 지표인 AST(aspartate aminotransferase)의 농도를 Roche Modular spectrophotometric autoanalyzer를 이용하여 측정하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 간염을 유발시킨 두 군(LPS+D-gel, LPS+D-gel+Loratatine)의 혈액에서 AST의 농도가 현저하게 증가하였으며, Loratadine을 처리한 군은 대조군(LPS+D-gel)과 비교하여 혈중 AST의 농도가 절반 이하로 크게 감소함을 확인하였다. 상기 결과는 본 발명의 Loratadine이 간염의 치료 또는 예방에 우수한 효과를 보인다는 것을 의미한다.

실시예 9 : Loratadine의 전사 수준에서의 염증반응 억제효과

대식세포로부터 cytokine 분비능 측정

Murine 대식세포주인 RAW264.7 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 100 mm cell culture dish에 70-80%의 밀도로 배양하였다. 이 후, 배양된 RAW264.7 세포(1×10⁵ cells/well)를 Loratadine(0, 20, 30, 40μM)으로 60분 동안 처리한 다음, LPS(1㎍/㎖)와 함께 6시간 동안 더 배양하였다.

사이토카인의 발현 정도를 전사수준에서 조사하기 위해 Trizol reagent를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA를 First strand cDNA synthesis kit (Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 Realtime-PCR을 통해 증폭함으로써, 염증과 관련된 인자인 iNOS, COX-2, IL-1β, 및 IL-6의 발현 정도를 비교하였다. 본 실시예에서 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.

PCR amplication은 SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio)과 realtime thermal cycler (Bio-Rad)를 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였으며, 대조 유전자로 GAPDH를 사용하였다.

[표 1]

도 11 내지 도 14에 나타낸 바와 같이, LPS에 의해 유도된 염증 관련 인자인 iNOS, COX-2, IL-1β, 및 IL-6의 증가된 발현량이 Loratadine 처리에 의해서 감소하였으며, Loratadine의 농도가 증가할수록 대체적으로 발현량이 더욱 감소함을 확인하였다. 상기 결과는 본 발명의 Loratadine은 전사 수준에서 염증 관련 인자의 발현을 억제함으로서, 항염증효과를 가짐을 의미한다.

실시예 10 : Loratadine의 전사인자 NF-кB/ AP-1 활성 억제효과

Luciferase gene promotor 발현 측정법

HEK 293 세포주를 Opti-MEM을 이용하여 24 well plate에 분주한 후 37 ℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 전 배양한 후, 세포가 50% 밀도가 되었을 때 실험을 진행하였다. PEI 법을 이용하여 NF-кB, AP-1 Luciferase DNA와 TRIF, MyD88 DNA, beta-galactosidase DNA를 각기 co-transfection하였다. 구체적으로, DNA 1 μg과 PEI 3 μg을 Opti-MEM에 각각 희석해 주고, 상온에서 20분 동안 배양 한 후, DNA 희석액과 PEI 희석액을 혼합하여 다시 상온에서 20분 배양하였다.

배양 후 혼합액을 세포가 분주된 24 well plate에 넣어 주었으며, 6시간 후 세포배양 배지[10 % FBS, 1 % penicillin/streptomycin in DMEM]로 교체해주고, 24시간 배양하였다. 이 후, Loratadine을 농도별(0, 20,30, 40 μM)로 처리한 다음, 다시 30분간 배양하였다.

이 후, NF-кB, AP-1 DNA를 활성화 시키는 stimuli (100 nM PMA)를 처리한 후 6-18 시간동안 배양하였다. 배양 후 lysis buffer를 이용하여 세포를 용해시키고 substrate와 1:1로 반응시켰으며, Luminometer로 흡광도를 측정하여 NF-кB 또는 AP-1 Luciferase의 활성을 평가 하였다. beta-galactosidase의 경우, X-gal과 1:1로 반응시키고, 37 ℃ 배양기에서 5분 배양한 후, 405 nm로 흡광도를 측정하였다.

도 15 내지 도 17에 나타낸 바와 같이, NF-кB Luciferase(0.8μg) 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 군(도 15), NF-кB Luciferase(0.3μg), TRIF(0.3μg), 및 beta-galactosidase(0.1μg)을 처리한 군(도 16), NF-кB Luciferase(0.3μg), MyD88(0.3μg), 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 군(도 17)에서, NF-кB Luciferase 활성이 Loratadine에 의하여 감소하였으며, Loratadine의 농도가 증가할수록 NF-кB Luciferase 활성이 더욱 감소함을 확인하였다.

또한, 도 18 내지 도 20에 나타낸 바와 같이, 상기와 마찬가지로 AP-1 Luciferase(0.8μg) 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 군(도 18), AP-1 Luciferase(0.3μg), TRIF(0.3μg), 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 군(도 19), 및 AP-1 Luciferase(0.3μg), MyD88(0.3μg), 및 beta-galactosidase(0.1μg)를 처리한 군(도 20)에서, AP-1 Luciferase 활성이 Loratadine에 의하여 감소하였으며, Loratadine의 농도가 증가할수록 AP-1 Luciferase 활성이 더욱 감소함을 확인하였다. 상기 결과는 본 발명의 Loratadine은 염증관련 전사인자인 NF-кB/ AP-1의 활성을 억제함으로써, 항염증효과를 가짐을 의미한다.

실시예 11 : Loratadine의 전사인자 NF-кB/ AP-1의 핵내 이동 억제효과

Murine 대식 세포주인 RAW264.7 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였으며, 상기 배양한 세포를 90%의 밀도로 100mm의 dish에서 전 배양시켰다. 이 후 Loratadine(1 μg/ml)를 30분 동안 전 처리하고, stimuli (Lipopolysaccharide, LPS)로 자극한 후, 일정 시간 후 ice-cold PBS로 washing 하고 Homogenization buffer A [20 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM EGTA, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM PMSF, 25 μg/ml Aprotinin, 10 μg/ml Leupeptin] 300 μl를 이용하여 세포를 모았다. Sonicator를 사용하여 Output 4의 세기로 세포를 파쇄한 후, 8000 rpm으로 15분 동안 4 ℃에서 원심분리 하여 상층액 (Cytosol 분획)을 분리하였다. Pellet (Nuclear 분획)은 300 μl Homogenization buffer B [1% TritonX-100 in Homogenization buffer A]로 부유시킨 후, sonicator를 사용하여 Output 4의 세기로 세포를 파쇄하여 수득하였으며, 얻어진 분획을 SDS-PAGE와 western blotting 법을 이용하여 전사인자의 핵 내 이동 수준을 평가하였다.

각 표본의 단백질 농도를 BSA(Bovine Serum Albumin)를 표준으로 하여 측정였다. 단백질 농도가 되는 각 표본량을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하고, Western blotting 방법을 사용해 PVDF membrane으로 단백질을 blotting시킨 후, membrane을 5 % non-fat dried milk (Bio-rad)를 사용해 blocking시켰다. 이 후, 표적 단백질 항체 (p65, p50, c-Jun, Lamin A/C) 용액을 사용해 1차 처리하고, 다시 washing 단계 후, 2차 항체 용액을 처리하고 washing하였다. 그리고 암실에서 membrane에 ECL 용액 (Amersham, England)을 골고루 분주하여 X-ray film으로 감광하였으며, 대조 단백질로 Lamin A/C를 사용하였다.

도 21 에 나타낸 바와 같이, Nuclear 분획에서, 시간의 경과에 따른 Loratadine에 의한 표적 단백질 항체 (p65 및 p50 및 c-Jun) 단백질의 감소를 확인하였으며, 상기 결과는 본 발명의 Loratadine은 NF-кB/ AP-1 유전자의 전사인자인 p65 및 p50 및 c-JUN의 핵내 이동을 억제함으로써, 항염증효과를 가짐을 의미한다

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Composition comprising Loratadine for anti-inflammation <130> PB14-12294 <150> 10-2014-0021207 <151> 2014-02-24 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS Forward primer <400> 1 ggagccttta gacctcaaca ga 22 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS Reverse primer <400> 2 tgaacgagga gggtggtg 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 Forward primer <400> 3 ccagcacttc acccatcagt t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 Reverse primer <400> 4 acccaggtcc tcgcttatga 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta Forward primer <400> 5 gttgacggac cccaaaaaga t 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta Reverse primer <400> 6 cctcatcctg gaaggtccac 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 Forward primer <400> 7 aacgatgatg cattgcaga 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 Reverse primer <400> 8 gagcattgga aattggggta 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward primer <400> 9 caatgaatac ggctacagca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse primer <400> 10 agggagatgc tcagtgttgg 20

Claims

로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate) 또는 그 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 염증질환은 위염, 간염, 및 복막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 일산화질소(Nitric Oxide, NO) 또는 PGE₂(Prostaglandin E₂)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 NF-кB 또는 AP-1의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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로라타딘(Loratadine, Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b]pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylate) 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증질환 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 염증질환은 위염, 간염, 및 복막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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