KR101538450B1 - 악티게닌 함유 우방자 추출물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 악티게닌 및 악틴을 일정한 비율로 포함하는 우방자 추출물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 악티게닌 및 악틴을 약 1:1의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
우방자를 파쇄하는 공정과, 우방자를 내압하는 β-글루코시다아제에 의해 우방자에 내재하는 악틴을 악티제닌으로 효소변환하는 공정에 있어서, 상기 효소변환은, 20~50℃의 온도에서 반응시키는 공정을 포함하는, 악티게닌 및 악틴을 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 유기 용매를 가하여 가열환류함으로써, 악티게닌 및 악틴을 함유하는 추출물을 추출하는 공정을 추가로 포함하는 방법을 제공한다.

Description

악티게닌 함유 우방자 추출물 및 그 제조방법{ARCTIGENIN-CONTAINING BARDANAE FRUCTUS EXTRACT AND METHOD FOR PRODUCING SAME}

본 발명은, 악티게닌 및 악틴을 함유하는 우방자 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 악티게닌 및 악틴을 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

우방자는, 일본약국방(Japanese Pharmacopoeia) 15에서 우엉(Arctium Lappa Linne(Compositae))의 과실이라고 규정되어 있다. 또한, 우방자는 은교산, 구풍해독탕, 소풍산 등에 처방되는 생약이며, 전적으로 의약품으로서 사용되는 성분 본질로 분류된다.

우방자는, 리그난 배당체로 분류되는 악틴을 약 7% 및 그 아글리콘인 악티게닌을 약 0.6% 함유한다.

최근, PANC-1, AsPC-1, BxPC-1 및 KP-3 등의 췌장암 유래의 세포는, 극도의 영양 기아 상태에서도 강한 내성이 관찰되고, 그 내성을 해제하는 것이 암치료에 있어서의 새로운 생화학적 접근이 될 가능성이 있음이 보고되어 있다(특허문헌 1).

또한, 췌장암 세포주 PANC-1을 사용하여, 저양양상태에서의 종양세포의 생존능력을 해제할 수 있는 물질의 선별검사를 행한 바, 악티게닌이 유효하다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 따라서, 악티게닌을 함유하는 우방자 추출물은 췌장암을 치료하기 위한 항암제로서 사용할 수 있다.

현재 알려져 있는 우방자는, 우방자에 함유되어 있는 악티게닌 함량이 약 0.6%로 낮으며, 또한 물에 쉽게 녹지 않는다. 이 때문에, 종래 이용되고 있는 열수추출법으로는, 악티게닌을 고함량으로 함유하는 우방자 추출물을 제조하기가 지극히 곤란하였다.

또한, 췌장암 등의 치료에 사용함에 있어서, 유효성분인 악티게닌이 일정한 양으로 함유되는 우방자 추출물의 제공이 요망되고 있지만, 상기와 같이, 악티게닌 고함유 우방자 추출물의 제조에 있어서, 악틴을 악티게닌으로 변환하고, 물에 쉽게 녹지 않는 악티게닌을 일정한 함유량이 되도록 제어하는 것은 곤란하였다.

또한, 췌장암 등의 치료에 사용함에 있어서, 악티게닌 및 악틴을 일정 함량으로 포함하는 우방자 추출물은, 특히 항암효과가 우수하다는 것을 알게 되었다. 이 때문에, 악티게닌 고함유 우방자 추출물의 제조에 있어서, 악티게닌 및 악틴을 일정한 함유량이 되도록 제어할 수 있는 제조방법이 요망된다. 특히 악티게닌 및 악틴을 약 1:1의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 제조할 수 있는 방법이 요망된다.

특허문헌 1 : 일본 공개특허공보 특개 2002-065298호 공보

비특허문헌 1 : S. Awale, J. Lu, S. K. KaLauni, Y. Kurashima, Y. Tezuka, S. Kadota, H. Esumi, Cancer Res., 2006, 66(3), 1751-1757).

본 발명은, 악티게닌 및 악틴을 일정한 비율로 포함하는 우방자 추출물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 악티게닌 및 악틴을 약 1:1의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 최선을 다해 검토를 행한 결과, 원료로 하는 우방자의 효소활성, 우방자를 파쇄하는 입자 직경, 악틴을 악티게닌으로 효소변환할 때의 온도 및 우방자로부터 악티게닌 및 악틴을 추출할 때의 온도를 조정함으로써, 악티게닌 및 악틴의 함유비를 조절하는 기술을 발견하였다.

본 발명은, 우방자를 파쇄하는 공정과, 우방자에 내재하는 β-글루코시다아제에 의해 우방자에 내재하는 악틴을 악티게닌으로 효소변환하는 공정에 있어서, 상기 효소변환은, 20℃~50℃의 온도에서 반응시키는 공정을 포함하며, 악티게닌 및 악틴의 중량비는 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 파쇄하는 공정에 있어서, 우방자가 0.85㎜~9.5㎜의 입자 직경으로 파쇄되는, 우방자 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

추가로, 본 발명은, 우방자에 내재하는 β-글루코시다아제의 효소활성이, 우방자 1g 중 0.4U 내지 8.23U인 우방자 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 효소변환하는 공정 후에, 유기 용매를 더함으로써, 악티게닌 및 악틴을 함유하는 추출물을 추출하는 공정을 포함하는, 우방자 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 유기 용매가 에탄올인, 우방자 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 추출하는 공정이 80 ℃ 내지 90 ℃에서 추출되는, 우방자 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

추가로, 본 발명은, 상기 방법에 의하여 얻어지는, 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 제공한다.

추가로, 본 발명은, 상기 방법에 의하여 얻어지는, 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 함유하는 항암제를 제공한다.

본 발명에 의해, 항종양 효과를 갖는 악티게닌을 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 일정한 함유비를 갖는 우방자 추출물의 제공이 가능하게 되었다. 특히 췌장암 환자에게 투여하는 것으로, 안정된 종양의 증식억제나 항종양 효과를 기대할 수 있다. 또한 제조시의 생산성도 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다. 개시하는 조건은 일례이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원 발명의 우방자 추출물은, 생약파쇄공정, 추출공정(효소변환 공정 및 유기 용매에 의한 추출공정), 고액분리공정, 농축공정 및 건조공정을 거쳐 제조된다.

(생약파쇄공정)

본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에서는, 원료로 하는 우방자를 추출에 적합한 크기로 파쇄한다. 원료가 되는 생약은, 식물의 다양한 부위나 광물, 동물 등 여러 가지의 크기, 형상, 단단함을 고려하여, 그 성질에 따른 파쇄가 필요해진다. 우방자는, 당업자에게 공지의 임의의 수단을 사용하여 파쇄할 수 있다. 예를 들면, 시판되는 일반적인 파쇄기를 사용할 수 있다.

본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에서는, 우방자에 내재하는 효소인 β-글루코시다아제의 활성을 사전에 측정하고, 본 발명에 적합한 우방자를 선택할 수 있다.

β-글루코시다아제의 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드(C₁₂H₁₅NO₈: 분자량 301.25) (SIGMA-ALDRICH사 제품)을 기질로 하여, 우방자 분쇄품을 작용시키는 것으로 생성하는 p-니트로페놀을 400㎚의 흡광도에서 변화를 측정함으로써, 효소활성을 측정할 수 있다. 효소활성을 표시하는 단위로서 1분 동안에 1마이크로몰의 p-니트로페놀을 생성하는 효소량을 1단위(U)로 하여 표시할 수 있다.

악티게닌 및 악틴을 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 얻기 위해서는, 우방자에 내재하는 β-글루코시다아제의 활성이, 예를 들면, 0.4U/g 이상, 바람직하게는 1U/g 이상인 우방자를 이용할 수 있다.

만일, 0.4U/g 미만의 경우는, 가수분해가 불충분해지고, 악티게닌의 중량비가 내려가, 원하는 우방자 추출물을 효율적으로 얻을 수 없게 된다.

또한, 본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에서는, 임의의 입자 직경으로 파쇄된 우방자를 사용할 수 있다. 파쇄된 우방자의 입자 직경이 작을수록 효소변환이 촉진되고, 추출물 수율도 상승된다. 그 반면에, 입자 직경이 너무 작으면, 효소변환이 지나치게 빨라 프로세스 관리가 곤란해지거나, 다음 공정에 있어서 정확한 고액분리에 지장이 발생하거나 하는 일이 있다.

악티게닌 및 악틴을 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 얻기 위해서는, 이하의 실시예에 나타낸 바와 같이, 우방자는, 9.5㎜ 이하의 입자 직경으로, 예를 들면 9.5㎜의 체를 전부 통과하도록 파쇄된다.

또한, 악티게닌 및 악틴을 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 얻기 위해서는, 우방자의 입자 직경이, 9.5㎜ 체를 전부 통과하고, 예를 들면 0.85㎜의 체에 60~100%가 분포되도록, 더욱 바람직하게는 0.85㎜의 체에 65~80%가 분포되도록 파쇄하는 것이 바람직하다.

(추출공정)

추출공정은, 생약추출물 분말제조공정 중에서, 품질상 가장 중요한 공정이다. 이 추출공정에 의해, 생약추출물 분말의 품질이 결정된다. 본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에서는, 우방자 추출물을 추출하기 위해, 효소변환 공정과 유기 용매에 의한 추출공정의 2단계로 나누어 추출을 행한다.

(효소변환공정)

효소변환공정은, 본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에 있어서 중요한 공정이다. 효소변환공정은, 우방자에 내재하는 효소인 β-글루코시다아제에 의해, 우방자에 포함되어 있는 악틴을 악티게닌으로 효소변환하는 공정이다.

구체적으로는, 상기 공정에서 준비한 우방자 파쇄물을, 적절한 온도로 유지함으로써 β-글루코시다아제를 작용시켜서, 악틴으로부터 악티게닌으로의 반응을 진행시킨다.

예를 들면, 파쇄한 우방자에 물 등의 임의의 용액을 가하여, 30℃ 부근의 온도로 교반하는 것 등에 의해, 우방자를 임의의 온도로 유지할 수 있다.

악티게닌 및 악틴을 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 얻기 위해서는, 파쇄한 우방자를 30℃ 부근의 온도, 예를 들면 20℃~50℃ 사이의 온도로 유지한다.

만일, 20℃ 미만의 경우는, 가수분해가 불충분해지고, 악티게닌의 중량비가 내려가, 원하는 우방자 추출물을 효율적으로 얻을 수 없게 된다. 한편, 50℃ 보다 고온의 경우는, 효소가 활성을 잃고, 악티게닌의 중량비가 내려가, 원하는 우방자 추출물을 효율적으로 얻을 수 없게 된다.

또한, 유지시간은, 상기 온도에 있어서 유지되는 한 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 약 30분 유지시킬 수 있다. 20~50℃ 사이로 유지함으로써, 유지시간에도 상관없이, 적절한 양의 악틴이 악티게닌으로 효소변환되고, 악티게닌:악틴= 1:1 중량비로 함유되는 우방자 추출물을 얻을 수 있다.

(유기 용매에 의한 추출공정)

유기 용매에 의한 추출공정은, 임의의 적절한 유기 용매를 사용하여, 우방자로부터 악티게닌 및 악틴을 추출하는 공정이다. 즉, 상기의 효소변환공정에 의해 악티게닌이 고함량으로 된 상태에서, 적절한 용매를 첨가하여, 우방자 추출물을 추출하는 공정이다. 예를 들면, 우방자 추출물에 적절한 용매를 첨가하여, 적절한 시간 가열교반하여 우방자 추출물을 추출한다. 또한, 가열교반 이외에도, 가열환류, 드립식 추출, 침지식 추출 또는 가압식 추출법 등의 당업자에게 공지의 임의의 추출법을 사용하여, 우방자 추출물을 추출할 수 있다.

악티게닌은 수난용성이기 때문에, 유기 용매를 첨가함으로써, 악티게닌의 수율을 향상시킬 수 있다. 유기 용매는, 임의의 유기 용매를 사용할 수 있다. 예를 들면, 메탄올, 에탄올 및 프로판올 등의 알코올 및 아세톤을 사용할 수 있다. 안전성의 측면을 고려하면, 본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에서는, 유기 용매로서 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

가열교반에 의하여 우방자 추출물을 추출하는 경우, 가열교반은, 임의의 온도로 행할 수 있지만, 악티게닌 및 악틴을 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 얻기 위해서는, 80℃ 이상의 온도, 예를 들면 80~90℃ 사이의 온도로 유지한다.

또한, 가열교반하는 시간은, 상기 온도에 있어서 가열교반하는 한, 특별히 한정되지 않고, 약 30분 동안, 예를 들면 30~60분 동안 가열교반함으로써, 용매 중에 우방자로부터 악티게닌 및 악틴을 추출시킬 수 있다.

악티게닌 및 악틴의 수율은, 가열교반의 시간이 길수록 향상된다. 그러나, 가열교반의 시간이 길면, 불필요한 유지류가 많이 용출되어, 농축공정의 부하가 커지게 된다. 따라서, 가열교반의 시간은, 상황에 따라서 적정하게 결정하면 된다.

또한, 악티게닌 및 악틴의 수율은, 에탄올량이 많을수록 악티게닌 및 악틴의 용해도가 높아지기 때문에, 수율도 향상된다. 그러나, 에탄올량이 많으면, 불필요한 유지류도 많이 용출되어, 농축공정의 부하가 커지게 된다. 따라서, 투입량은, 상황에 따라 적정하게 결정하면 된다. 또한 이 공정에서의 가열교반에 의해, 동시에 우방자 추출물을 멸균 및 살균할 수 있다.

(고액분리공정)

고액분리공정은, 추출을 마친 우방자를 추출액으로부터 분리하는 공정이다. 고액분리는, 당업자에게 공지의 임의의 방법을 사용하여 행할 수 있다. 고액분리법에는, 예를 들면 여과법, 침강법, 원심분리법 등이 있다. 공업적으로는, 원심분리법이 바람직하다.

(농축공정)

농축공정은, 건조에 앞서 우방자 추출액으로부터 용매를 제거하는 공정이다. 우방자 추출액으로부터의 용매의 제거는, 당업자에게 공지의 임의의 방법을 사용하여 행할 수 있다.

그러나, 상기 공정에 의하여 얻어진 우방자로부터의 추출액이, 다시 고온에 장시간 노출되는 일이 없도록 하는 것이 바람직하다.

예를 들면, 감압농축법을 사용함으로써, 고온에 장시간 노출되는 일 없이, 우방자 추출액을 농축할 수 있다.

우방자 추출액의 농축은, 원하는 농도의 우방자 추출물을 얻을 수 있는 농도까지 농축할 수 있다.

예를 들면, 이하의 건조공정에 있어서 건조를 적정하게 행할 수 있는 정도까지 농축하는 것이 바람직하다. 또한, 이하의 공정에 있어서 우방자 추출물을 건조시켜서 분말제제로 한 경우에, 적절한 제제 특성이 얻어지는 농도까지 농축을 행하는 것이 바람직하다.

악티게닌 및 악틴은, 수난용성이기 때문에, 악티게닌 및 악틴이 이하의 건조공정에 있어서의 제조장치 내에 부착되는 양이 많고, 최종적인 수율이 대폭으로 저하된다. 따라서, 제조장치에 악티게닌 및 악틴이 부착되는 것을 방지하기 위해서, 이 농축공정에서 얻어진 우방자 추출액에 덱스트린을 첨가할 수 있다. 덱스트린의 첨가량은, 예를 들면 농축액의 고형분에 대하여 15~30% 정도가 바람직하다.

(건조공정)

상기 공정에 의하여 얻어진 우방자 추출물을 분말 형상으로 완성하는 공정이다. 건조는, 당업자에게 공지의 임의의 방법을 사용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 건조법으로서, 동결건조 및 분무건조 등이 알려져 있지만, 실험실 수준이라면 전자, 양산 수준이라면 후자를 이용하는 것이 일반적이다.

이상의 제조공정에 의해, 악티게닌 및 악틴을 악티게닌:악틴이 0.7~1.3 중량%:1 중량%의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 얻을 수 있다. 본 발명의 우방자 추출물의 제조방법은, 20℃~50℃의 온도에서 효소변환을 행하는 공정을 포함하지 않으면 안되지만, 기타 공정의 모두를 포함할 필요는 없다.

(우방자 추출물을 함유하는 항암제)

우방자 추출물의 주요성분인 악티게닌은, 췌장암을 치료하기 위한 항암제의 유효성분으로서 작용하는 것이 알려져 있다. 또한, 우방자 추출물을 유효성분으로 하는 항암제는, 우방자 추출물 중의 악티게닌 및 악틴이 대략 1:1의 중량비로 함유되어 있는 경우에, 그 항암효과가 가장 우수한 것을 알 수 있게 되었다.

한편, 본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에 의하여 얻어진 추출물 분말은, 상기와 같이, 악티게닌 및 악틴을 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유한다. 따라서, 본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에 의해서 얻어진 추출물 분말은, 종래의 우방자 추출물과 비교하여, 우수한 항암효과를 갖는 항암제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에 의하여 얻어진 추출물을 함유하는 항암제는, 또한 임의의 성분을 포함하는 조성물일 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 추출물을 함유하는 항암제는, 의약으로서 사용되는 경우, 약학적으로 허용되는 기제, 담체, 부형제, 붕괴제, 활택제 및 착색제 등과 함께 의약 조성물로서 제공할 수 있다.

의약 조성물에 사용하는 담체 및 부형제의 예에는, 유당, 포도당, 백당, 만니톨, 덱스트린, 감자전분, 옥수수전분, 탄산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘 및 결정셀룰로오스 등을 포함한다.

또한, 결합제의 예에는, 전분, 젤라틴, 시럽, 트래거캔스 고무, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스 등을 포함한다.

또한, 붕괴제의 예에는, 전분, 한천, 젤라틴분말, 결정셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨, 알긴산 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 및 카르복시메틸셀룰로오스칼슘 등을 포함한다.

또한, 활택제의 예에는, 스테아린산 마그네슘, 수소첨가 식물유, 탈크 및 마크로골 등을 포함한다. 또한, 착색제는 의약품에 첨가하는 것이 허용되어 있는 임의의 착색제를 사용할 수 있다.

또한, 의약 조성물은, 필요에 따라, 백당, 젤라틴, 정제세락, 젤라틴, 글리세린, 솔비톨, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 폴리비닐필로리돈, 부탈산셀룰로오스아세테이트, 히드록시프 로필메틸셀룰로오스 부탈레이트, 메틸메타크릴레이트 및 메타아크릴산 중합체 등으로 하나의 층 이상으로 피막할 수 있다.

또한, 필요에 따라, pH 조절제, 완충제, 안정화제 및 가용화제 등을 첨가할 수 있다.

또한, 의약 조성물은, 임의의 형태의 제제로서 제공할 수 있다. 예를 들면, 의약 조성물은, 경구투여제제로서, 당의정, 버컬정, 코팅정 및 츄어블정 등의 정제, 트로키제, 환제, 산제 및 소프트캡슐을 포함하는 캡슐제, 과립제, 현탁제, 유제, 드라이시럽을 포함하는 시럽제, 에릭실제 등의 액제일 수 있다.

또한, 의약 조성물은, 비경구 투여를 위해, 정맥주사, 피하주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 경피투여, 경비투여, 경폐투여, 경장투여, 구강내 투여 및 경점막 투여 등의 투여를 위한 제제일 수 있다. 예를 들면, 주사제, 경피흡수테입, 에어졸제 및 좌제 등일 수 있다. 또한, 추출물 분말이 특유의 문양을 갖는 것이기 때문에, 추출물 분말을 마스킹하는 제제로 하거나, 피복제로 피복하는 필름코트제로 하거나 할 수 있다.

한편, 본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에 따라 얻어진 추출물 분말은, 그대로의 형태로 사용할 수도 있다. 또한, 식품 등에 첨가할 수도 있다. 또한, 본 발명의 우방자 추출물의 제조방법에 의하여 얻어진 추출물 분말은, 다른 식품에 첨가하고, 혼합하고, 또는 도포하는 것 등에 의해, 식품소재로서 제공할 수 있다. 식품 이외에, 화장품 및 사료 등으로서 제공할 수도 있다.

(시험예)

우방자의 효소활성 및 효소변환 조건(온도와 시간)이, 악티게닌/악틴(중량비)에 미치는 영향, 즉 양자의 인과관계를 검증하였다.

(효소활성의 측정)

우방자를 윌리씨 분쇄기에 의해 분쇄하고, 이 우방자 분쇄품 0.1g을 10mL의 물로 희석하여, 시료용액으로 하였다.

기질용액으로서, p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드 0.15g에 물을 가하여 25mL의 일정용량이 되도록 하여, 20mmol/L p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드 수용액을 조제하였다. 0.1㏖/L 초산 완충액 1mL에 20m㏖/L p-니트로페닐-β-D-글루코 피라노사이드 수용액 0.5mL를 가하여, 반응혼액을 제조하고, 37℃에서 약 5분 예비가열을 행하였다.

반응혼액에 시료용액 0.5mL를 가하여 37℃에서 15분 반응시킨 후, 반응정지액인 0.2㏖/L 탄산나트륨 수용액을 2mL 가하여 반응을 정지시켰다. 이 액의 400㎚에 있어서의 흡광도를 측정하고, 효소반응을 행하지 않는 블랭크 용액으로부터의 변화량으로부터 아래의 식에 의해 효소활성을 구하였다.

효소활성(U/g)=(시료용액의 흡광도-블랭크 용액의 흡광도)×4mL×1/18.1 (p-니트로페놀의 상기 측정조건 하에서의 밀리몰 분자 흡광계수: ㎠/μ㏖)×1/광로 길이(㎝)×1/반응시간(분)×1/0.5mL×1/시료용액 농도(g/mL)

표 1에 나타내는 바와 같이 각 우방자의 효소활성이 0.12~8.23U/g인 것을 확인하였다.

(시험예 1)

효소활성이 0.12, 0.27, 0.40U/g (시료 1~3)인 파쇄한 우방자 1g에 물 7mL를 가하여, 효소반응 온도 15℃, 20℃의 온도 조건에서 각각의 반응온도에서의 반응시간을 30분으로 설정하고, 반응후 에탄올을 가하여 80℃에서 추출을 행하고, 얻어진 추출물의 악티게닌 및 악틴을 정량하고, 악티게닌/악틴 중량비를 구하였다.

결과를 표 1의 비교예 1~2, 실시예 1에 나타낸다.

효소활성이 0.40U/g인 시료 3은, 효소반응 온도 20℃, 반응시간 30분으로, 악티게닌/악틴(중량비)=0.82의 우방자 추출물이 얻어졌다.

한편, 효소반응 온도 15℃, 반응시간 30분에서는, 악티게닌/악틴 (중량비)=0.69이며, 효소반응 온도는 20℃ 이상인 것이 바람직하다.

또한, 효소활성이 0.40U/g 미만인 시료 1 및 2는, 효소반응 온도 20℃여도 악티게닌/악틴(중량비)=0.70 이상을 만족시킬 수 없기 때문에, 우방자의 효소활성은 0.40U/g 이상인 것이 바람직하다.

(시험예 2)

효소활성이 4.03U/g(시료 5)인 파쇄한 우방자 1g에 물 7mL를 가하여, 효소반응 온도 30℃, 40℃, 50℃, 60℃의 온도조건에서 각각의 반응온도에서의 반응시간을 15분, 30분(30℃와 60℃만)으로 설정하고, 반응 후 에탄올로 추출을 행하고, 얻어진 추출물의 악티게닌 및 악틴을 정량하고, 악티게닌/악틴 중량비를 구하였다.

결과를 표 1의 실시예 3에 나타낸다. 효소반응 온도 30℃, 반응시간 15분에서 악티게닌/악틴(중량비)=0.7, 효소반응 온도 30℃, 반응시간 30분에서 악티게닌/악틴(중량비)=1.0, 효소반응 온도 40℃, 반응시간 15분에서 악티게닌/악틴(중량비)=1.2, 효소반응 온도 50℃, 반응시간 15분에서 악티게닌/악틴(중량비)=1.2의 우방자 추출물이 얻어진다.

한편, 효소반응 온도 60℃, 반응시간 15분에서는 악티게닌/악틴 (중량비)=0.4, 효소반응 온도 60℃, 반응시간 30분에서는 악티게닌/악틴 (중량비)=0.5였다.

이상으로, 효소반응 온도는 60℃ 미만이 바람직하다.

(시험예 3)

효소활성이 1.42U/g(시료 4)인 파쇄한 우방자 1g에 물을 7mL 가하여, 효소반응 온도 25℃의 온도조건에서 반응시간을 10분, 30분으로 설정하고, 반응 후 에탄올로 추출을 행하고, 얻어진 추출물인 악티게닌 및 악틴을 정량하고, 악티게닌/악틴 중량비를 구하였다.

결과를 표 1의 실시예 2에 나타낸다. 효소반응 온도 25℃, 반응시간 10분에서 악티게닌/악틴(중량비)=0.74, 마찬가지로 반응시간 30분에서 악티게닌/ 악틴(중량비)=0.85의 우방자 추출물이 얻어진다.

이상으로부터 효소활성 1.42U/g이어도 원하는 결과를 얻을 수 있었다.

			비교예 1	비교예 2	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5
시료			시료 1	시료 2	시료 3	시료 4	시료 5	시료 6	시료 7
효소활성(U/g)			0.12	0.27	0.40	1.42	4.03	7.82	8.23
악티게닌/악틴 중량비	15℃	30분	0.26	0.50	0.69	──	──	──	──
	20℃	30분	0.23	0.60	0.82	──	──	──	──
	25℃	10분	──	──	──	0.74	──	──	──
		30분	──	──	──	0.85	──	──	──
	30℃	15분	──	──	──	──	0.70	──	──
		30분	──	──	──	──	1.00	0.93	0.89
	40℃	15분	──	──	──	──	1.20	──	──
		30분	──	──	──	──	──	──	──
	50℃	15분	──	──	──	──	1.20	──	──
		30분	──	──	──	──	──	──	──
	60℃	15분	──	──	──	──	0.40	──	──
		30분	──	──	──	──	0.50	──	──

실시예 6 우방자 추출물의 제조 1

우방자(효소활성 8.23U/g)를 파쇄하고, 9.5㎜의 체를 전부 통과하는 것을 다시 0.85㎜의 체에 통과시키고, 75%가 남은 것을 확인하였다. 이 우방자를 세절한 것 80㎏을 29~33℃로 가온된 물 560L에 가하여 30분간 교반하였다. 다음으로, 에탄올 265L를 가하여 85℃로 승온하고, 다시 60분 동안 가열환류하였다. 이 용액을 원심분리하여, 우방자 추출액을 얻었다. 이 조작을 2회 반복하여 얻어진 추출액을 합하여, 감압농축하고, 추출물 고형분에 대하여 덱스트린 20%를 가하여, 분무건조하였다. 악티게닌 및 악틴 함량은, 각각 6.2% 및 7.1%이고, 악티게닌/악틴(중량비)=0.89인 우방자 추출물 분말(덱스트린 20% 함유)이 얻어졌다.

실시예 7 우방자 추출물의 제조 2

우방자(효소활성 8.23U/g)를 파쇄하고, 9.5㎜의 체를 전부 통과하는 것을 다시 0.85㎜의 체에 통과시켜 75%가 남는 것을 확인하였다. 이 우방자를 세절한 것 80㎏을 30~33℃로 가온한 물 560L에 가하여 30분 동안 교반한 후, 에탄올 265L를 가하여 85℃로 승온하고, 다시 30분 동안 가열환류하였다. 이 용액을 원심분리하여 우방자 추출액을 얻었다. 이 조작을 2회 반복하여 얻어진 추출액을 합하여, 감압농축하고, 추출물 고형분에 대하여 덱스트린 20%를 가하여 분무건조하였다. 악티게닌 및 악틴 함량은 각각 6.0% 및 6.8%이고, 악티게닌/ 악틴(중량비)=0.87의 우방자 추출물 분말(덱스트린 20% 함유)이 얻어졌다.

실시예 8 우방자 추출물의 제조 3

우방자(효소활성 7.82U/g)를 파쇄하고, 9.5㎜의 체를 전부 통과하는 것을 다시 0.85㎜의 체에 통과시켜 75%가 남는 것을 확인하였다. 이 우방자를 세절한 것 80㎏을 30~32℃로 가온한 물 560L에 가하여 40분 동안 교반한 후, 60분 후에 에탄올 258L를 가하여 85℃로 승온하고, 다시 30분 동안 가열환류하였다. 이 액을 원심분리하여 우방자 추출액을 얻었다. 이 조작을 2회 반복하여 얻어진 추출액을 합하여, 감압농축하고, 추출물 고형분에 대하여 덱스트린 20%를 가하여 분무건조하였다. 악티게닌 및 악틴 함량은 각각 6.2% 및 6.7%이고, 악티게닌/ 악틴(중량비)=0.93의 우방자 추출물 분말(덱스트린 20% 함유)이 얻어졌다.

실시예 9 우방자 추출물의 제조 4

우방자(효소활성 7.82U/g)를 파쇄하고, 9.5㎜의 체를 전부 통과하는 것을 다시 0.85㎜의 체에 통과시켜 75%가 남는 것을 확인하였다. 이 우방자를 세절한 것 80㎏을 30~32℃로 가온한 물 560L에 가하여 30분 동안 교반한 후, 에탄올 253L를 가하여 85℃로 승온하고, 다시 40분 동안 가열환류하였다. 이 액을 원심분리하여 얻어진 추출액을 얻었다. 이 조작을 2회 반복하여 얻어진 추출액을 합하여, 감압농축하고, 추출물 고형분에 대하여 덱스트린 25%를 가하여, 분무건조하였다. 악티게닌 및 악틴 함량은, 각각 6.4% 및 7.2%이고, 악티게닌/ 악틴(중량비)=0.89의 우방자 추출물 분말(덱스트린 25% 함유)이 얻어졌다.

		실시예 6	실시예 7	실시예 8	실시예 9
우방자	효소활성	8.23	8.23	7.82	7.82
파쇄공정	입자 직경(㎜)	0.85~9.5	0.85~9.5	0.85~9.5	0.85~9.5
효소변환 공정	온도(℃)	29~33℃	30~33℃	30~32℃	30~32℃
	시간(분)	30분	30분	40분	30분
추출공정	용매	에탄올	에탄올	에탄올	에탄올
	온도(℃)	85℃	85℃	85℃	85℃
	시간(분)	60분	30분	30분	40분
고액분리공정		원심분리법	원심분리법	원심분리법	원심분리법
농축공정		감압농축	감압농축	감압농축	감압농축
건조공정		분무건조	분무건조	분무건조	분무건조
악티게닌/악틴(중량비)		0.89	0.87	0.93	0.89

상기의 실시예 6~9의 결과로부터, 효소변환공정에 있어서, 대략 30℃에서 효소변환함으로써, 악티게닌:악틴(중량비)=약 1:1의 함유량인 우방자 추출물이 얻어지는 것을 알 수 있다. 통상, 효소에 의한 반응은, 온도 및 시간에 의존적으로 반응이 진행되지만, 이 온도라면 효소변환 시간에 상관없이, 악티게닌:악틴(중량비)=약 1:1의 함유량인 우방자 추출물이 얻어지는 것을 알 수 있다.

또한, 상기의 실시예 6~9의 결과로부터, 가열환류공정에 있어서, 대략 85℃로 온도를 상승시켜서 가열환류함으로써, 악티게닌:악틴(중량비)=약 1:1의 함유량인 우방자 추출물이 얻어지는 것을 알 수 있었다. 통상, 가열환류하여 추출물을 얻는 경우, 추출물 중의 함유물의 양은, 온도 및 시간에 의존하여 변화되지만, 이 온도라면 가열환류 시간에 상관없이, 악티게닌:악틴(중량비)=약 1:1의 함유량인 우방자 추출물이 얻어지는 것을 알 수 있었다.

실시예 10 우방자 추출물 분말 배합과립제

(1)실시예 7의 우방자 추출물 분말 33.3%

(2)유당 65.2%

(3)히드록시프로필셀룰로오스 1.5%

합계 100%

제조방법

「일본약국방」 제제총칙, 과립제 항에 준하여 과립제를 제조한다. 즉 위의 표에 기재된 (1)~(3)까지의 성분을 취하여 과립 형상으로 제조하였다. 이것을 1.5g씩 알루미늄라이네이트 필름으로 충진하고, 1포당 우방자 추출물 분말을 0.5g 함유하는 과립제를 얻었다.

실시예 11 우방자 추출물 분말 배합정제

(1)실시예 7의 우방자 추출물 분말 37.0%

(2)결정셀룰로오스 45.1%

(3)카르멜로스 칼슘 10.0%

(4)크로스포비돈 3.5%

(5)함수이산화규소 3.4%

(6)스테아린산 마그네슘 1.0%

합계 100%

(제조방법)

「일본약국방」제제 총칙, 정제 항에 준하여 정제를 제조한다. 즉 위의 표에 기재된 (1)~(6) 성분으로 하고, 정제를 얻었다.

Claims (13)

1. 우방자를 파쇄하는 공정과,
   우방자에 내재하는 β-글루코시다아제에 의해 우방자에 내재하는 악틴을 악티게닌으로 효소변환하는 공정에 있어서, 상기 효소변환은, 20℃~50℃의 온도에서 반응시키는 공정을 포함하며, 악티게닌 및 악틴을 악티게닌/악틴 = 0.7~1.3의 중량비로 함유하는 우방자 추출물을 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 파쇄하는 공정에 있어서, 우방자가 0.85㎜~9.5㎜의 입자 직경으로 파쇄되는 우방자 추출물을 제조하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 우방자에 내재하는 β-글루코시다아제의 효소활성이, 우방자 1g 중 0.4U 내지 8.23U인 우방자 추출물을 제조하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
   상기 효소변환하는 공정 후에, 유기 용매를 더함으로써, 악티게닌 및 악틴을 함유하는 추출물을 추출하는 공정을 포함하는 우방자 추출물을 제조하는 방법.
5. 제 3 항에 있어서,
   상기 효소변환하는 공정 후에, 유기 용매를 더함으로써, 악티게닌 및 악틴을 함유하는 추출물을 추출하는 공정을 포함하는 우방자 추출물을 제조하는 방법.
6. 제 4 항에 있어서,
   상기 유기 용매가 에탄올인 우방자 추출물을 제조하는 방법.
7. 제 5 항에 있어서,
   상기 유기 용매가 에탄올인 우방자 추출물을 제조하는 방법.
8. 제 4 항에 있어서,
   상기 추출하는 공정은, 80℃ 내지 90℃에서 추출되는 우방자 추출물을 제조하는 방법.
9. 제 5 항에 있어서,
   상기 추출하는 공정은, 80℃ 내지 90℃에서 추출되는 우방자 추출물을 제조하는 방법.
10. 제 6 항에 있어서,
    상기 추출하는 공정은, 80℃ 내지 90℃에서 추출되는 우방자 추출물을 제조하는 방법.
11. 제 7 항에 있어서,
    상기 추출하는 공정은, 80℃ 내지 90℃에서 추출되는 우방자 추출물을 제조하는 방법.
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