KR101533355B1

KR101533355B1 - 스테비올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 스테비올의 제조 방법

Info

Publication number: KR101533355B1
Application number: KR1020130043540A
Authority: KR
Inventors: 이평천; 공민경
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2012-04-19
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2015-07-06
Also published as: WO2013157887A1; KR101533350B1; KR20140134636A; KR20140134635A; KR101533352B1; KR20130118279A

Abstract

본 발명은 스테비오사이드의 전구체인 카우린, 카우린산 또는 스테비올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 카우린, 카우린산 또는 스테비올의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 스테비아의 추출물로부터 직접 분리하는 것이 아닌, 미생물에 도입된 재조합 유전자에 의해 대사경로를 조작함으로써, 간단한 공정만으로도 천연 감미료인 스테비오사이드의 전구체인 카우린, 카우린산 또는 스테비올을 다량으로 제공할 수 있다.

Description

스테비올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 스테비올의 제조 방법 {Recombinant microorganism with steviol production ability and method for preparing steviol using the same}

본 발명은 스테비오사이드의 전구체인 카우린, 카우린산 또는 스테비올 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 카우린, 카우린산 또는 스테비올의 제조 방법에 관한 것이다.

스테비아 (Stevia rebaudiana Bertoni)는 국화과의 여러해살이풀로 원산지는 남미의 브라질과 파라과이의 국경지역에 인접한 고산지대이다. 스테비아는 하천이나 습지대 주변에서 자생하며, 잎에 감미물질이 함유되어 있다. 스테비아의 감미 성분은 스테비올 (steviol)을 배당체로 하는 스테비오사이드 (Stevioside), 레바우디오사이드-에이 (Rebaudioside-A) 등이 있다.

스테비오사이드는 설탕의 약 200배, 레바우디오사이드-에이는 설탕의 약 250배의 감미도를 가지는 천연 감미료이다. 스테비오사이드는 뒷맛이 약간 쓴 후미를 가지고 있지만, 레바우디오사이드-에이는 쓴맛이 거의 없어 감미 성분으로 우수하다. 이에, 스테비오사이드를 글루코실화하여 레바우디오사이드-에이를 생산하기 위한 노력이 계속되었으며, 공여체로서 스테비올 글리코시드를 이용하여 글리코실전이반응 (transglycosylation)을 진행하는 것이 밝혀졌다.

현재까지 스테비오사이드의 생산과 관련된 연구는 스테비아 (Stevia rebaudiana Bertoni)의 잎으로부터 직접 추출하는 것이 주된 내용이었으며, 스테비아 자체의 추출물에서 스테비오사이드를 억제하고, 감미질이 우수한 레바우디오사이드 A의 생산 수율을 높이기 위한 효소 처리 방법 등이 연구되어 왔다. 선행 특허문헌으로는 스테비오사이드를 주성분으로 한 스테비아 추출물과 ß-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하는 수용액상에서 ß-1,4-갈락토실 전이효소를 작용시켜 스테비오사이드에 갈락토실기를 제조하는 방법 (일본특허공개 제58-94367호), 물과 소수성 유기용매를 혼합한 반응계에서 효소반응에 의하여 스테비오사이드를 당전이 스테비오사이드로 전환하여 스테비오사이드의 미질을 개선하는 방법 (한국등록특허 특1994-528호), 스테비오사이드와 레바우디오사이드 A 혼합물로부터 알코올과 물에 대한 용해도 차이를 이용하여 각각을 결정형으로 분리하는 방법 (일본특허공개 제56-121453호), 스테비아 식물에 감마광선을 조사하여 레바우디오사이드 A를 다량 함유케 하는 식물로 유전적 변형을 유발시키는 방법 (일본특허공개 제2002-34502호) 등이 개시되어 있다.

이에, 본 발명자들은 미생물을 이용하여 스테비오사이드를 생산하는 새로운 방법을 개발하고자 노력한 결과, 스테비오사이드의 전구체인 카우린, 카우린산 또는 스테비올을 합성할 수 있는 재조합 벡터를 개발하고, 상기 벡터로 형질 전환된 재조합 미생물이 우수한 카우린, 카우린산 또는 스테비올 생성능을 가지는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 스테비오사이드의 전구체인 카우린, 카우린산 또는 스테비올 제조용 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 스테비오사이드의 전구체인 카우린, 카우린산 또는 스테비올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 스테비오사이드의 전구체인 카우린, 카우린산 또는 스테비올의 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 GGDPS (geranylgeranyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자; CDPS (copalyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자; 및 KS (kaurene synthase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 스테비오사이드의 전구체인 카우린 제조용 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 GGDPS를 코딩하는 유전자; CDPS를 코딩하는 유전자; KS를 코딩하는 유전자; 및 KO (kaurene oxidase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 스테비오사이드의 전구체인 카우린산 제조용 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 (1) GGDPS를 코딩하는 유전자; CDPS를 코딩하는 유전자; KS를 코딩하는 유전자; 및 KO를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및 (2) KAH (kaurenoic acid hydroxylase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터;를 모두 포함하는 스테비오사이드의 전구체인 스테비올 제조용 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 스테비오사이드의 전구체인 카우린, 카우린산 또는 스테비올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 수득한 미생물 배양액으로부터 카우린, 카우린산 또는 스테비올을 회수하는 단계;로 이루어지는 스테비오사이드의 전구체인 카우린, 카우린산 또는 스테비올의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 스테비아의 추출물로부터 직접 분리하는 것이 아닌, 미생물에 도입된 재조합 유전자에 의해 대사경로를 조작함으로써, 간단한 공정만으로도 천연 감미료인 스테비오사이드의 전구체인 카우린, 카우린산 또는 스테비올을 다량으로 제공할 수 있다.

도 1은 카우린, 카우린산 및 스테비올의 생합성 대사회로를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에서 클로닝에 이용된 벡터를 나타낸 도이다 ((A) pGEM-T Easy 벡터, (B) pUC_mod 벡터, (C) pET23 벡터를 변형한 발현 벡터, (D) pSTV29 벡터).
도 3은 재조합 대장균으로부터 분리 및 정제한 CDPS를 확인한 도이다.
도 4는 in vitro 어세이를 통해 생산된 copalol을 GC/MS 분석을 통해 나타낸 도이다.
도 5는 재조합 대장균으로부터 분리 및 정제한 KS를 확인한 도이다.
도 6은 in vitro 어세이를 통해 생산된 copalol 및 카우린을 GC/MS 분석을 통해 나타낸 도이다.
도 7은 in vitro 어세이를 통해 생산된 카우린을 GC/MS 분석을 통해 나타낸 도이다.
도 8은 재조합 대장균으로부터 분리 및 정제한 CDPS 및 KS 단백질을 SDS-PAGE를 통해 나타낸 도이다.
도 9는 스테비아 및 다양한 균주로부터 유래한 GGDPS를 이용하여 생산된 카우린을 GC/MS를 통해 나타낸 도이다.
도 10은 스테비아 및 다양한 균주로부터 유래한 GGDPS를 이용하여 생산된 카우린의 양을 비교하여 나타낸 도이다.
도 11은 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)로부터 유래된 GGDPS (crtE)와 스테비아(Stevia rebaudiana Bertoni)로부터 유래된 CDPS 및 KS를 코딩하는 유전자가 포함된 재조합 벡터를 나타낸 도이다.
도 12는 배양 방식에 따른 카우린 생산량의 변화를 나타낸 도이다.
도 13은 스테비아로부터 유래된 정상 KO 유전자 및 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지는 KO* 유전자를 이용하여 생산된 카우린산의 양을 비교하여 나타낸 도이다.
도 14는 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지는 KO* 유전자를 이용하여 생산된 카우린산을 GC/MS를 통해 나타낸 도이다.
도 15는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)로부터 유래된 GGDPS (crtE)와 스테비아(Stevia rebaudiana Bertoni)로부터 유래된 CDPS, KS 및 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지는 KO* 유전자를 코딩하는 유전자가 포함된 재조합 벡터를 나타낸 도이다.
도 16은 카우린산을 생산하는 유전자군과 KAH 유전자를 이용하여 생산된 스테비올의 양을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 GGDPS (geranylgeranyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자; CDPS (copalyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자; 및 KS (kaurene synthase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 스테비오사이드의 전구체인 카우린 제조용 재조합 벡터를 제공한다.

상기 유전자는 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana Bertonii)로부터 유래된 것을 특징으로 하나, 다른 생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 이에 제한되지 않는다.

상기 GGDPS (geranylgeranyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)로부터 유래된 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드인 것이 바람직하며, 이 경우 스테비아 레바우디아나 유래 GGDPS를 이용할 때에 비해 현저하게 우수한 효율로 스테비오사이드의 전구체를 생성할 수 있다.

상기 CDPS (copalyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자는 스테비아 레바우디아나로부터 유래된 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

상기 KS (kaurene synthase)를 코딩하는 유전자는 스테비아 레바우디아나로부터 유래된 서열번호 3으로 표시되는 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

상기 KO (kaurene oxidase)를 코딩하는 유전자는 스테비아 레바우디아나로부터 유래된 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오티드 또는 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 상기 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오티드는 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지고 있는 KO 유전자를 코딩하는 것으로, 정상 KO 유전자 (서열번호 4)를 이용할 때에 비해 현저하게 우수한 효율로 스테비오사이드의 전구체를 생성할 수 있다.

상기 KAH (kaurenoic acid hydroxylase)를 코딩하는 유전자는 스테비아 레바우디아나로부터 유래된 서열번호 6으로 표시되는 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "작동 가능하게 연결된"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에서 “목적 유전자의 발현"은 상기 목적 유전자를 발현시켜 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 생산하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서 목적 유전자를 발현하는 방법은 상기 목적 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환된 형질 전환체 (숙주세포, 미생물 등)를 배양하여 상기 목적 유전자가 코딩하는 단백질을 발현시키는 방법이며, 이를 통해 상기 단백질이 관여되는 생합성 경로의 최종 산물을 제조할 수 있다.

본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명에서는 바람직한 일 실시예로, 본 발명에 따른 카우린 제조용 벡터의 벡터맵을 도 11에 도시하였으며, 카우린산 제조용 벡터의 벡터맵을 도 15에 도시하였다.

또한 본 발명은, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 카우린, 카우린산 또는 스테비올 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.

상기 미생물은 대장균, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 대장균이나, 카우린, 카우린산 또는 스테비올 생성능을 가지고 있는 한 이에 제한되지 않는다.

재조합 벡터를 세포 내로 도입시키는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 형질 전환 방법이다. 상기 "형질 전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질 전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE (diethylaminoethyl)-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한 본 발명은, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 수득한 미생물 배양액으로부터 카우린, 카우린산 또는 스테비올을 회수하는 단계;로 이루어지는 카우린, 카우린산 또는 스테비올의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 재조합 미생물의 배양은 통상적으로 알려진 배양 방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 재조합 미생물 및 이의 배양액으로부터 카우린, 카우린산 또는 스테비올의 분리 및 회수는 해당 물질의 물리, 화학적 특성에 따라 적합한 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어 증류, 전기투석, 투과증발, 크로마토그래피, 용매추출, 반응추출, HPLC 등을 이용할 수 있으며, 이들을 조합하여 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 벡터의 확보 및 클로닝 프라이머의 제작

카우린, 카우린산 및 스테비올의 생합성 대사회로는 도 1과 같다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 카우린 생합성 관련 효소는 GGDPS (geranylgeranyl diphosphate synthase, crtE), CDPS (copalyl diphosphate synthase), KS (kaurene synthase) 등이 있으며, 카우린산 생합성 관련 효소에는 KO (kaurene oxidase)가 더 포함되고, 스테비올 생합성 관련 효소에는 KAH (kaurenoic acid hydroxylase)가 더 포함된다.

스테비오사이드 전구체의 생성능을 가지는 재조합 미생물을 제조하기 위하여, 생합성 관련 효소를 확보하기 위한 클로닝을 수행하였다. 먼저 액체질소 하에서 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana Bertoni)의 잎에 있는 수분을 제거하고, 상기 건조물을 막자사발에서 곱게 갈았다. 당업계에 공지된 방법을 이용하여 스테비아 잎의 전체 RNA를 수득하고, 이로부터 cDNA를 합성하였다.

본 발명에서 생합성 유전자 클로닝, 어셈블리 및 단백질 발현을 확인하기 위해 이용된 벡터 맵을 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, T-벡터 (A)는 Promega사의 pGEM®-T Easy Vector System I에서 제공되는 pGEM®-T Easy Vector를 이용하였으며, pUC_mod 벡터 (B)는 일반적인 클로닝 과정에서 이용하였다. 또한, invitrogen사의 pET23 벡터 (C)를 변형한 발현 벡터를 단백질 분리 및 정제를 위한 실험에서 이용하였으며, Takara사의 pSTV29벡터 (D)는 유전자를 어셈블리 (Assembly)하는 용도로 이용하였다.

또한, 각 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머를 하기 표 1 내지 3에 나타내었다 (밑줄로 표시된 부분은 각 유전자와 상보적인 부분을 나타냄).

pUC_mod 벡터로 클로닝 하기 위한 프라이머 염기서열

유전자	프라이머 염기서열	제한효소 자리
GGDPS	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGGCTCTTGTAAATCCCAC - 3’	XbaI
GGDPS	5’-R GGAATTCTCAGTTTTGCCTATAAG - 3’	EcoRI
CDPS	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAAGACCGGCTTCATC - 3’	XbaI
CDPS	5’-R TTCCCTTGCGGCCGCTCATATTACAATCTCGAAC - 3’	NotI
KS	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGAATCTTTCACTATGCATC - 3’	XbaI
KS	5’-R TTCCCTTGCGGCCGCTTACCTTTGTTCTTCATTTTC - 3’	NotI
KO (또는 KO*)	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGGATGCCGTCACCGGTTTG - 3’	XbaI
KO (또는 KO*)	5’-R GGAATTCTCATATCCTGGGCTTTATTATG - 3’	EcoRI
KAH	5’-F GCTCTAGAAGGAGGATTACAAAATGATTCAGGTGCTGACCC - 3’	XbaI
KAH	5’-R GGAATTCTTAGACTTGGTGTGGGTGC - 3’	EcoRI

T 벡터로 클로닝 하기 위한 프라이머 염기서열

유전자	프라이머 염기서열
CDPS	5’-F ATGAAGACCGGCTTCATC - 3’
CDPS	5’-R TCATATTACAATCTCG - 3’
KS	5’-F ATGAATCTTTCACTATG - 3’
KS	5’-R TTACCTTTGTTCTTCAT - 3’

pET 벡터로 클로닝 하기 위한 프라이머 염기서열

유전자	프라이머 염기서열	제한효소 자리
GGDPS	5’-F TCCCCCCGGGGCTCTTGTAAATCCCAC - 3’	XmaI
GGDPS	5’-R GGAATTCTCAGTTTTGCCTATAAG - 3’	EcoRI
CDPS	5’-F TCCCCCCGGGAAGACCGGCTTCATC - 3’	XmaI
CDPS	5’-R TTCCCTTGCGGCCGCTCATATTACAATCTCGAAC - 3’	NotI
KS	5’-F TCCCCCCGGGAATCTTTCACTATGCATC - 3’	XmaI
KS	5’-R TTCCCTTGCGGCCGCTTACCTTTGTTCTTCATTTTC - 3’	NotI

상기 각 벡터에 각 유전자를 클로닝한 구체적인 재조합 벡터의 정보를 하기 표 4에 나타내었다.

플라스미드	특성
pUCM	pUC19으로부터 변형된 앰피실린 내성을 가지고 있으며 지속적으로 발현이 가능한 벡터
pUCM_GGDPS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 GGDPS 발현 벡터
pUCM_CDPS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 CDPS 발현 벡터
pUCM_KS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 KS 발현 벡터
pUCM_KO	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 KO 발현 벡터
pUCM_KO*	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지는 KO* 발현 벡터
pUCM_KAH	스테비아 레바우디아나의 단백질 시퀀스 정보로부터 합성한 KAH 발현 벡터
pGEM®-T Easy	클로닝을 위한 T벡터
pGEM_CDPS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한CDPS가 삽입된 벡터
pGEM_KS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한KS가 삽입된 벡터
pET21	C-terminal에 6개의 His tag을 갖고 있는 단백질 발현용 벡터
pET21_GGDPS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 GGDPS 단백질 발현 벡터
pET21_CDPS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 CDPS 단백질 발현 벡터
pET21_KS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 KS 단백질 발현 벡터
pET23M	N-terminal에 His tag을 갖고 있는 단백질 발현용 벡터
pET23M_GGDPS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 GGDPS 단백질 발현 벡터
pET23M_CDPS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 CDPS 단백질 발현 벡터
pET23M_KS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 KS 단백질 발현 벡터
pSTV29	카우린산 생성 유전자 어셈블리를 위한 클로람페니콜 내성을 가지고 있는 벡터
pSTV29_CDPS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 CDPS가 삽입된 벡터
pSTV29_CDPS_KS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 CDPS, KS가 삽입된 벡터
pSTV29_crtE_CDPS_KS	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 CDPS, KS와 로도박터 스페로이드로부터 유래한 crtE를 가지는 KS가 어셈블리 되어 있는 카우린 생산 벡터
pSTV29_crtE_CDPS_KS_KO	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 CDPS, KS와 로도박터 스페로이드로부터 유래한 crtE 및 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 정상 KO 유전자가 어셈블리 되어있는 카우린산 생산 벡터
pSTV29_crtE_CDPS_KS_KO*	스테비아 레바우디아나로부터 유래한 CDPS, KS와 로도박터 스페로이드로부터 유래한 crtE 및 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지는 KO*가 어셈블리 되어있는 카우린산 생산 벡터

최종적으로 확보한 클론에 대하여 NCBI의 데이터베이스와 비교하여 염기서열 및 아미노산 서열을 비교하였다.

실시예 2. In vitro functional assay

2-1. CDPS (Copalyl diphosphate synthase) 활성 확인

CDPS 유전자를 삽입한 pET23M_CDPS 재조합 벡터를 이용하여 공지된 전기천공법 (electroporation)에 따라 형질 전환된 재조합 대장균을 제조하였다. 이를 50ml LB 배지에서 37℃에서 OD600nm에서 0.6이 될 때까지 배양한 후에 0.1 mM의 IPTG로 발현을 유도한 후, 30℃에서 3시간 동안 추가로 배양하였다. 배양액 내의 재조합 대장균을 원심분리를 통해 모으고, 모아진 세포 펠렛에 GGDP 어세이 완충액 (50mM potassium phosphate pH 8, 10% glycerol, 2mM DTT, 5mM MgCl₂)과 라이소자임 (lysozyme, 100 mg/ml)을 섞어주었다. 이를 37℃에서 15분 간 배양한 뒤에 얼음에서 20초 간 3회 초음파 처리하였다. 이를 12000g에서 원심분리 한 후, 상등액을 제거하였다. 상기 과정을 통해 수득한 CDPS 단백질을 His-tag 정제를 통해 확인하였다. 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, IPTG로 발현 유도 후 시간대 별로 CDPS의 분자량에 해당하는 약 90kDa 근처에서 밴드를 확인하였으며, 재조합 대장균 내에서 발현된 CDPS가 높은 순도로 분리 및 정제되었음을 SDS-PAGE상에서 확인하였다.

다음으로, 상기 과정을 통해 수득한 CDPS가 정상적으로 발현되어 GGDP에서 CDP로의 전환이 정상적으로 이루어지는지를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저 상기 과정을 통해 수득한 CDPS 유전자가 발현된 재조합 대장균의 단백질 추출물 500㎍과 250㎕의 GGDP 어세이 완충액에 녹인 GGDP (Sigma, St Louis, Missouri, USA) 10㎍을 섞어 30℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 가스 크로마토그래피-질량분석기 (gas chromatography-mass spectrometry, GC/MS)를 이용하여 생성 단백질을 확인하였다. 이때, GGDP에서 CDP로의 전환이 이루어지면, 말단에 인산기가 붙어서 copalyl diphosphate 구조를 형성하게 되는데, 상기 물질은 GC/MS를 통한 분석이 불가능하므로, CIP (Calf-intestinal alkaline phosphatase) 처리를 통해 인산기를 제거하고 분석하였다. 대조군으로 유전자를 발현시키지 않은 공벡터를 삽입한 재조합 대장균의 단백질 추출물을 이용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 질량값 290 m/z에서 하나의 분리된 피크를 확인하였으며, 조각화된 매스 패턴 결과와 GC/MS 라이브러리를 비교한 결과, 상기 물질이 copalol 구조인 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 재조합 대장균 내에서 CDPS가 정상적으로 발현되어 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

2-2. KS (Kaurene synthase) 활성 확인

상기 실시예 2-1에서의 CDPS 유전자를 삽입한 pET23M_CDPS 재조합 벡터 대신 KS 유전자를 삽입한 pET23M_KS 재조합 벡터를 이용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 상기 과정을 통해 수득한 KS 단백질을 His-tag 정제를 통해 확인하였다. 이를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, IPTG로 발현 유도 후 시간대 별로 KS의 분자량에 해당하는 약 89kDa 근처에서 밴드를 확인하였으며, 재조합 대장균 내에서 발현된 KS가 높은 순도로 분리 및 정제되었음을 SDS-PAGE상에서 확인하였다.

다음으로, 상기 과정을 통해 수득한 정상적으로 발현되어 CDP에서 카우린으로의 전환이 정상적으로 이루어지는지를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저 상기 과정을 통해 수득한 KS 유전자가 발현된 재조합 대장균의 단백질 추출물 250㎍, 상기 실시예 2-1에서 수득한 CDPS 유전자가 발현된 재조합 대장균의 단백질 추출물 250㎍ 및 10㎍의 GGDP를 섞어 30℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 가스 크로마토그래피-질량분석기 (gas chromatography-mass spectrometry, GC/MS)를 통해 생성 단백질을 확인하였다. 대조군으로 유전자를 발현시키지 않은 공벡터를 삽입한 재조합 대장균의 단백질 추출물을 이용하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, GC/MS를 통해 중간 산물인 copalol과 최종 산물인 카우린이 구분되어 확인되었다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 질량값 272 m/z에서 하나의 분리된 피크가 확인되었으며, 조각화된 매스 패턴 결과와 GC/MS 라이브러리를 비교한 결과, 상기 물질이 카우린임을 다시 한번 확인하였다.

마지막으로, 최종 단백질 추출물을 SDS-PAGE를 통해 추출과 정제가 제대로 이루어졌는지 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, CDPS 및 KS 단백질이 추출 및 정제가 제대로 이루어졌음을 확인하였다. 이후 실험은 상기 과정을 통해 확인된 CDPS 및 KS 단백질 추출물을 이용하여 수행하였다.

이상의 실험 결과를 통해, in vitro assay에서 CDPS가 GGDP를 기질로 하여 CDP(copalyl diphosphate)를 만들고, KS가 이를 기질로 하여 카우린을 생성하는 것을 확인하였다. 따라서 이후 실험은 기질을 첨가하여 카우린을 생산하는 방법이 아닌, 대장균 내에서 GGDPS와 KS를 발현하여 직접 카우린을 생성해내는 시스템을 제작하고자 하였다.

실시예 3. GGDPS (crt E) 스크리닝

카우린 생성능이 우수한 재조합 미생물을 제조하기 위하여, GGDPS (crtE) 스크리닝을 수행하였다. 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana Bertoni)의 GGDPS (crtE)를 대조군으로 하고, 다른 균주로부터 유래한 GGDPS(crt E)와 같은 기능을 하는 유전자를 확보하였다. Rhodopirellula Baltica SH1, Pantoea agglomerans, Corynebacterium glutamicum Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Brevibacterium linens 등 총 여섯 가지 균주에서 유래한 GGDPS (crtE)와 같은 기능을 하는 유전자를 이용하여 최종 카우린의 생산량을 비교하였다. 카우린의 경우 표준이 존재하지 않아 정확한 정량 분석이 어렵기 때문에 상대적인 정량 비교 실험을 위해 총 세 번의 실험을 수행하였으며, 단위 셀 당 생산되는 카우린의 양을 상대적인 정량값으로 비교하였다.

보다 구체적으로, 유전자 어셈블리 (Gene assembly)한 pSTV29_CDPS_KS에 6종류의 pUCM_crtE를 발현하여 형질 전환 세포를 확보하였다. 형질 전환 세포에서 최종 생성된 카우린를 분리하기 위하여, 하기와 같은 세 가지 방법을 이용하였다.

a) 전체 배양된 세포 (0.2 g-wet cell weight, g-wcw)를 클로로포름:MeOH = 2:1 용액으로 추출한 뒤에, 같은 용액으로 최종 용출 (elution)하였다.

b) 전체 배양된 세포 (0.2 g-wcw)를 헥산 용액으로 추출한 뒤에, 같은 용액으로 최종 용출하였다.

c) 전체 배양된 세포 (0.2 g-wcw)를 클로로포름:MeOH = 2:1 용액으로 추출한 군과 헥산 용액으로 추출한 군을 모두 건조한 뒤에, 메톡시아민하이드로클로라이드 (metoxyaminhydrochloride) 40㎕을 넣고 37℃에서 2시간 동안 진탕 배양하였다. 그 뒤 MSTFA을 넣고 37℃에서 30분 동안 진탕 배양하여 최종 샘플을 확보하였다.

a)와 b)의 방법을 통해 수득한 물질은 피크의 풍도(abundance)가 굉장히 높고 다른 피크가 많았으며, c)의 방법을 통해 수득한 물질이 비교적 안정적인 패턴의 결과를 나타내었다. 따라서 c)의 방법을 통해 수득한 물질을 GC/MS를 통해 분석하였다. 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.

도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 스테비아로부터 유래한 GGDPS를 이용한 경우, 카우린을 정성적으로 확인할 수 없었다. 또한, GGDPS의 종류에 따른 카우린의 생성량을 정량적으로 비교해본 결과, 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 GGDPS(crtE)를 이용할 경우 단위 세포 당 가장 많은 카우린이 생성됨을 확인하였다. 따라서 이후 실험은 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 GGDPS(crtE)를 어셈블리 하여 이용하였다.

실시예 4. CDPS, KS 및 GGDPS (crtE)를 포함하는 카우린 제조용 재조합 벡터의 제작

상기 실시예 3의 결과를 토대로, 재조합 대장균 내에서 다량의 카우린을 생성하기 위하여, CDPS, KS 및 GGDPS (crtE)를 하나의 플라스미드에서 발현할 수 있도록 조립하여, 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 재조합 벡터의 벡터 맵을 도11에 나타내었다.

상기 재조합 벡터로 형질 전환된 재조합 균주 내에서 카우린의 생성이 이루어지는 것을 확인하였으며, 이를 통해 기존의 스테비아 유래의 GGDPS 유전자가 아닌 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 GGDPS를 이용하여 재조합 미생물 내에서 다량의 카우린을 효과적으로 생산할 수 있는 시스템을 구축하였다.

실시예 5. 발효조 배양을 통한 카우린 생산 재조합 균주의 생산성 증대 검증

상기 실시예 4에서 제조한 재조합 벡터로 형질 전환된 재조합 미생물 (대장균) 내에서 카우린의 생산성 증대를 위해 발효조 (fermentor) 배양을 실시하였다. 보다 구체적으로는, 탄소원 (carbon source)으로 글리세롤을 포함하는 1L의 LGN (yast extract 5g, tryptone 10g, NaCl 5g, sodium nitrate 10g, glycerol 5g)을 이용하였으며, 질소 가스를 지속적으로 공급하여 혐기성 배양을 실시하여 카우린을 생산할 수 있는지를 확인하였다. 플라스크 조건에서의 비교 실험을 위해 120ml의 병에 100ml의 글리세롤을 포함하는 1L의 LGN (yast extract 5g, tryptone 10g, NaCl 5g, sodium nitrate 10g, glycerol 5g)을 넣고 산소가 공급되지 않도록 밀봉하여 혐기성 배양을 실시하였다. 최종적으로 같은 단위 셀 당 생산되는 카우린의 양을 비교하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 동일한 혐기성 배양 조건에서 같은 양의 재조합 균주가 생성한 카우린을 추출하여 분석한 결과, 플라스크 배양보다 발효조 배양을 실시하였을 때, 더 많은 양의 카우린을 생산할 수 있음을 확인하였다.

실시예 6. 카우린산의 생성을 위한 KO (정상 KO 또는 돌연변이 KO*) 스크리닝

종래의 pSTV29의 벡터에 상기 실시예 4에서 우수한 카우린 생성능을 가지는 것을 확인한 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 GGDPS (crtE), 스테비아 유래의 CDPS 및 KS 유전자를 어셈블리하여 카우린 제조용 재조합 벡터 (pSTV29_crtE_CDPS_KS)를 제작하였다 (도 11 참조). 상기 재조합 벡터(pSTV29_crtE_CDPS_KS)와 함께 스테비아로부터 유래한 정상 KO 유전자 및 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지는 KO* 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 (pUCM-KO 또는 pUCM-KO*)를 이용하여 공지된 전기천공법 (electroporation)에 따라 형질 전환된 재조합 대장균을 제조하였다. 상기 재조합 대장균이 최종적으로 생산하는 카우린산의 생성량을 확인하였다. 카우린산의 경우 표준이 존재하지 않아 정확한 정량 분석이 어렵기 때문에 상대적인 정량 비교 실험을 위해 총 세 번의 실험을 수행하였으며, 단위 세포 당 생산되는 카우린산의 양을 상대적인 정량값으로 비교하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, KO 유전자가 포함되지 않는 벡터로 형질 전환된 대조군에서는 카우린산이 전혀 생성되지 않았으나, KO 유전자 중에서도 정상 유전자가 아닌 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지는 KO* 유전자를 포함한 재조합 벡터로 형질 전환된 군에서는 카우린산의 생성능이 현저하게 증가함을 확인하였다.

상기 카우린산의 생성을 GC/MS를 통해 재확인하기 위하여, 재조합 대장균에 5ml의 클로로포름:MeOH=2:1 용액 및 2ml의 물을 넣고 충분히 섞은 뒤에 인터널스탠다드(IS)로 n-헥사데칸(hexadecane)을 절대량 넣었다. 상기 용액에 열을 가한 후, 초음파 처리하여 추출한 후, 건조한 뒤에 TMSD (Trimethylsilydiazomethane, methylation)를 넣고 70℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 카우린산의 생성이 확인되었다.

실시예 7. CDPS, KS, GGDPS (crt E) 및 돌연변이 KO*를 포함하는 카우린산 제조용 재조합 벡터의 제작

상기 실시예 6의 실험 결과를 토대로, 재조합 대장균 내에서 다량의 카우린산을 생성하기 위하여, CDPS, KS, 로도박터 스페로이드 유래의 GGDPS (crtE) 및 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지는 KO*를 하나의 플라즈미드에서 발현할 수 있도록 조립하여, 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 재조합 벡터의 벡터 맵을 도 15에 나타내었다.

상기 재조합 벡터로 형질 전환된 재조합 균주 내에서 카우린산의 생성이 이루어지는 것을 확인하였으며, 이를 통해 기존의 스테비아 유래의 정상 KO 유전자가 아닌 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지는 KO* 유전자를 이용하여 재조합 미생물 내에서 다량의 카우린산을 효과적으로 생산할 수 있는 시스템을 구축하였다.

실시예 8. 스테비올 생산능을 가지는 재조합 미생물의 제작

상기 실시예 7에서 제조한 카우린산 생성 모듈을 포함하는 재조합 벡터 (도 15 참조)와 스테비아 유래의 KAH를 발현시키는 재조합 발현 벡터 (pUCM_KAH)를 함께 이용하여, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 재조합 대장균을 제조하였다. 상기 재조합 대장균을 100ml의 LB (yast extract 5g, tryptone 10g, NaCl 5g) 배지를 이용하여, 30℃에서 16시간 내지 24시간 동안 배양하여 배양액을 확보하였다. 상기 재조합 대장균으로부터 생성된 스테비올의 분리 및 정성 분석을 위하여, 재조합 대장균의 배양액을 클로로포름:MeOH=2:1의 용액으로 추출하고 건조한 후, TMSD (Trimethylsilydiazomethane, methylation) 50㎕을 넣고 70℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, KAH 유전자가 포함되지 않는 재조합 벡터로 형질 전환된 대조군에서는 스테비올이 전혀 생성되지 않았으나, 정상 KO 유전자를 포함한 재조합 벡터로 형질 전환된 군(푸른색)에서는 스테비올이 미량으로 생성됨을 확인하였으며, 세 개의 돌연변이(L28Q, N284H, F446V)를 가지는 KO* 유전자를 포함한 재조합 벡터로 형질 전환된 군(붉은색)에서는 현저하게 많은 양의 스테비올이 생성됨을 확인하였다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Recombinant microorganism with kaurene, kauronic acid, or steviol production ability and method for preparing kaurene, kauronic acid, or steviol using the same <130> 15 <150> KR 10-2012-0040906 <151> 2012-04-19 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 867 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides <400> 1 atggcgtttg aacagcggat tgaagcggca atggcagcgg cgatcgcgcg gggccagggc 60 tccgaggcgc cctcgaagct ggcgacggcg ctcgactatg cggtgacgcc cggcggcgcg 120 cgcatccggc ccacgcttct gctcagcgtg gccacggcct gcggcgacga ccgcccggct 180 ctgtcggacg cggcggcggt ggcgcttgag ctgatccatt gcgcgagcct cgtgcatgac 240 gatctgccct gcttcgacga tgccgagatc cggcgcggca agcccacggt gcatcgcgcc 300 tattccgagc cgctggcgat cctcaccggc gacagcctga tcgtgatggg cttcgaggtg 360 ctggcccgcg ccgcggccga ccagccgcag cgggcgctgc agctggtgac ggcgctggcg 420 gtgcggacgg ggatgccgat gggcatctgc gcggggcagg gctgggagag cgagagccag 480 atcaatctct cggcctatca tcgggccaag accggcgcgc tcttcatcgc cgcgacccag 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Claims

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(1) 서열번호 1로 표시되는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)로부터 유래된 GGDPS (geranylgeranyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자; 서열번호 2로 표시되는 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana)로부터 유래된 CDPS (copalyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자; 서열번호 3으로 표시되는 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana)로부터 유래된 KS (kaurene synthase)를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 5로 표시되는 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana)로부터 유래된 KO (kaurene oxidase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 및
(2) 서열번호 6으로 표시되는 스테비아 레바우디아나 (Stevia rebaudiana)로부터 유래된 KAH (kaurenoic acid hydroxylase)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터;를 포함하는, 스테비오사이드의 전구체인 스테비올 제조용 재조합 벡터로서,
상기 K0를 코딩하는 유전자는 L28Q, N284H 및 F446V의 돌연변이를 가지고 있는 것을 특징으로 하는, 스테비오사이드의 전구체인 스테비올 제조용 재조합 벡터.
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제 19항의 재조합 벡터로 형질 전환된, 스테비오사이드의 전구체인 스테비올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
제 26항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 박테리아, 효모 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 스테비올 생성능을 가지는 재조합 미생물.
(a) 제 26항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계에서 수득한 미생물 배양액으로부터 스테비올을 회수하는 단계;를 포함하는, 스테비오사이드의 전구체인 스테비올의 제조 방법.