KR101526308B1

KR101526308B1 - 생체 내 이식 적용 및 중장기 생체소재 분해 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101526308B1
Application number: KR1020130007605A
Authority: KR
Inventors: 권두연; 태국철; 김문석
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2013-01-23
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2015-06-09
Also published as: KR20140094932A

Abstract

본 발명은 생체 내 생체소재의 이식 중장기 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조영제가 화학적 결합된 생체소재는 기존의 단분자 조영제가 단순 함유된 생체소재가 생체 이식된 후 단시간 내에 단분자 조영제가 체내 방출되기 때문에 중장기 영상화 추적이 어려웠던 점을 해결할 수 있는 기술개발로서, 고분자의 말단이나 곁사슬 작용기에 형광물질 또는 나노입자를 화학적 결합을 통해 도입한 생체소재를 제조하여 약물전달체, 스캐폴드 또는 기타 생체 이식물로의 생체 중장기 영상화가 가능한 효과가 있다.

Description

생체 내 이식 적용 및 중장기 생체소재 분해 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재 및 이의 제조방법{Biomaterials containing contrast agent for tracing polymer in vivo and method for preparing the same}

본 발명은 생체 내 이식 적용 및 중장기 생체소재 분해 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

조직공학 또는 약물전달 등의 다양한 생체적용에 이용되는 고분자 재료는 주로 생체 내에서 분해가 가능하며 생체적합성을 가지는 물질로서 많은 응용이 이루어지고 있다. 질병의 치료를 위해 이러한 생체 재료로 제조한 약물전달체, 스캐폴드 또는 기타 생체 이식물을 생체 내에 이식 시, 이식된 고분자 물질의 형태학적 및 기능적인 변화를 관찰하기 위해서는 이식된 물질을 검출할 수 있는 조영법이 필수적이다. 기존에 이용되고 있는 대표적인 조영기술에는 MRI, CT, 초음파 조영, 형광조영 등이 있으며 각각의 다양한 기능성 조영제들이 개발되고 있다.

대표적으로 형광조영법의 경우는 특정파장의 광에 여기되어 형광을 방출하는 물질을 조영제로 사용하며 생체 내에 이식 후 생체를 외부의 여기 광에 노출시켜 형광조영제로부터 방출되는 형광을 검출하는 조영법이다. 이러한 형광조영법은 다른 조영법들에 비해 대형 장비가 필요 없어 조작이 간편하고 적은 시간이 소요되는 장점을 가지고 있다.

최근에는 고분자에 기초한 바이오 이미징 기술이 혈액 내 반감기의 증가와 낮은 독성, 표적 지향성 등의 장점을 가지고 있어 이미징 분야에서 각광을 받고 있으며 다양한 합성고분자 및 천연고분자들이 이에 이용되고 있다.

그러나 고분자 마이셀이나 나노입자 등을 이용한 표적지향성 약물전달체 또는 조영제의 개발은 제조과정 및 대량생산의 어려움을 가지고 있다. 또한, 아래 그림에 나타난 바와 같이 단분자 영상제의 경우 단기간에 생체 외로 방출(플루오레세인 주사 제형이 체내 이식 후 3일 이내에 영상이 사라짐)되기 때문에 중장기적 분해 및 조직화를 관찰하기 힘들다는 점이 있다.

이로 인해 직접적으로 형광 또는 금속입자가 도입된 고분자 재료의 제조와 그를 이용하여 이미징 가능한 약물전달체, 스캐폴드 또는 기타 생체 이식물로의 응용기술이 요구되며, 특히 화학적 방법을 통한 다양한 유기, 무기 발광물질을 도입한 고분자는 생체소재의 체내 적용 및 분해도의 중장기적 영상화에 이용될 수 있는 무한한 가능성을 가지고 있다.

따라서 생체소재의 체내 적용 영상화 문제 및 생체 내 이식된 고분자 물질의 중장기적 추적이 가능하며, 제조과정과 대량생산이 용이한 조영제를 함유한 생체소재의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 생체 내에 이식된 고분자 물질의 추적 및 약물전달체, 스캐폴드 또는 기타 생체 이식물의 영상화 문제점을 해결하기 위한 연구를 계속하던 중, 락타이드, 글리콜라이드, 카프로락톤을 단량체로 한 폴리에스터 공중합체를 합성하고, 고분자의 말단이나 곁사슬 작용기에 형광물질 또는 나노입자를 도입하여 고분자 조영제를 제조할 경우, 고분자 물질의 추적 및 약물전달체, 스캐폴드 또는 기타 생체 이식물로의 영상화가 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 생체 내 이식 적용 및 중장기 생체소재 분해 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 락타이드, 글리콜라이드, 카프로락톤을 단량체로 한 폴리에스터 공중합체의 말단이나 곁사슬 작용기에 형광물질 또는 나노입자가 화학적으로 결합된 고분자 조영제 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 고분자 조영제는 기존의 단분자 영상제를 단순 함유한 생분해성 약물전달체, 스캐폴드 또는 기타 생체 이식물로부터 쉽게 방출되기 때문에 중, 장기 영상화가 어려웠던 점을 해결할 수 있으므로, 기존의 단분자 조영제에 비해 장기적으로 추적이 가능한 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 의해 제조된 공중합체의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다 [(1)락타이드(LA) : 카프로락톤(CL) = 50 : 50이고 분자량이 500,000 g/mole인 PCLA 공중합체; (2)락타이드(LA) : 글리콜라이드(GA) : 카프로락톤(CL) = 40 : 40 : 10 이고 분자량이 200,000 g/mole인 PLGC 공중합체; (3)말단에 FITC가 도입된 PCLA-FITC; (4)금나노입자 도입을 위하여 말단에 황화물을 도입한 PCL-S].
도 2는 염추출법으로 제조된 PCLA-FITC, PCLA-RhodamineB-ITC 스캐폴드(생체이식물)의 사진을 나타낸 도이다.
도 3은 자유형상제작기술로 제조된 PCLA, PCLA-FITC 스캐폴드(생체이식물)의 사진을 나타낸 도이다.
도 4는 염추출법으로 제작된 PCLA-Rhodamine 스캐폴드(생체이식물)의 생체 내 이식과정 및 이식 후 시간에 따른 형광이미지의 변화를 관찰한 사진을 나타낸 도이다.
도 5는 분자량 및 단량체 조성이 다른 스캐폴드(생체이식물)의 생체내에서 시간에 따른 GPC 변화 그래프를 나타낸 도이다.
도 6은 생체내에서 스캐폴드(생체이식물)가 분해됨에 따른 고분자의 분자량의 변화와 형광강도의 감소, 생체조직화의 관계를 나타낸 그래프를 나타낸 도이다.
도 7는 자유형상제작기술로 제작된 PCLA-FITC 스캐폴드(생체이식물)의 생체내 이식 후 시간에 따른 형광이미지의 변화를 관찰한 사진을 나타낸 도이다.
도 8은 자유형상제작기술로 제작된 PLGC-FITC 스캐폴드(생체이식물)의 생체내 이식 후 시간에 따른 형광이미지의 변화를 관찰한 사진을 나타낸 도이다.
도 9은 자유형상제작기술로 제작된 PCLA-Rhodamine 스캐폴드(생체이식물)의 생체내 이식 후 시간에 따른 형광이미지의 변화를 관찰한 사진을 나타낸 도이다.
도 10은 MPEG-PCL 하이드로젤(생체이식물)의 생체 내 주입 후 시간에 따른 형광이미지를 관찰한 사진을 나타낸 도이다.
도 11은 금나노입자가 도입된 MPEG-PCL-S의 ICP 측정 그래프를 나타낸 도이다.

본 발명은 폴리알킬렌글리콜을 개시제로 하여 락타이드, 글리콜라이드 및 카프로락톤을 함유하는 폴리에스터가 중합된 폴리알킬렌글리콜/폴리에스터 공중합체의 말단 또는 측쇄에 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재를 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 조영제가 결합된 생체소재는 폴리알킬렌글리콜을 개시제로 하여 락타이드, 글리콜라이드 및 카프로락톤을 함유하는 폴리에스터가 중합된 폴리알킬렌글리콜/폴리에스터 공중합체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 폴리에스터 공중합체는 생분해성, 생체적합성을 가지는 고분자 재료로서 약물전달체, 스캐폴드 또는 기타 생체 이식물 재료로 많이 사용되고 있으며, 단량체의 비율이나 분자량 조절을 통해 분해기간을 조절할 수 있고, 락타이드와 카프로락톤의 조성을 적절히 조절하여 중합시킴으로써 폴리락타이드의 뛰어난 기계적 물성과 폴리카프로락톤의 유연성이 상호 보완되어 생분해성이며, 탄성 및 유연성이 우수하고, 기계적 강도가 뛰어난 고분자를 제조할 수 있으며 다양한 작용기를 도입할 수 있다. 상기 카프로락톤은 생분해성이면서 여러 고분자와 상용성을 가지며 쉽게 결정화하는 특징이 있으나, 높은 결정성은 생체 적용 시 조직과의 적합성을 감소시키고 장기간의 분해 거동을 나타내는 단점이 있어, 본 발명에서는 카프로락톤에 생분해성 에스터계열의 락타이드를 첨가하여 카프로락톤 세그먼트와 락타이드 세그먼트가 불규칙적으로 존재하며 이루어진 생분해성 폴리에스터계 소수성부를 갖도록 하여 결정성을 낮추고, 생분해 기간을 조절한다.

상기 폴리알킬렌글리콜/폴리에스터 공중합체의 말단에 형광염료가 결합될 수 있는데, 형광염료를 사용함으로써 형광조영이 가능하다.

상기 형광염료는 플루오레세인 이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate), 로다민 B 이소티오시안산염(Rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine isothiocyanate), 테트라메틸로다민-5-이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate), 텍사스레드(Texas red), 아미노메틸쿠마린(Aminomethylcoumarin), 사이아닌(Cyanine) 및 메가스톡스(Megastokes)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 조영제는 금나노입자, 양자점 입자, 산화철, 알루미늄, 실리콘, 바륨, 이트륨, 가돌리늄, 망간 및 희토류 원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.

상기 폴리알킬렌글리콜은 120~5000 g/mole의 분자량을 갖는 것이 바람직하다.

또한, 상기 락타이드, 글리콜라이드 및 카프로락톤 세그먼트를 함유하는 폴리에스터는 2,000~1,000,000 g/mole의 분자량을 갖는 것이 바람직한데, 분자량이 10,000 g/mole 미만인 경우에는 재료의 기계적 강도가 낮으나 친수성기의 조절을 통한 하이드로젤로의 이용이 가능하고, 고분자량의 경우에는 높은 기계적 물성을 가지는 스캐폴드(생체이식물) 형태로의 제조가 용이하다.

상기 폴리에스터의 락타이드, 글리콜라이드 및 카프로락톤의 몰 비율은 1:1:98 ~ 48:48:4 인 것이 바람직하다.

상기 폴리알킬렌글리콜/폴리에스터 공중합체에 금 나노입자를 추가로 중합시킬 수 있는데, 하기 반응식 1과 같이 폴리알킬렌글리콜/폴리에스터 공중합체에 금나노입자를 형성시킬 수 있는 작용기를 도입하여 마이셀 상에서 제조한다. 금나노입자를 도입할 경우 CT와 같은 촬영장비를 이용했을 때 스캐폴드(생체이식물)의 조영이 더욱 용이하다.

[반응식 1]

상기 폴리알킬렌글리콜/폴리에스터 공중합체의 폴리에스터 부분은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, x,y,z는 각각 0 ~ 1이며, x+y+z=1 이다.

또한, 본 발명은

(a) 폴리에틸렌글리콜을 공비 증류를 수행 후 냉각하는 단계; 및

(b) 상기 (a)단계에서 냉각된 폴리에틸렌글리콜과 락타이드, 글리콜라이드 및 카프로락톤을 아주석옥토산염 (Sn(OCT)₂, stannous octoate) 촉매 하에 반응 용매에서 반응시켜 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 공중합체를 제조하는 단계;를 포함하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명에 따른 고분자 조영제의 제조방법은, 상기 (b)단계 이후에,

(c) 상기 (b)단계에서 합성된 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 공중합체를 공비 증류를 수행 후 냉각하는 단계; 및

(d) 상기 (c)단계에서 냉각된 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 공중합체와 형광염료를 아주석옥토산염 (Sn(OCT)₂, stannous octoate) 촉매 하에 반응 용매에서 반응시켜 말단에 형광물질이 도입된 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 공중합체를 제조하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

상기 (a)단계는 폴리에틸렌글리콜을 공비 증류 후 냉각하는 단계이며, 상기 (c)단계는 제조된 폴리에틸렌글리콜/폴레에스터 공중합체를 공비 증류 후 냉각하는 단계로서, 상기 냉각은 20~30℃에서 수행하는 것이 바람직하다.

상기 (b)단계는 하기 반응식 2로 나타낼 수 있으며, 상기 (d)단계는 하기 반응식 3으로 나타낼 수 있다. 상기 (b)단계 및 (d)단계의 반응은, 반응온도 110~160℃, 반응시간 20~28시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

[반응식 2]

[반응식 3]

상기 (b)단계 및 (d)단계에서의 반응 용매는 톨루엔인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 고분자 조영제의 제조방법의 상기 (a) 내지 (d)단계를 모두 포함하는 대표적인 반응식은 하기 반응식 4에 나타내었다.

[반응식 4]

상기한 제조방법에 의해 제조된 폴리알킬렌글리콜/폴리에스터 공중합체는 생체 내 이식된 후 특정 파장에 의해 형광을 발현함으로써, 생체 내에서의 고분자 물질의 추적 및 생분해 거동을 통한 생체 조직화를 평가할 수 있는 효과가 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 분자량이 500,000 g/ mole 인 메톡시폴리에틸렌글리콜 -( 폴리락타이 드- co - 폴리카프로락톤 ) 공중합체의 제조 [ MPEG -( PLLA - co - PCL )] ( 락타이드 : 카프로락톤 = 50 : 50)

분자량 500,000 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-(폴리락타이드(PLLA)-co-폴리카프로락톤(PCL)) 블록 공중합체를 제조하기 위하여, 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(0.012 g, 0.016 mmol)과 톨루엔 80 ml를 잘 건조된 100 ml 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간 동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 50 ml 제거하고 25 ℃로 냉각시킨 후 미리 정제된 카프로락톤(CL)(3.54 g, 31 mmol)과 락타이드(LA)(4.4627g, 31 mmol)를 넣고, 중합 촉매로서 Sn(Oct)₂를 0.2 ml 넣고 24 시간 동안 130 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여, 1,600 ml의 헥산과 400 ml의 에테르에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켜 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리락타이드-co-폴리카프로락톤) 공중합체를 얻었다.

상기에서 제조된 공중합체의 구성성분의 몰 비에 대한 분자량은 ¹H-NMR을 이용하여 측정하였으며, 다분산도는 젤 투과 크로마토그래피(GPC)를 이용하여 측정하였다. 상기 제조된 공중합체의 ¹H-NMR 스펙트럼은 도 1-(1)에 나타내었다.

도 1-(1)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리락타이드-co-폴리카프로락톤) 공중합체는 이론적인 값과 유사한 분자량 450,000 g/mole을 얻을 수 있었고, 1.6의 다분산도를 가짐을 확인하였다.

< 실시예 2>　분자량이 200,000 g/ mole 인 메톡시폴리에틸렌글리콜 -( 폴리락타 이드- co - 폴리글리콜라이드 - co - 폴리카프로락톤 ) 블록 공중합체의 제조 [ MPEG -( PLLA -co-PGA-co-PCL)] ( 락타이드 : 글리콜라이드 : 카프로락톤 = 45 : 45 : 10)

분자량 200,000 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-(폴리락타이드(PLLA)-co-폴리글리콜라이드(PGA)-co-폴리카프로락톤(PCL)) 블록 공중합체를 제조하기 위하여, 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(0.03 g, 0.04 mmol)과 톨루엔 80 ml을 잘 건조된 100 ml 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3 시간 동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 70 ml 제거하고 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)을 25 ℃로 냉각시킨 후 미리 정제된 카프로락톤(CL)(1.44 g, 13.0 mmol), 락타이드(LA)(3.6203 g, 25 mmol) 및 글리콜라이드(GA)(2.94 g, 25mmol)를 넣고 반응용매로서 미리 정제된 톨루엔 10 ml을 넣은 다음, 중합 촉매로서 Sn(Oct)₂를 0.48 ml 넣고 24 시간 동안 160 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 1,600 ml의 헥산과 400 ml의 에테르에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켜 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리락타이드-co-폴리글리콜라이드-co-폴리카프로락톤) 블록 공중합체를 얻었다.

상기에서 제조된 공중합체의 구성성분의 몰 비에 대한 분자량은 ¹H-NMR을 이용하여 측정하였으며, 다분산도는 젤 투과 크로마토그래피(GPC)를 이용하여 측정하였다. 상기 제조된 공중합체의 ¹H-NMR 스펙트럼은 도 1-(2)에 나타내었다.

도 1-(2)에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리락타이드-co-폴리글리콜라이드-co-폴리카프로락톤) 블록 공중합체는 이론적인 예상 값과 유사한 분자량 21,000 g/mole을 얻을 수 있었고, 1.7의 다분산도를 가짐을 확인하였다.

< 실시예 3> Fluorescein isothiocyanate ( FITC )가 도입된 분자량이 500,000 g/mole인 메톡시폴리에틸렌글리콜 -( 폴리락타이드 - co - 폴리카프로락톤 )- FITC 공중합체의 제조 [ MPEG -( PLLA - co - PCL )- FITC ]

상기 실시예 1에서 제조된 MPEG-(PLLA-co-PCL) 4 g과 톨루엔 80 ml를 잘 건조된 100 ml 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간 동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 50 ml 제거하고 25 ℃로 냉각시킨 후 FITC 3.8 mg을 넣고, 반응 촉매로서 Sn(Oct)₂를 0.1 ml 넣고 24 시간 동안 130 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 FITC를 제거하기 위하여 1,000 ml의 헥산과 500 ml의 에테르, 500 ml의 메탄올에 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켜 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리락타이드-co-폴리카프로락톤)-FITC 공중합체를 얻었다. 상기 FITC가 도입된 공중합체(MPEG-(PLLA-co-PCL)-FITC)의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도 1-(3)에 나타내었다.

<실시 예 4> Rhodamine -B가 도입된 분자량이 500,000 g/ mole 인 메톡시폴리에 틸렌글리콜-( 폴리락타이드 - co - 폴리글리콜라이드 - co - 폴리카프로락톤 )- Rhodamine -B 공중합체의 제조 [ MPEG -( PLLA - co - PGA - co - PCL )- Rhodamine -B]

상기 실시예 2에서 제조된 MPEG-(PLLA-co-PGA-co-PCL) 4 g과 톨루엔 80 ml를 잘 건조된 100 ml 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간 동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 50 ml 제거하고 25 ℃로 냉각시킨 후 Rhodamine B-isothiocyanate 5.2 mg 을 넣고, 반응 촉매로서 Sn(Oct)₂를 0.1 ml 넣고 24 시간 동안 130 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 Rhodamine-B를 제거하기 위하여 1,000 ml의 헥산과 500 ml의 에테르, 500 ml의 메탄올에 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켜 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리락타이드-co-폴리글리콜라이드-co-폴리카프로락톤)-Rhodamine-B 공중합체[MPEG-(PLLA-co-PGA-co-PCL)-Rhodamine-B]를 얻었다.

<실시예 5> FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 도입된 분자량이 2,400 g/mole인 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤-FITC 공중합체의 제조 [MPEG-PCL-FITC]

분자량 2,4000 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-폴리카프로락톤(PCL) 블록 공중합체를 제조하기 위하여, 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(1 g, 1.3 mmol)과 톨루엔 80 ml를 잘 건조된 100 ml 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 130℃에서 3시간 동안 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 완전히 제거하고 25℃로 냉각시킨 후 미리 정제된 메틸렌클로라이드(MC) 30mL과 카프로락톤(CL)(3.2 g, 28 mmol), 중합 촉매로서 에틸에테르 내 HCl 1.0M 용액을 2.6 ml 넣고 24 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 1,000 ml의 헥산에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켰다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.

상기에서 제조된 MPEG-PCL 1 g과 톨루엔 80 ml를 잘 건조된 100 ml 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 130℃에서 3시간 동안 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 50 ml 제거하고 25 ℃로 냉각시킨 후 FITC 150 mg을 넣고, 반응 촉매로서 Sn(Oct)₂를 0.4 ml 넣고 130℃에서 24 시간 동안 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 FITC를 제거하기 위하여 500 ml의 헥산과 250 ml의 에테르, 250 ml의 메탄올에 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켜 메톡시폴리에틸렌글리콜-폴리카프로락톤-FITC 공중합체를 얻었다.

< 실시예 6> 금나노입자가 도입된 분자량이 2,400 g/ mole 인 메톡시폴리에틸렌 글리콜-( 폴리카프로락톤 ) 공중합체의 제조 [ MPEG - PCL -S]- GNP

분자량 2,4000 g/mole의 메톡시폴리에틸렌글리콜(MPEG)-폴리카프로락톤(PCL) 블록 공중합체를 제조하기 위하여, 개시제인 메톡시폴리에틸렌글리콜(1 g, 1.3 mmol)과 톨루엔 80 ml를 잘 건조된 100 ml 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간 동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 완전히 제거하고 25 ℃로 냉각시킨 후 미리 정제된 메틸렌클로라이드(MC) 30mL과 카프로락톤(CL)(3.2 g, 28 mmol), 중합 촉매로서 에틸에테르 내 HCl 1.0M 용액을 2.6 ml 넣고 24 시간 동안 실온에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응 단량체나 개시제를 제거하기 위하여 1,000 ml의 헥산에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.

상기 제조된 고분자 (2 g, 0.83 mmol)를 톨루엔 80 ml를 잘 건조된 100 ml 둥근 플라스크에 넣고 딘 스탁 트랩을 사용하여 3시간 동안 130 ℃에서 공비 증류를 실시하였다. 증류 후 톨루엔을 완전히 제거하고 25 ℃로 냉각시킨 후 정제된 메틸렌클로라이드(MC) 30mL, 티옥트산 (Thioctic acid) (0.52 g, 2.5 mmol) 촉매로서 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) (0.2g, 1.7 mmol) N,N'-디시클로헥실 카르보디이미드(DCC) (0.35 g, 1.7 mmol)을 넣고 24 시간 동안 25 ℃에서 교반시켜 주었다. 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미 반응물을 제거하기 위하여 500 ml의 헥산과 500 ml의 에테르에 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜 주었다. 침전물은 메틸렌클로라이드(MC)에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.

상기 제조된 MPEG-PCL-S 1 g을 증류수 25 mL에 넣고 빛이 차단된 상태에서 24 시간 동안 교반시켰다. 증류수 5 mL에 녹인 HAuCl₄·3H₂O 15 mg을 서서히 떨어뜨린 후 디메틸포름아마이드(DMF)에 0.05 M로 녹인 NaBH₄ 2mL을 적가하여 금나노입자가 도입된 분자량이 2,400 g/mole인 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤) 공중합체를 얻었다. 상기 제조된 황화물이 도입된 공중합체[[MPEG-PCL-S]-GNP]의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도 1-(4)에 나타내었다.

도 1-(4)에 나타난 바와 같이, 상기에서 제조된 황화물이 도입된 공중합체는 ¹H-NMR을 통하여 치환된 말단의 피크를 확인할 수 있었다. 또한, 금나노입자의 도입은 유도결합 플라즈마 분광광도계를 통하여 금나노입자의 존재와 그 함량을 확인하였다.

< 실험예 1> 염추출법을 이용한 PLGC - FITC 와 PLGC - Rhodamine 스캐폴드(생체이 식물) 의 제조

상기 실시예 3 및 4의 고분자를 각각 1g 과 NaCl 4 g을 혼합한 후 메틸렌 클로라이드(MC) 5 mL와 혼합하여 잘 섞어준 후 직경 10 mm, 두께 5 mm인 실리콘 몰드에 채워 넣어 일정 압력을 가하여 스캐폴드(생체이식물)를 제조하였다. 제조된 스캐폴드(생체이식물)의 사진을 도 2에 나타내었다.

< 실험예 2> 자유형상제작기술( SFF )을 이용한 스캐폴드(생체이식물)의 제조

상기 실시예 3 및 4의 고분자를 자유형상 제작기술을 이용하여 스캐폴드(생체이식물)로 제작하였다. 각각의 고분자를 금속 실린지에 넣은 후 150 ℃로 가열하고 고분자가 완전히 녹은 것을 확인한 후 50 kPa 의 압력으로 플로팅 하여 10x10x5 mm 인 스캐폴드(생체이식물)를 제조하였다. 제조된 스캐폴드(생체이식물)의 사진은 도 3에 나타내었다.

< 실험예 3> 형광이미지 및 생분해 거동 측정을 위한 생체 내 스캐폴드 (생체이식물) 이식

상기 실험예 1,2의 제조방법으로 제조된 스캐폴드(생체이식물)를 각각 누드마우스의 등 부위를 절개한 후 피하에 이식하였다. 이후 시간이 흐름에 따라 형광이미지를 촬영하여 스캐폴드(생체이식물)의 분해거동을 관찰하였다. 이의 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 염추출법으로 제작된 PCLA-FITC, PCLA-Rhodamine 스캐폴드(생체이식물)를 생체내 이식 후 시간에 따른 형광이미지의 변화를 관찰하였을 때 스캐폴드(생체이식물)의 분해와 동시에 형광강도의 감소를 확인할 수 있었다.

< 실험예 4> 스캐폴드(생체이식물)의 생체내 생분해 거동 측정

상기 실시예 1에서 제조된 고분자를 상기 실험예 2의 방법으로 스캐폴드(생체이식물)를 제조하여 쥐의 피하에 이식한 후 각 주에 적출하여 GPC 측정을 통하여 분자량의 변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 시간에 따라 분자량이 줄어드는 것을 GPC를 통해 확인하였다.

< 실험예 5> 스캐폴드 (생체이식물) 의 생분해와 생체 조직화의 관계 측정

상기 실험예 3 및 4에서 얻은 형광이미지 및 GPC 그래프를 이용하여 형광강도의 소멸과 분자량 감소의 관계를 확인하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다.

< 실험예 6> 스캐폴드의 생체 내 이식 후 형광이미지 변화 측정

상기 실험예 2의 방법으로 제조된 PCLA-FITC, PLGC-FITC 및 PCLA-Rhodamine 스캐폴드(생체이식물)의 생체 내 이식 후 시간에 따른 형광이미지 변화를 관찰하였다. 그 결과는 도 7 내지 도 9에 나타내었다.

도 7 내지 도 9에 나타난 바와 같이, SFF로 제작된 PCLA-FITC, PCLA-Rhodamine 스캐폴드(생체이식물)는 생체내 이식 후 분해됨과 동시에 형광강도가 감소됨을 관찰할 수 있었다.

또한, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, SFF로 제작된 PLGC-FITC 스캐폴드(생체이식물)는 PCLA 스캐폴드(생체이식물)에 비해 빠른 분해가 진행된다는 것을 형광이미징을 통하여 관찰할 수 있었다.

<실험예 7> MPEG-PCL-FITC 하이드로젤(생체이식물)의 생체 내 이식 후 형광이미지 변화 측정

상기 실시예 5의 방법으로 제조된 고분자 0.125g을 증류수 0.5mL에 넣고 현탁시켜 MPEG-PCL-FITC 하이드로젤(생체이식물)을 제조하였다. 제조된 하이드로젤(생체이식물)을 누드마우스의 피하에 주입한 후 시간에 따른 형광이미지 변화를 관찰하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에서 나타난 바와 같이, 생체 내 주입된 하이드로젤(생체이식물)의 추적 및 분해거동에 대해서도 응용이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 8> 금나노입자가 도입된 공중합체의 ICP 측정

상기 실시예 6의 방법으로 제조된 금나노입자가 도입된 메톡시폴리에틸렌글리콜-(폴리카프로락톤) 공중합체의 ICP를 측정하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 유도결합 플라즈마 분광광도계를 이용하여 제조된 PCL-GNP 를 측정하였을때 MPEG-PCL 공중합체에 금나노입자가 도입되었음을 확인할 수 있었다.

Claims

(a) 폴리에틸렌글리콜을 공비 증류를 수행 후, 냉각하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 냉각된 상기 폴리에틸렌글리콜과 락타이드, 글리콜라이드 및 카프로락톤을 아주석옥토산염 (Sn(OCT)₂, stannous octoate) 촉매 하에 반응 용매에서 반응시켜 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 공중합체를 제조하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 제조된 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 공중합체를 공비 증류를 수행 후, 냉각하는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계에서 냉각된 합성물과 형광염료를 반응 용매에서 반응시켜 말단에 형광물질이 화학적으로 결합된 폴리에틸렌글리콜/폴리에스터 공중합체를 제조하는 단계;를 포함하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 조영제는 금나노입자, 양자점 입자, 산화철, 알루미늄, 실리콘, 바륨, 이트륨, 망간 및 희토류 원소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 120~5000 g/mole의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 락타이드, 글리콜라이드 및 카프로락톤의 몰 비율은 1:1:98 ~ 48:48:4 인 것을 특징으로 하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 조영제에 금나노입자를 추가로 중합시킨 것을 특징으로 하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리에스터 부분은 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, x,y,z는 각각 1이다.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 또는 (c) 단계에서 냉각은 20~30℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계 또는 (d) 단계에서 반응은 반응온도 110~160℃, 반응 시간 20~28시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계 또는 (d) 단계에서 반응 용매는 톨루엔인 것을 특징으로 하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (d)단계에서 형광염료는 플루오레세인 이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate), 로다민 B 이소티오시안산염(Rhodamine B isothiocyanate), 테트라메틸로다민 이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine isothiocyanate), 테트라메틸로다민-5-이소티오시안산염(Tetramethylrhodamine-5-isothiocyanate), 텍사스레드(Texas red), 아미노메틸쿠마린(Aminomethylcoumarin), 사이아닌(Cyanine) 및 메가스톡스(Megastokes)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 생체 내 고분자 물질 추적용 조영제가 화학적 결합된 생체소재의 제조방법.