KR101512566B1 - 연속 혈당 모니터링 센서 - Google Patents

연속 혈당 모니터링 센서 Download PDF

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KR101512566B1
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aminoalkoxysilane
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신재호
허민
강성욱
윤인준
정우영
김민구
이기자
박헌국
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광운대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 체내에서 연속적으로 혈당을 모니터링하는 센서에 대한 것으로, 센서의 감응성 향상을 위한 나노 구조체를 기반으로 하고, 표면에 선택적 투과성을 이용하여 방해 작용이 제거된 막 구조를 포함하며, 생체적합성을 향상시키는 수단에 의하여 생체 삽입이 가능한 전기화학방식의 연속 혈당 모니터링 센서를 제공한다.
상기 막 구조는 아미노알콕시실란및 트리메톡시실란 용액의 졸-겔법으로부터 제조된 글루코오스 산화 효소가 고정된 것으로, 효소 반응에 의해 글루코오스로부터 생성되는 과산화수소(hydrogen peroxide)에 대해 선택성을 갖도록 포어(pore) 사이즈 및 밀도가 조정된 것이다. 또한 일산화질소를 저장 및 전달하는 나노섬유를 표면에 도입하여 그로부터 방출되는 일산화질소에 의해 생체적합성이 현저히 향상된 특성을 나타낸다.
따라서 본 발명의 센서는 체내 삽입형 센서의 생체적합성을 향상시키고, 체내 삽입 시 신뢰성과 재현성이 우수하며 상용화 가능한 형태의 마이크로 혈당 센서로서 개발될 수 있다.

Description

연속 혈당 모니터링 센서 {Continuous glucose monitoring sensors}
본 발명은 체내 삽입형 센서에 관한 것이다. 본 발명의 센서는 방해종에 의한 영향 없이 높은 선택성으로 글루코오스의 농도를 측정할 수 있으며, 체내 삽입 시 신뢰성과 재현성이 우수하고 생체적합성이 향상되어 체내에서의 감응 특성 및 수명 특성이 향상된 특징을 갖는다.
전분 대사와 관련하여 체내에서는 인슐린과 글루카곤이라는 두 가지 호르몬이 분비된다. 인슐린은 췌장에서 분비되는 것으로, 식사 후 혈액 내 글루코오스의 농도(즉, 혈당)가 높아지면 신체는 인슐린을 분비하여 세포 내로 포도당을 유입시키고, 간에서는 포도당을 글리코겐으로 바꾸어 저장함으로써 혈당을 낮춘다. 반면 시간이 지나면서 혈당이 떨어지면 췌장은 인슐린 분비를 감소시키고 대신 글루카곤을 분비하여 간에 저장된 글루코겐을 포도당으로 바꾸어 혈액 내로 흘려보냄으로써 혈당을 높이는 역할을 한다. 그러므로 혈액 내 글루코오스 농도는 이러한 체내 대사에 관련된 질환 즉, 당뇨병, 당뇨병으로 인한 고혈당증, 저혈당증과 관계가 있으며, 글루코오스의 농도를 측정하는 것은 상기 질환들의 예방, 진단 및 치료 차원에서 매우 중요한 수단이 되며, 특히 당뇨환자가 저혈당증을 보이면 쇼크로 인한 사망에 이를 수 있어 연속혈당 모니터링은 당뇨환자에게 매우 중요하다.
혈액 내 글루코오스의 농도를 측정하기 위하여 전기화학적 방법을 도입한 바이오센서는 분석하고자 하는 물질에 대해 특이적 인식 능력을 갖는 생물학적 물질(예를들어, 항체, 효소, RNA, DNA 등) 및 전기화학적으로 측정이 가능한 화합물을 사용하여 분석물의 존재 및 농도에 관한 정보를 얻는 것이다.
효소 반응을 이용하는 바이오센서는 전극 상에 글루코오스 산화 효소인 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase(GOx))를 포함하는 층을 도입하여 하기 식 (1)에서 생성된 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)를 식 (2)와 같은 전극반응에 의하여 생성되는 전자(전류)를 측정하는 센서가 개발되었다(Guilbault, G.; Lubrano, G.; Anal. Chem. Acta 1974, 57, 283-289).
Figure 112013091560751-pat00001
(1)
H 2 O 2 → O 2 + 2H + + 2e - (2)
한편, 체내에서 생성되는 이원자 자유라디칼인 일산화질소(Nitric Oxide, NO)는 혈관확장, 신경전달, 혈관형성, 식균작용, 상처치료, 혈전생성방지, 심근손상방지, 면역반응 등의 다양한 생리학적 공정에서 매우 중요한 역할을 하는 물질로 알려져 있다. 예를 들면, 혈관 표면의 항 혈전적 특성은 주로 혈관 내벽의 내피세포에서 생성된 일산화질소에 기인한다. 내벽에서 생성된 일산화질소는 혈액의 흐름 및 압력을 조절하여 혈소판의 활성화 및 응집을 억제한다. 더욱이 식균세포에서 생성되는 일산화질소는 체내에 침투한 박테리아 등의 미세 유기물질에 대항하여 싸운다. 이러한 특성뿐만 아니라 혈관의 확장과 형성을 촉진시키기 때문에 상처, 특히 화상을 입은 피부의 치료에 효과적이며, 세균이 상처로 침입하는 것을 막아 감염의 위험 또한 줄일 수 있다.
체내 삽입형 센서로 사용되기 위해 가장 큰 문제점이자 요구되는 사항은 생체적합성으로서 체내에 삽입되었을 때 면역 반응을 일으키지 않고 상당 시간 동안 동작될 수 있는 것, 즉 신뢰성 있고 재현성 있는 감응 특성을 나타내는 것이다. 이를 위해서는 체내 면역 물질에 대한 면역성을 감소시키는 것이 요구되는데 이 때 사용될 수 있는 물질이 상기와 같은 일산화질소이다. 체내 삽입된 센서로서 일산화질소를 연속적으로 방출할 수 있다면 염증반응 및 대식세포 활동을 억제할 수 있어 삽입된 센서를 외부의 적으로 인식하지 않을 것이다. 따라서 본 발명에서는 체내 삽입형 센서에 대해 일산화질소를 저장 및 전달할 수 있는 수단을 도입하고자 하였다.
본 발명은 체내 삽입형 센서로서 크레아티닌(creatinine), 요산(uric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 아세트아미노펜(acetaminophen), 우레아(urea), 빌리루빈(bilirubin) 등의 방해종에 의한 영향을 제거하고, 향상된 감응 특성(직선성 즉, 글루코오스 농도에 따라 직선적으로 비례하는 감응 결과 및 감응 속도)을 갖는 센서로서, 체내 삽입되었을 때 면역 반응에 의한 감응 특성 및 수명 특성이 저하되는 현상이 제거되어 생체적합성이 향상된 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 연속적으로 체내 혈당 수치를 모니터링할 수 있는 센서로 개발될 수 있는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 모세관 내부에 위치하는 전극 및 상기 전극으로부터 모세관 한 끝의 외부로 돌출된 나노 구조체의 말단부를 포함하며, 상기 말단부 및 말단부가 돌출된 모세관의 표면에는 글루코오스 산화 효소가 고정된 막 구조가 형성되고, 그 위로 일산화질소를 저장 및 전달하는 나노섬유로 둘러싸인 구조의 센서를 제공한다.
바람직하게, 상기 막 구조는 아미노알콕시실란 및 트리메톡시실란 용액의 졸-겔법으로부터 제조된 것으로, 글루코오스 산화 효소의 효소 반응에 의해 글루코오스로부터 생성되는 과산화수소(hydrogen peroxide)에 대해 선택성을 갖도록 포어(pore) 사이즈 및 밀도가 조정된 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 막 구조는 아미노에틸아미노프로필트리메톡시실란(aminoethylaminopropyltrimethoxysilane(AEAP3)), 메틸아미노프로필트리메톡시실란(methylaminopropyltrimethoxysilane(MAP3)), 아미노헥실아미노프로필트리메톡시실란(aminohexylaminopropyltrimethoxysilane(AHAP3)) 및 아미노에틸아미노메틸페네틸트리메톡시실란(aminoethylaminomethylphenetyltrimethoxysilane(AEMP3))으로 구성되는 그룹에서 선택된 1종 이상의 아미노알콕시실란 및 메틸트리메톡시실란(methyltrimethoxysilane(MTMOS)), 에틸트리메톡시실란(ethyltrimethoxysilane(ETMOS)), 프로필트리메톡시실란(propyltrimethoxysilane(PTMOS)) 및 이소부틸트리메톡시실란(isobutyltrimethoxysilane(BTMOS))으로 구성되는 그룹에서 선택된 1종 이상의 트리메톡시실란을 포함한다.
바람직하게, 상기 막 구조는 졸 상태의 아미노알콕시실란 및 트리메톡시실란 용액을 산 촉매 또는 염기 촉매 하에서 겔화하여 형성된 것이다.
바람직하게, 상기 전극은 백금(platinum), 금(gold), 은(silver), 탄소(carbon), 백금흑(platinum black) 및 금흑(gold black)으로 구성되는 그룹에서 선택되는 1종 이상이다.
바람직하게, 상기 촉매는 HCl, HBr, HI, HNO3, H2SO4, H3PO4, HClO4, 아세트산(acetic acid), 타타르산(tartaric acid) 및 시트르 산(citric acid) 으로 구성되는 그룹에서 선택된 1종 이상의 산 촉매 또는 NaOH, KOH, Ca(OH)2, Ba(OH)2, CsOH, Sr(OH)2, LiOH 및 RbOH 으로 구성되는 그룹에서 선택된 1종 이상의 염기 촉매이다.
바람직하게, 상기 글루코오스 산화 효소는 막 구조에 대하여 0.1 내지 10 g/L의 범위로 포함된다.
바람직하게, 상기 상기 나노섬유는 전극의 말단부에 대하여 아미노알콕시실란 및 전기방사가 가능한 고분자의 혼합물을 전기방사하여 제조되는 것이다.
바람직하게, 상기 아미노알콕시실란은 N-(6-아미노헥실)아미노프로필트라이메톡시실란(N-(6-aminohexyl) aminopropyltrimethoxysilane(AHAP3)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트라이메톡시실란(N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane(AEAP3)), N-(2-아미노에틸)아미노페네틸트라이메톡시실란(N-(2-aminoethyl)aminomethylphenethyltrimethoxysilane(AEMP3)), (3-트라이메톡시실릴프로필)디에틸렌트라이아민((3-trimethoxysilylpropyl)diethylenetriamine(DET3)), 메틸아미노프로필트라이메톡시실란(methylaminopropyltriethoxysilane(MAP3)), N-(아세틸글리실)-3-아미노프로필트라이메톡시실란(N-(acetylglycyl)-3-aminopropyl trimethoxysilane(AGAP3)), N-(3-아크릴록시-2-히드록시프로필)-3-아미노프로필트라이에톡시실란 (N-(3-acryloxy-2-hydroxypropyl)-3-aminopropyltriethoxysilane(AHPAP3)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노이소뷰틸메틸디메톡시실란 (N-(2-aminoethyl)-3-aminoisobutylmethyldimethoxysilane(AEAB3)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디에톡시실란 (N-(2-aminoethyl)-3-aminopropylmethyldiethoxysilane(AEAP3E)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란 (N-(2-aminoethyl)-3-aminopropylmethyl dimethoxysilane(AEAP2)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필실란트라이올 (N-(2-aminoethyl)-3-aminopropylsilanetriol(AEAP3OH)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트라이에톡시실란 (N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltriethoxysilane(AEAP3E)), N-(6-아미노헥실)아미노메틸트라이에톡시실란 N-(6-aminohexyl)aminomethyltriethoxysilane(AEAM3E)), N-(2-아미노에틸)-11-아미노운데실트라이메톡시실란 (N-(2-aminoethyl)-11-aminoundecyl trimethoxysilane(AEAU3)), N-[3-아미노(폴리프로필에녹시)]아미노프로필트라이메톡시실란 (N-[3-amino(polypropylenoxy)]aminopropyltrimethoxysilane(APPAP3)), 3-아미노프로필실란트라이올 (3-aminopropyl silanetriol(AP3OH)), N-(2-N-벤질아미노에틸)-3-아미노프로필트라이메톡시실란히드로클로라이드 (N-(2-N-benzylaminoethyl)-3-aminopropyl trimethoxysilane hydrochloride(BAEAP3Cl)) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
바람직하게, 상기 고분자는 폴리메틸메타아크릴레이트 (Polymethylmethacrylate (PMMA)), 나일론-6,6 (Nylon-6,6 (PA-6,6)), 폴리우레탄 (Polyurethanes(PU)), 폴리벤즈이미다졸 (Polybenzimidazole(PBI)), 폴리카보네이트 (Polycarboate(PC)), 폴리아크릴로나이트릴 (Polyacrylonitrile(PAN)), 폴리비닐 알코올 (Polyvinyl alcohol(PVA)), 폴리락틱에시드 (Polylactic acid(PLA)), 폴리에틸렌-co-비닐 아세테이트 (Polyethylene-co-vinyl acetate(PEVA)), 폴리메타아크릴레이트 (Polymethacrylate(PMA)), 폴리에틸렌 옥사이드 (Polyethylene oxide(PEO)), 폴리아닐린 (Polyaniline(PANI)), 폴리비닐카바졸 (Polyvinylcarbazole), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (Polyethylene terephthalate (PET)), Polyacrylic acid-polypyrenemethanole (PAA-PM), 폴리스티렌 (Polystyrene (PS)), 폴리메틸메타아크릴레이트 (Polymethylmethacrylate(PMMA)), 폴리아마이드 (Polyamide(PA)), 폴리비닐페놀 (Polyvinylphenol(PVP)), 폴리비닐클로라이드 (Polyvinylchloride(PVC)), 셀룰로스 아세테이트 (Cellulose acetate(CA)), 폴리비닐알콜(Polyvinyl alcohol(PVA)), 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide(PAAm)), 폴리락틱-코-글리코실 산(PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), 콜라겐(Collagen), 폴리카프로락톤 (Polycaprolactone(PCL)), 폴리(2-히드록시에틸메타아크릴레이트) (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)(HEMA)), 폴리(비닐리덴플루오라이드) (Poly(vinylidene fluoride)(PVDF)), 폴리에테르이미드(Polyether imide (PEI)), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol (PEG)), 나일론-4,6(Nylon-4,6 (PA-4,6)), 폴리(페로세닐디메틸실란)(Poly(ferrocenyldimethylsilane)(PFDMS)), 폴리(에틸렌-co-비닐알콜)(Poly(ethylene-co-vinyl alcohol)), 폴리비닐피롤리돈(Polyvinyl pyrrolidone(PVP)), 폴리메타-페닐렌이소프탈아마이드(Polymetha-phenyleneisophthalamide) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
바람직하게, 상기 혼합물은 졸-겔 반응으로 망목 구조를 형성한다.
바람직하게, 상기 아미노알콕시실란에는 5 내지 10 기압으로 유지되는 일산화질소 하에 유지됨으로써 일산화질소가 저장되어 있는 것이다.
바람직하게, 상기 나노섬유는 막 구조가 형성된 전극의 말단부 주위로 전기방사되는 것이다.
바람직하게, 상기 모세관의 다른 끝은 밀봉되어 있는 것이다.
바람직하게, 상기 나노섬유의 직경은 10 ~ 2,000 nm의 범위이다.
바람직하게, 상기 모세관은 유리(glass)로부터 제조되는 것이다.
바람직하게, 상기 센서에 대해서는 일정한 전압을 인가하여 과산화수소의 산화환원 반응으로부터 발생하는 전류를 측정함으로써 글루코오스의 농도를 측정한다.
바람직하게, 상기 센서는 기준전극, 작업전극 및 보조전극을 포함하는 3전극계 또는 기준전극과 작업전극을 포함하는 2 전극계를 이용한다.
바람직하게, 상기 센서는 바늘형이다.
바람직하게, 상기 센서는 표면에 도입된 NO-방출 나노섬유에 의해 일산화질소가 지속적으로 방출되어 생체적합성이 향상된다.
본 발명의 체내 삽입형 센서에서는 전극 표면 위에 형성되는 막 구조를 조정함으로써 임상 범위를 포함하여 넓은 영역에 걸쳐 방해종에 의한 영향이 최소화되었거나 그의 영향이 없는 상태에서 글루코오스의 농도를 측정할 수 있다.
또한 상기 센서에서는 일산화질소를 저장 및 방출하는 나노섬유를 표면에 도입하여 센서가 체내에 삽입되었을 때 일정 시간 동안 일산화질소를 연속적으로 방출함으로써 생체적합성이 향상된다. 즉, 면역 반응을 감소시켜 체내에서의 센서의 성능을 향상시키고, 대식세포 활동을 억제하며 염증 반응을 감소시켜 센서를 외부의 적으로 인식하지 않게 한다. 따라서 본 발명의 센서는 신뢰성 및 재현성 있는 혈당 센서로 이용될 수 있으며, 감응 특성 및 수명 특성이 우수한 체내 삽입형 센서이다.
또한 본 발명은 구조가 간단하고 제작이 용이하다는 장점을 갖는다.
도 1은 본 발명의 NO-방출형 혈당센서 구조 및 제작과정을 도시한 것이다.
도 2는 NO-분비 센서 및 일반 센서를 체내 삽입하였을 때 일어나는 현상을 도시한 것이다.
도 3은 전기방사의 과정을 나타내는 개략도이다.
도 4는 주위에 전기방사된 나노섬유로 감겨져 있는 전극 말단부의 주사 전자 현미경 (Scanning electron microscope, SEM) 촬영 사진이다.
도 5는 본 발명의 센서로서 2 전극계를 도시한 것이다.
도 6은 비교예 센서에서의 연속전압 인가상태에서 감응 특성 및 사용 수명 특성 측정 결과이다.
도 7은 실시예 센서에서의 시간에 따른 일산화질소(NO) 방출 특성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 전혈을 이용한 in vitro 연속 혈당 측정 결과이다.
도 9는 실시예 및 비교예 센서에서의 쥐 모델을 이용한 in vivo 연속 혈당 측정 결과이다.
도 10은 도 9의 결과를 Clarke error grid analysis로 나타낸 것이다.
본 발명은 분석하고자 하는 물질을 선택적으로 인식하는 효소를 고정시킨 막 구조를 전극 표면 위에 형성하고, 상기 막 구조의 포어 사이즈 및 막의 두께와 막 내부에 고정되는 효소의 양을 조절함으로써 센서의 감응 특성 및 수명 특성이 향상된 센서를 제공한다. 또한 본 발명은 일산화질소를 저장 및 방출하는 나노섬유를 표면에 도입하여 생체적합성을 향상시킨 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예로서 센서의 개략도 및 NO-방출 나노섬유가 도입된 혈당 센서의 제작과정을 나타낸 것이다. 도면을 보면 텅스텐 및 백금으로 이루어진 전극이 유리 모세관 내부에 위치하고, 모세관의 한 끝으로 백금흑으로 도금된 전극 말단부가 돌출되어 있는 구조이다. 더욱 상세하게 상기 전극의 말단부를 포함하여 그것이 돌출되어 있는 모세관의 표면에 글루코오스 산화 효소가 고정된 막 구조가 형성되고, 그 위로 일산화질소를 저장 및 전달하는 나노섬유로 감겨져 있다. 또한 모세관의 다른 한 끝은 에폭시 밀봉되어 있다.
상기 전극 말단부 표면에 글루코오스 산화 효소가 고정된 막 구조는 아미노알콕시실란 및 트리메톡시실란 용액의 졸-겔법으로부터 제조된 것으로, 상기 글루코오스 산화 효소의 효소 반응에 의해 글루코오스로부터 생성되는 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)에 대해 선택적 투과성을 갖는다.
막(매트릭스) 구조 내부에 글루코오스를 기질로 하는 글루코오스 산화 효소(글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase(GOx))를 고정시키고, 이것이 분석 물질(예를 들어, 혈액 등) 내에 포함된 글루코오스를 산화하여 글루코산(gluconic acid)및 과산화수소(hydrogen peroxide)를 생성시키도록 한다. 다음으로 전류법 측정 메카니즘에서는 상기 생성된 과산화수소를 산화시킬 수 있는 전위인 0.7 V(vs. Ag/AgCl)를 인가하여 전자를 발생시키고, 이때 발생하는 전류를 측정함으로써 분석 물질 내에 포함된 글루코오스의 농도를 측정한다.
이러한 센서의 동작 과정에서 막 구조, 즉 막 구조 내부의 포어(pore) 사이즈 및 막 구조의 밀도(density)를 조정하여 분석 물질 내에 포함된 글루코오스 이외의 물질 즉, 방해종의 영향을 최소화하여 궁극적으로 선택성 측면에서 센서의 성능을 향상시킨다.
본 발명에서는 막 형성 재료를 포함하는 졸(sol) 상태의 용액으로부터 겔(gel) 형성 과정("막 형성 과정" 또는 "겔화 과정" 이라고도 함)을 통해 막 구조를 완성한다("졸-겔법").
본 발명 센서의 제작에 사용되는 막 형성 용액(본 발명에서 "막 형성 용액"은 졸 및 겔 상태를 모두 포함하는 용어로 사용한다)은 막 형성 재료로서 아미노알콕시실란, 트리메톡시실란, 막 형성 과정에서의 반응에 사용되는 촉매, 글루코오스 산화 효소 및 용매를 포함한다. 본 발명은 상기 막 형성 용액의 조성을 조절하여 최종적으로 얻어지는 바람직한 센서의 성능을 달성할 수 있는 막 구조를 형성한다. 여기서 막 구조의 조절 수단이 되는 것은 막 형성 재료 및 촉매이다.
우선 막 형성 재료로서 본 발명은 아미노알콕시실란 및 트리메톡시실란을 사용하며, 바람직하게 아미노알콕시실란으로서 아미노에틸아미노프로필트리메톡시실란(aminoethylaminopropyltrimethoxysilane(AEAP3)), 메틸아미노프로필트리메톡시실란(methylaminopropyltrimethoxysilane(MAP3)), 아미노헥실아미노프로필트리메톡시실란(aminohexylaminopropyltrimethoxysilane(AHAP3)) 및 아미노에틸아미노메틸페네틸트리메톡시실란(aminoethylaminomethylphenetyltrimethoxysilane(AEMP3))으로 구성되는 그룹에서 선택된 1종 이상 및 트리메톡시실란으로서 메틸트리메톡시실란(methyltrimethoxysilane (MTMOS)), 에틸트리메톡시실란(ethyltrimethoxysilane(ETMOS)), 프로필트리메톡시실란(propyltrimethoxysilane(PTMOS)) 및 이소부틸트리메톡시실란(isobutyltrimethoxysilane(BTMOS))으로 구성되는 그룹에서 선택된 1종 이상을 사용한다.
막 구조 형성 용액에서 트리메톡시실란은 졸-겔법에 의한 막 구조의 기본 골격(backbone)을 형성하는 역할을 하고, 아미노알콕시실란은 상기 골격에 바람직한 특성을 부여하는 막 구조의 조절 수단으로서 작용한다. 예로서 막 구조 형성 용액으로 상기 MTMOS, ETMOS, PTMOS, BTMOS만 사용하였을 경우에는 AEMP3와 함께 사용하였을 때에 비해 방해종에 의한 영향이 증가할 수 있고, 반면 AEMP3만을 사용하였을 경우에는 막 구조 형성 시 고분자화(polymerization)가 매우 더디게 일어나고, 따라서 막의 안정성이 현저히 저하되는 문제점이 있다.
상기 아미노알콕시실란 및 트리메톡시실란은 구체적으로 하기 구조를 갖는 것이다:
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상기 아미노알콕시실란의 종류에 따라 그로부터 형성되는 막 구조 내부에서의 포어(pore) 사이즈가 달라진다. 막 구조의 포어 사이즈는 글루코오스가 글루코오스 산화 효소에 의해 산화되어 생성된 과산화수소의 전기화학적 반응에 대한 투과 선택성을 결정한다. 즉, 막 구조의 포어 사이즈를 조정함으로써 과산화수소와 함께 존재하는 각종 방해종의 막 투과성을 낮추고 과산화수소만을 선택적으로 투과시켜 방해종의 영향없이 글루코오스의 농도 측정을 가능하게 하는 것이다. 일 실시예로서, 아미노에틸아미노메틸페네틸트리메톡시실란(aminoethylaminomethylphenetyl trimethoxysilane(AEMP3)) 및 이소부틸트리메톡시실란(isobutyltrimethoxysilane(BTMOS))으로부터 형성된 막은 작은 포어 사이즈로 인하여 과산화수소보다 크기가 큰 방해종은 막을 투과하기가 어렵게 한다.
바람직하게 상기 막 형성 재료는 졸 상태의 막 형성 용액 전체에 대하여 1 내지 30 부피%의 범위로 사용한다. 상기 범위로 사용되었을 때 예상되는 포어 사이즈를 갖는 막 구조가 형성되며 또한 겔화 과정이 용이하게 달성될 수 있기 때문이다.
한편, 졸-겔법에서는 겔화 과정에서 반응에 관여하는 촉매의 종류에 따라 생성되는 막 구조의 밀도가 달라지는데, 염기 촉매의 경우에는 겔 형성 과정에서 아미노알콕시실란과 트리메톡시실란의 축합이 발생하면 양성자 이탈이 가속화되며, 친핵성 공격을 통해 미세구조가 형성되는 반면, 산 촉매의 경우에는 실란올이 양성자 첨가에 의해 축합이 이루어지며 축합된 실란올의 반응성이 저하되므로 염기 촉매에 비해 낮은 밀도의 개방된 구조로, 가지 구조의 연속적 네트워크 구조를 형성한다.
산 촉매로서는 HCl, HBr, HI, HNO3, H2SO4, H3PO4, HClO4, 아세트산(acetic acid), 타타르산(tartaric acid), 시트르 산(citric acid) 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 염기 촉매로서는 NaOH, KOH, Ca(OH)2, Ba(OH)2, CsOH, Sr(OH)2, LiOH, RbOH 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 적절한 속도 및 반응도의 겔을 형성하기 위하여 사용될 수 있는 산 및 염기 촉매의 양은 바람직하게 1 mmol ~ 0.1 μmol 의 범위로 한다.
상술한 바와 같은 막 형성 재료 및 촉매에 의해 막의 구조를 조절하는 것 이외에 막 형성 용액에 포함되는 글루코오스 산화 효소의 사용량을 조절하는 것으로 센서의 감응 특성(직선성 즉, 글루코오스 농도에 따라 직선적으로 비례하는 감응 결과 및 감응 속도)를 조정할 수 있다. 즉, 센서의 성능과 관련하여 적절한 효소 기질 반응을 일으키기 위해 막 구조에 포함되어야 글루코오스 산화 효소에 있어 바람직한 농도 범위가 존재한다. 이것은 특히 상기 농도 범위를 뛰어넘어 고농도의 글루코오스 산화 효소가 포함된 경우 막 구조 내부에 글루코오스가 반응을 할 수 있는 효소가 너무 많이 존재하므로 반응에 필요한 산소량이 증가하고, 용액 내에 존재하는 산소는 한정되어 있으므로 글루코오스가 선형적으로 감응하는 구간이 줄어들게 된다. 일 실시예로서, 글루코오스 산화 효소는 전체 막 형성 용액의 졸 상태에서 0.1 내지 10 g/L의 농도 범위로 포함되었을 때 바람직한 수준의 감응도가 달성된다. 더욱 바람직하게는 1 내지 6 g/L의 농도 범위로 포함된다.
한편, 본 발명의 센서는 일산화질소를 저장 및 방출하기 위하여 막 구조가 형성된 전극의 말단부를 포함하는 모세관 표면에 나노섬유를 도입하여 체내에 삽입되었을 때 일정 시간 동안 감응성이 보장되고 신뢰성 및 재현성 있는 결과가 얻어지도록 한다. 도 2는 체내에 삽입된 센서에서 일산화질소(NO)의 방출 여부에 따라 체내에서 일어나는 현상을 도시한 것이다. 이를 보면 NO-분비 센서에서는 면역 반응이 억제되고 단백질의 흡착 및 바이오파울링(biofouling) 형성이 억제되어 생체 내에서 센서로서의 기능이 저하되는 것이 방지된다. 반면 일반 센서에서는 면역 반응으로 콜라겐 캡슐이 형성되어 센서 표면으로의 당 접근이 차단되고, 삽입된 센서를 외부의 적으로 인식하여 대식세포의 활동이 일어나 더 이상 센서의 작동이 불가능해진다. 따라서 본 발명에서는 일산화질소를 연속적으로 방출시키기 위하여 일 기술적 수단으로서 나노섬유를 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 나노섬유는 나노미터 수준의 직경을 가지는 섬유로서 바람직하게는 10 ~ 2,000 nm 범위의 직경을 갖는 것이다. 나노섬유의 소재로는 실리카를 포함하는 나노섬유이거나, 또는 실리카 이외에 다른 성분을 함유할 수 있다. 또한 일산화질소를 저장 및 방출하는 물질로서 분자 내에 아민 작용기를 가지고 졸-겔 반응이 가능한 알콕시기를 가지는 물질, 바람직하게는 아미노알콕시실란을 사용한다.
상기 아미노알콕시실란은 N-(6-아미노헥실)아미노프로필트라이메톡시실란(N-(6-aminohexyl) aminopropyltrimethoxysilane(AHAP3)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트라이메톡시실란 (N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane(AEAP3)), N-(2-아미노에틸)아미노페네틸트라이메톡시실란 (N-(2-aminoethyl)aminomethylphenethyltrimethoxysilane(AEMP3)), (3-트라이메톡시실릴프로필)디에틸렌트라이아민((3-trimethoxysilylpropyl) diethylenetriamine(DET3)), 메틸아미노프로필트라이메톡시실란(methylaminopropyltriethoxysilane(MAP3)), N-(아세틸글리실)-3-아미노프로필트라이메톡시실란(N-(acetylglycyl)-3-aminopropyl trimethoxysilane(AGAP3)), N-(3-아크릴록시-2-히드록시프로필)-3-아미노프로필트라이에톡시실란(N-(3-acryloxy-2-hydroxypropyl)-3-aminopropyltriethoxysilane(AHPAP3)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노이소뷰틸메틸디메톡시실란(N-(2-aminoethyl)-3-aminoisobutylmethyldimethoxysilane(AEAB3)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디에톡시실란 (N-(2-aminoethyl)-3-aminopropylmethyldiethoxysilane(AEAP3E)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란(N-(2-aminoethyl)-3-aminopropylmethyl dimethoxysilane(AEAP2)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필실란트라이올(N-(2-aminoethyl)-3-aminopropylsilanetriol(AEAP3OH)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트라이에톡시실란(N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltriethoxysilane(AEAP3E)), N-(6-아미노헥실)아미노메틸트라이에톡시실란 N-(6-aminohexyl)aminomethyltriethoxysilane(AEAM3E)), N-(2-아미노에틸)-11-아미노운데실트라이메톡시실란(N-(2-aminoethyl)-11-aminoundecyl trimethoxysilane(AEAU3)), N-[3-아미노(폴리프로필에녹시)]아미노프로필트라이메톡시실란(N-[3-amino(polypropylenoxy)]aminopropyltrimethoxysilane(APPAP3)), 3-아미노프로필실란트라이올 (3-aminopropyl silanetriol(AP3OH)), N-(2-N-벤질아미노에틸)-3-아미노프로필트라이메톡시실란히드로클로라이드(N-(2-N-benzylaminoethyl)-3-aminopropyl trimethoxysilane hydrochloride(BAEAP3Cl)) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
아미노알콕시실란을 용매에 용해시킨 후 일산화질소의 압력을 높이면 아미노알콕시실란 내의 2차-아민기에 일산화질소가 공유결합을 형성하여 일산화질소가 아미노알콕시실란에 충전되며(반응 (A): 충전 메카니즘), 하기와 같이 N-디아제니움디올레이트 (N-diazeniumdiolate) 형태로 존재하게 된다. 이렇게 충전된 일산화질소는 수용액 내의 수소 이온과 상대적으로 높은 온도 조건 하에서 방출된다(반응 (B): 방출 메카니즘).
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아미노알콕시실란 내 알콕시실란 부분은 전기방사가 가능한 고분자로서, 분자 내에 졸-겔 반응이 가능한 작용기를 가지거나 졸-겔 반응이 가능한 작용기가 없더라도 다른 물질과의 조합을 통해 졸-겔 반응을 할 수 있는 작용기를 가지는 고분자, 구체적으로 나일론-6,6(Nylon-6,6 (PA-6,6)), 폴리우레탄(Polyurethanes(PU)), 폴리벤즈이미다졸(Polybenzimidazole(PBI)), 폴리카보네이트(Polycarboate(PC)), 폴리아크릴로나이트릴(Polyacrylonitrile(PAN)), 폴리비닐 알코올(Polyvinyl alcohol (PVA)), 폴리락틱에시드(Polylactic acid(PLA)), 폴리에틸렌-co-비닐 아세테이트 (Polyethylene-co-vinyl acetate(PEVA)), 폴리메타아크릴레이트 (Polymethacrylate(PMA)), 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethylene oxide(PEO)), 폴리아닐린 (Polyaniline(PANI)), 폴리비닐카바졸(Polyvinylcarbazole), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (Polyethylene terephthalate(PET)), Polyacrylic acid-polypyrenemethanole(PAA-PM), 폴리스티렌 (Polystyrene(PS)), 폴리메틸메타아크릴레이트(Polymethylmethacrylate(PMMA)), 폴리아마이드(Polyamide(PA)), 폴리비닐페놀(Polyvinylphenol(PVP)), 폴리비닐클로라이드(Polyvinylchloride(PVC)), 셀룰로스 아세테이트(Cellulose acetate (CA)), 폴리비닐알콜(Polyvinyl alcohol(PVA)), 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide(PAAm)), 폴리락틱-코-글리실 산(poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)), 콜라겐(Collagen), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone (PCL)), 폴리(2-히드록시에틸메타아크릴레이트)(Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)(HEMA)), 폴리(비닐리덴플루오라이드) (Poly(vinylidene fluoride)(PVDF)), 폴리에테르이미드 (Polyether imide (PEI)), 폴리에틸렌글리콜 (Polyethylene glycol(PEG)), 나일론-4,6 (Nylon-4,6 (PA-4,6)), 폴리(페로세닐디메틸실란)(Poly(ferrocenyldimethylsilane) (PFDMS)), 폴리(에틸렌-co-비닐알콜) (Poly(ethylene-co-vinyl alcohol)), 폴리비닐피롤리돈 (Polyvinyl pyrrolidone(PVP)), 폴리메타-페닐렌이소프탈아마이드 (Polymetha-phenyleneisophthalamide) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 되는 것과 졸-겔 반응으로 망목 구조를 형성하게 된다.
망목 구조는 일산화질소가 충전된 아미노알콕시실란과 고분자를 화학적으로 결합시키기는 졸-겔 반응으로 형성된다. 졸-겔 반응은 상온에서도 쉽게 이루어지며 물성이 변하지 않는 조건에서라면 온도가 상온보다 낮거나 높아도 상관없다. 졸-겔 반 응은 물이 첨가되어 일어나는 가수분해 반응과, 촉매에 의해 일어나는 축합 반응의 단계로 이루어진다. 물의 함량 조절, 혹은 다양하게 존재하는 촉매의 종류와 함량을 조절하여 pH를 변화시키는 것으로 반응의 속도를 조절할 수 있으며, 수 분에서 수십 시간까지 시간을 조절하는 것으로도 반응의 정도를 다르게 수행되도록 할 수 있다. 일반적으로 산 촉매로는 염산, 염기촉매로는 암모니아수가 많이 쓰이지만 초산이나 KOH 등도 사용되며, 금이나 구리, 알루미늄과 같은 금속도 촉매로 사용될 수 있다. 이러한 반응을 통해 아미노알콕시실란의 알콕사이드 부분과 고분자의 -Si(OCH3)3 부분이 결합하여 망목 구조(network structure)가 형성된다.
하기는 일산화질소가 충전된 아미노알콕시실란(MAP3)과 고분자(Poly(MMA-co-HMA-co-SiMA))가 졸-겔 반응을 거쳐 형성한 망목 구조를 도시한 것이다.
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아미노알콕시실란(MAP3) 내에 충전된 일산화질소는 여전히 공유결합을 형성하여 망목 구조 내에 안정적으로 존재할 수 있다.
졸-겔 반응은 -10~30 ℃, pH 5~10에서 1~6 시간 동안 수행할 수 있다. 온도가 -10 ℃ 보다 낮으면 반응속도가 느려지는 문제가 발생할 수 있고, 30 ℃ 보다 높으면 아미노알콕시실란에 충전된 일산화질소가 방출되는 문제가 발생할 수 있다. pH가 5보다 낮으면 수소 이온의 수가 증가하므로 수소 이온에 의해 분해되는 N-diazeniumdiolate의 특성 때문에 아미노알콕시실란에 충전된 일산화질소가 방출되는 문제가 발생할 수 있고, 10 보다 크면 졸-겔 반응의 속도가 증가하기 때문에 분자들이 입자(particle)를 형성하여 전기방사가 가능한 고분자 용액이 만들어지지 않는 문제가 발생할 수 있다. 반응 시간이 1 시간보다 짧으면 망목 구조를 형성하는 데에 부족한 반응 시간이 될 수 있으며, 6 시간보다 길면 졸-겔 반응의 진행으로 인한 점도 증가의 우려와, 반응시간의 연장으로 인한 일산화질소의 방출 등의 문제점이 발생할 수 있다.
다음으로, 겔을 전기방사하여 나노섬유를 제조한다. 이 과정에서 도 3과 같이 나노섬유를 전극의 말단부에 대하여 전기방사한다.
전극의 말단부(이하 “말단부”라고도 함)는 모세관 내부에 위치하는 전극으로부터 연장하여 모세관 표면으로 돌출되어 있으며 센서의 체내 삽입 및 이동에서 전단부의 역할을 하는 것이다. 즉, 뽀족한 탐침 형태의 말단부는 1 ~ 500 ㎛ 범위의 직경을 갖는다. 따라서 상기 전극의 말단부는 모세관 내부의 전극으로부터 연장되어 형성되는 나노 구조체이며, 그 표면에는 표면적을 넓히기 위하여 전극의 소재와 구분되는 소재를 도입할 수 있다. 예를 들면, 백금 전극으로부터 연장되어 형성된 나노 구조체의 말단부 표면에 도입된 Pt black 층은 3차원 나노 구조를 가지게 되어 전극의 유효 면적을 넓혀 신호의 크기를 증가시킨다.
또한 상기 말단부를 포함하는 모세관 표면으로 일산화질소가 충진된 나노섬유를 전기방사하여 도 4와 같이 나노섬유로 휘감아지도록 한다. 이때 말단부를 포함하는 모세관 표면으로 휘감아 형성되는 나노섬유의 양은 0.01 mg ~ 0.1 g 범위의 양으로 일산화질소를 충진하고 있는 것이 체내 삽입 시 면역 반응의 억제 및 그로 인한 센서의 감응 특성을 향상시키고 바람직한 수명 특성을 나타낼 수 있기 때문에 선호된다.
전기방사 과정에서는 수직으로 위치한 방적돌기에서 중력과 표면장력 사이에 평형을 이루며 반구형 방울을 형성하여 매달려 있는 고분자 용액에 대해 전기장을 부여하면 표면장력과 반대되는 힘이 발생하여, 반구형 방울은 원추형으로 늘어나게 되며, 전기장이 어느 세기 이상이 되면 표면장력을 극복하면서 하전된 고분자 용액이 테일러 콘(taylor corn)을 형성하며 젯(jet)에서 계속하여 방출된다. 이 젯은 점도가 높으면 붕괴되지 않고 접지된 집전판을 향하여 공기 중을 날아가면서 용매는 모두 증발하게 되고, 집전판에는 하전된 연속상의 고분자 섬유가 쌓이게 된다. 따라서 집전판 위치에 전극의 말단부를 놓아 방사시키면 말단부를 포함하는 모세관 표면으로 나노섬유가 쌓이게 되어 본 발명의 센서가 완성된다.
말단부를 포함하는 모세관 표면에 도입된 나노섬유에는 일산화질소가 충전되어 있으며 일산화질소가 충전된 아미노알콕시실란은 고분자 골격과 공유결합을 하고 있기 때문에 나노섬유 밖으로 빠져 나오지 않는다. 따라서 체내에 삽입되었을 때 일산화질소의 방출량과 방출시간이 안정적일 수 있으며, 신뢰성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 센서는 전극에 대하여 일정한 전압을 인가하기 위한 기준 전극을 포함하는 2전극계 또는 분석 과정에서 사용되는 버퍼 용액에 의한 영향을 보상하기 위한 보조 전극을 포함하는 3전극계를 사용하여, 글루코오스의 산화 생성물인 과산화수소의 산화/환원 반응에 의한 전류를 측정한다. 그러나 체내에 삽입되는 것으로는 보다 간단한 구조인 도 5에 도시된 바와 같은 2 전극계가 더욱 바람직하다.
한편 도 5에 도시된 바와 같이 본 발명에서 모세관 내부에 위치하는 전극 및 그로부터 연장되어 모세관 외부로 돌출된 말단부를 포함하는 구조는 바람직하게 바늘형이다. 따라서 상기 구조에 대해 “바늘형 전극”이라는 용어를 사용할 수도 있다.
또한 본 발명에서 "센서"라 함은 좁은 의미로는 도 1에 도시된 바와 같이 모세관 내부에 위치하는 전극 및 상기 전극으로부터 연장되어 모세관 외부로 돌출된 말단부를 포함하는 구조의 것을 의미하기도 하며, 넓은 의미로는 상기에 더하여 도 5에 도시된 바와 같이 기준 전극이 포함된 2 전극계 또는 3 전극계를 의미하기도 한다.
전극의 소재로는 백금(platinum), 금(gold), 은(silver), 탄소(carbon), 백금흑(platinum black) 및 금흑(gold black)으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 사용할 수 있으며, 그 말단부에는 상술한 바와 같이 3차원의 나노 구조가 도입될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 것이므로 본 발명이 이에 한정되는 것으로 여겨져서는 안된다.
실시예
본 발명의 센서를 하기의 과정으로 제작하였다.
<막 형성 용액의 제조>
이소부틸트리메톡시실란(isobutyltrimethoxysilane(BTMOS))(Sigma 사, St. Louis, MO, USA) 25 μL 및 아미노에틸아미노메틸페네틸트리메톡시실란(aminoethylaminomethylphenetyltrimethoxysilane(AEMP3))(Gelest 사) 5 μL을 1 mL 튜브에 넣은 후 글루코오스 옥시다아제(glucose oxidase(GOx))(Lot No 128K1577V, 192,000 units/g; Sigma 사, St. Louis, MO, USA) 용액(GOx 0.3 mg/탈이온수 50 μL), 1,4-디옥산(1,4-dioxane)(Sigma 사, St. Louis, MO, USA) 100 μL, 0.1 M HCl(Sigma 사, St. Louis, MO, USA) 5 μL를 순서대로 넣은 후, 3 mm 마그네틱 바로 2시간 동안 격렬히 교반하여 막 형성 용액을 제조하였다.
<바늘형 전극의 제작>
길이 1 cm 의 platinum 와이어(직경 127 ㎛)를, 길이 8 cm 의 tungsten 와이어(직경 100 ㎛)에 코일 모양으로 감았다. 코일 모양으로 감긴 platinum 와이어와 tungsten 와이어 사이에 전류가 흐를 수 있도록 은 반죽을 바르고, 50 ℃의 온도를 유지하는 오븐에 넣어 15 분간 건조시켰다. 은 반죽이 건조된 platinum-tungsten 와이어를 함수발생기(function generator)에 연결하였다. 함수발생기의 설정을 60 Hz의 sine 파, 5 V의 전압으로 설정한 뒤, 1.2 M CaCl2 용액 (용매; 아세톤: 증류수 = 2:1)에 platinum-tungsten 와이어의 platinum 쪽을 1 mm 담그고 함수발생기를 8분간 작동시켜 platinum-tungsten 와이어의 platinum 부분이 뾰족해지도록 에칭(etching)하였다. 끝이 뾰족하게 에칭된 platinum-tungsten 와이어를 길이 4.5 cm의 유리모세관에 platinum 와이어가 0.5 mm 나오도록 유리 모세관에 넣고 flame torch에 유리 모세관을 넣어 밀봉했다. Flame torch에 의하여 밀봉되지 않은 유리 모세관 반대편 끝 쪽은 epoxy 수지로 밀봉하여 바늘형 전극을 제작하였다.
<전극 말단부 표면에 Pt black 층 도입>
제작된 바늘형 전극을 potentiostat의 작업전극 커넥터에 연결하고, 기준전극 커넥터에 vycor 기준전극(Ag/AgCl)을 연결한 뒤, 보조전극에 platinum sheet를 연결하였다. 작동전극, 기준전극, 보조전극을 0.5 M 황산 용액에 담그고 인가 전위 범위 -0.3 ~ 1.55 V, 훑기 속도 0.1 V/s, 순환 10 회로 설정하여 순환전압전류법(Cyclovoltammetry, CV)을 시행하여 전기화학적으로 세척했다. 세척된 바늘형 전극의 말단부를 3 wt% chloroplatinic acid와 0.029 wt% lead acetate가 포함된 수용액에 담그고 인가 전위 범위 -0.35 ~ 0.6 V, 훑기 속도 0.1 V/s, 순환 2 회로 설정하여 순환전압전류법을 수행하여 백금흑(platinum black) 층을 도입하였다.
<막 구조의 형성>
백금흑(platinum black) 층이 도입된 바늘형 전극의 말단부를 막 형성 용액에 20분 간격으로 4회 딥핑(dipping)하여 막 구조가 형성되도록 하였다.
<나노섬유 전기방사를 위한 혼합물의 준비>
에탄올과 메탄올을 4:1의 비율로 혼합한 혼합용액에 아미노알콕시실란(aminoalkoxysilane)인 AHAP3 5 m㏖, 소듐메톡사이드(sodium methoxide) 5 m㏖을 첨가하고, 상온에서 일산화질소(NO, nitric oxide)를 5~10 기압으로 하여 3 일 동안 유지하여 아미노알콕시실란에 일산화질소를 충전하였다. 충전은 40 기압까지 견딜 수 있는 스테인레스 반응기에서 교반과 함께 진행되었다. 일산화질소의 충전에 앞서, 용액과 반응기 내에 존재할 수 있는 산소와 반응에 영향을 줄 수 있는 기타 기체들을 제거하기 위해 아르곤을 10 기압까지 충전한 후 방출시키는 과정을 빠르게 세 번 반복하였으며, 이후 10 분 간격으로 두 번 더 10 기압까지 충전 후 방출하는 과정을 거쳐 반응기 내부에 반응성을 지닌 기체들이 제거되도록 하였다. 다음으로, 반응기 내 일산화질소의 압력을 10 기압으로 하여 3 일 동안 유지하였다. 3 일 후, 반응기에서 일산화질소가 충전된 용액을 얻었으며, 이 용액은 사용하지 않을 시엔 진공 처리하여 -20 ℃에서 보관하였다.
톨루엔(toluene)에 MMA(methylmethacrylate) 60 ㏖%, HMA(hexylmethacrylate) 20 ㏖% 및 SiMA((trimethoxysilylpropyl)methacrylate) 20 ㏖%를 첨가하고, 합성개시제로는 아조비스이소뷰티로나이트릴(azobisisobutyronitile (AIBN))을 메탄올에 녹여 30 분 동안 첨가한 후 80 ℃에서 12 시간 동안 반응을 진행시켜 고분자를 합성하였다. 합성 후 감압증류와 진공건조를 이용하여 톨루엔(toluene)을 제거하였으며, 헥세인(hexane)으로 3 회 정제하여 남아있는 단량체(monomer)와 촉매를 제거한 후 다시 진공 건조하였다.
제조된 고분자의 무게가 20 wt%, 이를 용해시킬 용매인 아세톤(acetone)의 무게가 80 wt%가 되도록 하여 고분자 용액을 만들었고, 이를 3 g 추출하여 여기에 MTMOS(methyltrimethoxysilane) 6.4 mol%(0.3 m㏖), 및 일산화질소가 충전된 아미노알콕시실란(AHAP3) 4.3 mol%(0.2 mmol)을 섞은 후, 촉매로 알루미늄 아세틸아세토네이트(aluminum acetylacetonate) 45.4 mg을 물과 함께 첨가하여 졸-겔 반응을 진행하여 고분자와 아미노알콕시실란(AHAP3)이 화학적으로 결합한 상태로 존재하는 용액을 얻었다. 이때 졸-겔 반응은 4 ℃, pH 7에서 1 시간 동안 교반하며 진행하였다.
<전기방사 시스템의 구성>
도 3과 같이 needle과 바늘형 전극의 말단부가 서로 마주보도록 전기방사 시스템을 구축하였다. Needle과 말단부가 서로 마주보도록 하기 위하여 알루미늄 호일을 collector로 사용하였고, 알루미늄 호일에 구멍을 내어 구멍 속으로 전극의 말단부를 삽입하였다. 전극은 모두 collector에 연결하였다.
<전기방사>
상기 졸-겔 반응으로 준비된 혼합물을 시린지(syringe)에 넣고 전기방사(electrospinning) 장비를 이용하여 나노 수준의 직경을 가지는 나노섬유(nanofiber)를 제조하였다. 전기방사 조건은 다음과 같다. Needle의 크기는 18 gauge, needle 과 collector 간의 거리는 15 ㎝, 전압은 20 ㎸, 유속(flow rate)은 10 ㎕/min으로 하였다.
비교예
실시예에서 말단부를 포함하는 모세관 표면으로 나노섬유를 도입하는 과정을 제외하고 동일한 방법으로 센서를 제작하였다.
(평가)
1. 연속전압 인가상태에서 비교예 센서 사용 수명 측정
비교예 센서를 이용하여 0.7 V의 전압 인가 상태를 유지하면서 0.01 M PBS(phosphate buffered solution, pH 7.4) 완충용액 하에서 센서의 방해종 및 글루코오스에 대한 감응을 측정하였다. 방해종 및 글루코오스에 대한 감응 측정을 하지 않을 때는 센서를 글루코오스가 5 mM 포함된 0.01 M PBS(phosphate buffered solution, pH 7.4) 완충 용액에 담그고, 센서에 0.7 V의 전압을 다시 인가하여 전압 인가상태를 유지하였으며, 12시간 간격으로 센서의 방해종 및 글루코오스에 대한 감응을 측정하였다.
방해종에 대한 영향을 평가하기 위하여 주요 방해종인 요산 100 mM, 아스코르빈 산 100 mM, 아세트아미노펜 100 mM을 주입하여 3종의 방해종에 대한 전체 감응량을 글루코오스 검정곡선에 대입하여 글루코오스의 감응 농도로 환산하고, 이 값을 정상인의 정상혈당치 평균 값인 5 mM로 나누어 %Error를 계산하였다.
비교예 센서의 감응 및 수명 특성을 도 6에 나타내었다. 전압이 연속적으로 인가된 상태에서 8 일 이상 정상적으로 작동하였으며, %Error 값 또한 8 일 이상 20% 미만을 보여주었다. 이는 연속혈당 측정 시 8 일 이상 안정적으로 작동이 가능할 것으로 기대된다.
2. NO 방출특성
실시예의 센서 제작에서와 동일한 방법으로 5 cm 길이의 tungsten 와이어에 막 구조를 형성한 후, 그 위에 NO-방출 나노섬유를 도입하였다. 상기 tungsten 와이어를 Sievers chemiluminescence nitric oxide analyser(NOA280i)의 측정기 도입하여 일산화질소의 분당 방출량을 측정하였다.
도 7은 시간에 따른 일산화질소(NO) 방출 특성을 나타낸 그래프이다. 6-7 일 동안 0.1 nmol/cm-2·분 이상의 방출 특성을 나타냈다. 따라서 상기 기간 동안 센서의 작동이 가능할 것으로 기대된다.
3. 연속 혈당 측정
정맥에서 채혈된 전혈에 실시예 센서 및 비교예 센서와 Ag/AgCl 와이어를 담그고 potentiostat(CHI 760D)에 연결하여 작업전극에 0.7 V를 인가하여 글루코오스 모니터링을 하였다. 3 M 글루코오스 수용액을 소량 첨가하여 전혈의 글루코오스 농도가 약 5,000 mg/dL가 되도록 글루코오스 전혈 용액을 제조하고, 이 글루코오스 전혈 용액을 작업전극 및 Ag/AgCl 와이어가 담겨있는 용액에 소량 첨가하여 글루코오스 농도를 증가시켰다. 글루오코스 농도가 300 mg/dL 이상이 되면 글루코오스를 첨가하지 않은 전혈을 작업전극 및 Ag/AgCl 와이어가 담겨있는 용액에 첨가하여 작업전극 및 Ag/AgCl 와이어가 담겨있는 용액의 글루코오스 농도를 감소시켰다. 글루코오스 전혈 용액, 혹은 전혈 용액을 첨가한 후 i-sens사 CareSens N을 사용하여 글루코오스 레벨을 측정하였다.
도 8은 전혈을 이용한 in vitro 연속 혈당 측정 결과이다. 1, 2, 3 일째 모두 Clarke error grid analysis 의 A 영역에 속하여 연속 혈당 측정에서 신뢰성 있는 결과를 나타냈다.
4. 쥐 모델을 이용한 연속 혈당 측정
실시예 및 비교예 센서에 대해 쥐 모델을 이용하여 in vivo 연속 혈당 측정을 실시하였다. 이를 위해 11주 이상 사육된 Spargue Dawley rat에 마취제(Chloral hydrate)를 쥐 무게 1 kg 당 300 mg이 되도록 투여하고, 17G needle을 길이 3 cm로 2개를 잘라 Spargue Dawley rat 어깨뼈 부분에 삽입한 뒤, needle 구멍 안쪽으로 실시예 센서와 비교예 센서를 각각의 needle에 삽입하고, Ag/AgCl 와이어를 각각의 needle 삽입하였다. 혈당 센서들을 작업전극 커넥터에 연결하고, Ag/AgCl 와이어를 기준전극 커넥터와 보조전극 커넥터에 연결하였다. 실시예 센서 및 비교예 센서 신호와 혈당값을 비교하기 위하여 i-sens사 CareSens N 혈당기를 이용하여 쥐의 꼬리에서 채혈하여 혈당을 측정하였다. 측정 결과를 도 9 및 10에 나타내었다. 도 9를 보면 비교예 센서에서는 체내 글루코오스 레벨과 센서의 측정치가 인슐린 및 포도당 투여 후 단지 2.6 내지 5 시간 경과 후에 잠시 일치하였지만, 실시예의 센서는 투여 직후부터 계속하여 글루코오스 레벨을 그대로 따라가는 것을 알 수 있다. 도 10은 상기 결과를 Clarke error grid analysis로 나타낸 것이다. Clarke error grid analysis를 수행하기 위하여 실시예 및 비교예의 신호값과, 쥐의 최고 혈당치와 최저 혈당치 값을 기준으로 하여 2-point 검정을 수행하였으며, 검정을 통하여 얻어진 값과, CareSens N 혈당기를 이용하여 얻은 값을 비교하였다. 이것을 보면 비교예 센서는 A 영역을 벗어나 B 영역, 심지어 D 영역으로 까지 확산되어 있으나, 실시예 센서는 A 영역에 집중되어 있다. 따라서 본 발명의 센서는 체내에서 연속 혈당 측정에 대해 신뢰성 있는 결과를 보여주었다.

Claims (20)

  1. 모세관 내부에 위치하는 전극 및 상기 전극으로부터 모세관 한 끝의 외부로 돌출된 나노 구조체의 말단부를 포함하며; 상기 말단부 및 말단부가 돌출된 모세관의 표면에는 글루코오스 산화 효소가 고정된 막 구조가 형성되고; 그 위로 일산화질소를 저장 및 전달하며, 전극의 말단부에 대하여 아미노알콕시실란 및 전기방사가 가능한 고분자의 혼합물을 전기방사하여 제조되는 나노섬유로 둘러싸인 구조의 센서.
  2. 제1항에서,
    상기 막 구조는 아미노알콕시실란 및 트리메톡시실란 용액의 졸-겔법으로부터 제조된 것으로, 글루코오스 산화 효소의 효소 반응에 의해 글루코오스로부터 생성되는 과산화수소(hydrogen peroxide)에 대해 선택성을 갖도록 포어(pore) 사이즈 및 밀도가 조정된 것을 특징으로 하는 센서.
  3. 제1항에서,
    상기 막 구조는 아미노에틸아미노프로필트리메톡시실란(aminoethylaminopropyltrimethoxysilane(AEAP3)), 메틸아미노프로필트리메톡시실란(methylaminopropyltrimethoxysilane(MAP3)), 아미노헥실아미노프로필트리메톡시실란(aminohexylaminopropyltrimethoxysilane(AHAP3)) 및 아미노에틸아미노메틸페네틸트리메톡시실란(aminoethylaminomethylphenetyltrimethoxysilane(AEMP3))으로 구성되는 그룹에서 선택된 1종 이상의 아미노알콕시실란 및 메틸트리메톡시실란(methyltrimethoxysilane(MTMOS)), 에틸트리메톡시실란(ethyltrimethoxysilane(ETMOS)), 프로필트리메톡시실란(propyltrimethoxysilane(PTMOS)) 및 이소부틸트리메톡시실란(isobutyltrimethoxysilane(BTMOS))으로 구성되는 그룹에서 선택된 1종 이상의 트리메톡시실란을 포함하는 것을 특징으로 하는 센서.
  4. 제1항에서,
    상기 막 구조는 졸 상태의 아미노알콜시실란 및 트리메톡시실란 용액을 산 촉매 또는 염기 촉매 하에서 겔화하여 형성된 것을 특징으로 하는 센서.
  5. 제1항에서,
    상기 전극은 백금(platinum), 금(gold), 은(silver), 탄소(carbon), 백금흑(platinum black) 및 금흑(gold black)으로 구성되는 그룹에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 센서.
  6. 제4항에서,
    상기 촉매는 HCl, HBr, HI, HNO3, H2SO4, H3PO4, HClO4, 아세트산(acetic acid), 타타르산(tartaric acid) 및 시트르 산(citric acid) 으로 구성되는 그룹에서 선택된 1종 이상의 산 촉매 또는 NaOH, KOH, Ca(OH)2, Ba(OH)2, CsOH, Sr(OH)2, LiOH 및 RbOH 으로 구성되는 그룹에서 선택된 1종 이상의 염기 촉매인 것을 특징으로 하는 센서.
  7. 제1항에서,
    상기 글루코오스 산화 효소는 막 구조에 대하여 0.1 내지 10 g/L의 범위로 포함되는 것을 특징으로 하는 센서.
  8. 삭제
  9. 제1항에서,
    상기 아미노알콕시실란은 N-(6-아미노헥실)아미노프로필트라이메톡시실란(N-(6-aminohexyl) aminopropyltrimethoxysilane(AHAP3)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트라이메톡시실란 (N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane(AEAP3)), N-(2-아미노에틸)아미노페네틸트라이메톡시실란 (N-(2-aminoethyl)aminomethylphenethyltrimethoxysilane(AEMP3)), (3-트라이메톡시실릴프로필)디에틸렌트라이아민((3-trimethoxysilylpropyl) diethylenetriamine(DET3)), 메틸아미노프로필트라이메톡시실란(methylaminopropyltriethoxysilane(MAP3)), N-(아세틸글리실)-3-아미노프로필트라이메톡시실란(N-(acetylglycyl)-3-aminopropyl trimethoxysilane(AGAP3)), N-(3-아크릴록시-2-히드록시프로필)-3-아미노프로필트라이에톡시실란(N-(3-acryloxy-2-hydroxypropyl)-3-aminopropyltriethoxysilane(AHPAP3)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노이소뷰틸메틸디메톡시실란(N-(2-aminoethyl)-3-aminoisobutylmethyldimethoxysilane(AEAB3)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디에톡시실란 (N-(2-aminoethyl)-3-aminopropylmethyldiethoxysilane(AEAP3E)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필메틸디메톡시실란(N-(2-aminoethyl)-3-aminopropylmethyl dimethoxysilane(AEAP2)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필실란트라이올(N-(2-aminoethyl)-3-aminopropylsilanetriol(AEAP3OH)), N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트라이에톡시실란(N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltriethoxysilane(AEAP3E)), N-(6-아미노헥실)아미노메틸트라이에톡시실란 N-(6-aminohexyl)aminomethyltriethoxysilane(AEAM3E)), N-(2-아미노에틸)-11-아미노운데실트라이메톡시실란(N-(2-aminoethyl)-11-aminoundecyl trimethoxysilane(AEAU3)), N-[3-아미노(폴리프로필에녹시)]아미노프로필트라이메톡시실란(N-[3-amino(polypropylenoxy)]aminopropyltrimethoxysilane(APPAP3)), 3-아미노프로필실란트라이올 (3-aminopropyl silanetriol(AP3OH)), N-(2-N-벤질아미노에틸)-3-아미노프로필트라이메톡시실란히드로클로라이드(N-(2-N-benzylaminoethyl)-3-aminopropyl trimethoxysilane hydrochloride(BAEAP3Cl)) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 센서.
  10. 제1항에서,
    상기 전기방사가 가능한 고분자는 나일론-6,6(Nylon-6,6 (PA-6,6)), 폴리우레탄(Polyurethanes(PU)), 폴리벤즈이미다졸(Polybenzimidazole(PBI)), 폴리카보네이트(Polycarboate(PC)), 폴리아크릴로나이트릴(Polyacrylonitrile(PAN)), 폴리비닐 알코올(Polyvinyl alcohol (PVA)), 폴리락틱에시드(Polylactic acid(PLA)), 폴리에틸렌-co-비닐 아세테이트 (Polyethylene-co-vinyl acetate(PEVA)), 폴리메타아크릴레이트 (Polymethacrylate(PMA)), 폴리에틸렌 옥사이드(Polyethylene oxide(PEO)), 폴리아닐린 (Polyaniline(PANI)), 폴리비닐카바졸(Polyvinylcarbazole), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (Polyethylene terephthalate(PET)), Polyacrylic acid-polypyrenemethanole(PAA-PM), 폴리스티렌 (Polystyrene(PS)), 폴리메틸메타아크릴레이트(Polymethylmethacrylate(PMMA)), 폴리아마이드(Polyamide(PA)), 폴리비닐페놀(Polyvinylphenol(PVP)), 폴리비닐클로라이드(Polyvinylchloride(PVC)), 셀룰로스 아세테이트(Cellulose acetate (CA)), 폴리비닐알콜(Polyvinyl alcohol(PVA)), 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide(PAAm)), 폴리락틱-코-글리실 산(poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)), 콜라겐(Collagen), 폴리카프로락톤(Polycaprolactone (PCL)), 폴리(2-히드록시에틸메타아크릴레이트)(Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)(HEMA)), 폴리(비닐리덴플루오라이드) (Poly(vinylidene fluoride)(PVDF)), 폴리에테르이미드 (Polyether imide (PEI)), 폴리에틸렌글리콜 (Polyethylene glycol(PEG)), 나일론-4,6 (Nylon-4,6 (PA-4,6)), 폴리(페로세닐디메틸실란)(Poly(ferrocenyldimethylsilane) (PFDMS)), 폴리(에틸렌-co-비닐알콜) (Poly(ethylene-co-vinyl alcohol)), 폴리비닐피롤리돈 (Polyvinyl pyrrolidone(PVP)), 폴리메타-페닐렌이소프탈아마이드 (Polymetha-phenyleneisophthalamide) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 센서.
  11. 제1항에서,
    상기 혼합물은 졸-겔 반응으로 망목 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 센서.
  12. 제1항에서,
    상기 아미노알콕시실란에는 5 내지 10 기압으로 유지되는 일산화질소 하에 유지됨으로써 일산화질소가 저장되어 있는 것을 특징으로 하는 센서.
  13. 제1항에서,
    상기 나노섬유는 막 구조가 형성된 전극의 말단부 주위로 전기방사되는 것을 특징으로 하는 센서.
  14. 제1항에서,
    상기 모세관의 다른 끝은 밀봉되어 있는 것을 특징으로 하는 센서.
  15. 제1항에서,
    상기 나노섬유의 직경은 10 ~ 2,000 nm의 범위인 것을 특징으로 하는 센서.
  16. 제1항에서,
    상기 모세관은 유리(glass)로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 센서.
  17. 제1항에서,
    상기 센서에 대해서는 일정한 전압을 인가하여 과산화수소의 산화환원 반응으로부터 발생하는 전류를 측정함으로써 글루코오스의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 센서.
  18. 제1항에서,
    상기 센서는 기준전극, 작업전극 및 보조전극을 포함하는 3전극계 또는 기준전극과 작업전극을 포함하는 2 전극계를 이용하는 것을 특징으로 하는 센서.
  19. 제1항에서,
    상기 센서는 바늘형인 것을 특징으로 하는 센서.
  20. 제1항에서,
    상기 센서는 표면에 도입된 NO-방출 나노섬유에 의해 일산화질소가 지속적으로 방출되어 생체적합성이 향상되는 것을 특징으로 하는 센서.
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