KR101509049B1 - 위암 특이적 유전자의 조기 탐지를 위한 메틸화 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 출원은 POPDC3, FLJ25393, LRRC3B, PRKD1, CYP1B1, LIMS2, DCBLD2, BC036441, ADCY8, BACH2, ALOX5, TCF4, CXXC4, CAMK2N2, EMX1, KCNK9, NCAM2, AMPD3, NOG, SP6, AK124779 또는 CSS3, 또는 그것의 조합과 같은 마커 유전자의 발현의 손실에 대한 분석 단계를 포함하는 위암 또는 상기 암의 진행 단계를 진단하는 방법에 대한 것이다.

위암, 마커 유전자, TCF4, 유전자 메틸화, 암 발생

Description

위암 특이적 유전자의 조기 탐지를 위한 메틸화 바이오마커{METHYLATION BIOMARKER FOR EARLY DETECTION OF GASTRIC CANCER}

본 발명은 위암 세포 전환에 관련한 바이오마커를 발굴하는 것에 대한 계획적인 접근법에 관한 것이다. 나아가 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 위암의 진단 및 예후 판정에 관한 것이다. 나아가 본 발명은 초기 위암의 탐지 또는 진단에 관한 것이다.

과거 몇 년 동안, 위암(gastric cancer, 이하, GC로 약칭함)의 발달 및 진행에 영향을 미치는 다중 유전적 또는 후생학적 변화를 설명하기 위한 많은 연구가 있어왔다(1 Zheng et al ., 2004). 진단 및 치료 기술의 발달은 GC에 대한 탁월한 장기 생존의 결과를 내었지만, 위암은 여전히 전 세계에서 암에 의한 사망에 있어서 그 빈도가 두 번째로 높은 원인이다(2 Parkin et al ., 2005). 최근의 연구는 초기를 포함하는 종양발생의 모든 단계에서 유전적 변화뿐만 아니라 후생학적 변화도 일어나고, 상기 후생학적 변화는 유전적 변화보다 더 빈번히 일어나는 것을 보여주었다(3 Zardo et al ., 2002). 종양 억제 유전자의 침묵이 암 발달에 중요한 구동력 인 것으로 점점 인식되고 있다(4 Jones & Baylin, 2002).

종양발생에서 후생학적 변화의 탐지는 혁신적인 진단 및 치료 전략의 주역이 되기에 이르렀다. 후생학적 변화는 암 환자의 거의 모든 기관계의 체액으로부터 검출되었다(5 Laird, 2003). 후생학적으로 침묵하는 유전자가 종양 세포에서 재발현되는 것은 세포 성장의 억제 또는 항암 치료에 대한 민감도의 변화를 유도하는데, 후생학적 불활성화를 역전시키는 소분자(small molecule)에 대한 임상 시험이 암환자에서 지금 진행되고 있다(6 Momparler et al ., 1997, 7 Pohlmann et al ., 2002). 따라서, 후생학적 변화는 그들의 가역성으로 인한 잠재적인 치료 표적일뿐만 아니라, 초기 단계에서 암의 탐지 및 진단에 사용될 수 있는 잠재적인 바이오마커이다(8 Brown et al ., 2002).

GC는 조직학적으로 장형(intestinal type)및 확산형(diffuse type)의 두 가지 서브타입으로 분류된다(9 Lauren, 1965). 위암발생의 상기 두 가지 형태의 정확한 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았다. 그러나 많은 보고들에서 위암발생 중의 유전자 과메틸화에 대하여 유전자 단위 접근법(gene-by-gene approach)을 통해 최근 발표되었다. 예를 들면, 장형 GC의 25%에서 돌연변화되어 있는 APC(10 Tamura et al., 1994)는 일련의 발암 단계, 심지어 정상 위점막에서도 높은 빈도로 과메틸화되어 있었다(11 Clement et al ., 2004). 돌연변화에 의해 기능이 손실된 CDHI는 확산형 GC의 우발성 및 유전성 형태 모두에서 중추적인데(12 Becker et al ., 1994), 장형 GC보다 확상형 GC에서 더 높은 빈도로 과메틸화되어 있다(13 Oue et al ., 2003). p15/INK4B, p16/1NK4A 및 ρl4/ARF의 세 가지 종양 억제 유전자는 GC 에서 높은 빈도로 과메틸화되어 있는데, 이들 유전자 사이의 메틸화 패턴에는 차이점이 있다. p15/INK4B 및 p16/INK4A가 GC에서 높은 빈도로 과메틸화되는 것은, p14/ARF가 종양세포에서 종종 전구체 장애가 발생하는 것에 비하여 종양-특이적이다. 또한, p14/ARF의 메틸화가 확산형 GC에서 지배적으로 일어나는 것에 비하여(13 Oue et al ., 2003), p16/INK4A는 장형에서 주로 과메틸화되어 있다(14 Iida et al ., 2000). 기능의 손실의 주된 이유가 과메틸화인 RUNX3(15 Li et al ., 2002)은 장형 위암발생에서 세포 분화 및 증식의 역할을 할 수 있다.

Toyota 등은 암에서의 유전자 과메틸화에 기초한 새로운 분자 표현형을 제안하였다(16 Toyota et al ., 1999a). 이들은 대장암에서 26개의 과메틸화된 CpG 섬("MINT"라고 불림: 종양에서 메틸화됨)을 동정하였고, 두 가지 유형으로 분류하였다: 연령-관련 메틸화 유전자(A 형)및 암-특이적 메틸화 유전자(C 형). 또한, 이들은 개체 내 암에서 C형분T에서 높은 빈도로 과메틸화된 것을 발견하고, 상기 표현형을 CpG 섬 메틸화 표현형(ClMP)으로 명명하였다. 또한, 상기 CIMP+ 표현형은 GC의 24-47%에서 발견되었다(13 Oue et al ., 2003, 17 Toyota et al ., 1999b). CIMP의 존재는 많은 위암에서 유전자의 다중 프로모터 부위가 메틸화되어 있음을 가리킨다. 게다가, CIMP는 종양뿐만 아니라 전암 상태의 손상에서도 탐지되었다(18 Lee et al ., 2004). 이러한 발견은 CIMP가 위암발생의 초기 분자 이벤트 중 하나일 수 있음을 시사한다. 본 발명자들은 위암발생에서 많은 유전자들이 과메틸화되어 있는 것을 알았지만, 상기 유전자들은 위암발생의 전체적인 메틸화 수준을 이해하고, 초기단계에서 암을 진단하기 위해 제한되어야 한다.

본 발명에서, 본 발명자들은 새로운 후생학적 표적을 동정하기 위하여 RLGS(Restriction Landmark Genomic Scanning)분석을 이용하여 초기 위암종뿐만 아니라 위암 세포주를 분석하였는데(19 Hatada et al ., 1991), 다양한 인간 암종에서의 광범위한 메틸화를 설명하는데 성공적으로 적용되었다(3 Zardo et al, 2002, 20 Nagai et al, 1994, 21 Costeilo et al ., 2000, 22 Rush et al ., 2004). 본 발명자들의 지식에 따르면, GC에서 CpG 섬 메틸화의 게놈-단위(genome-wide)분석은 아직 보고된 바가 없다. 또한, 본 발명자들은 임상 시료에서 후생학적 표적의 발현 형태 및, 상기 표적사이 또는 상기 표적 및 GC에서 높은 빈도로 발현이 억제된 것이 잘 알려진 종양 억제 유전자인 CDHI 또는 DAPK 사이의 상관관계를 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 정량적 메틸화 분석에 의해 GC에서 암-특이적으로 메틸화된 유전자(type-C)뿐만 아니라 연령-관련 메틸화 유전자(type-A)인, 기본적인 헬릭스-턴-헬릭스 전사인자의 하나인 전사인자 4를 암호화하는 TCF4를 최초로 보고하였다.

따라서, 본 발명은 세포 전환 특히, 암세포 전환에 관련된 메틸화 마커의 스크리닝 및 암의 치료에 관한 것이다.

광범위한 DNA 메틸화는 아직 받아들이는데 어려움이 있지만, 후생학적 변화는 이제 인간 고형종양의 일반적인 특징이 되는 것으로 인식되었다. 본 발명자들은 위암에서의 광범위한 메틸화를 처음으로 측정하였고, 15개 위종양에서 3.3%의 NotⅠ 부위가 메틸화되어 있고, 11개 위암 세포주에서 11.9%의 NotⅠ 부위가 메틸화되어 있는 것을 RLGS(Restriction Landmark Genomic Scanning)를 사용하여 발견하였다. 본 발명자들은 RLGS 겔과 NotⅠ-연계 클론을 혼합하여, RLGS 프로파일에서 높은 빈도로 메틸화되어 있고, RT-PCR에서 유전자 발현억제와 연관된 26개 후생학적 표적을 동정하였다, 본 발명자들은 26개 유전자 중 23개가 탈인산화 제제인 5-aza 및/또는 HDAC 억제제인 TSA에 의해 복원되는 것을 확인하였다. 스물세 개의 유전자는 96개 초기 종양에서 그의 정상 부위와 비교하였을 때, 25-50% 범위로 발현이 적은 것을 정량적 RT-PCR 결과 나타났다. 특히, 본 발명자들은 종양 시료에서 LIMS2, ALOX5, TCF4, PRKD1. 및 NACM2의 발현이 연관되어 있는 것을 확인하였다. 이들 중 TCF4의 발현의 감소가 위암의 초기 형태(P=0.004) 또는 초기 단계(P=0.013) 및, 장형(P=0.0001) 위암에서 상당히 높았다. 파이로씨퀀싱(pyrosequencing) 분석을 사용하여, 본 발명자들은 TCF4의 엑손 1의 메틸화 상태를 정량하였고, 초기 종양뿐만 아니라 세포주에서 엑손 1의 유전자 발현 억제 및 과메틸화 사이의 강력한 상관관계를 찾았다. 또한, 본 발명자들은 초기 종양의 메틸화 상태가 환자의 연령과 높은 연관성이 있음을 발견하였다(R=0.3265. P=0.0037, 34.7% 메틸화 평균). 게다가, 상기 메틸화는 정상 조직에서도 환자 연령과 높은 상관관계를 보여주었는데(r=0.4524, P<0.0001, 13.2% 메틸화 평균), 이는 상기 메틸화가 정상 점막 조직에서 50세부터 급격히 증가하는 것을 가리킨다. 그러므로 본 발명의 바람직한 실시예의 결과는 상기 메틸화된 TCF4가 위암의 초기탐지 및 예후 바이오마커가 될 가능성을 가지고, 또한 메틸화된 TCF4를 분석하여 암을 모니터링 하는데 유용함을 시사한다.

본 발명은 위암뿐만 아니라 위암의 진행단계 중 조직의 다양한 형성이상 단계에서 다르게 메틸화되는 것에서 몇몇의 유전자를 동정한 종래의 출원에서 서술된 시스템을 사용한 발견에 기초한다. 상기 발견은 위암의 스크리닝, 위험 평가, 예후, 질병 동정, 질병의 단계화(staging) 및 치료 표적의 동정에 유용하다. 상기 위암 및 그의 다양한 손상 단계에서 메틸화된 유전자의 동정으로 정확하고 효율적인 초기 진단 분석, 다중 유전자를 이용한 메틸화 프로파일링 및 치료를 위한 신규한 표적의 동정이 가능하다. 나아가, 위암의 보다 정확한 진단 시스템을 얻기 위하여, 상기 메틸화 데이터는 다른 비메틸화 연관 바이오마커 탐지 방법과 조합될 수 있다.

본 발명의 한 구체적 실시예에서, 본 발명은 상기에서 기술한 바와 같이 개체로부터 분리된 핵산 바이오마커의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하는 위암 진행의 여러 단계 또는 진행도를 진단하는 방법을 제공한다. 위조직의 세포 증식 장애를 가지지 않는 개체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교된 상기 하나 이상의 메틸화 상태는 개체의 위장 장애의 단계를 나타내는 지표이다. 본 발명의 구체적 실시예에서, 상기 메틸화 상태는 과메틸화이다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 핵산은 조절 부위에서 메틸화된다. 다른 측면에서, 메틸화가 안으로 작동하는 조절 영역의 외측 경계선부터 시작되기 때문에, 조절 영역의 외측 경계선에 있는 메틸화를 탐지하는 것에서 세포 변화에 포함된 유전자의 조기 탐지가 가능하다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명은 하기에 예시된 핵산에서 하나 이상의 메틸화 상태를 탐지함으로써 개체 내 위조직의 세포 증식 장애를 진단하는 방법을 제공한다 : POPDC3, FIJ25393, LRRC3B, PRKDl, CYPlBl, LIMS2, DCBLD2, BC036441, ADC Y8, BACH2, ALOX5, TCF4, CXXC4, CAMK2N2, EMXl, KCNK9, NCAM2, AMPD3, NOG3 SP6, AKI 24779, CSS3 또는, 그들의 조합.

또한 본 발명의 다른 구체적 실시예에서 개체 내 위조직의 세포 증식 장애의 성향을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 방법을 포함하고, 위조직의 세포 증식 장애의 성향을 가지지 않은 개체로부터 분리된 핵산의 메틸화 상태와 비교한 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태로부터 개체 내 위조직의 세포 증식 장애 여부를 알 수 있다. 증폭된 핵산의 일부는 POPDC3, FLJ25393, LRRC3B, PRKLDI, CYPlBK, LIMS2, DC8LD2, BC03644I, ADCY8, BACH2, ALOX5, TCF4, CXXC4, CAMK2N2, EMXl, KCNK9, NCAM2, AMPD3, NOG, SP6, AKl24779 또는 CSS3, 또는 그들의 조합을 암호화하는 핵산일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체적 실시예에서, 본 발명은 위암 형성의 가능성의 조기 탐지를 대상으로 한다. 예시적인 발명의 실시예에 따라, 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 나타나는 조직에서 암조직에서 메틸화되는 것으로 알려진 유전자가 메틸화되어 있을 때, 상기 정상으로 나타나는 조직이 암 형성의 단계에 있음을 가리키는 것이다. 따라서 본 출원에 따른 위암 특이적 유전자가 메틸화된 것으로 부터 정상으로 나타나는 위조직의 위암의 조기 진단을 내릴 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 구체적 실시예에서 개체 내 위조직의 세포 증식 장애를 탐지하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 개체로부터 분리된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 시료와 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제를 접촉하는 것을 포함한다. 상기 방법은 나아가 적어도 하나의 핵산에서 적어도 하나의 부위의 메틸화를 식별하는 것을 포함하며, 상기 핵산의 메틸화 상태는 위조직의 세포 증식 장애를 가지지 않는 개체 내 핵산의 같은 부위의 메틸화 상태와 다르다.

본 발명은 나아간 구체적 실시예에서 시료를 수용하여 구획화할 수 있는 담체; 및, 비메틸화된 핵산을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫 번 째 담체 및 상기 바이오마커의 증폭을 위한 표적-특이적 프라이머를 함유하는 두 번 째 제제를 포함하는 하나 이상의 담체를 포함하는 개체 내 세포 증식 장애의 탐지에 유용한 키트를 제공한다.

본 발명의 한 구체적 실시예에서, 본 발명은 상기 마커 유전자의 메틸화를 분석하는 것을 포함하는 변화된 위암 세포를 식별하는 방법을 대상으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체적 실시예에서, 본 발명은 상기 마커 유전자의 메틸화를 분석하는 것을 포함하는 개체 내 위암 또는 상기 암의 진행 단계를 진단하는 방법을 대상으로 한다.

본 발명의 다른 구체적 실시예에서, 본 발명은 정상으로 나타나는 신체 시료로부터 위암 특이적 마커 유전자의 메틸화를 분석하는 것을 포함하는 발생 중인 위암이 있을 가능성을 진단하는 방법을 대상으로 한다. 상기 신체 시료는 고형 또는 혈청 또는 혈장과 같은 액상 조직일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체적 실시예에서, 본 발명은 위암 특이적으로 메틸화된 유전자의 구획에서 메틸화 수준을 검토하고, 발생중인 위암의 가능성의 수준을 판단함으로써 발달중인 위암의 가능성을 판단하는 방법을 대상으로 한다.

본 발명의 구체적 실시예에서, 본 발명은 하기와 같은 군에서 선택되는 마커 유전자의 발현의 손실에 대한 분석을 포함하는 개체 내 위암 또는 상기 암의 진행 단계를 진단하는 방법을 대상으로 한다: POPDC3, FIJ25393, LRRC3B, PRKDl, CYPlBl, LIMS2, DCBLD2, BC036441, ADCYS, BACH2, ALOX5, TCF4, CXXC4, CAMK2N2, EMXl, KCNK9, NCAM2, AMPD3, NOG, SP6, AK124779 및 CSS3 또는, 이들의 조합. 상기 발현의 손실은 마커 유전자의 과메틸화로 인해 유발될 수 있다. 상기 과메틸화는 조절 부위 또는 아미노산 암호화 부위에서 일어날 수 있다. 상기 단계는 초기 TNM(종양, 절(node), 전이)단계이고, 선택적으로 상기 TNM 단계는 제 1기일 수 있다. 바람직하게는 상기 마커유전자는 TCF4. PRKDl, CYPlBl, LIMS2, ALOX5 또는 BACH2 또는, 이들의 조합일 수 있다. 본 발명의 한 구체적 실시예에서, 상기 마커유전자는 TCF4일 수 있으며, 바람직하게는 TCF4의 메틸화가 엑손 1에서 일어난 것일 수 있다.

나아가 상기에서 서술한 방법에서, 상기 위암은 장형일 수 있다. 바람직하게는 상기 마커 유전자는 TCF4, PRKDl, CYPlBl, LIMS2, ALOX5 또는 BACH2 또는, 이들의 조합, 바람직하게는 상기 마커 유전자는 TCF4이고, TCF4의 메틸화는 엑손 1에서 일어날 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 정상으로 나타나는 신체 시료의 위암 특이적 마커 유전자의 메틸화를 분석하는 것을 포함하는 발생 중인 위암이 있을 가능성을 진단하는 방법을 대상으로 한다. 상기 신체 시료는 고형 조직 또는 체액일 수 있다. 바람직하게는 상기 마커 유전자는 TCF4, PRKDl, CYPlBl, LIMS2, ALOX5 또는 BACH2 또는, 이들의 조합일 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은

(i)시료를 수용하여 구획화 할 수 있는 담체; 및,

(ii) 비메틸화된 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫 번째 용기, CpG-함유 핵산의 증폭을 위한 프라이머를 함유하는 두 번 째 용기 및 절단되거나 절단되지 않은 핵산의 존재를 탐지하기위한 매체를 함유하는 세 번 째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하는 키트에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 핵산은 위암의 탐지를 위한 마커 유전자 일 수 있다. 상기 키트에서, 상기 마커 유전자는 POPDC3. FLJ25393, LRRC3B, PRKDl, CYPlBl, LIMS2, DCBLD2, BC03644L ADCY 8, BACH2, ALOX5, TCF4, CXXC4, CAMK2N2, EMXl, KCNK9, NCAM2, AMPD3, NOG, SP6, AKl24779 또는 CSS3 또는, 이들의 조합일 수 있다. 상기 키트에서 핵산은 초기 위암의 탐지를 위한 마커 유전자 일 수 있다. 특히, 상기 마커 유전자는 TCF4, PRKDl, CYPlBl, LIMS2, ALOX5 또는 BACH2 또는, 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 상기 및 다른 목적은 하기 본 발명의 명세서, 본 발명에 첨부되는 인용된 도면 및 본 명세서에 추가된 청구항으로부터 더욱 완전히 이해될 것이다.

본 출원에 있어서, "하나의(a)" 및 "하나의(an)"은 단수 및 복수의 물체를 모두 지칭하는데 사용되었다.

본 명세서에서, "세포 변화"는 정상에서 비정상, 비-종양에서 종양, 분화 전에서 분화 후, 줄기 세포에서 비-줄기 세포와 같이 한 형태에서 다른 형태로 세포의 특성에서의 변화를 지칭한다. 나아가, 상기 변화는 세포의 형태, 세포의 표현형, 생화학적 특성 및 이와 같은 것에서 식별될 수 있다. 많은 예들이 있지만, 본 출원에서는 위조직에서의 비정상 및 암세포의 존재에 초점을 맞추고 있다. 이러한 조직변화에 대한 마커는 위암 세포 변화의 범위 안에 있다.

본 명세서에서, "탈메틸화 제제"는 화합물 또는 효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 핵산에서 메틸 그룹을 제거하거나, 메틸화가 일어나는 것을 막을 수 있는 모든 제제를 지칭한다. 상기 탈메틸화 제제의 예시는 5-아자사이티딘(5-azacytidine), 5-아자-2'-데옥시사이티딘(5-aza 2'-deoxycytidine; DAC), 아라비노후라노실-5-아자사이토신(arabinofuranosyl-5-azacytosine), 5-플루오로-2'-데옥시사이티딘(5-fluoro-2'-deoxycytidine), 피리미돈(pyrimidone), 트리플루오로메틸데옥시사이티딘(trifluoromethyldeoxycytidine), 슈도이소사이티딘(pseudoisocytidine), 디하이드로-5-아자사이티딘(dihydro-5-azacytidrne), AdoHcy와 같은 경쟁적 억제제로서 AdoMet/AdoHcy 아날로그, 시네펀진(sinefungin) 및 아날로그, 5'데옥시-5'-S-이소부틸아데노신(5'deoxy-5'-S-isobutyladenosine; SIBA), 5'-메틸티오-5'데옥시아데노신(5'-methylthio-5'deoxyadenosine; MTA), 에티오닌(ethionine) 아날로그, 메티오닌, L-시스-AMB, 사이클로루신(cycloleucine), 안티폴레이트(antifolates), 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 AdoMet의 수준에 영향을 주는 제제, AdoHcy의 수준에 영향을 주는 제제, AdoHcy 가수분해효소의 억제제와 같은 dc-AdoMet 및 MTA, 3-디아자-아데노신(3-deaza-adenosine), 네플라노신 A(neplanocin A), 3-디아자네플라노신(3-deazaneplanocin), 4'-티오아데노신(4'-thioadenosine), 3-디아자-아리스테로마이신(3-deaza-aristeromycm), 오르니틴 디카복실라아제(ornithine decarboxylase)의 억제제, α-디플루오로메틸오르니틴(α-difluoromethylornithine; DFMO), 스퍼민(spermine) 및 스퍼미딘(spermidine) 합성효소의 억제제, S-메틸-5'-메틸티오아데노신(S-methyl-5'-methythioadenosine(MMTA), L-시스-AMB, AdoDATO, MGBG, 메틸티오아데노신 포스포릴라아제(methylthioadenosine phosphorylase)의 억제제, 디플루오로메틸티오아데노신(difluoromethylthioadenosine; DFMTA), 메티닌(methinin), 스퍼민/스퍼미딘(spermine/spermidine), 나트륨 부틸레이트(sodium butyrate), 프로카인아미드(procainamide), 히드랄라진(hydralazine), 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), 자유라디칼 DNA 첨가제, 자외선, 8-히드록시 구아닌(8-hydroxy guanine), N-메틸-N-니트로소유레아(N-methyl-N-nitrosourea), 노보바이오신(novobiocine), 페리오바비탈(pheriobarbital), 벤조[자]피렌(benzo[a]pyrene), 에틸메탄설폰산(ethylmethansulfonate), 에틸니트로소유레아(ethylnitrosourea), N-에틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-ethyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), 9-아미노아크리딘(9-aminoacridine), 니트로겐 머스타드(nitrogen mustard), (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), 디에틸니트로사민(diethylnitrosamine), 클로르단(chlordane), N-아세톡시-N-2-아세틸아미노플루오렌(N-acetoxy-N-2-acerylaminofluorene), 아플라톡신 Bl(aflatoxin Bl), 날리딕산(nalidixic acid), N-2-플루오레닐아세트아민(N-2-fluorenylacetamine), 3-메틸-4'-(디메틸아미노)아조벤젠(3-methyl-4'-(dimethylamino)azobenzene), l,3-비스(2-클로르에틸)-l-니트로소유레아(l,3-bis(2-chlorethyl)-l-nitrosourea), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(4-nitroquinoline-1-oxide), N-니트로소디에틸아민(N-nitrosodiethylamine), 헥사메틸렌비스아세트아미드(hexamethylenebisacetamide), 레티노산(retinoic acid), cAMP를 함유한 레티노산, 방향족 탄화 수소 발암 물질(aromatic hydrocarbon carcinogens), 디부틸릴 cAMP(dibutyryl cAMP), 또는 메틸트랜스퍼라아제(methyltransferase)에 대한 안티센스 mRNA(Zingg et al ., 암발생, 18:5. pp. 869-882, I997)과 같은 뉴클레오티드 아날로그와 같은 다른 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 참조의 내용은 그 전체가, 특히, 게놈의 메틸화 및 이의 억제제에 대한 논의에 관하여 참조로써 통합된다.

본 명세서에서, 암의 "조기 탐지" 는 전이 전, 바람직하게는 개체의 조직 또는 세포의 형태학적 변화가 관찰되기 전에 암에 대한 가능성을 발견하는 것을 가리킨다. 나아가, 세포 변화의 "조기 탐지"는 세포가 형태학적으로 형질 전환되었다고 지정되기 전에 형질전환의 초기단계에서, 세포에서 형질전환이 일어날 가능성이 높은 것을 지칭한다.

본 명세서에서, "과메틸화"는 CpG 섬의 메틸화를 지칭한다.

본 명세서에서, "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 그의 인식부위에 CG를 포함하여, C가 메틸화 되었을 때, C가 메틸화되지 않았을 경우와 비교하여 그 활성이 변화되는 제한 엔도뉴클레아제이다. 바람직하게는, 상기 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제는 C가 메틸화되었을 때 활성이 억제된다(예를 들어, SmaⅠ). 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 특이적이고 제한되지 않는 예시는 SmaⅠ, BssHⅡ, 또는 HpaⅡ, BstUⅠ 및 NotⅠ을 포함한다. 상기 효소는 각각 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제는 당업자는 알 것이고, SacⅡ 및 EagⅠ를 포함하지만 이에 한정되지는 않으며, 예를 들면, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 "아이소스키조머(isoschizomer)" 는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제로서 동일한 인식 부위를 가지지만, MspⅠ와 같이 메틸화되거나 비메틸화된 CG를 모두 절단하는 제한 엔도뉴클레아제이다. 당업자라면 핵산을 절단하기 위한 제한 엔도뉴클레아제의 적절한 조건을 쉽게 결정할 수 있을 것이다.(Sambrook et al, Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989 참조).

본 명세서에서, "성향"은 개인이 장애를 가지게 될 것이라는 증가된 가능성을 가리킨다. 성향이 있는 개인이 아직 장애를 가지지 않음에도 불구하고, 상기 질병에 대한 증가된 성향이 존재한다.

본 명세서에서, "시료" 또는 "신체 시료"는 이에 있어 가장 넓은 의미로, 수행될 수 있는 분석의 타입에 따라 개인, 체액 세포주, 조직 배양으로부터 얻은 모든 생물학적 시료를 포함한다. 언급한 바와 같이, 생물학적 시료는 정액, 림프, 혈청, 혈장 등의 체액을 포함한다. 포유동물로부터 생체 조직 및 체액을 얻는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 위에서 유래한 생체 조직이 바람직하다.

본 명세서에서, "종양-근처 조직" 또는 "종양-근처 조직 쌍"은 암 조직 부위 근처의 임상적으로 및 형태학적으로 지정된 정상으로 나타나는 조직을 지칭한다.

위암 특이적 유전자 바이오마커

산발성 위암의 분자병리학적인 기계론적 통찰이 증가되고 있을지라도, 인간 위점막 조직에서 어떻게 암발생이 시작되는지에 대한 질문은 아직 모르는 채로 남아있다(1 Zheng et al ., 2004). 그러나 후생학적 변화가 사실상 모든 종양에서 전제조건인 것이 널리 받아들여졌고, 상기 후생학적 변화가 증식에 대한 이점으로 세포의 클론 증식을 통해 암 진행에서 추가적인 유전적 변화의 축적을 촉진한다(31 Grady, 2005).

RLGS 기술(19 Hatada 1991)은 위암에서 프로모터가 과메틸화된 신규 표적을 동정하고, 정상인 듯한 정상 점막뿐만 아니라 이에 상응하는 종양에서 프로모터의 과메틸화를 증명하기 위하여 사용되었다. 본 발명자들은 15쌍의 정상 및 종양 DNA에 대한 RLGS 프로파일로부터 1948개의 NotⅠ-위치를 비교하여 평균 3.3%가 메틸화된 것을 찾았다. 위암 세포주는 1차 종양과 비교한 세포주에서 전체적인 메틸화가 3배 더 증가한 것을 보이는, 평균 11.9%의 메틸화를 나타내었다. 상기 데이터는 암세포주가 원발성 악성 종양보다 더 높은 수준의 CpG 섬 과메틸화를 현저하게 보이는 이전의 관찰과 훌륭한 일치이고(26 Smiraglia et al., 2001; 32 Paz et al, 2003), 이는 세포주의 과메틸화 이벤트의 대부분이 배양 중의 성장과 같은 배경 이벤트로부터 초래될 수 있음을 시사한다. 사실, 72%의 세포주에서 메틸화된 위치는 실험한 15개의 초기 종양에서는 메틸화되지 않았다. 세포주에서 CpG 섬 과메틸화가 발견되었을지라도, 초기종양의 경우와는 상당한 차이가 있었고, 그럼에도 불구하고 상기 세포주는 특히, 과메틸화된 위치에 대하여 종양의 기원으로부터의 과메틸화 특성이 남아있었다(26 Smiraglia et al ., 2001). 따라서 위암에서 프로모터 과메틸화의 신규 표적을 동정하기 위하여 위암 세포 및 초기 종양에서 일치하게 메틸화된 위치를 선별하는 것이 중요하다.

본 발명자들은 이전에 발표된 논문으로부터 얻을 수 있는 서열 정보에서, 적어도 2개의 위암 세포주 및 두 개의 일차 종양에서 일치하게 메틸화된 NotⅠ-위치를 선별하였다(21 Costello et al ., 2000; 22 Rush et al ., 2004; 25 Kim et al ., 2006; 26 Smiraglia et al ., 2003 ; 27 Rush et al, 2001; 28 Dai et al., 2001). 이들 중, 절반은 이전의 보고들에서 다양한 종양에서 메틸화되는 것으로 기술되었다: 예를 들면, 3B79/NotⅠ-위치의 메틸화는 Master RLGS 프로파일의 3Cl8과 일치하고(21 Costello et al ., 2000), 전에 간암종에서 탐지된 적도 있다(20 Nagai): 상기 3C43 NotⅠ-위치의 메틸화(2D74 in Master RLGS 프로파일)는 유방암종, 대장암종 및 신경교종(21), 급성 골수성 백혈병(27 Rush et al., 2001)및, 만성 림프성 백혈병(22)과 같은 다양한 종양에서 탐지되었다. 그러나 40개의 NotⅠ-위치와 연결된 유전자 또는 mRNA 중에서, 위암 세포주에서 오직 55% (40개 전사체 중 22개)만이 RLGS 데이터의 NotⅠ 메틸화와 일치하게 발현의 변화성을 보여주었다. 나머지 유전자는 모든 세포주에서 모두 발현되지만, PCR 산물이 없고, NotⅠ-메틸화와의 연관성도 없는 것으로부터 그들의 발현은 NotⅠ-메틸화와 독립적이거나, 위점막에서 기능하지 않을 수 있음을 시사한다. 또 다른 가능성은 NotⅠ-위치 메틸화의 오판독 또는 부정확한 서열 정보일 수 있다. 게다가, 5-Aza-dC 및/또는 TSA 처리 후에 상기 22개 유전자는 유전자-특이적 또는 세포-특이적 방식에 의존하는 상응되는 비활동성 세포에서 복원되었다. 또한, 각 표적은 일차 종양에서 "발현의 손실"(LOE) 수준 및 NotⅠ-메틸화 사이의 강력한 양성 연관관계를 보여주었다. 그러므로 상기 결과는 선별된 유전자에서의 변종 메틸화 이벤트가 위암에서 전사에 영향을 미치고, 일정 범위에 대하여 위암발생에 연관되는 것을 가리킨다.

본 발명자들의 지식에 따르면, 상기 22개의 유전자는 위암 발생에 대하여 보고된 바가 없다. 상기 유전자 중에서, TCF4, SP6, EMXl 및 BACH2는 전사 조절에 관련된 전사인자로, POPDC3, KCNK9, NCAM2, DCBLD2, ADCY8, PRKDl, CSS3 및 LIMS22는 세포 성장 또는 신호 전달에 관련된 막통과 단백질로 NCBl 데이터베이스의 CGAP[암 유전자군 분석 프로젝트(Cancer Genome Anatomy Project)] 웹사이트 또는 존스 홉킨스 대학 및 생명정보학 연구소의 인간 단백질 참고 데이터베이스에 기초하여 분류할 수 있다. 또한, CAMK2N2. AMPD3, AWX5, CYPlBl, CXXCA 및 NOG는 신호 전달 또는 대사를 통해 세포 성장에 밀접하게 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 나머지 4개 유전자는 mRNA 서열 및 가상의 단백질에 대한 기능이 알려져 있지 않다. 그러므로 상기 선별된 유전자의 대부분은 세포 성장 또는 신호 전달 기능에 관련되어 있고, 또한 위암을 포함하는 다양한 암의 형태에서 종양 발생에 중요할 수 있다.

실험된 임상 시료에서, 이전의 연구에서 다양한 종양에서 비정상적인 메틸화로 인해 종종 감소되었던 CDHl 및 DAPK 발현 사이에 상당한 연관성이 있음을 발견하였다(33 Esteller et al ., 2001). 상기 데이터는 CDH1의 발현 억제는 종양의 깊이 및 전이와 상당히 연관되어 있음을 보여준다. 위암에서 CDH1의 LOE가 종양 전이 또는 미세-림프절 전이와 밀접하다는 것은 이전의 관찰 결과와 잘 일치한다(34 Cai et al., 2001). 그러나 CDHl 또는 DAPK는 본 발명에서 선별된 유전자와 어떤 다른 상관관계도 보이지 않았다. 대신에, 본 발명자들은 상기 선별된 유전자 발현 사이에서 상당한 연관 관계를, 특이적으로 TCF4 및 PRKDl, CYPlBl, LIMS2, ALOX5, 또는 BACH2 발현 사이에서의 상당히 높은 상관관계를 보였다. 특히, 초기 위암 또는 초기 TNM(종양, 절(node), 전이) 단계에서 CDH1의 그림과 비교하였을 때, TCF4의 LOE 는 상당히 높았다. 또한, TCF4 발현은 확장형보다 장형에서 상당히 감소되었다. 또한, 이러한 상황은 상기의 다른 선별된 유전자에 대해서도 찾을 수 있다(데이터는 보여주지 않음). 그러므로, 상기 데이터는 TCF4를 포함하는 상기 선별된 유전자의 비정상적 메틸화는 종양 전이 또는 위암발생 중의 전이보다 암의 시작 또는 초기 종양발생과 연관될 수 있다.

상기 인간 TCF4 유전자는 기본적인 헬릭스-턴-헬릭스 전사인자인 전사인자 4를 암호화한다. 상기 단백질은 처음에 면역글로불린 중쇄 인핸서의 mu-E5 모티프 및 경쇄 인핸서에서 발견되는 kappa-E2 모티프에 결합하는 '면역글로불린 전사인자 2'의 TIF2(35 Henthorn et al ., 1990) 또는 마우스 백혈병 바이러스(murine leukemia virus) SL3-3의 인핸서에서 당질코르티코이드 반응 인자(GRE)의 모티프에 결합하는 'SL3-3 인핸서 factors 2'의 SEF2(36 Corneliussen et al ., 1991)로서 알려졌다. TCF4가 Wnt/TCF 경로의 하류 표적인 β-catenin 조절에 결함을 가진 암세포의 성장 및/또는 생존을 촉진하기 위하여 다른 TCF(T cell factor) 표적 유전자와 협력하여 기능함으로써 암화 특성을 보인다는 내용이 최근 보고된바 있다(37 Kolligs et al ., 2002). 상기 암시는 본 발명에서 시험한 조직 시료에서 NotⅠ-메틸화와 연관되어 TCF4의 발현이 상당히 감소된다는 본 발명의 데이터 때문에 오히려 예상외였다. 임상 시료에서 TCF4 엑손 1의 메틸화 상태가 정량적으로 분석되었을 때, 많은 정상 점막에서도 양성 메틸화가 관찰되었다. 상기 메틸화는 '암세포 오염’ 또는 '암발생 효과 지역’때문일 수 있다(38 Slaughter et al ., 1953; 39 Braakhuis et al ., 2003). 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 정상인듯한 위조직(13.2%)과 비교하여, 초기 종양(34.7%)에서 전체적인 메틸화 상태가 상당히 높게 변화된 것을 확인하였고, 이는 TCF4 엑손 1이 암-특이적 형태로 메틸화되고, C형으로 분류될 수 있음을 가리킨다(16 Toyota et al ., 1999a). 게다가, 본 발명자들은 TCF4 엑손 1의 과메틸화 및 TCF4의 발현의 감소사이의 상당한 상관관계를 또한 확인하였다. 초기 또는 확산형에서는 각 파라미터들이 약간 높은 수준인 것을 보였으나, 종양 깊이에 대한 임상병리학적 파라미터 또는 로렌 분류(Lauren's classification) 사이의 평균 메틸화 수준에서 유의한 차이점을 찾지 못했다.

놀랍게도, 50세 이하의 14명의 환자로부터 유래한 정상인듯한 위조직에서는 탐지되지 않았던 TCF4 엑손 1의 메틸화가 50세 이상에서는 연령에 비례하여 점차적으로 증가하였다. 상기 데이터는 산발적 위종양의 발생율 이래로 종양 형성이 강력하게 연령과 연관되어 있고, 이는 50살 이후로 로그단위로 증가되는 것과 큰 관련성을 가지는 것을 나타낸다. 상기 데이터는 선종양 용종(polyps)과 같은 종양 형성의 초기단계 및 연령-연관 형태로 정상 결장 점막까지 포함하는 대장 암종에서 나타나는 ER-α 프로모터의 과메틸화를 설명한 기존의 보고와 일치한다(40 Issa et al ., 1994). 따라서, 본 발명의 결과는 정상인듯한 위점막에서의 양성 메틸화는 '종양 오염’이라기보다는 '암발생 효과 지역’때문이라고 할 수 있음을 강력히 시사한다. 이는 구강, 인두 중앙부(oropharynx) 및 후두(102), 폐(103), 식도(104), 외음부(105), 자궁경부(106), 대장(107), 유방(108), 방광(109)및 피부(110)과 같은 많은 기관계에서 설명되었던 암화의 영역에 대한 첫 번째 증거일 수 있다. 따라서, TCF4 유전자의 메틸화는 위암이 발병하기 쉬운 초기 이벤트 중 하나를 나타내는 것일 수 있다. 본 발명자들은 추가로 TCF4 엑손 1의 메틸화가 A형이라고 정의할 수 있는데(16 Toyota et al ., 1999a), 이는 상기 메틸화가 정상으로 보이는 조직에서뿐만 아니라 종양조직에서도 연령에 의존적으로 상당히 증가되기 때문이다. 특히, 흥미롭게도 70세 이후의 정상인듯한 위조직에서의 메틸화 상태는 50세 이하의 연령 그룹에서의 종양 조직에서의 그것과 매우 유사하다.

결론적으로, 본 발명자들은 RLGS 분석을 통하여 TCF4를 포함하는 22개의 신규 후생학적 표적을 선별하였다. 상기 TCF4에 대한 데이터는 유전적으로 또는 후생학적으로 변화된 세포 분야의 개발에 중요한 역할을 하는 발암 모델을 지지한다(39 Braakhuis et al ., 2003; 31 Grady, 2005). 개시 단계에서 정상 위점막 세포가 후생학적 변화를 획득하고, 변화된 딸세포의 클론 단위인 "패치" 를 형성한다. 상기 패치는 TCF4 엑손 1의 메틸화에 기초하여 인지될 수 있다. 상기 패치의 확산 영역으로의 전환은 상피 세포의 발암에서 논리적이고 결정적인 단계이다. 추가적인 유전적 또는 후생학적 변화가 상기 단계에서 요구되고, 이의 성장 용이성의 장점에의해, 증식 영역은 점차 정상 점막을 대체한다. 중요한 임상적 암시는 존재하는 부위 및 시간 간격에 따라 상기 영역이 종종 초기 종양의 외과수술 이후에도 남아 " 이차 초기 종양" 또는 "국부 재발"이라고 임상의에 의해 명명되는 새로운 암이 유발될 수 있다. 상기 후생학적 변화를 야기하는 근본적인 메카니즘이 소명되기 위해 남아있을지라도, 상기 메틸화된 유전자는 위암의 조기 탐지 및 예후의 바이오마커가 될 가능성을 가진다. 또한 영역의 탐지 및 관찰은 암 예방에 대한 깊은 관계를 가질 수 있다.

본 발명의 다른 실시예는 개체로부터 유래한 핵산을 함유하는 표본과 상기 표본에서 핵산의 메틸화 상태의 결정을 제공하는 제제와 접촉하고, 적어도 하나의 핵산에서 적어도 하나의 부위의 메틸화 상태를 확인하여, 상기에서 세포 증시 장애를 가지지 않는 개체의 같은 핵산의 같은 부위의 메틸화 상태와 다른 적어도 하나의 핵산의 적어도 하나의 부위의 메틸화 상태를 개체 내 위 조직의 세포 증식 장애의 지표로 선별하는 것을 포함하는 개체 내 위 조직의 세포 증식 장애를 진단하기 위한 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 방법은 개체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함한다. 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 본 명세서에서 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 단편, 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낼 수 있는 게놈 또는 합성에 기원한 DNA 또는 RNA, 펩티드 핵산(PNA), 또는 천연 또는 합성에 기원한 모든 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질을 지칭한다. 당업자라면, 상기 핵산이 RNA일 때, 상기 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T가 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 각각 대체되는 것을 쉽게 이해할 것이다.

상기 관심있는 핵산은 다르게 메틸화된 CpG 섬의 존재를 탐지하는데 바람직한 모든 핵산일 수 있다. 상기 CpG 섬은 핵산 서열에서 CpG 풍부 부위이다.

메틸화

표적 위치(예를 들어, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산 서열을 함유하거나 함유하는 것으로 여겨지도록 제공되는, 정제되거나 정제되지 않은 모든 핵산 시료는 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 다르게 메틸화될 수 있는 하나의 핵산 부위는 데옥시뉴클레오티드 CpG의 다른 핵산 부위와 상대적으로 밀도가 증가된 핵산 서열인 CpG 섬이다. 상기 CpG 중첩(doublet)은 척추동물 DNA에서 오직 20%의 빈도로 일어나고, GT 염기쌍의 비율로부터 추정될 것이다. 이는 상기 CpG 중첩의 밀도가 예측된 수치에 이르는 부위에서는 게놈의 나머지 부위와 비교하여 10배 더 증가된다. CpG 섬은 전체 DNA에서 40%인 것에 비하여 60%의 평균 G*C 구성을 가진다. 상기 섬은 일반적으로 약 1 내지 2 Kb 길이의 DNA 범위의 형태를 가진다. 인간 게놈에는 그와 같은 섬이 대략 45,000개 있다.

많은 유전자에서, 상기 CpG 섬은 프로모터 바로 전의 상류에서 시작하여 전사된 부위의 하류까지 확장된다. 프로모터 부위의 CpG 섬의 메틸화는 일반적으로 유전자의 발현을 방해한다. 상기 섬은 또한 유전자를 암호화 하는 부위의 5' 부위뿐만 아니라 상기 암호화 부위의 3' 부위의 주위일 일 수 있다. 따라서 CpG 섬은 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위에서 암호화 서열의 상류, 암호화 부위(예를 들어, 엑손), 예를 들면, 인핸서 부위와 같은 암호화 부위의 하류 및 인트론을 포함하는 핵산 서열의 다중 부위에서 발견될 수 있다.

일반적으로, 상기 CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA, 또는 DNA 및 메신저 RNA를 포함하는 RNA를 포함하는 시료를 사용할 수 있으며, 상기 DNA 또는 RNA는 단일 사슬 또는 이중 사슬일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 혼성체를 시료에 포함할 수 있다. 상기 핵산의 혼합물이 사용될 수 있다. 상기 특이적 서열이 전체 핵산을 구성하도록, 상기 특이적 핵산 서열은 더 큰 분자의 분획에서 탐지되거나 처음에는 불연속적인 분자로써 나타날 수 있다. 상기 서열은 처음에 순수한 형태로 제공되어 조사할 필요는 없다; 상기 핵산은 전체 인간 DNA를 함유하는 것과 같은 복합혼합물의 비주류 분획일 수 있다. 상기 시료에 함유된 핵산의 메틸화 상태의 탐지 또는 메틸화된 CpG 섬의 탐지에 사용되는 상기 핵산-함유 시료는 Sambrook 등에 의해 기술된 것과 같은 다양한 기술에 의해 추출될 수 있다(Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; incorporated in hs entirety herein by reference).

핵산은 정보 암호화 부위에 직접 또는 상기 핵산의 전사를 조절하는 DNA 부위인 조절 부위를 포함할 수 있다. 조절 부위는 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. "프로모터"는 세포-형태 특이적, 조직-특이적으로 조절되거나 외부 신호 또는 제제에 의해 유도될 수 있는 프로모터-의존적 유전자 발현을 하기 위한. 전사를 감독하기에 충분한 최소한의 서열이다. 프로모터는 유전자의 5' 또는 3' 부위에 위치될 수 있다. 몇몇 핵산의 전체 또는 일부의 프로모터 부위에서 CG-섬 부위의 메틸화를 검사할 수 있다. 게다가, 표적 유전자 프로모터의 메틸화는 자연적으로 외측 경계선에서 안쪽으로 진행되는 것으로 일반적으로 인식된다. 그러므로 세포 변화의 조기 단계는 유전자의 아미노산 암호화 부위, 특히 엑손 부위뿐만 아니라 프로모터 부위의 바깥 지역의 메틸화를 분석함으로써 탐지될 수 있다.

개체로부터 분리된 핵산은 개체로부터 유래한 생물학적 표본에서 얻어진다. 위암 또는 위암 진행 단계를 탐지하길 원한다면, 상기 핵산은 긁어내거나 생체 검사를 실시하여 위조직으로부터 분리될 수 있다. 상기 표본은 당업자에게 알려진 다양한 의학적 절차에 의해 얻어질 수 있다.

본 발명의 구체적 실시예에서 상기 개체로부터 얻은 시료의 핵산에서 메틸화 상태는 위 조직의 세포 증식 장애를 가지지 않는 개체에서 유래한 핵산의 같은 부위와 비교된 과메틸화이다. 본 명세서에서 과메틸화는 하나 이상의 핵산에서 메틸화된 대립 유전자가 존재하는 것이다. 위 조직의 세포 증식 장애를 가지지 않는 개체로부터 유래한 핵산은 실험된 같은 핵산에서 메틸화된 대립 유전자가 탐지되지 않는 것을 포함한다.

유전자 마커 명칭

본 출원에서 사용된 하기 유전자 기호는 하기와 같이 식별된다. 접근 번호는 켈리포니아 산타 크룩스 대학(University of California Santa Crux, UCSC)의 NCBI에서 관리하는 데이터 베이스에 근거 한 것이다:

POPDC3, NCBl RefSeq. NM_022361, " 뽀빠이 도메인-함유 단백질 3".

FLJ25393, NM . 181645.3, "코일드-코일 도메인 함유 67"

LRRC3B, NM_052953, "루신 리치 반복 함유 3B"

PRKDl, NM JX)2742, "단백질 키나아제 Di"

CYPI BI. NMJXM)104. "사이토크롬 P450, 패밀리 1, 서브패밀리 B, 폴리펩티드 1"

L1MS2, NMJ)17980, "LIM 및 노화 세포항원-유사 도메인 2"

DCBLD2, NM080927, "디스코이딘, CUB 및 LCCL 도메인 함유2"

BC036441, XR_04l995, "이론상의 단백질 LOC149351"

ADCY8, NM 001115. "아데닐레이트 사이클라아제 8"

B ACH2, NM J>21813, "BTB 및 CNC 유사체 I, 기본 루신 지퍼"

ALOX5, NM JJ00698, "아라키도네이트 5-리폭시제나아제"

TCF4: NM_001083962, ''전사인자 4"

CXXC4, NM 025212, "CXXC 핑거 4"

CAM K2N2, NM^033259y "CaM-KH 억제 단백질"

EMX 1, NM_004097, "엠티 스피라클 유사체 1 "

KCNK9, NM O 16601, "칼륨 채널, 서브패밀리 K, 멤버 9"

NCAM2, NM_004540, "신경 세포부착 분자 2 전구체"

AMPD3, NM 000480, "적혈구 아데노신 일인산 디아미나아제"

NOO, NMm(K)5450, "노긴 전구체 '

SP6, NM_ 199262, " Sp6 전사인자"

AK124779, XM 001719287, "히포테티칼 단백질 LOClOO] 28675"

CSS3 JNM J 75856, "콘드로이틴 솔레이트 합성효소 3".

시료

본 출원은 위암의 조기 탐지에 대해 기술한다. 위암 특이적 유전자의 메틸화가 기술되었다. 본 출원은 위암 특이적 유전자의 메틸화는 또한 종양 부위 근처의 조직에서도 일어나는 것을 보여주었다. 그러므로 위암의 조기 탐지를 위한 방법에서, 액상 조직 또는 고형 조직을 포함하는 모든 신체 시료에서 위-특이적 유전자의 메틸화 여부를 조사할 수 있다. 이러한 시료는 혈청 또는 혈장을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 프라이머는 "실질적으로" 증폭될 위치의 각 사슬에 상보적이고, 상술한 바와 같이 G 또는 C 뉴클레오티드를 적절히 포함하도록 설계되었다. 이는 상기 프라이머가 중합을 실시하기 위한 제제가 있는 조건하에서 충분히 그들의 각자 사슬에 상보적으로 혼성화되어야만 하는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 표적 위치의 양이 반응 단계에서 포함된 수에 비하여 기하 급수적으로 증가하는 효소 연쇄 반응 과정인 증폭 과정에서 사용될 수 있다[예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)]. 전형적으로, 하나의 프라이머는 상기 위치의 역방향(-) 사슬에 상보적이고(안티센스 프라이머) 다른 것은 정방향(+) 사슬에 상보적이다(센스 프라이머). 상기 프라이머가 변성된 핵산과 어닐링(Annealing)한 다음 Taq 중합효소와 같은 효소 및 뉴클레오티드로 증폭되고, 그 결과 상기 표적 위치 서열을 포함하는 + 및 - 사슬이 새로 합성되었다. 상기 새로 합성된 서열 또한 주형이 될 수 있기 때문에, 변성, 프라이머 어닐링 및 증폭의 순환이 반복되어 상기 프라이머에 의해 결정된 부위(예를 들어, 표적 위치 서열)의 산물이 기하 급수적으로 증가되었다. 상기 연쇄 반응 산물은 사용한 상기 특이적 프라이머의 말단에 상응하는 말단을 가진 불연속적 핵산 이중쇄(duplex)이다.

바람직하게는, 상기 증폭 방법은 상기에서 기술한 바 및 당업계에서 통상적으로 사용되는 일반적인 방법인 PCR에 의해 수행된다. 그러나 증폭의 대안적인 방법이 종래 기술된 바 있으며, 실시간 PCR 및 등온 효소를 이용한 선형 증폭과 같은 것도 사용될 수 있다. 또한, 다중 PCR 반응도 사용될 수 있다.

메틸화 차이의 탐지- 중아황산염 서열분석 방법

메틸화된 CpG-함유 핵산을 탐지하기 위한 다른 방법은 핵산-함유 표본 및 비메틸화된 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키고, 메틸화되거나 메틸화되지 않은 변형된 핵산 사이를 구별하여 메틸화된 핵산을 탐지할 수 있는 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 상기 표본의 CpG-함유 핵산을 증폭하는 것을 포함한다. 상기 증폭 단계는 선택적이고 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 메틸화되거나 메틸화되지 않은 변형된 DNA 사이를 구분하여 스스로를 PCR 반응 하는 것에 차이가 있다. 이러한 방법은 미국 특허 제 5,786,146호의 구성에 기술되어 있고, 상기 내용은 그들 전체 특히, 메틸화된 핵산의 탐지를 위한 중아황산염 서열분석에 관련된 부분이 본 명세서에 통합된다.

기질

상기 표적 핵산부위가 한번 증폭되면, 상기 핵산은 상기 핵산 서열의 존재를 탐지하기위해 고체 지지체에 고정된 공지의 유전자 프로브와 혼성화된다.

본 명세서에서 "기질"은 기질, 구조, 표면 또는 물질에 대한 참조에서 사용될 때, 상기 표면, 구조 또는 물질을 포함하는 다른 분자 종의 수를 초과하는, 지금까지 특이적 결합, 혼성화 또는 효소 인지 부위 또는 복수의 다른 인식 부위 또는 다수의 다른 인식 부위를 구성하는 것으로 알려져 있지 않은 비생물학적, 합성, 무생물, 평면, 구형 또는 납작한 표면을 포함하는 조성물을 의미한다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, 합성(유기)물질, 합성 반도체, 절연체 및 도팡트(dopants, 반도체 첨가용 미세 불순물); 금속, 합금, 요소, 화합물 및 미네랄; 합성, 절단, 에칭, 석판인쇄, 인쇄, 기계화 및 미세섬유화된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 공업용 중합체, 플라스틱, 막; 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹스; 목재, 종이, 판지, 면, 울, 천, 직물 및 부직포 섬유, 물질 및 직물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

막의 몇 가지 형태가 핵산 서열에 결합하는 것으로 당업계에 알려져 있다. 상기 막에 특이적이지만, 제한되지 않는 예시는 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐클로라이드, 디아조타이즈 종이 및 다른 GENESCREEN™, ZETAPROBE™(Biorad) 및 NYTRAN™와 같이 시판되는 막과 같이 유전자 발현의 탐지에 사용되는 다른 막을 포함한다. 비드, 유리, 회로판 및 금속 기질이 포함된다. 상기 물체에 핵산을 부착하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 대안적으로 액체상에서 스크리닝을 수행할 수 있다.

혼성화 조건

핵산 혼성화 반응에서, 엄중한 특정 수준을 달성하기 위한 상기 조건은 혼성화 조건의 선별에서 예를 들면, 길이, 상보성의 정도, 뉴클레오티드 서열 조성물(예를 들어, GC 또는 AT 함유량) 및 핵산에서 혼성화가 일어날 부위의 핵산 형태(예를 들어, RNA 또는 DNA)와 같이 혼성화되는 핵산의 특성에 따라 고려하여 변경될 것이다. 추가적인 고려사항은 핵산 중 하나가 예를 들면, 필터에서 이동할 수 있는지 여부이다.

점차적으로 높은 엄중한 조건의 예시는 하기와 같다: 상온에서 2× SSC/0.1% SDS(혼성화 조건); 상온에서 0.2× SSC/0.1% SDS(낮은 엄중한 조건); 42℃에서 0.2× SSC/0.1% SDS(중간의 엄중한 조건); 및 68℃에서 0.1× SSC(높은 엄중한 조건).세척은 예를 들면, 높은 엄중한 조건과 같이 상기 조건 중 오직 하나를 사용하거나, 예를 들면, 각각 10-15 분 씩 상기에서 나열된 순서대로, 상기에서 나열된 어느 하나 또는 모든 단계를 반복하는 것과 같이 각각의 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 그러나 상술한 바와 같이, 최적의 조건은 특정 혼성화 반응이 포함되는지에 따라 변경될 것이고, 경험적으로 결정될 수 있다. 일반적으로 높은 엄중한 조건은 관심 프로브의 혼성화를 위해 사용된다.

표지

상기 관심 프로브는 예를 들면, 방사성 동위 원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 탐지가능하게 표지될 수 있다. 당업자라면 상기 프로브에 결합하기 위한 알맞은 표지를 알 것이고, 통상적으로 사용되는 실험을 통해 이를 확인할 수 있을 것이다.

키트

본 발명의 방법은 키트의 제조에 이상적으로 적합하다. 따라서 본 발명의 다른 실시예에 따라, 개체 내 세포 증식 장애의 탐지에 유용한 키트를 제조할 수 있다. 본 발명의 키트는 시료를 수용하여 구획화할 수 있는 담체, 비메틸화된 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫 번째 용기, CpG-함유 핵산의 증폭을 위한 프라이머를 함유하는 두 번 째 용기 및 절단되거나 절단되지 않은 핵산의 존재를 탐지하기위한 매체를 함유하는 세 번 째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 본 발명에 따른 용도에 일치되는 프라이머는 본 출원에서 상술한 바와 같이, 모든 기능적 조합 및 이의 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 기능적 조합 또는 단편은 프라이머가 게놈의 부위에서 메틸화가 일어났는지 여부를 탐지하기 위해 프라이머로서 사용될 그의 능력을 가리킨다.

담체 수단은 유리병, 튜브 등과 같은 용기 수단을 하나 이상 포함하고, 상기 용기 수단의 각각은 본 발명에서 사용될 개별 요소의 하나를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법을 설명하는 관점에서, 당업자는 상기 용기 수단 중에서 필요한 제제의 배분을 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기 용기 수단의 하나는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 함유하는 용기를 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 용기 수단은 관심 위치에 상보적인 프라이머를 포함할 수 있다. 게다가, 하나 이상의 용기 수단은 또한 메틸화 민감성 제한 효소의 아이소스키조머(isoschizomer)를 포함할 수 있다.

본 발명은 하기 상세한 설명 및 한 예시로써 첨부된 도면에 의해 더욱 완전히 이해될 수 있으나, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다;

도 1A-1B는 위암에서 NotⅠ-EcoRV-HmfL 제한 효소를 이용한 RLGS 프로파일을 나타낸다. (A) 대략 2,300개 NotⅠ 절편을 나타내는 정상 점막의 표준 RLGS 프로파일. 다른 시료의 RLGS 프로파일과 비교하였을 때, 각각의 스폿은 3 차원 명칭을 부여받는다(Y 축, X 축, 스폿 번호). 상기 본 발명의 모든 비교에 사용된 RLGS 프로파일의 중앙 부위는 본 발명자들의 이전의 연구에 의한 1,948개 스폿(25 Kim et al ., 2006)을 포함하는 30개 구획을 가진다(1-8 세로, A-D 가로). (B) 확대도의 RLGS 프로파일 사이의 비교를 위한 대표적인 예시. 각각의 화살표는 종양에서 정상인 경우와 비교하여 감소된 세기를 가지는 정상 조직의 RLGS 스폿을 가리킨다. 상기 스폿은 상응되는 위암 세포에서 완전히 소멸되었거나 감소되었고(세포), 세포 및 정상 DNA를 상기 스폿의 위치를 확인하기 위해 혼합하였을 때, 대략 절반의 세기를 보였다(세포+정상).

도 2A-2C는 위암 세포에서 NotⅠ-메틸화로 선별된 유전자를 나타낸다. (A) RT-PCR 분석을 통한 11개 위암 세포주 사이의 유전자 발현의 가변성. 본 발명에서 선별된 상기 유전자 또는 mRNA의 좌측에 기호 또는 접근 번호를 나타내었다. 위암 세포주는 각 레인의 상부에 나타내었다. (B) 약물 치료 이후의 재활성화 분석. 상기 분석은 SNUOOl, SMJ601 및 SNU638의 세 가지 위암 세포주에서 수행되었다. 5-AZA 및 TSA는 5-아자-2'-(5-aza-2'-deoxycytidine) 및 트리코스타틴 A(trichostatin A)의 약어이다. (C)초기 종양에서 '발현의 손실'(LOE) 및 NotⅠ-메틸화 사이의 상관관계. 유전자는 표 1의 마지막 단에서 LOE의 높은 순서로 오른쪽에서 왼쪽으로 배열하였다. 비교를 위하여, NotⅠ-메틸화의 %를 표 1의 3번 째 단에서 임의로 계산하여 각 유전자에 대한 LOE의 옆에 배열하였다. 열린 또는 닫힌 사각형은 RLGS를 통해 LOE의 % 및 NotⅠ-메틸화의 %를 각각 나타낸다. 상기 LOE 및 NotⅠ-메틸화 수치는 각 유전자별로 나타내었고, 직선 회귀 분석을 통해 두 수치 사이에 높은 상관관계가 있음을 보여준다.

도 3A-3C는 선별된 유전자 사이의 유전자 발현의 상관관계 및 위암발생에서 CDHl 및 TCF4 발현의 비교를 나타낸다. (A) PRKDl, CYPlBl, LIMS2, ALOX5 및 BACH2 와 TCF4의 강력한 상관관계를 상부에 나타내었다. 중앙의 도는 CDHl 및 DAPK 사이의 강력한 상관관계를 나타내지만, 상기 두 유전자와 TCF4는 상관관계가 없었다. 또한, PRKD11 CYPlBl, LIMS2, ALOX5 및 BACH2과 CDH1이 상관관계가 없는 것을 하부 에 나타내었다. 상기 도는 표 2의 데이터를 나타낸 것이다. (B) 96 쌍의 시료에서 CDH1 발현의 비교. 정량화는 실시간 RT-PCR을 통해 이루어졌고, 각 종양의 GAPDH 발현에 의해 평준화된 각 발현값을 정상 조직에서 상기와 같이 평준화된 값으로 나누었다. 상자는 25번째 내지 75번째 백분위수를 가리키고, 별표는 90번째 및 10번째 백분위수를 가리킨다. 평균 발현값은 각 견본 그룹 사이의 스튜던트 t-검증(Student's t test)로 비교하였다: 조기 위암(EGC) 및 발달된 위암(AGC); 4 가지의 TNM 단계(I, IL IH 및 IV); 장형(I)및 확산형(D). 각 종양 형태별로 아래 괄호에 표시된 번호는 실험한 시료의 번호를 가리킨다. (C) 96쌍의 시료에서 TCF4 발현의 비교. 견본 그룹 사이의 도식화(Plotting)및 통계학적 비교는 상기와 동일한 절차로 수행하였다.

도 4A-4G는 TCF4 엑손 1의 메틸화 분석을 나타낸다.(A) TCF4의 유전자 구조에 기초한 메틸화 분석을 위한 전략. UCSC 게놈 생명정보학 데이터베이스에 따르면, TCF4 유전자는 인간 염색체의 18p 11.21에 위치한 360 Kb 길이의 19개 엑손을 포함하고, 전사 시작위치로부터 1.5 kb 떨어진 부위에서 전형적인 CpG 섬(CpG30)이 발견된다. 본 발명에서 클론된 NotⅠ 서열(6B54)은 인트론 7에 위치하고, 다른 CpG 클러스터는 상기 엑손 1을 포함하는 5'-상류 부위에서 발견할 수 있다. (B) 11개 위암 세포주에서 인트론 7의 NotⅠ 부위 및 엑손 1·의 CpG 클러스터 부위에 대한 메틸화-특이적 PCR을 수행하였다. 상기 결과는 TCF4 발현과 RT-PCR을 통해 비교하였다. 위암 세포주는 각 레인의 상부에 나타내었다. N은 정상 조직을 가리킨다. (C) TCF4 엑손 1의 파이로시퀀싱 결과. 도 4A에 나타나는 TCF4 엑손 1 서열에 기초 하여, 7개 CpG 부위의 정량적 메틸화 상태를 10가지 위암 세포주에서 파이로시퀀싱 분석을 통해 분석하였다. 각 세포주는 왼쪽에, 7개 CpG 부위의 메틸화의 평균%는 오른쪽에 나타내었다. (D) 85 쌍의 정상 및 종양 DNA에서 메틸화 상태의 쌍(Pairwise) 비교. 메틸화의 평균 %는 13.2%였지만, 종양 DNA에서는 34.7%로 상당한 차이를 보였다(Student's t test, P>0.0001). (E) TCF4 발현과 TCF4 엑손 1 메틸화의 상관관계. 비교를 위하여, 종양에서의 메틸화 정도에서 정상 DNA의 메틸화 정도를 뺀 다음, 음성적 상관관계를 나타내는 실시간 RT-PCR을 통해 상대적 발현을 플로팅(plotting)하여 각 시료 쌍의 상대적 메틸화를 결정하였다. (F) 85 쌍의 시료에서 TCF4 엑손 1 메틸화의 비교. 상자 및 별표는 메틸화의 평균 % 및 각 견본 그룹의 표준편차를 가리킨다. EGC 및 AGC 그룹 또는 장형(I) 및 확산형(D) 사이의 유의한 차이는 없었다. 하지만, 정상 및 종양 DNA에서 환자 연령 그룹에 따라 메틸화의 점진적인 변화가 있었다. (G) 연령과 TCF4 엑손 1 메틸화의 상관관계. 연령에 따른 메틸화의 회귀 결과는 왼쪽에 정상 DNA, 오른쪽에 종양 DNA를 나타내었다. 상기 모두 상당한 상관관계를 나타내었다.

도 5A 내지 도 5K는 (A)CDHl, (B)DAPK, (C)ALOXS, (D)BACH2, (E)CYPlBl, (F)LIMS2, (G)PRKDl, (H)TCF4, (I)POPDC3, (J)FLJ25393 및 (K)LRRC3B를 포함하는 다양한 유전자의 메틸화 분석을 나타낸다-막대 쌍 아래의 그래프는 정상 및 종양 DNA 쌍의 메틸화 상태의 쌍(pairwise) 비교를 나타낸다. 정상 및 종양 막대 아래의 그래프는 정상 DNA 및 종양 DNA에서 연령에 따른 메틸화의 상관관계 및 회귀 결과를 각각 보여준다. 상관관계 아래의 그래프는 유전자 발현과 메틸화의 상관관계를 보여준다. 비교를 위하여, 종양에서의 메틸화 정도에서 정상 DNA의 메틸화 정도를 뺀 다음, 음성적 상관관계를 나타내는 실시간 RT-PCR을 통해 상대적 발현을 플로팅(plotting)하여 각 시료 쌍의 상대적 메틸화를 결정하였다.

본 발명의 범위는 본 명세서의 특정 실시예에 의해 제한되지 않는다. 사실, 본 발명의 다양한 변형은 본 발명에서 전술한 설명과 함께, 당업자에 의해 명백히 설명될 것이다. 이와 같은 변형은 본 발명에 추가된 청구의 범위에 포함될 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 제한하지는 않는다.

실시예 1. 재료 및 방법-세포주 및 조직 시료

본 발명에서 사용된 상기 인간 위암 세포주는 한국 세포주 은행 및 상기에서 기재한 곳에서 얻었다(23 Park et al, 1990, 24 Park et al ., 1997). 신선한 위종양과 짝을 이루는 정상 근처 조직은 대한민국 대전시의 국립 충남대 병원(CNUH)의 위조직 은행으로부터 얻었다. 15 쌍의 위종양 및 정상 조직 시료를 RLGS 분석에 사용하였다. 정량적 유전자 발현 및 메틸화 분석에 96 쌍의 위종양 및 정상 조직 시료를 사용하였다. 상기 시료는 29 내지 82세 연령(평균 58.2세)의 30 명의 여성 및 66명의 남성으로부터 분리된, 35개의 TNM 1기, 15개의 2기, 33개의 3기 및 13개의 4기 종양을 포함한다. 각 환자로부터 고지(告知)에 입각한 동의를 얻었고, CNUH의 의학연구윤리심의위원회는 이에 대한 사용을 승인하였다. 모든 표본은 액체 질소에 재빨리 얼린 후 DNA 및 RNA 추출물 상태로 -80℃에 보관하였다.

실시예 2. RLGS 분석

고분자량 DNA를 표준 프로토콜에 의해 추출하였고, 이전에 설명된 바와 같이 RLGS를 수행하였다(19 Hatada et al ., 1991). RLGS는 초기 종양 및 정상 조직 쌍의 시료로 전개되었다. 세포주의 DNA는 또한, 상기 세포주의 RLGS 프로파일에서 감소되거나 없어진 스폿의 정확한 지점을 결정하기 위하여 세포주 DNA 단독 및 상기 세포주의 혼합된 DNA 쌍에서 전개시켰다. 초기 위종양 및 정상 조직으로부터 또는, 세포주 및, 혼합된 DNA 및/또는 정상조직으로부터의 RLGS 프로파일 쌍은 압도되었고, 두 프로파일 사이의 차이점을 가시적 정밀 검사에 의해 탐지되었고, 두 조사자에 의해 개별적으로 평가되었다. 스폿의 고밀도 또는 저분해능으로 인한 어려움을 제거하기 우하여 다른 시료로부터의 RLGS 프로파일의 유일한 비교를 하기 위해, 본 발명자들은 본 발명자들이 이전에 연구해서 밝혔던(25 Kim et al ., 2006), RLGS 프로파일의 중앙 위치를 포함하는 1948개 스폿을 비교하였다.

실시예 3. 위암에서 메틸화된 Not Ⅰ-위치의 선별

메틸화 분석에서 RLGS를 사용하는 것의 이점의 하나는 배열된 플라스미드 라이브러리를 이용하여 관심있는 클론 위치를 확인할 수 있는 것이다. 스폿 세기에서 차이점은 정상 및 조양 시료 또는 정상 조직 및 세포주 쌍 사이에서 탐지되고, 본 발명자들은 상기 스폿을 서열정보를 얻기 위해 이전의 마스터 RLGS 프로파일(21 Costello et al ., 2000) 또는 본 발명자들의 RLGS 프로파일(25 Kim et al .,2006)과 비교하였다.

실시예 4. 역전사 - PCR

NotⅠ 위치의 주변부에서 NotⅠ-메틸화 및 유전자 발현억제 사이의 연관 관계를 확인하기 위하여 위암 세포주의 RNA와 함께 각각 선별된 유전자에 대하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 5μg의 DNase-처리된 RNA의 역전사는 20 ㎕ 반응 부피에서 Superscript Il 역방향 transcriptase(Invitrogen)을 이용하여 실시하였다. 1 ㎕의 상기 역전사 반응물은 Platinum Taq DNA 중합효소(Invitrogen)를 이용하여 증폭에 사용되었다. 증폭은 하기와 같이 수행되었다: 94℃에서 30초 간 변성, 프라이머 특이적 어닐링 온도에서 30초 간 어닐링 및, 72℃에서 45초 간 증폭. 모든 반응은GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer Corp.)에서 수행되었다. 상기 PCR 산물의 5 ㎕은 0.8% 아가로즈 겔에서 전개시킨 다음, EtBr 염색으로 가시화하였다. GAPDH 유전자는 각 시료의 역전사된 주형의 양을 비교하기 위한 대조군으로서 사용되었다.

실시예 5. 세포주에서 약물 치료

SNUOOl, SNU60L 및 SNU668의 세 가지 위암 세포주에 탈메틸화 제제로서 5-aza-2'-deoxycytidine(5-Aza-dC; Sigma), HDAC 억제제로서 trichostatin A(TSA; Sigma)를 처리하였다. 상기 세포들에서 선별된 유전자의 복원을 확인하기 위하여, 각 세포를 1 x 10⁵ 세포s/100-mm 디쉬의 밀도로 깐 다음, 24시간 동안 배양한 뒤, 1 μM 5-Aza-dC에서 72시간 동안 배양하였다. 또한, 다른 세포는 250 nM TSA에서 24시간 동안 배양하거나, 5-Aza-dC를 72시간 동안 처리한 세포를 24시간 더 배양하였다. RNA를 준비한 뒤, 전술한 바와 같이 유전자-특이적 프라이머 세트를 l용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다. 또한, GAPDH 유전자는 대조군으로써 사용되었다.

실시예 6. 초기 종양에서 정량적 실시간 RT - PCR

'발현의 손실 수준'(LOE)은 임상 시료 세트에서 RT-PCR 분석을 통해 선별된 유전자 또는 mRNA에 대하여 정량적으로 측정되었다. 96 쌍의 정상 및 종양 시료로부터 유래한 전체 RNA를 Qiagen RNeasy Kit(Qiagen)를 사용하여 분리되었고, 첫-사슬 cDNA를 합성하였다. 상기 반응은 96-웰 기반 Exicycler apparatus(Bioneer, 한국)에서 AccuPower HotStart PCR PreMix(Bioneer, 한국) 및 SYBR green 염색약을사용하여 제조업체의 설명서에 따라 수행되었다. 상기 데이터는 회사에서 제공된 graphic user interface(GUI)-기반 운용 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 모든 유전자 발현의 수준은 주기 역치(cycle threshold, CT) 수치로 나타내었으며, GAPDH 유전자 발현 수준에 따라 평준화시켜 각 종양에서의 발현량을 정상에서의 발현량에 대한 상대값으로 나타내었다. 그러고나서 본 발명자들은 각 종양의 발현 수준이 쌍을 이루는 정상 조직과 비교하여 절반 이하일 때 비정상적 LOE라고 임의로 명명하였다.

실시예 7. 메틸화 민감성-PCR( MS - PCR )

두 개의 게놈 부위를 신규 후생학적 표적인 전사인자 4 유전자(TCF4)의 유전자 발현 억제와 메틸화 사이의 연관관계를 학인하기 위하여 선택되었다: 하나는 인트론 7에서 유래한 NotⅠ 클론이고, 다른 하나는 상기 엑손 1을 포함하는 5'-상류 부위로부터 유래한 것 이다(도 4A). DNA는 Hz DNA 메틸화 Kit(ZYMO Research)를 이용하여 제조업체의 설명서에 따라 나트륨 중아황산염으로 변형되었다. 본 발명자들은 Methprimer program을 사용하여 메틸화 특이적-PCR(MSP)를 위한 프라이머를 디자인 하였다: 엑손 1의 메틸화된 서열에 대하여, TCF4-엑손 1-MF(정방향), 5'-GAATTTGTAATTTCGTGCGTTrC-3')(서열번호 l), TCT4-엑손 1-MR(역방향), 5'-AAA AA AAAtTCTCCGTAC ACCG-3'(서열번호 2) 및 258 bp의 PCR 산물 길이; TCF4 엑손 1의 비메틸화된 서열에 대하여-UF(정방향), 5'-TGAATrTGTAATπTGTGrGTπTG-3'(서열번호 3), TCF4-엑손MJR(역방향), 5'-AAAAAAAACTCTCCATACACCACC-S'(서열번호 4) 및 259 bp의 PCR 산물 길이; 인트론 1의 메틸화된 서열에 대하여, TCF4-int7-MF(정방향), 5'-TTAATTTTAGAGTGGAGAACGTGC-3')(서열번호 5), TCF4-int7-MR(역방향), 5'-AAATAΛCAATACGACCCGCC-3'(서열번호 6) 및 198 bp의 PCR 산물 길이; 인트론 7의 비메틸화된 서열에 대하여, TCF4-int7-UF(정방향), 5'-TTTTAG AGTGGAG A ATGTGTGT-3'(서열번호 7), TCF4-int7-UR(역방향), 5'-AAACAAAATAACAATACAACCCACC-3'(서열번호 8) 및 199 bp의 PCR 산물 길이. 10 내지 15 부피의 중아 황산-변형 DNA는 상기 프라이머와 함께 20 ㎕ 반응으로 증폭되었다. 모든 시료는 94℃에서 5분 간 가열한 뒤, 94℃에서 30초 간, 59℃에서 30초 간 및 72℃에서 60초 간 반응시키는 것을 35회 반복하여 증폭되었다. 모든 반응은 72℃에서 4분 간 반응시킨 다음 4℃에서 냉각하였 다. 각 산물의 5 ㎕을 3% 아가로즈 겔에서 전개시킨 다음 EtBr 염색을 통해 가시화하였다.

실시예 8. 파이로시퀀싱을 통한 정량적 메틸화 분석

TCF4의 전사 시작 부위 근처의 CpG 부위는 파이로시퀀싱을 사용하여 메틸화의 정량화에 의해 선별되었다. 하나의 서열분석 프라이머로 분석된 7개 중에서 25개의 CpG 위치를 포함하는 225 bp길이의 단편이 Platinum Tαq DNA 중합효소(tnvitrogen, USA)를 이용하여 50 ㎕ 부피로 반응시켜 증폭되었다. 혼합물은 95℃에서 4분 간 가열한 다음, 95℃에서 30초, 50℃에서 45초 및 72℃에서 20초의 조건으로 상기 프라이머가 모두 고갈될 때까지 50회 반복 수행하였다. 마지막 증폭 단계에서 72℃에서 4분 간 더 반응시켰다. 열 순환 절차는 GeneAmp PCR System 9700 thermal reactor(Perkin-EImer Corp.)에서 수행되었다. ssDNA 주형의 제조는 스트렙타비딘 세파로즈 HP beads(Amersham Biosciences, Sweden)를 사용하여 멀티채널 피펫으로 PSQ 96MA 시료 제조 설명서에 따라 바이오틴화된 20-25 ㎕의 PCR 산물로부터 수행되었다. 서열분석은 SNP reagent Kit(pyrosequencingAB)로 PSQ 96MA system에서 제조업체의 설명서에 따라 수행되었다. 증폭 및 서열분석 프라이머는 SNP 프라이머 design software(Pyrosequenciug AB)로 디자인하였다: 증폭을 위해, 정방향 프라이머, 5'-GAAGAGAGTTGGTGTTAAGAGTTAG-3'(서열번호 9)및 바이오틴-표지 역방향 프라이머, 5'-CCACCAAAA AAAACTCTCC-3'(서열번호 10); 서열 분석 프라이머, 5'-TGTGTCTTTGAGGΛTTTG-3'(서열번호 11). 각 CpG 부위의 메틸화 정도는 PSQ 96MA software의 대립 유전자 정량화 기능을 사용하여 대립 유전자 빈도로 계산하였고, 7개 CpG 부위에 대한 평균값은 각 시료의 메틸화 %로서 나타내었다.

실시예 9. 통계학적 분석

발현의 손실 및 NotⅠ-메틸화 사이의 상관관계 또는 정량적 메틸화는 SigmaPbt software의 회귀 마법사를 이용하여 확인하였다. 96-쌍의 시료에 대한 실시간 RT-PCR 데이터에서 유전자 사이의 상관관계는 SAS software(SAS institute, Cary, North Carolina)로 확인하였고, SigrnaPfot software를 이용하여 적절히 그래프로 나타내었다. 스튜던트 t-검증은 임상병리학적 데이터를 조사하기 위해 사용되었다. 메틸화 수준의 차이점은 SigmaPlot software를 사용하여 변화의 분석, 대응 t-검증(paired t test), 또는 우연성 테이블을 분석하였다. 상기 확률이 0.05 이하 일 때 유의한 것으로 생각된다.

실시예 10. 결과

실시예 10.1. RLGS 를 통한 위암 게놈의 광범위한 메틸화 확인

본 발명자들은 RLGS 겔의 1948개의 스폿 중 1.0 내지 7.1%(평균 3.3%)이 15개 초기 종양에서 대응되는 정상 조직에 비하여 없어지거나 감소된 것을 발견하였다. 위암 세포주는 6.6% 내지 19.1%(평균 11.9%)로 스폿이 없어지거나 세기가 감소되었고, 초기 종양과 비교하여 세포주에서 전체적 메틸화가 3배 더 높은 것으로 나타났다. 개별 스폿을 비교하였을 때, 313개의 스폿은 정상 조직 프로파일에서는 있 었으나, 적어도 하나의 종양에서는 없거나 감소되었고, 929개의 스폿은 정상 조직 프로파일에서는 있었으나, 적어도 하나의 위암 세포주에서는 없거나 감소되었다. 전체적으로, 261개의 스폿은 초기 종양 및 암 세포주 모두에서 일치하게 없거나 감소되는 것을 확인하였다. 도 1B는 초기 종양 및 암 세포주 모두에서 일치하게 없어지거나 감소된 스폿을 나타낸 것을 보여준다.

실시예 10.2. 위암에서 메틸화-민감성 유전자의 선별

본 발명자들은 우선, 적어도 2개의 암세포와 2개의 종양에서 동시에 세기가 바뀐 RLGS 스폿을 선별하였고, 본 발명자들의 기존 RLGS 프로파일에 따라 표기하였다(25 Kim et al ., 2006). 상기 스폿은 이전에 발표된 마스터 RLGS 프로파일(21 Costello et al ., 2000)과 비교하였고, 또한, 각자에서 정확하게 일치하는 스폿 지점이 있을 때, 마스터 스폿 번호에 따라 표기하였다. 통틀어, 본 발명자들은 종래 문헌에서 얻은 서열 정보에서 40개 스폿을 선별하였다(표 1): 본 발명자들의 기존의 연구(25 Kim et al ., 2006)에서 NotⅠ-연관 서열로부터 복제된 29개, 나머지 11개는 이전의 RLGS 연구에서 선별(21 Costello et al ., 2000; 22 Rush et al ., 2004; 26 Smiragia et al ., 2001; 27 Rush et al ., 2001; 28 Dai et al ., 2001). 본 발명자들은 다음으로 RT-PCR을 사용하여 11개 위암 세포주에서의 유전자 발현의 가변성 및 RLGS 데이터로부터 유전자 발현과 메틸화 상태의 연관 관계를 실험하였다. 29개 유전자 또는 mRNA 만이 위암 세포 전반에서 발현 수준의 변화를 보여주었다(도 2A). 한편, 나머지 3개 유전자는 세포주에서 모두 발현되었고(변화 없이) 나 머지 8개는 PCR 산물이 생성되지 않았다. 요컨대, 29개 유전자 중 22개가 위암 세포주에서 RLGS 데이터와 일치하게 변화되는 것을 보여주었다.

실시예 10.3. 약물 치료를 통한 재활성화 분석

선별된 22개 유전자에 대하여, 재활성화 분석을 세 가지 위암 세포주에서 5-Aza-dC 및/또는 TSA 처리를 통해 실시되었다. 본 발명자들은 상기 유전자가 다양한 형태로 모두 또는 일부 복원되는 것을 확인하였다: 예를 들면, POPDC3, NACM2, PRKDl 및 AMPD3은 두 개 또는 세 개의 상응하는 비활성화된 세포에서 오직 5-Aza-dC에 의해 복원되었고; CVPlBl, CXXC4, TCF4, CAM-KrrN 및 FLJ25393는 5-Aza-dC에 의해 하나의 세포에서, 다른 세포는 TSA에 의해 복원되었으며; LRRC3B과 같은 나머지 유전자는 몇몇 세포에서 5-Aza-dC 및/또는 TSA에 의해 복원되었다(도 2A). 상기 결과는 본 발명에서 선별된 유전자가 유전자-특이적 또는 세포-특이적 형태로 위암 세포에서 변화된 후생학적 표적일 수 있음을 시사한다.

실시예 10.4. 정량적 실시간 PCR 을 통한 신규 후생학적 표적의 연계된 발현 확인

선발된 22개 유전자에 대하여, 본 발명자들은 정량적 실시간 PCR을 사용하여 정상 및 종양 시료 96-쌍에서 상기 유전자들의 상대적 발현을 분석하였고, 초기 종양에서 10% 내지 85%의 범위에서 LOE를 관찰하였다(표 1의 마지막 단락). 또한, 위암에서 종양 억제 유전자로서 잘 알려진 DAPK 및 CDHl의 LOE는 상기 선별된 유전자 와의 비료를 위하여 같은 96-쌍의 시료에서 분석되었다. 상기 LOE 수준은 DAPK 및 CDH1에서 각각 51% 및 39%인 것으로 분석되었다. 각 유전자들의 LOE 수준은 연관된 스폿의 정도는 RLGS 데이터에서보다 감소되었고, RKDl, DCBLD2, BC036441, KCNK9 및 NCAM2에서는 차이점이 있었지만, 본 발명자들은 두 수치간의 높은 상관관계를 발견하였다(r=0.7436, P<0.0001)(표 1 및 도 2B).

DAPK 및 CDH1을 포함하는 LOE가 30%를 넘는 15개 유전자에 대하여, 상기 유전자와 유전자 발현의 상관관계의 쌍을 을 96쌍의 시료에서 시험하였다. 본 발명자들은 DAPK 및 CDH1 사이의 강력한 상관관계를 발견하였으나(표 2), 상기 유전자는 본 발명에서 선별된 어떤 후생학적 표적에 대해서도 상관관계를 보이지 않았다. 대신에 13개의 선별된 유전자 사이에서 상당한 상관관계가 관찰되었는데, 신규 후생학적 표적은 임상 시료 중에 각자 유사한 패턴으로 발현되나, DAPK 및 CDH1과는 독립적인 것을 시사한다. 도 3A는 TCF4에 대하여 PRKDl(r=0.62, P<0.0001), CYPlBl(r=0.60, P<0.0001), LIMS2(r=0.70, P<0.0001), ALOX5(r=0.67. P<0.0001)및 BACH2(r=0.67, P<0.0001)와의 강력한 상관관계를 보여주고, CDH1 및 DAPK 사이에 다른 상관관계를 보여준다. 그러나 CDHI 또는 DAPK는 PRKDl, CYPlBI, LIMS2, ALOX5, BACH2 및 TCF4와 상관관계를 보이지 않았다.

실시예 10.5. 위암발생에서 TCF4 및 CDHI 상태의 비교

본 발명자들은 위암 발생 동안 두 그룹 사이의 발현 패턴이 왜 다른지 알아보기 위해 TCF4 및 CDH1을 선택하였다. 정량적 실시간 RT-PCR은 CDH1의 LOE 수준은 초기 위암 타입(19개 중 6개, 24%)에 비해 말기 암 타입(70개 중 30개, 43%)에서 높거나, 초기 TNM 단계(34개 중 10개, 29% in 1기)보다 후기 TNM 단계에서 높았다(61개 중 28개, II-IV기에서 50%)(도 3B). 장형(44개 중 17개, 38%) 및 확산형(48개 중 18개, 37%) 사이에서는 유의한 차이가 발견되지 않았다. 반대로, TCF4의 LOE 수준은 말기 위종양(71개 중 20개, 28%: P=0.0045)과 비교하였을 때 초기 위암 타입(25개 중 15개, 60%)에서 상당히 높거나, 후기 TNM 단계(46개 중 10개, III 및 IV기에서 22%; P=0.0041)보다 초기 TNM 단계(50개 중 25개, I 및 II기에서 50%)에서 더 높았다. 또한, TCF4의 비정상적 감소는 확산형(48개 중 8개, 17%: P=0.0001)보다 장형(45개 중 27개, 60%)에서 상당히 높았다(도 3C). 성별 간 또는 연령 간의 차이는 발견되지 않았다(데이터는 보여주지 않음). 따라서 상기 결과는 두 유전자가 초기 위종양의 다른 단계-다른 형태로 조절이 약화되는 것을 보여준다.

실시예 10.6. TCF4 유전자 발현억제와 TCF4 엑손 1 과메틸화의 연관관계

선별된 유전자 중에서, 본 발명자들은 유전자 발현 억제와 후생학적 변형 사이의 상관관계를 증명하기 위해 TCF4를 선별하였다. 본 발명자들은 먼저 TCF4 유전자의 7번째 인트론에서 클로닝된 NotⅠ-연결 서열(스폿 # 6B54)의 DNA 서열에 기반하여 MSP 분석을 수행하였고(도 4A), 11개 세포 중 7개에서 메틸화 및 TCF4 발현 억제 사이의 양성적 상관관계를 발견하였다. 같은 시가나에, 본 발명자들은 TCF4 엑손 1에서 MSP 분석을 실시하였을 때, SNU601을 제외한 10개 세포주에서 더 가까 운 상관관계를 찾았다(도 4A, C). 이에 본 발명자들은 파이로시퀀싱 분석을 사용하여 TCF4 엑손 1의 7개 CpG 부위의 메틸화 상태를 정량적으로 측정하였다(도 4A). 6개 세포주(SNUOOl, SNU005, SNU016, SNU52O, SNU620 및 SNU638)가 TCF4의 전사체를 가지지 않았는데, 상기 위치의 98~100%에서 높은 메틸화가 발견되었다(도 4C). 한편, 강력하게 TCF4를 발현하는 세 가지 세포주(SNU216, SNU484 및 SNU668)의 메틸화 상태는 0 내지 14% 범위였다. 상기 결과는 TCF4를 발현하지만 TCF4 엑손 1 부위가 심하게 메틸화된 SNU610 세포를 제외하고, 대부분의 위암 세포에서 TCF4 엑손 1의 과메틸화와 유전자 발현억제의 강력한 연관관계를 가리킨다.

실시예 10.7. 초기 위종양에서 TCF -4 엑손 1의 과메틸화

본 발명자들은 다음으로 정량적 발현 분석에 사용된 시료와 일치하는 85쌍의 정상 및 종양 DNA에서 파이로시퀀싱을 사용하여 상기 7개 CpG 부위의 메틸화 상태를 정량적으로 측정하였다. 7개 환자 시료에서 정상, 종양 또는 모두의 DNA에서 좋은 피로그람(Pyrogram)을 생성하는 것에 실패하였으며, 상기 시료는 이후의 분석에서 배재하였다. 상기 결과는 77개의 정상 DNA 시료에 대한 각각의 CpG 부위에서 10.9%, 13.8%, 13.5%, 15.1%, 12.4%, 13.3% 및 13.3%의 평균 메틸화를 보여주었다. 그래서 상기 메틸화 정도는 7개 CpG 위치로부터 평균 13.2%로 계산될 수 있다(도 4D). 한편, 77개의 종양 DNA는 각 CpG 부위에서 각각 34.9%, 34.1%, 34.5%, 34.2%, 34.3%, 35.4% 및 35.8%, 따라서 정상조직과 비교하여 상당한 차이를 보이는 평균 34,7%의 메틸화를 보여주었다(t-test, P<0.0001)(도 4D). TCF4 엑손 1의 메틸화가 임상 시료에서의 비정상적 발현과 관련되었는지 학인하기 위하여, 본 발명자들은 메틸화 변화 및 상대적 발현 수준 사이의 상관관계를 확인하였다. 상기 분석을 위하여 본 발며자들은 종양 DNA에서의 메틸화 정도에서 정상 DNA의 메틸화 정도를 빼 임의로 각 쌍의 DNA의 메틸화 변화를 정의하였다. 메틸화 변하 및 상대적 발현 수준 사이의 상당한 음성적 상관관계가 발견되었고(R=-0.2722, P=0.0166), 이는 TCF4 엑손 1의 과메틸화가 LOE와 연관되어있음을 가리킨다(도 4E).

실시예 10.8. TCF4 엑손 1의 연령-연관 메틸화

상기 메틸화 정도를 각각의 임상병리학적 카테고리안에서 비교해 보았을 때, 본 발명자들은 초기(EGC) 및 말기 위암(AGC) 형태에서 상당한 차이점을 관찰하지 못했다: 정상 조직에 대하여, EGC(N=18)에서는 12.6% 및 AGC(N=59)에서는 13.3%; 종양 조직에 대하여 HGC에서는 35.8% 및 AGC에서는 35.8%(도 4F의 왼쪽). 장형 종양(36.9%, N=40)이 확산형(32.4%, N=37)에 비해 높은 메틸화를 보였지만, 종양 단계 또는 로렌 분류와 같은 다른 파라미터의 그룹 사이에서는 메틸화의 평균 백분율에서 유의한 차이점이 없었다(도 4F의 중간). 그러나 본 발명자들은 정상 및 종양 조직 모두에서 연령에 따라 점진적으로 메틸화되는 것을 발견하였다: 연령 그룹 1에 대하여(=50 years), 정상 및 종양 DNA(N=17)에서 상기 TCF4 엑손 1 메틸화의 평균은 1.7% 및 24.5%; 연령 그룹 2에 대하여(51-60 years), 9.5% 및 30.9%(N=22); 연령 그룹 3에 대하여(61 ~ 70 years), 18.2% 및 41.0%(N-26); 연령 그룹 4에 대하여(> 70 year), 25.3% 및 42.5%(N=12)(도 4F의 오른쪽). 도 4G는 TCF4 엑손 1의 메 틸화가 종양조직(R=0.3265, P=0.0037)에서 뿐만 아니라 정상 조직(R=0.4524, P<0.0001)에서 환자의 나이에 따라 급격히 증가하는 것을 보여준다. 상기 결과는 TCF4 엑손 1이 암-특이적 형태 뿐만 아니라 연령-연관되어 상당히 메틸화되는 것을 시사한다. 또한, 50세 전의 환자(N=14)에서는 정상 조직에서 TCF4 엑손 1의 메틸화가 0%였는데, 70세 이상의 환자(N=12)의 정상 조직에서 이의 평균 메틸화 상태(25.3%)가 50세 이하의 환자(N=17)에서 유래한의 종양 조직의 메틸화 상태(24.5%)와 가까웠다.

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본 명세서에 인용된 모든 참조문헌은 그들의 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다.

본 명세서에 구체적으로 기재된 특정 실시예는 일반적인 실험에 지나지 않을 뿐 이에 동등한 것도 가능할 것이라는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 이런 동등한 것은 본 발명의 청구항의 범위에 포함된다.

본 발명의 바람직한 실시예의 결과는 상기 메틸화된 TCF4가 위암의 초기탐지 및 예후 바이오마커가 될 가능성을 가지고, 또한 메틸화된 TCF4를 분석하여 암을 모니터링 하는데 유용함을 시사한다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> METHYLATION BIOMARKER FOR EARLY DETECTION OF GASTRIC CANCER <130> 9fpi-10-03 <150> 60/912,115 <151> 2007-04-16 <150> PCT/IB2008/003482 <151> 2008-04-15 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gaatttgtaa tttcgtgcgt ttc 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 aaaaaaaact ctccgtacac cg 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tgaatttgta attttgtgtg ttttg 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 aaaaaaaact ctccatacac cacc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ttaattttag agtggagaac gtgc 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 aaataacaat acgacccgcc 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ttttagagtg gagaatgtgt gt 22 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 aaacaaaata acaatacaac ccacc 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gaagagagtt ggtgttaaga gttag 25 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ccaccaaaaa aaactctcc 19 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 tgtgtgtttg aggatttg 18

Claims (20)

1. 개체 유래 분리된 시료로부터 하기 모든 마커 유전자 mRNA 발현의 감소에 대한 분석 단계를 포함하는 개체 내 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 발현 수준 측정 방법:

   POPDC3(Popeye domain-containing protein 3), FLJ25393(coiled-coil domain containing 67), LRRC3B(leucine rich repeat containing 3B), PRKDl(protein kinase Di), CYP1B1(cytochromoe P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1), LIMS2(LIM and senescent cell antigen-like domains 2), DCBLD2(discoidin, CUB and LCCL domain containing 2), BC036441(hypothetical protein LOC149351), ADCY8(adenylate cyclase 8), BACH2(BTB and CNC homology I , basic leucine zipper), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), TCF4(transcription factor 4), CXXC4(CXXC finger 4), CAMK2N2(CaM-KH inhibitory protein), EMXl(empty spiracles homolog 1), KCNK9(potassium channel, subfamily K, member 9), NCAM2(neural cell adhesion molecule 2 precursor), AMPD3(erythrocyte adenosine monophosphate deaminase), NOG(noggin precursor ), SP6(Sp6 transcription factor), AK124779(hypothetical protein LOC100128675) 및 CSS3(chondroitin soliate synthase 3).
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 위암은 위암 1기인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. (i) 시료를 수용하여 구획화할 수 있는 담체; 및,

    (ii) 비메틸화된 시토신을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 함유하는 첫 번째 용기, CpG-함유 하기 유전자의 증폭을 위한 프라이머를 모두 함유하는 두 번째 용기 및 하기 유전자의 존재를 탐지하기 위한 하기 유전자 각각에 상보적인 프라이머를 함유하는 세 번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하는 위암 진단용 키트:

    POPDC3(Popeye domain-containing protein 3), FLJ25393(coiled-coil domain containing 67), LRRC3B(leucine rich repeat containing 3B), PRKDl(protein kinase Di), CYP1B1(cytochromoe P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1), LIMS2(LIM and senescent cell antigen-like domains 2), DCBLD2(discoidin, CUB and LCCL domain containing 2), BC036441(hypothetical protein LOC149351), ADCY8(adenylate cyclase 8), BACH2(BTB and CNC homology I , basic leucine zipper), ALOX5(arachidonate 5-lipoxygenase), TCF4(transcription factor 4), CXXC4(CXXC finger 4), CAMK2N2(CaM-KH inhibitory protein), EMXl(empty spiracles homolog 1), KCNK9(potassium channel, subfamily K, member 9), NCAM2(neural cell adhesion molecule 2 precursor), AMPD3(erythrocyte adenosine monophosphate deaminase), NOG(noggin precursor ), SP6(Sp6 transcription factor), AK124779(hypothetical protein LOC100128675) 및 CSS3(chondroitin soliate synthase 3).
17. 제 16항에 있어서, 상기 유전자는 위암의 탐지를 위한 마커인 것을 특징으로 하는 키트.
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19. 제 16항에 있어서, 상기 유전자는 초기 위암의 탐지를 위한 마커 유전자인 것을 특징으로 하는 키트.
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