KR101503909B1

KR101503909B1 - 글루코사민을 포함한 조성물 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101503909B1
Application number: KR1020130067937A
Authority: KR
Inventors: 김성진; 박진아; 이소영
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-13
Filing date: 2013-06-13
Publication date: 2015-03-19
Also published as: KR20140145460A

Abstract

타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화를 저해하기 위한 조성물, 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 조성물, 개체의 세포 중의 타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화를 저해하는 방법 및 개체의 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

글루코사민을 포함한 조성물 및 그의 용도{A composition comprising a glucosamine and use thereof}

타입 II TGF-β 수용체 (TβRII)의 N-연결 글리코실화를 저해하기 위한 조성물, 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 조성물, 개체의 세포 중의 타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화를 저해하는 방법 및 개체의 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

신장 섬유증은 만성 신장 질병의 전형이며 신장 기능의 퇴화와 강하게 연관되어 있다.

TGF-β1 신호전달은 신장 섬유증에 있어 강력한 섬유생성 유도자로서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Kidney Int. 2010 Jun;77(11):950-5, "An integrative view on the role of TGF-beta in the progressive tubular deletion associated with chronic kidney disease"). TGF-β1은 간질 섬유아세포 (interstitial fibroblast), 근섬유모세포 (myofibroblast), 및 세관 표피 세포 (tubule epithelial cell)를 활성화시키고, 세포외 마트릭스 단백질을 증가시킴으로써 신장 섬유생성을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Int J Biol Sci. 2011; 7(7): 1056-1067, "Diverse Roles of TGF-β/Smads in Renal Fibrosis and Inflammation").

TGF-β 신호전달은 다른 신호전달 경로뿐만 아니라 번역후 수식에 의하여도 조절된다. 번역 후 수식의 조절이상 (dysregulation)은 TGF-β 신호전달뿐만 아니라, TGF-β1-연관 질환에 영향을 미칠 수도 있다. TGF-β1과 TβRII의 결합이 TGF-β 신호전달의 첫 번째 단계임을 고려할 때, TβRII에 대한 기능 연구는 매우 의미가 있다.

글루코사민은 연골 마트릭스 및 활액의 글리코스아미노글리칸의 통상의 구성성분이다. 이 아미노 단당은 골관절 환자의 잠재적 관절 보호 효과 (chondro-protective effect)로 인하여 식품 보조제로서 자주 사용되어 왔다. 그러나, 글루코사민이 TβRII의 N-글리코실화에 영향을 미치는지에 대하여는 개시된 바 없다.

일 양상은 타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화를 저해하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 개체의 세포 중의 타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화를 저해하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 개체의 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

일 양상은 글루코사민 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로서 포함하는 타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화를 저해하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 조성물에 있어서, 그의 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용되는 글루코사민의 염이면 어느 것이나 포함될 수 있다. 상기 염은 예를 들면, 글루코사민 히드로클로리드 (GS-HCl), 글루코사민 술페이트 또는 그의 조합인 것일 수 있다.

용어 "유효성분"이란 N-연결 글리코실화를 저해하기에 충분한 양으로 포함되는 것을 나타내고, 불순물로서 포함되는 것을 제외한다.

글루코사민 (glucosamine)은 아미노 당이며 글리코실화된 단백질 및 지질의 생합성에 있어서 전구체이다. 글루코사민은, 갑각류와 절지 동물의 세포외골격 (exoskeletons) 및 곰팡이와 많은 고등 동물의 세포벽을 구성하는 다당류 키토산 및 키틴의 구조의 일부이다.

상기 타입 II TGF-β 수용체는 TGF-β 수용체이며, 분자량은 탈글리코실화된 형태가 약 64 kDa이고, 글리코실화된 형태가 약 68 kDa 내지 약 80 kDa이다. TGFBR2는 인간 유전자이다. 타입 II TGF-β 수용체는 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene)이다. 타입 II TGF-β 수용체는 Ser/Thr 단백질 키나제의 한 멤버이며 TGF-β 수용체 패밀리의 한 멤버이다. 타입 II TGF-β 수용체는 단백질 키나제 도메인을 가진, 다른 수용체 단백질과 헤테로 다이머 복합체 (heterodimeric complex)를 형성하는 TGF-β에 결합하는 경막 단백질 (transmembrane protein)이다. 이 수용체-리간드 복합체는 Smad2와 Smad3 단백질을 인산화시키고, 인산화된 단백질은 핵에 들어가 세포 증식에 관련된 유전자의 서브세트의 전사를 조절한다. 타입 II TGF-β 수용체는 C-말단 단백질 키나제와 N-말단 엑토도메인으로 구성될 수 있다. 상기 엑토도메인은 6개 내부가닥 디술피드 결합의 네트워크에 의하여 안정화되는 9개 베타-가닥 및 한 개의 나선을 포함한 콤팩트 폴드 (compact fold)로 구성될 수 있다.

상기 타입 II TGF-β 수용체는 동물, 예를 들면, 포유동물 유래의 것일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1 (NCBI reference 서열: NP_001020018.1), 서열번호 2 (NCBI reference 서열: NP_033397.3), 서열번호 3 (NCBI reference 서열: NP_003233.4), 또는 서열번호 4 (NCBI reference 서열: NP_083851.3)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 1 및 2는 각각 사람과 마우스의 TGF-β 타입 II 수용체 이소폼 A를 나타낸다. 서열번호 3 및 4는 각각 사람과 마우스의 TGF-β 타입 II 수용체 이소폼 B를 나타낸다.

상기 타입 II TGF-β 수용체는 서열번호 5 (NM_001024847.2), 서열번호 6 (NP_09371.3), 서열번호 7 (NM_003242.5), 또는 서열번호 8 (NM_029575.3)의 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 것일 수 있다. 서열번호 5 및 서열번호 6은 각각 사람과 마우스의 TGF-β 타입 II 수용체 이소폼 A를 코딩하는 서열이다. 서열번호 7 및 8은 각각 사람과 마우스의 TGF-β 타입 II 수용체 이소폼 B를 코딩하는 서열이다. 그러나, 상기 타입 II TGF-β 수용체는 이들 단백질뿐만 아니라, mRNA의 스플라이스 변이체 (splice variant)와 같은 이들의 전사 변이체를 포함한다.

상기 "N-연결 글리코실화"는 TβRII의 아미노산 서열 중의 임의의 N-연결된 글리코실화를 포함한다. 상기 "N-연결 글리코실화"는 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열을 기준으로 95번, 119번, 또는 둘 모두의 N-연결된 글리코실화일 수 있다. 또한, 상기 "N-연결 글리코실화"는 서열번호 3 및 4의 아미노산 서열을 기준으로 70번, 94번, 또는 둘 모두의 N-연결된 글리코실화일 수 있다.

상기 타입 II TGF-β 수용체는 세포 내에 존재하는 것일 수 있다. 즉, 세포 표면에 수송되기 전의 상기 타입 II TGF-β 수용체일 수 있다.

상기 조성물은 또한, Smad3의 인산화를 저해하는 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, Smad3 단백질 (Mothers against decapentaplegic homolog 3)은 동물 유래의 것일 수 있다. 예를 들면, 사람과 같은 포유동물, 초파리와 같은 곤충, 또는 마우스와 같은 설치류 유래의 것일 수 있다. Smad3 단백질은 NCBI Genbank accession 번호 NP_005893.1 (서열번호 9), 또는 NP_058049 (서열번호 10)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. Smad3 단백질은 온전한 단백질뿐만 아니라 Smad3 단백질 발현 과정의 변이에 의하여 발생된 변이체 (variant)도 포함할 수 있다. 상기 변이체는 잘려진 형태 (truncated form)를 포함할 수 있다. 상기 Smad3의 인산화 부위는 서열번호 9의 아미노산 서열을 기준으로 Smad3 단백질의 링커 영역의 T179, S204, S208 및 S213 중 하나 이상 및/또는 Smad3 단백질의 C-말단 S422, S423 및 S425 중 하나일 수 있다.

상기 조성물은 임의의 약학적 형태를 가질 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구 투여 형태를 갖는 것일 수 있다. 상기 조성물은 정제, 환제, 주사제, 또는 이들의 조합일 수 있다.

다른 양상은 글루코사민 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로서 포함하는 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 '글루코사민', '약학적으로 허용가능한 염', '유효성분' 및 그 외 상기한 N-연결 글리코실화를 저해하기 위한 조성물 중 대응되는 성분에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 조성물은 타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화를 저해하는 것일 수 있다. '타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화를 저해'에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 타입 II TGF-β 수용체는 세포 내에 존재하는 것일 수 있다.

또한, 상기 조성물은 Smad3의 인산화를 저해하는 것일 수 있다. 'Smad3의 인산화를 저해하는 것'에 대하여는 상기한 바와 같다.

본 명세서에 있어서, 용어 "섬유증 (fibrosis)"이란 기관 또는 조직 중 과도한 섬유성 연결 조직 (fibrous connective tissue)이 형성되는 것을 포함한다. 상기 형성은 수복과정 (reparative process) 또는 반응 과정 (reactive process)에서 일어날 수 있다. 이는 기관 또는 조직의 정상적 성분으로서 섬유성 조직 (fibrous tissue)의 형성에 대향되는 것이다. 상처 (scarring)는 그 아래의 기관 또는 조직의 구조를 없애버리는 융합 섬유증 (confluent fibrosis)이다.

상기 섬유증은 TGF-β1-유도된 것일 수 있다. 상기 섬유증은 타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화를 저해에 의하여 유도되는 것일 수 있다. 상기 섬유증은 Smad3의 인산화를 저해에 의하여 유도된 것일 수 있다.

상기 섬유증은 신장 섬유증 (renal fibrosis), 특발성 폐섬유증 (idiopathy pulmonary fibrosis), 및 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis)을 포함한 폐 섬유증, 간경변 (cirrhosis), 심내막심근섬유증 (endomyocardial fibrosis), 종격섬유증 (mediastinal fibrosis), 미엘로섬유증 (myelofibrosis), 후복막 섬유증 (retroperitoneal fibrosis), 진행성 종괴성 섬유증 (progressive massive fibrosis), 신성 전신성 섬유증 (nephrogenic systemic fibrosis), 크론 섬유증 (crohn's disease), 켈로이드 (keloid), 진구성 심근경색 (old myocardial infarction), 강피증 (scleroderma) 또는 전신성 경화증(systemic sclerosis), 관절섬유증 (arthrofibrosis), 또는 이들의 조합일 수 있다. 신장 섬유증은 만성 신장 질병의 전형이며 신장 기능의 퇴화와 강하게 연관되어 있다.

다른 양상은 상기 글루코사민 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로서 포함하는 타입 II TGF-β 수용체 (TβRII)의 N-연결 글리코실화를 저해하기 위한 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 세포 중의 타입 II TGF-β 수용체 (TβRII)의 N-연결 글리코실화를 저해하는 방법을 제공한다.

상기 투여는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구를 통하여 투여될 수 있다. 상기 투여는 N-연결 글리코실화를 저해하기에 충분한 양으로 투여하는 것일 수 있다. 'N-연결 글리코실화를 저해하기에 충분한 양'은 개체의 성별, 체중, 세포의 종류, 세포의 N-연결 글리코실화 정도 등에 따라 당업자가 적절하게 정할 수 있다.

상기 개체는 포유동물인 것일 수 있다. 상기 포유동물을 사람, 개, 고양이, 소, 말, 양, 염소, 돼지, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 세포는 신장 세포, 폐 세포, 피부 세포, 심장 세포, 골수 세포, 관절세포, 간 세포, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 개체는 섬유증을 가지고 있거나, 가질 가능성이 있는 개체일 수 있다. 상기 섬유증은 TGF-β1-유도된 것일 수 있다. 상기 섬유증은 타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화 저해에 의하여 조절되는 것일 수 있다. 상기 섬유증은 Smad3의 인산화 저해에 의하여 조절된 것일 수 있다.

상기 섬유증은 신장 섬유증 (renal fibrosis), 특발성 폐섬유증 (idiopathy pulmonary fibrosis), 및 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis)을 포함한 폐 섬유증, 간경변 (cirrhosis), 심내막심근섬유증 (endomyocardial fibrosis), 종격섬유증 (mediastinal fibrosis), 미엘로섬유증 (myelofibrosis), 후복막 섬유증 (retroperitoneal fibrosis), 진행성 종괴성 섬유증 (progressive massive fibrosis), 신성 전신성 섬유증 (nephrogenic systemic fibrosis), 크론 섬유증 (crohn's disease), 켈로이드 (keloid), 진구성 심근경색 (old myocardial infarction), 강피증 (scleroderma) 또는 전신성 경화증(systemic sclerosis), 관절섬유증 (arthrofibrosis), 또는 이들의 조합일 수 있다.

다른 양상은 글루코사민 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로서 포함하는 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 섬유증을 예장 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 투여는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구를 통하여 투여될 수 있다. 상기 투여는 개체의 섬유증을 예방 또는 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 것일 수 있다. '섬유증을 저해하기에 충분한 양'은 개체의 성별, 체중, 섬유증의 종류 및 경중, 세포의 종류, 세포의 N-연결 글리코실화 정도 등에 따라 당업자가 적절하게 정할 수 있다.

일 양상에 따른 타입 II TGF-β 수용체 (TβRII)의 N-연결 글리코실화를 저해하기 위한 조성물에 의하면, 타입 II TGF-β 수용체 (TβRII)의 N-연결 글리코실화를 저해하는데 효율적으로 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 조성물에 의하면, 개체의 섬유증을 효율적으로 치료하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 개체의 세포 중의 타입 II TGF-β 수용체 (TβRII)의 N-연결 글리코실화를 저해하는 방법에 따르면, 개체의 세포 중의 타입 II TGF-β 수용체 (TβRII)의 N-연결 글리코실화를 효율적으로 저해할 수 있다.

다른 양상에 따른 개체의 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법에 따르면, 개체의 섬유증을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 pFLAG-CMV^TM-5a의 벡터 맵을 나타낸 것이다.
도 2는 GS-HCl이 TβRII의 N-글리코실화의 결함을 유도하고 TGF-β 신호전달을 감소시키는 것을 나타낸 도면이다.
도 3은 GS-HCl-유도된 TβRII N-글리코실화 저해는 TβRII의 세포 막 표면 수송 및 뒤이은 TGF-β1 결합을 방해하는 것을 보이는 도면이다.
도 4는 GS-HCl이 신장 표피 세포에서 TGF-β 신호전달을 감소시키는 것을 보이는 도면이다.
도 5는 GS-HCl이 신장 표피 세포에서 TGF-β1-유도된 섬유생성 반응을 감소시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 6은 GS-HCl이 UUO-유도된 신장 섬유증 모델에서 항섬유 효과 (antifibrotic effect)를 나타낸다는 것을 보이는 도면이다.
도 7은 GS-HCl이 폐쇄된 마우스 신장에서 Smad3의 인산화 수준을 감소시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 8은 GS-HCl이 폐쇄된 신장에서 α-SMA 발현을 감소시킨다는 것을 나타내는 도면이다.
도 9는 GS-HCl이 UUO-유도된 신장 섬유증의 마우스 모델에서 콜라겐 I과 피브로넥틴 발현을 저해한다는 것을 나타낸다.
도 10은 pCMV SPORT-βgal 플라스미드 지도를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 방법

달리 언급이 없는 이하의 실시예에서는 다음의 방법을 사용하였다.

(1) 세포 배양

인간 근위 튜브 상피세포 (human proximal tubular epithelial cells: HKC-8), 인간 경부 아데노암종 세포 (HeLa) 및 마우스 일차 신장 상피세포 (mouse primary renal epithelial cells)를 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 및 Ham's F12 배지 (DMEM/F12: Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 DMEM (WelGENE, Daegu, S. Korea)에서 유지시켰다.

(2) 형질감염과 처리

제조자의 지침에 따라서, HKC-8 및 HeLa 세포를 FuGENE^TM HD Transfection Reagent (Promega, Madison, WI)를 사용하여 형질감염 (transfection)시켰다. 세포를 D-(+)-글루코사민 히드로클로리드 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 지정된 시간 동안 지정된 용량)와 투니카미신 (Sigma-Aldrich; 12 시간 동안 1 μg/ml)으로 처리하였다. 다음으로, 세포를 무혈청 조건에서 재조합 TGF-β1 (R&D Systems, Minneapolis, MN)로 처리하였다. N-글리코실화는, 제조자의 지침에 따라, PNGase F (R&D Systems, Minneapolis, MN)와 함께 인큐베이션함으로써 제거하였다.

(3) 웨스턴 블롯 분석

세포와 조직을 Flag, phospho-Smad2, Smad2, phospho-Smad3, Smad3, 피브로넥틴, α-SMA 및 β-actin에 대한 항체를 사용하여 면역블롯 분석 (immunoblot analysis)을 수행하였다.

(4) 루시퍼라제 분석 ( Luciferase Assay )

제조자의 지침에 따라, 루시퍼라제 활성을 Luciferase Assay System kit (Promega 사)를 사용하여 분석하였다. 결과는 삼배수 (triplicate)에서 평균값을 구하여 나타내었고, β-gal activity에 대하여 보정하였다.

(5) 면역형광 분석( Immunofluorescence Assay )

HeLa, HKC-8 세포 및 조직을 Flag, PDI, Phalloidin, 피브로넥틴 및 α-SMA에 대한 일차 항체와 인큐베이션시켰다. 2차 항체와 인큐베이션한 후, 세포 및 절편을 BX43 Clinical (IX51 Inverted) Microscope (Olympus America Inc., Melville, NY) 또는 Confocal Laser Scanning Microscope (LSM-510; Carl Zeiss, Jena, Germany)에 의하여 평가하였다.

(6) 유세포 분석 ( Flow cytometry )

제조자 (R&D Systems)의 지침에 따라서, 비오틴화된 TGF-β1-결합된 TβRII 분자의 수는 비오틴화된 인간 TGF-β1 (R&D Systems)을 사용하여 정량하였다. 유세포 분석 전에, 세포를 7-amino-actinmycin D (BD PharMingen, Bedford, MA)로 처리하여 죽은 세포를 제외시켰다.

(7) RT - PCR 및 실시간 RT - PCR

제조자의 지침에 따라 총 RNA는 TRIzol Reagent (Invitrogen)를 사용하여 추출하였다. PCR은 특이적 프라이머 쌍을 가지고 AccuPower^TM PCR PreMix kit (Bioneer Co., Daejon, S. Korea)를 사용하여 수행하였다. 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR)은 ViiA^TM 7 Real-time PCR systems (Applied Biosystems) 상에서 Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 수행하였다. 다양한 유전자의 mRNA 수준은 삼배수로 측정하고 18S RNA에 대하여 보정하였다. 인간/마우스 collagen I, 피브로넥틴, α-SMA, E-cadherin, GAPDH 및 18S RNA를 포함한, 이 실시예에 사용된 프라이머 세트의 서열은 표 1과 같다.

유전자		포워드 프라이머 (서열번호)	리버스 프라이머 (서열번호)
collagen I	사람	11	12
	마우스	13	14
피브로넥틴	사람	15	16
	마우스	17	18
α-SMA	사람	19	20
	마우스	21	22
E-cadherin	사람	23	24
GAPDH	사람 및 마우스	25	26
18sRNA	사람 및 마우스	27	28

(8) 일측 요관폐쇄 -유도된 신장 섬유증 ( unilateral ureteral obstruction -induced renal fibrosis : UUO ) 모델의 확립 및 GS - HCl 처리

20 내지 22g 몸무게의 수컷 C57BL/6 마우스를 Orient Bio Inc. (Seongnam, S. Korea)로부터 얻었다. 5 그룹의 마우스 (n=5)를 사용하였다: (1) sham control, (2) UUO + PBS, (3) UUO + GS-HCl 20 mg/kg, (4) UUO + GS-HCl 40 mg/kg 및 (5) UUO + GS-HCl 60 mg/kg. UUO는 이전에 기술된 바대로 수행하였다 (Zhang Y et al., J Am Soc Nephrol 2010; 21: 966-973). GS-HCl (Sigma-Aldrich)를 PBS에 녹이고 UUO 수술 전 7일부터 20 내지 60mg의 지정된 용량을 매일 복막내 주사를 통하여 마우스에 투여하였다. 모든 마우스는 UUO 14일 후에 죽이고, 신장 조직을 다양한 분석을 위하여 수집하였다. 모든 절차는 차병원 동물 케어 및 사용 위원회 (CHA Hospital Animal Care and Use Committee)에 의하여 제공된 가이드라인에 따라 수행되었다.

(9) 신장 섬유증의 반정량적 평가 ( Semiquantitative Assessment )

4-μm 두께로 신장 절편을 준비하고, 광학현미경 검사를 위하여 Masson's trichrome으로 염색하였다. 염색된 절편 상의 무작위적으로 선택된 4개 다른 영역을 BX43 Clinical Microscope (Olympus America Inc.)에 의하여 분석하였다. 섬유증을 0 내지 3의 반정량적 점수 부여에 따라 (Zhang Y et al., J Am Soc Nephrol 2010; 21: 966-973), 2개 독립된 병리에 의하여 계급화되었다.

(10) 면역조직화학 분석 ( Immunohistochemistry Assay )

신장 절편을 anti-phospho-Smad3 및 anti-피브로넥틴과 인큐베이션하였다. 상기 절편을 BX43 Clinical Microscope (Olympus America Inc.)에 의하여 평가하였다.

(11) 통계 분석

본 실시예에서 얻은 데이터는 평균 ± SEM로서 표현하였다. 데이터의 통계적 분석은 윈도용 SPSS program (Ver. 17; SPSS Inc., Chicago, IL)을 사용하여 수행하였다. 그룹간 비교는 one-way ANOVA를 수행한 후 Student-Newman-Keuls test를 수행하였다. 유의성은 P < 0.05에서 달성되었다.

실시예 1: GS - HCl 은 Tβ RII 의 N- 글리코실화를 저해하고 TGF -β 신호전달을 감소시킨다.

GS-HCl이 TβRII의 N-글리코실화에 영향을 미치는지 조사하기 위하여, C-말단에 Flag-태그된 생쥐 TβRII 이소폼 b 유전자 (서열번호 29)를 포함한 pFLAG-CMV^TM-5a Expression Vector (SIGMA-ALDRICH, Catalog No. E7523)가 형질감염된 HKC-8에 GS-HCl을 처리하였다. 도 1은 pFLAG-CMV^TM-5a의 벡터 맵을 나타낸 것이다. C-말단에 Flag-태그된 생쥐 TβRII 이소폼 b 유전자는 EcoRI과 SalI 부위에 삽입하였다. 처리는 DMEM/F12 중에서 상기 HKC-8를 C-말단에 Flag-태그된 생쥐 TβRII 이소폼 b 유전자를 형질감염시킨 후 최소 6 시간 후에 최종 농도 5mM의 GS-HCl을 첨가하고 36 시간 동안, 또는 1μg/ml의 투니카미신을 첨가하고 12 시간 동안 유지하였다. 그 후 세포를 채취하여 생쥐 TβRII 이소폼 b의 N-글리코실화를 분석하였다.

TβRII의 발현 패턴에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의하면, TβRII는 약 72 kDa 이상의 고 분자량의 복수밴드를 보였다 (도 2a). 상단 밴드 (upper band)가 TβRII의 N-글리코실화에 의하여 생산된 것임을 확인하기 위하여, N-글리코실화 경로의 첫 번째 단계에서 모든 N-글리칸의 합성을 저해하는 N-글리코실화의 강력한 저해제인 투니카미신을 배양 중 첨가하거나, Flag-TβRII 유전자가 형질감염된 세포의 세포 추출 (cell extract)에 TβRII로부터 모든 N-글리칸을 제거하는 PNGase F를 처리하였다. 그 결과 실제로, 투니카미신과 PNGase F 처리시 약 64kDa의 단일 밴드가 검출되었으며, 이는 TβRII의 상단밴드는 TβRII의 N-글리코실화에 의해 생성된 것임을 나타낸다. 그러나, GS-HCl 처리는 고분자량 TβRII 발현의 현저한 감소와 함께 크기가 감소된 TβRII 단백질을 축적하게 했다.

GS-HCl 처리시, 더 완전하게 가공된 N-글리코실화된 TβRII를 나타내는 상단밴드는 용량 의존적으로 현저하게 감소하였다. 더욱이, TβRII의 하단밴드는 분자량 약 68kDa와 약 64kDa 사이의 범위에서 축적되었다. 이 결과는 적은 부분이 여전히 N-글리코실화되어 있기는 하지만, 대부분의 TβRII 단백질이 GS-HCl에 의하여 탈글리코실화된다는 것을 나타낸다. 전체적으로 이들 데이터는 GS-HCl이 TβRII의 N-글리코실화를 효과적으로 저해한다는 것을 나타낸다.

다음으로, TβRII의 GS-HCl-유도된 N-글리코실화 결함이 TGF-β 신호전달에 역할을 하는지를 조사하였다. 이를 위하여, TβRII가 과발현된 HKC-8 세포에 GS-HCl을 처리하고 TGF-β1 자극 후 Smad2와 Smad3 단백질의 인산화 수준을 분석하였다. 실제로, Smad 2/3 인산화는 GS-HCl 처리시 용량 의존적 방식으로 감소하였다. 또한, N-글리코실화 결함을 보이는, TβRII 단백질의 발현 패턴은 Smad2/3 인산화의 감소에 대응되었다 (도 2b). TGF-β 신호전달에 대한 GS-HCl의 효과를 더 탐구하기 위하여, HKC-8 세포를 C-말단에 Flag-태그된 생쥐 TβRII 이소폼 b 유전자 (서열번호 29)가 EcoRI과 SalI 부위에 삽입된, pFLAG-CMV^TM-5a Expression Vector (SIGMA-ALDRICH, Catalog No. E7523) (이하 Flag-TβRII 벡터라 함)와 TGF-β1-반응성 리포터 (CAGA)₁₂-luciferase 벡터로 공동-형질감염시킨 후, 최종 농도 2.5mM 및 5mM GS-HCl로 처리하였다. 상기 (CAGA)₁₂-MLP-luciferase 벡터는 pGL3-Basic vector (Promega, Cat. no. E1751)의 XhoI 부위에 CAGA 박스 함유 올리고뉴클레오티드 (서열번호 30) 12 카피를 삽입하고, BglII와 HindIII 부위에 MLP 프로모터를 삽입하여 제작하였다. MLP 프로모터는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (adenovirus major late promoter)의 개시자 서열 (initiator sequence)를 나타낸다 (Sylviane Dennler et al, The EMBO Journal Vol. 17 No. 11 pp.3091-3100, 1988: "Plasmids constructs" 참조). 그 결과, GS-HCl 처리는 TGF-β1-유도된 luciferase 활성을 GS-HCl 용량 의존적으로 저해하였다. 이들 데이터를 종합하여 볼 때, GS-HCl는 TβRII의 N-글리코실화를 저해할 뿐 아니라 TGF-β 신호전달을 감소시킨다.

도 2는 GS-HCl이 TβRII의 N-글리코실화의 결함을 유도하고 TGF-β 신호전달을 감소시키는 것을 나타낸 도면이다. 도 2에서, HKC-8 세포를 Flag-tagged TβRII 유전자로 형질감염시켰다. 6시간 후, HKC-8 세포 배양 배지 중에 GS-HCl를 지정된 농도가 되도록 첨가하고 36 시간 동안 배양하거나, 투니카미신 (TN)을 1μg/ml가 되도록 첨가하고 12 시간 동안 배양하였다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, GS-HCl는 TβRII의 N-글리코실화를 효과적으로 저해하였다. 도 2b는 GS-HCl 또는 TN 처리 후, GS-HCl 또는 TN 함유 배지 중의 세포를 TGF-β1 (5ng/ml)과 함께 30 분 동안 배양한 것이다. 세포에서 얻은 단백질을 anti-phospho-Smad 2/3, anti-Smad 2/3 및 anti-Flag와 함께 면역블롯팅하였다. 인산화된 Smad2/3 및 전체 Smad2/3 발현 수준을 나타내는 밴드 강도는 ImageJ software를 사용한 밀도계 (densitometry)에 의하여 전체 Smad2/3에 대한 인산화된 pSmad2/3의 비율로 전환하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, GS-HCl은 TβRII의 N-글리코실화 뿐만 아니라 Smad2와 Smad3의 인산화도 억제하였다.

도 2c는 (CAGA)₁₂-MLP-luciferase reporter 플라스미드와 β-gal 유전자 플라스미드를 Flag-TβRII 유전자와 함께 HKC-8 세포에 공동형질감염시켰다. β-gal 유전자 플라스미드는 도 10의 pCMV SPORT-β-gal 플라스미드 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하였다. 세포에 GS-HCl를 첨가하고 24시간 동안 및 TN을 첨가하고 12 시간 동안 유지한 후, TGF-β1를 3ng/ml 첨가하고 16 시간 동안 유지하였다. GS-HCl는 TGF-β1-유도된 luciferase 활성을 현저하게 감소시켰다. ^***P < 0.0001, TGF-β1 없는 control에 대한 ^*P <0.05; TGF-β1과 함께한 control에 대한 ^###P<0.0001.

실시예 2: GS - HCl -유도된 Tβ RII 의 N- 글리코실화 결함은 Tβ RII 의 세포 표면 수송과 Tβ RII 에의 TGF -β1 결합을 조절한다.

다음으로, GS-HCl이 어떻게 TGF-β 신호전달을 감쇄시키는데 영향을 미치는지에 대한 기작을 조사하였다. N-연결된 글리코실화는 TGF-β 수용체를 포함한, 많은 막 단백질의 세포 표면 수송에 관련되는 것으로 밝혀졌다. GS-HCl-유도된 TβRII의 N-글리코실화 결함이 TβRII의 세포 표면 수송에 미치는 영향을 조사하기 위하여, HeLa 세포에 과발현시킨 TβRII의 위치를 관찰하기 위하여 면역형광 분석 (immunofluorescence assay)을 수행하였다. 세포질로부터 표면 막을 구분하는데 있어 HKC-8 세포를 사용하는 불편함으로 인해, 상대적으로 큰 크기로 인해 단백질의 위치를 관찰하는데 더 효율적인, HeLa 세포를 선택하였다.

그 결과, TβRII 단백질은 액틴 필라멘트를 염색하여 세포의 형태를 나타내는 팔로이딘 (phalloidin)과 거의 융합되어 있음을 (almost merging) 관찰하였고, 세포질뿐만 아니라 막 표면에 많은 양이 위치하고 있음을 볼 수 있었다. 그러나, GS-HCl을 처리하여 N-글리코실화가 저해된 대부분의 TβRII는 세포 표면에 성공적으로 수송될 수 없었다 (도 3a). 대신, 그들은 소포체 (endoplasmic reticulum: ER) 마커인 PDI와 융합하는 모습을 보임으로써, 세포질에 주로 축적되어 있음을 볼 수 있었다 (도 3b). 또한 GS-HCl에 의하여 N-글리코실화가 저해된 TβRII의 위치는 투니카미신 영향하의 탈글리코실화된 TβRII의 위치와 거의 같은 모습을 보였다. 이들 발견을 통하여 GS-HCl은 TβRII의 N-연결된 글리코실화를 방해함으로써 TβRII의 세포 표면 수송을 방해함을 알 수 있었다.

도 3은 GS-HCl에 의해 유도된 TβRII N-글리코실화 저해는 TβRII의 세포 막 표면 수송 및 TGF-β1와의 결합을 방해하는 것을 보이는 도면이다. 도 3a와 3b는 도면에 지정된 각 염색물로 면역형광 염색한 결과를 나타낸 도면이다. 면역형광 염색 (400x)은 TβRII의 세포 내 위치를 보여준다 (Flag: red). 도 3a 및 도 3b에서, DAPI는 HeLa 세포의 핵 염색을 위하여 사용된 4',6-diamidino-2-phenylindole 염색 결과 (blue)를 나타내고, Phalloidin은 HeLa 세포 중의 phalloidin (green)을 염색한 결과이고, Flag은 Flag-TβRII에 대하여 염색한 결과이고, PDI는 단백질 디술피드 이소머라제 (protein disulfide isomerase: PDI)를 염색한 결과 (green)를 나타낸다. 도 3a에서, Merge는 Phalloidin과 Flag의 결과를 융합한 것이고, 도 3b에서, Merge는 PDI와 Flag의 결과를 융합한 것이다. 도 3에서, bar=50μm이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, GS-HCl은 TβRII의 세포 표면으로의 수송을 차단하고 대부분의 TβRII가 세포질에 우세하게 축적되게 하였다.

본 발명자들은 또한 GS-HCl에 의해 유도된 TβRII의 성공적이지 않은 세포 표면 수송이 TβRII에의 TGF-β1 결합에 영향을 미치는지를 조사하였다. 처리되지 않은 또는 GS-HCl-처리된 HKC-8 세포의 TβRII와 비오틴화된 TGF-β1의 결합 능력을 유세포 분석 (flow cytometry)을 사용하여 평가하였다 (도 3c). PBS-처리된 세포에서 TβRII와 TGF-β1과의 결합은 TGF-β1의 용량이 증가할수록 현저하게 증가하였다. 그러나, GS-HCl 처리는 PBS-처리된 세포에서의 TβRII에 대한 비오틴화된 TGF-β1 결합보다 50% 이상 감소되었다. GS-HCl-처리된 세포에서 TβRII와 TGF-β1-결합의 억제를 보이는 데이터는 GS-HCl-처리된 TβRII가 세포 표면으로 성공적으로 수송될 수 없다는 이전의 결과에 의하여 설명될 수 있다. 도 3c는 세포 표면에서 재조합 인간 TGF-β1 (rhTGF-β1)과 TβRII 결합 정도를 관찰한 유세포 흐름 분석의 분석결과이다. 36시간 동안 5mM GS-HCl-처리된 또는 처리되지 않은 (PBS 처리) 1x10⁵ HKC-8 세포에 다양한 양의 비오틴화된 TGF-β1 (10-40ng)을 첨가하였다. 비오틴화된 TGF-β1에 결합된 TβRII의 수는 rhTGF-β1에 대한 결합력을 갖는 avidin-FITC를 사용한 유세포 분석에 의하여 정량화되었다. GS-HCl은 TβRII와 TGF-β1의 결합을 억제하였다.

본 발명자들은 또한 GS-HCl이 HKC-8 세포에서 과발시킨 TβRII에 대한 비오틴화된 TGF-β1-결합을 감소시킨 것을 관찰하였다 (도 3d). HKC-8 세포주에 자연적으로 존재하는 TβRII로 인하여, TGF-β1-결합은 가짜(mock)-형질감염된 대조군 세포에서도 용량 의존적으로 증가하는 모습을 보였다. 더욱이, 내재적 TβRII 또한 비오틴화된 TGF-β1과 결합하기 때문에, 과발현된 TβRII는 대조군에 비하여, TGF-β1과의 결합이 현저하게 증가되지는 않았다. 그러나, GS-HCl 처리는 이미 내재된 TβRII뿐 아니라 과발현시킨 TβRII과의 결합 또한 감소시켰다. 그러므로, 이들 발견은 GS-HCl이 TβRII의 N-글리코실화를 방해하고, 그에 따라 TβRII의 세포 표면 수송을 저해하고 뒤이어 TGF-β1-결합을 억제한다는 것을 나타낸다.

실시예 3: GS - HCl 은 용량- 및 시간-의존적 방식으로 신장 표피 세포에서 TGF-β 신호전달 ( signaling )을 감쇄시킨다.

TGF-β 신호전달에 대한 GS-HCl의 생리적 유의성을 더 규명하게 위하여, 본 발명자들은 HKC-8 세포에 용량- 및 시간-의존적으로 GS-HCl를 처리하였고 TGF-β1 자극 후 Smad2 및 Smad3 단백질의 인산화 수준을 분석하였다. Smad2/3 인산화는 5mM GS-HCl 처리 후 약 50% 감소하였고, 심지어 12시간의 처리로도 Smad2/3 인산화를 감소시키는데 충분하였다 (도 4a 및 4b). 이들 관찰과 일관되게, GS-HCl 처리 시 Smad2/3 인산화의 현저한 감소는 마우스 일차 신장 표피 세포에서도 나타났다 (도 4c). 본 발명자들은 GS-HCl이 또한 용량-의존적 방식으로 TGF-β1-유도된 luciferase 활성을 억제함으로써 TGF-β1-유도된 전사활성을 감쇄시킨다는 것을 더 관찰하였다 (도 4d). 종합하면, 이들 데이터는 GS-HCl이 신장 표피 세포에서 TGF-β 신호전달의 감쇄에 중요한 영향을 미친다는 것을 증명한다.

도 4는 GS-HCl이 신장 표피 세포에서 TGF-β 신호전달을 감소시키는 것을 보이는 도면이다. 도 4에서, HKC-8 세포 (도 4a 및 4b)와 마우스 일차 신장 표피 세포 (도 4c)를 지정된 시간 동안 지정된 용량으로 GS-HCl을 첨가하고 배양하였다. 다음으로, 상기 배양물에 5ng/ml TGF-β1이 되도록 TGF-β1를 첨가하고 30분 동안 배양하였다. 세포에서 단백질을 추출하여 anti-phospho-Smad2/3, anti-Smad2/3 및 β-actin으로 면역블롯팅하였다. pSmad2/3과 Smad2/3 발현 수준을 나타내는 밴드 강도는 ImageJ software를 사용한 밀도분석법 (densitometry)에 의하여 Smad2/3에 대한 pSmad2/3의 비율로 전환시켰다. 도 4d에서, HKC-8 세포에 (CAGA)₁₂-MLP-luciferase reporter 유전자 및 β-gal을 형질감염시켰다. GS-HCl를 첨가한 후 24 시간 동안 및 투니카미신을 첨가한 후 12 시간 동안 배양한 후, 배양물에 3 ng/ml TGF-β1을 첨가하고 16 시간 동안 배양하였다. GS-HCl은 TGF-β1-유도된 luciferase 활성을 현저하게 감소시켰다. TGF-β1이 없는 control에 대한 ***P<0.0001, **P<0.001; TGF-β1이 있는 control에 대한 ^##P<0.001.

실시예 4: GS - HCl 은 신장 표피 세포에서 TGF -β1-유도된 섬유생성 효과 (fibrogenic effects )를 감소시킨다.

GS-HCl이 TGF-β 신호전달을 감쇄시킬 수 있는 능력이 있다는 것을 증명하였기 때문에, 본 발명자들은 다음으로 신장 표피 세포에서 GS-HCl이 TGF-β1-유도된 섬유생성 활성에 미치는 저해 효과를 연구하였다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, TGF-β1은 HKC-8 세포에서, 콜라겐 타입 I 및 피브로넥틴을 포함한, 세포외 마트릭스 (ECM) 성분의 mRNA 발현을 유도하였다. 그러나, GS-HCl의 저해 효과는 RT-PCR 및 정량적 실시간 RT-PCR 분석에 의하여 증명된 바와 같이, TGF-β1-유도된 콜라겐 타입 I과 피브로넥틴을 유의하게 억제하였다. TGF-β1은 또한 α-평활근 액틴 (α-smooth muscle actin: α-SMA) 유전자 발현을 유도함으로써 근섬유모세포 표현형을 나타내었다 (도 5b). 더욱이, HKC-8 세포는 E-cadherin의 mRNA 발현을 감소시킴으로써 TGF-β1 처리시 표피 특성 (epithelial characteristics)의 상실을 나타내었다. 그러나, GS-HCl은 TGF-β1-매개된 α-SMA mRNA의 증가를 감소시켰고 TGF-β1에 의한 E-cadherin 발현의 억제를 차단하였다. 일관되게, GS-HCl 처리는, TGF-β1에 의하여 유도된 피브로넥틴과 α-SMA 단백질의 발현을 감소시킴으로, 또한 ECM 침적 및 근원섬유모세포 활성화를 감소시킴을 시사하였다 (도 5c). 더욱이, 면역형광 염색도 GS-HCl 처리 후 TGF-β1-유도된 피브로넥틴 발현의 명백한 감소를 보였다 (도 5d). 종합하면, 이들 데이터는 GS-HCl이 신장 표피 세포에서 TGF-β1-매개된 섬유생성 효과를 효율적으로 감소시킨다는 것을 나타낸다.

도 5는 GS-HCl이 신장 표피 세포에서 TGF-β1-유도된 섬유생성 반응을 감소시킨다는 것을 나타내는 도면이다. 도 5a 내지 5d에서, HKC-8 세포를 다양한 시간 간격 동안 5mM GS-HCl을 처리한 후, 3ng/ml TGF-β1을 16 시간 동안 처리하였다. 도 5a 및 5b에서, 대표적 RT-PCR 및 정량적 실시간 RT-PCR 데이터는, GS-HCl이 TGF-β1-유도된 콜라겐 I, 피브로넥틴 및 α-SMA mRNA 발현을 저해하며, TGF-β1-매개된 E-cadherin 발현의 억제는 차단한다는 것을 나타낸다. TGF-β1이 없는 control에 대한 ***P<0.0001; TGF-β1이 있는 control에 대한 ^###P<0.0001. 도 5c에서, 세포에서 추출한 단백질을 피브로넥틴, α-SMA 및 β-actin에 대한 항체로 면역블롯팅시켰다. GS-HCl은 TGF-β1-유도된 피브로넥틴과α-SMA의 단백질 발현을 감소시켰다. 도 5d는 피브로넥틴 항체로 면역형광 염색 (200x)을 수행한 결과이다. 핵 염색을 위하여, DAPI를 사용하였다 (blue). GS-HCl은 TGF-β1-유도된 피브로넥틴의 단백질 발현을 감소시켰다. bar=50μm.

실시예 5: GS - HCl 은 폐쇄 신장병 ( obstructive nephropathy )에서 신장 섬유증 ( renal fibrosis )을 감쇄시킨다.

본 발명자들은 인 비보에서 손상 후 신장 섬유증을 감소시키는데 있어서 GS-HCl의 효과를 더 평가하였다. UUO 수술 7일 전부터, 본 발명자들은 GS-HCl을 마우스에 복막 내 주사를 통하여 20mg, 40mg, 및 60mg/kg을 매일 투여하였다. UUO 수술 후 14일에 마우스를 희생시켜 섬유증 정도를 측정하였다. PBS로 처리된 군에 비하여 GS-HCl (40mg 및 60mg/kg)으로 처리된 손상된 신장군이 현저하게 더 낮은 섬유증 점수 (fibrosis score)를 얻었다 (도 6a). 도 6b는, Masson's trichrome 염색에 의하여 처리된, sham, PBS-처리된 및 GS-HCl-처리된 UUO 군의 신장 절편의 대표적 광학현미경 사진을 나타낸다. 조직학적 검사는 sham-수술된 신장에서 정상 신장 피질 (cortex)을 나타내었다. 반면, 상기 폐쇄된 신장은 확연하게 (prominent) 팽창된 (dilated) 또는 atrophied tubules와, 강한 콜라겐 침적으로 나타나는 바와 같이, 자명한 간질 섬유증 (interstitial fibrosis)을 보였다. 그러나, 40mg/kg GS-HCl로 처리된 폐쇄된 신장은 상대적으로 잘 보존된 관 구조 (tubular structure)와 최소의 간질 섬유증을 보였다. 이들 결과에 의하여 예시된 바와 같이, GS-HCl은 인 비보에서 UUO-유도된 신장 섬유증을 감소시킬 수 있는 능력을 가지고 있음을 알 수 있다.

도 6은 GS-HCl이 UUO-유도된 신장 섬유증 모델에서 항섬유 효과 (antifibrotic effect)을 나타낸다는 것을 보이는 도면이다. 도 6a에서, 다른 용량의 GS-HCl을 UUO 수술 전 7일부터 마우스에 복막내로 주사하였다. 도 6a에서, PBS, GS 20, GS 40, 및 GS 60은 각각 PBS, GS-HCl 20mg/kg, 40mg/kg 및 60mg/kg을 투여한 것을 나타낸다. UUO 후 14일에 다양한 군으로부터 신장 절편을 채취하여 Masson's trichrome으로 염색하였다. 신장 섬유증의 반정량적 분석은 Banff quantitative criteria에 의거하여 0 내지 3의 범위의 점수에 의하여 수행하였다 (Lorraine C et al., Kidney International, Vol.55 (1999),pp.713-723). PBS에 대한 *P<0.05 (n=5). 도 6b는 Masson's trichrome 염색된 sham, UUO 및 GS-HCl-투여된 UUO 마우스 신장의 대표적 사진이다. 절편을 100x (하단 레인) 및 200x (하단 레인) 배율에서 관찰 및 사진촬영하였다. 40 mg/kg GS-HCl은 폐쇄 손상 (obstructive injury) 후 신장 섬유 상흔 (fibrotic lesions)을 현저하게 감소시켰다. bar=50μm.

실시예 6: GS - HCl 은 폐쇄 신장병에서 Smad3 인산화를 억제한다.

GS-HCl이 폐쇄된 신장에서 TGF-β 신호전달에 영향을 미칠 수 있는지를 연구하기 위하여, 본 발명자들은 다음으로 TGF-β 신호전달의 하류에서 신장 섬유증에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진, Smad3 단백질의 인산화 수준을 분석하였다.

웨스턴 블롯 분석은 폐쇄된 신장에서 Smad3 단백질의 현저하게 증가된 인산화 수준을 보였다. 그러나, 폐쇄된 신장에 GS-HCl 투여는 Smad3 인산화를 현저하게 감소시켰다 (도 7a). 면역조직염색 분석 또한 비슷한 결과를 보였는데, GS-HCl 투여는, 정상 신장에서 나타낸 것에 비견할 만한 정도로 폐쇄된 신장에서 증가된 Smad3 인산화를 낮추었다 (도 7b). 이 관찰은 GS-HCl이 폐쇄된 신장병에서 Smad3 인산화를 저해하고, 그에 따라 신장 섬유증에서 TGF-β 신호전달을 감소시키는데 대한 효능이 있다는 것을 의미함을 증명하였다.

도 7은 GS-HCl이 폐쇄된 마우스 신장에서 Smad3의 인산화 수준을 감소시킨다는 것을 나타내는 도면이다. 도 7a 및 7b에서, 다른 용량의 GS-HCl을 UUO 수술 전 7일부터 마우스에 복막내로 주사하였다. UUO 후 14일에, 조직 균질물 (tissue homogenate)을 phospho-Samd3 및 total-Smad3으로 면역블롯팅하였다 (도 7a). UUO에 의하여 유도된 Smad3 인산화의 증가는 GS-HCl 투여에 의하여 현저하게 감소하였다. 도 7b에서, 신장 절편 중의 phospho-Smad3에 대한 면역조직화학적 염색은 200x 배율로 관찰하고 사진촬영하였다. GS-HCl은 UUO에 의하여 증가된 Smad3 인산화 수준을 감소시켰다. bar=50μm.

실시예 7: GS - HCl 은 폐쇄된 신장병에서 α-평활근 액틴의 발현을 감소시킨다.

α-SMA-양성 및 마트릭스-생성 근섬유모세포의 활성화는 UUO에 의하여 유도된 신장 섬유증에서 자주 관찰되는, 분명한 특징 (distinctive feature)이다. TGF-β1은 간질 섬유아세포 및 관형 표피 세포가 근섬유모세포성 활성화 및 전이를 겪도록 자극하여 마트릭스-생성 섬유생성 세포로 되게 함으로써, 신장 섬유증의 강력한 매개자로서 가능을 한다.

GS-HCl이 UUO-유도된 신장 섬유증에서 α-SMA 발현을 조절하는지 여부를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 sham, UUO 및 GS-HCl-처리된 UUO 신장에서 α-SMA의 발현 수준을 검사하였다. α-SMA의 mRNA 발현은 sham-수술된 신장에서는 거의 검출할 수 없었다 (도 8a 및 도 8b).

면역형광 염색은 또한 sham-수술된 신장에서 혈관의 평활근 층에서만 양성 염색을 보였다(도 8c). 대조적으로, UUO는 RT-PCR 및 면역형광 염색에 의하여 증명된 바와 같이, 폐쇄된 신장에서 α-SMA 발현의 현저한 증가를 유도하였다. 그러나, α-SMA 발현 유도는 40mg/kg GS-HCl의 처리에 의하여 대조군의 38%까지 현저하게 감소하였다. 이전 발견과 일관되게, 면역형광 염색은 40mg 및 60mg/kg GS-HCl-처리된 UUO 군에서 현저하게 감소된 α-SMA 발현을 증명하였다. 그러므로, 이들 데이터는 GS-HCl이 신장 섬유증 중 α-SMA-양성 근섬유모세포 활성화를 감소시킬 수 있는 잠재력을 나타냄으로써, 그에 따른 ECM 성분의 생성을 감소시킬 것이라는 점을 시사한다.

도 8은 GS-HCl이 폐쇄된 신장에서 α-SMA 발현을 감소시킨다는 것을 나타내는 도면이다. 도 8a 내지 8c에서, GS-HCl은 UUO 7일전부터 마우스에 매일 복막내로 투여하였다. UUO 후 14일에 다양한 분석을 위하여 신장을 수집하였다. 도 8a의 대표적 RT-PCR 및 도 8b의 정량적, 실시간 RT-PCR은, GS-HCl이 UUO에 의하여 유도된 α-SMA mRNA 발현을 저해한다는 것을 나타낸다. sham control에 대한 *P < 0.05; UUO+PBS (n=5)에 대한 #P<0.05. 도 8b에서, 세로 축의 relative α-SMA mRNA는 sham control에 대한 비율을 나타낸다. 도 8c에서, α-SMA에 대한 면역형광 염색은 GS-HCl이 폐쇄된 신장에서 α-SMA 단백질의 발현을 감소시킨다는 것을 나타낸다 (배율, 200x). bar=50μm.

실시예 8: GS - HCl 은 폐쇄된 신장병에 의해 유도된 세포외 마트릭스 단백질의 발현을 감소시킨다.

본 발명자들은 GS-HCl이 UUO 신장에서 증가된 ECM 침적을 감소시키는데 영향을 미치는지를 더 조사하였다. 본 발명자들은 RT-PCR 및 정량적 실시간 RT-PCR에 의하여, 피브로넥틴 및 콜라겐 I을 포함한, 주요 간질 마트릭스 성분의 mRNA 발현을 분석하였다.

도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, GS-HCl은, 폐쇄성 손상 (obstructive injury) 후 증가된, 피브로넥틴과 콜라겐 I의 mRNA 발현 수준을 효과적으로 저해하였다. 면역조직화학적 염색 역시 GS-HCl-처리된 UUO 신장에서 피브로넥틴의 발현이 현저하게 감소된 결과를 보여주었다 (도 9c). 이들 발견에 의하여 증명된 바와 같이, GS-HCl은 폐쇄된 신장에서 ECM 과생산 및 침적에 대한 저해 효과를 나타낸다.

도 9는 GS-HCl이 UUO-유도된 신장 섬유증의 마우스 모델에서 콜라겐 I과 피브로넥틴 발현을 저해한다는 것을 나타낸다. 도 9a 내지 9c에서, UUO 수술 7일전부터 매일 마우스에 GS-HCl을 복막 내로 투여하고, UUO 후 14일에 희생시켰다. 도 9a의 대표적 RT-PCR 및 도 9b의 정량적, 실시간 RT-PCR은, UUO에 의한 피브로넥틴과 콜라겐 I의 증가된 mRNA 발현은 GS-HCl 투여에 의하여 감소된다는 것을 나타낸다. sham control에 대한 ^***P<0.0001, ^**P<0.001;^###P<0.0001, UUO+PBS (n=5)에 대한 ^##P<0.001. 도 9c에서, 피브로넥틴에 대한 면역형광 염색은 GS-HCl이 폐쇄된 신장에서 피브로넥틴 단백질의 과침적을 감소시킨다는 것을 나타낸다 (배율, 200x). bar=50μm.

<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A composition comprising a glucosamine and use thereof <130> PN100376 <160> 30 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 592 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE <222> (1)..(592) <223> human TGFBR2 isoform A <400> 1 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp 20 25 30 Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn 35 40 45 Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr 50 55 60 Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp 65 70 75 80 Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys 85 90 95 Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val 100 105 110 Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp 115 120 125 Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro 130 135 140 Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met 145 150 155 160 Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu 165 170 175 Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln Val 180 185 190 Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile 195 200 205 Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser 210 215 220 Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Glu His 225 230 235 240 Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys 245 250 255 Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp 260 265 270 Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu 275 280 285 Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe 290 295 300 Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser 305 310 315 320 Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu 325 330 335 Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe 340 345 350 His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser 355 360 365 Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala 370 375 380 His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile 385 390 395 400 Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu 405 410 415 Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr 420 425 430 Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg 435 440 445 Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val 450 455 460 Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp 465 470 475 480 Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu 485 490 495 Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met 500 505 510 Lys Asp Asn Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe 515 520 525 Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu 530 535 540 Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala 545 550 555 560 Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser 565 570 575 Cys Ser Glu Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys 580 585 590 <210> 2 <211> 592 <212> PRT <213> Mus Musculus <220> <221> UNSURE <222> (1)..(592) <223> TGF-beta receptor type-2 isoform 1 precursor <400> 2 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Pro Lys Ser Asp 20 25 30 Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Ala Ser Ile His Leu Ser Cys Asn 35 40 45 Arg Thr Ile His Pro Leu Lys His Phe Asn Ser Asp Val Met Ala Ser 50 55 60 Asp Asn Gly Gly Ala Val Lys Leu Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp 65 70 75 80 Val Arg Leu Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys 85 90 95 Ser Ile Thr Ala Ile Cys Glu Lys Pro His Glu Val Cys Val Ala Val 100 105 110 Trp Arg Lys Asn Asp Lys Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp 115 120 125 Pro Lys Leu Thr Tyr His Gly Phe Thr Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro 130 135 140 Lys Cys Val Met Lys Glu Lys Lys Arg Ala Gly Glu Thr Phe Phe Met 145 150 155 160 Cys Ala Cys Asn Met Glu Glu Cys Asn Asp Tyr Ile Ile Phe Ser Glu 165 170 175 Glu Tyr Thr Thr Ser Ser Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Ile Gln Val 180 185 190 Thr Gly Val Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Ile Ala Ile Ala Val Ile 195 200 205 Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val His Arg Gln Gln Lys Leu Ser Pro 210 215 220 Ser Trp Glu Ser Ser Lys Pro Arg Lys Leu Met Asp Phe Ser Asp Asn 225 230 235 240 Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys 245 250 255 Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp 260 265 270 Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu 275 280 285 Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu Thr Val Ala Val Lys Ile Phe 290 295 300 Pro Tyr Glu Glu Tyr Ser Ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser 305 310 315 320 Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu 325 330 335 Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe 340 345 350 His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr Leu Thr Arg His Val Ile Ser 355 360 365 Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala 370 375 380 His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile 385 390 395 400 Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu 405 410 415 Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr 420 425 430 Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg 435 440 445 Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val 450 455 460 Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr Ser Met Ala Leu Val Leu Trp 465 470 475 480 Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu 485 490 495 Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu His Pro Cys Val Glu Ser Met 500 505 510 Lys Asp Ser Val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe 515 520 525 Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Ile Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu 530 535 540 Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala 545 550 555 560 Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Pro Glu Arg Leu Ser Gly Arg Ser 565 570 575 Cys Ser Gln Glu Lys Ile Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys 580 585 590 <210> 3 <211> 567 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE <222> (1)..(567) <223> TGF-beta receptor type-2 isoform B precursor [homo sapiens] <400> 3 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 20 25 30 Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 35 40 45 Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 50 55 60 Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 65 70 75 80 Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 85 90 95 Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 130 135 140 Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu 145 150 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musculus <220> <221> UNSURE <222> (1)..(567) <223> TGF-beta receptor type-2 isoform 2 precursor [Mus musculus] <400> 4 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Pro Lys Ser Val 20 25 30 Asn Ser Asp Val Met Ala Ser Asp Asn Gly Gly Ala Val Lys Leu Pro 35 40 45 Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Leu Ser Thr Cys Asp Asn Gln 50 55 60 Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ala Ile Cys Glu Lys Pro 65 70 75 80 His Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Lys Asn Ile Thr 85 90 95 Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Thr Tyr His Gly Phe Thr 100 105 110 Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Val Met Lys Glu Lys Lys Arg 115 120 125 Ala Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ala Cys Asn Met Glu Glu Cys Asn 130 135 140 Asp Tyr Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Thr Thr Ser Ser Pro Asp Leu 145 150 155 160 Leu Leu Val Ile Ile Gln Val Thr Gly Val Ser Leu Leu Pro Pro Leu 165 170 175 Gly Ile Ala Ile Ala Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val His 180 185 190 Arg Gln Gln Lys Leu Ser Pro Ser Trp Glu Ser Ser Lys Pro Arg Lys 195 200 205 Leu Met Asp Phe Ser Asp Asn Cys Ala Ile Ile Leu Glu Asp Asp Arg 210 215 220 Ser Asp Ile Ser Ser Thr Cys Ala Asn Asn Ile Asn His Asn Thr Glu 225 230 235 240 Leu Leu Pro Ile Glu Leu Asp Thr Leu Val Gly Lys Gly Arg Phe Ala 245 250 255 Glu Val Tyr Lys Ala Lys Leu Lys Gln Asn Thr Ser Glu Gln Phe Glu 260 265 270 Thr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Tyr Glu Glu Tyr Ser Ser Trp Lys 275 280 285 Thr Glu Lys Asp Ile Phe Ser Asp Ile Asn Leu Lys His Glu Asn Ile 290 295 300 Leu Gln Phe Leu Thr Ala Glu Glu Arg Lys Thr Glu Leu Gly Lys Gln 305 310 315 320 Tyr Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Ala Lys Gly Asn Leu Gln Glu Tyr 325 330 335 Leu Thr Arg His Val Ile Ser Trp Glu Asp Leu Arg Lys Leu Gly Ser 340 345 350 Ser Leu Ala Arg Gly Ile Ala His Leu His Ser Asp His Thr Pro Cys 355 360 365 Gly Arg Pro Lys Met Pro Ile Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn 370 375 380 Ile Leu Val Lys Asn Asp Leu Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu 385 390 395 400 Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr Leu Ser Val Asp Asp Leu Ala Asn Ser 405 410 415 Gly Gln Val Gly Thr Ala Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser 420 425 430 Arg Met Asn Leu Glu Asn Val Glu Ser Phe Lys Gln Thr Asp Val Tyr 435 440 445 Ser Met Ala Leu Val Leu Trp Glu Met Thr Ser Arg Cys Asn Ala Val 450 455 460 Gly Glu Val Lys Asp Tyr Glu Pro Pro Phe Gly Ser Lys Val Arg Glu 465 470 475 480 His Pro Cys Val Glu Ser Met Lys Asp Ser Val Leu Arg Asp Arg Gly 485 490 495 Arg Pro Glu Ile Pro Ser Phe Trp Leu Asn His Gln Gly Ile Gln Ile 500 505 510 Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu Cys Trp Asp His Asp Pro Glu Ala Arg 515 520 525 Leu Thr Ala Gln Cys Val Ala Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Pro 530 535 540 Glu Arg Leu Ser Gly Arg Ser Cys Ser Gln Glu Lys Ile Pro Glu Asp 545 550 555 560 Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys 565 <210> 5 <211> 1779 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1779) <223> Homo sapiens TGF, beta receptor II (70/80kDa) transcript variant 1, mRNA <400> 5 atgggtcggg ggctgctcag gggcctgtgg ccgctgcaca tcgtcctgtg gacgcgtatc 60 gccagcacga tcccaccgca cgttcagaag tcggatgtgg aaatggaggc ccagaaagat 120 gaaatcatct gccccagctg taataggact gcccatccac tgagacatat taataacgac 180 atgatagtca ctgacaacaa cggtgcagtc aagtttccac aactgtgtaa attttgtgat 240 gtgagatttt ccacctgtga caaccagaaa tcctgcatga gcaactgcag catcacctcc 300 atctgtgaga agccacagga agtctgtgtg gctgtatgga gaaagaatga cgagaacata 360 acactagaga cagtttgcca tgaccccaag ctcccctacc atgactttat tctggaagat 420 gctgcttctc caaagtgcat tatgaaggaa aaaaaaaagc ctggtgagac tttcttcatg 480 tgttcctgta gctctgatga gtgcaatgac aacatcatct tctcagaaga atataacacc 540 agcaatcctg acttgttgct agtcatattt caagtgacag gcatcagcct cctgccacca 600 ctgggagttg ccatatctgt catcatcatc ttctactgct accgcgttaa ccggcagcag 660 aagctgagtt caacctggga aaccggcaag acgcggaagc tcatggagtt cagcgagcac 720 tgtgccatca tcctggaaga tgaccgctct gacatcagct ccacgtgtgc caacaacatc 780 aaccacaaca cagagctgct gcccattgag ctggacaccc tggtggggaa aggtcgcttt 840 gctgaggtct ataaggccaa gctgaagcag aacacttcag agcagtttga gacagtggca 900 gtcaagatct ttccctatga ggagtatgcc tcttggaaga cagagaagga catcttctca 960 gacatcaatc tgaagcatga gaacatactc cagttcctga cggctgagga gcggaagacg 1020 gagttgggga aacaatactg gctgatcacc gccttccacg ccaagggcaa cctacaggag 1080 tacctgacgc ggcatgtcat cagctgggag gacctgcgca agctgggcag ctccctcgcc 1140 cgggggattg ctcacctcca cagtgatcac actccatgtg ggaggcccaa gatgcccatc 1200 gtgcacaggg acctcaagag ctccaatatc ctcgtgaaga acgacctaac ctgctgcctg 1260 tgtgactttg ggctttccct gcgtctggac cctactctgt ctgtggatga cctggctaac 1320 agtgggcagg tgggaactgc aagatacatg gctccagaag tcctagaatc caggatgaat 1380 ttggagaatg ttgagtcctt caagcagacc gatgtctact ccatggctct ggtgctctgg 1440 gaaatgacat ctcgctgtaa tgcagtggga gaagtaaaag attatgagcc tccatttggt 1500 tccaaggtgc gggagcaccc ctgtgtcgaa agcatgaagg acaacgtgtt gagagatcga 1560 gggcgaccag aaattcccag cttctggctc aaccaccagg gcatccagat ggtgtgtgag 1620 acgttgactg agtgctggga ccacgaccca gaggcccgtc tcacagccca gtgtgtggca 1680 gaacgcttca gtgagctgga gcatctggac aggctctcgg ggaggagctg ctcggaggag 1740 aagattcctg aagacggctc cctaaacact accaaatag 1779 <210> 6 <211> 1779 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1779) <223> Mus musculus transforming growth factor, beta receptor II (Tgfbr2), transcript variant 1, mRNA <400> 6 atgggtcggg ggctgctccg gggcctgtgg ccgctgcata tcgtcctgtg gacgcgcatc 60 gccagcacga tcccgccgca cgttcccaag tcggatgtgg aaatggaagc ccagaaagat 120 gcatccatcc acctaagctg taataggacc atccatccac tgaaacattt taacagtgat 180 gtcatggcca gcgacaatgg cggtgcggtc aagcttccac agctgtgcaa gttttgcgat 240 gtgagactgt ccacttgcga caaccagaag tcctgcatga gcaactgcag catcacggcc 300 atctgtgaga agccgcatga agtctgcgtg gccgtgtgga ggaagaacga caagaacatt 360 actctggaga cggtttgcca cgaccccaag ctcacctacc acggcttcac tctggaagat 420 gccgcttctc ccaagtgtgt catgaaggaa aagaaaaggg cgggcgagac tttcttcatg 480 tgtgcctgta acatggaaga gtgcaacgat tacatcatct tttcggaaga atacaccacc 540 agcagtcccg acctgttgtt ggtcattatc caagtgacgg gtgtcagcct cctgcctccg 600 ctggggattg ccatagctgt catcatcatc ttctactgct accgtgtcca ccggcagcag 660 aagctgagcc cgtcctggga gagcagcaag ccccggaaac tgatggattt cagtgacaat 720 tgtgccatca tcctggagga cgaccgctcc gacatcagct ccacgtgcgc caacaacatc 780 aaccacaaca cggagctgct gcccatcgag ctggacacgc tggtggggaa gggccgcttc 840 gccgaggtct acaaggccaa gctgaagcag aacacctcag agcagtttga gaccgtggct 900 gtcaagatct tcccctacga ggagtactcc tcgtggaaaa cagagaagga catcttctcc 960 gatatcaacc tgaagcatga gaacatcctg cagttcctga cggccgagga gcggaagaca 1020 gagctgggca agcagtactg gctgatcacg gcgttccacg cgaagggcaa cctgcaggag 1080 tacctcacga ggcatgtcat cagctgggag gacctgagga agctgggcag ctccctggcc 1140 cggggcatcg ctcatctcca cagtgaccac actccttgtg ggaggcccaa gatgcccatt 1200 gttcacaggg acctcaagag ctctaacatc ctagtgaaga acgacttgac ctgttgcctg 1260 tgtgacttcg ggctgtcctt gcgcctggac cctactctgt ctgtggatga cctggccaac 1320 agcgggcagg tgggaacggc aagatacatg gccccggaag ttctagaatc caggatgaat 1380 ctggaaaacg tggagtcgtt caagcagacg gatgtctact ccatggctct ggtactctgg 1440 gaaatgacgt cccgctgcaa tgctgtggga gaagtgaagg attacgagcc cccatttggt 1500 tccaaggtgc gggagcaccc ctgtgtggag agcatgaaag acagtgtgct gagagaccga 1560 gggcggccgg aaattcccag cttctggctc aaccaccagg gcatccagat cgtgtgtgag 1620 actttgaccg agtgctggga ccatgacccc gaagcccgtc tcacagcaca gtgtgtggca 1680 gagcgcttca gtgagctgga gcatccggag agactctctg ggaggagctg ctcccaggag 1740 aagattccag aagatggctc gctgaacact accaaatag 1779 <210> 7 <211> 1704 <212> DNA <213> Hom sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1704) <223> Homo sapiens TGF, beta receptor II (70/80kDa) (TGFBR2), transcript variant 2, mRNa <400> 7 atgggtcggg ggctgctcag gggcctgtgg ccgctgcaca tcgtcctgtg gacgcgtatc 60 gccagcacga tcccaccgca cgttcagaag tcggttaata acgacatgat agtcactgac 120 aacaacggtg cagtcaagtt tccacaactg tgtaaatttt gtgatgtgag attttccacc 180 tgtgacaacc agaaatcctg catgagcaac tgcagcatca cctccatctg tgagaagcca 240 caggaagtct gtgtggctgt atggagaaag aatgacgaga acataacact agagacagtt 300 tgccatgacc ccaagctccc ctaccatgac tttattctgg aagatgctgc ttctccaaag 360 tgcattatga aggaaaaaaa aaagcctggt gagactttct tcatgtgttc ctgtagctct 420 gatgagtgca atgacaacat catcttctca gaagaatata acaccagcaa tcctgacttg 480 ttgctagtca tatttcaagt gacaggcatc agcctcctgc caccactggg agttgccata 540 tctgtcatca tcatcttcta ctgctaccgc gttaaccggc agcagaagct gagttcaacc 600 tgggaaaccg gcaagacgcg gaagctcatg gagttcagcg agcactgtgc catcatcctg 660 gaagatgacc gctctgacat cagctccacg tgtgccaaca acatcaacca caacacagag 720 ctgctgccca ttgagctgga caccctggtg gggaaaggtc gctttgctga ggtctataag 780 gccaagctga agcagaacac ttcagagcag tttgagacag tggcagtcaa gatctttccc 840 tatgaggagt atgcctcttg gaagacagag aaggacatct tctcagacat caatctgaag 900 catgagaaca tactccagtt cctgacggct gaggagcgga agacggagtt ggggaaacaa 960 tactggctga tcaccgcctt ccacgccaag ggcaacctac aggagtacct gacgcggcat 1020 gtcatcagct gggaggacct gcgcaagctg ggcagctccc tcgcccgggg gattgctcac 1080 ctccacagtg atcacactcc atgtgggagg cccaagatgc ccatcgtgca cagggacctc 1140 aagagctcca atatcctcgt gaagaacgac ctaacctgct gcctgtgtga ctttgggctt 1200 tccctgcgtc tggaccctac tctgtctgtg gatgacctgg ctaacagtgg gcaggtggga 1260 actgcaagat acatggctcc agaagtccta gaatccagga tgaatttgga gaatgttgag 1320 tccttcaagc agaccgatgt ctactccatg gctctggtgc tctgggaaat gacatctcgc 1380 tgtaatgcag tgggagaagt aaaagattat gagcctccat ttggttccaa ggtgcgggag 1440 cacccctgtg tcgaaagcat gaaggacaac gtgttgagag atcgagggcg accagaaatt 1500 cccagcttct ggctcaacca ccagggcatc cagatggtgt gtgagacgtt gactgagtgc 1560 tgggaccacg acccagaggc ccgtctcaca gcccagtgtg tggcagaacg cttcagtgag 1620 ctggagcatc tggacaggct ctcggggagg agctgctcgg aggagaagat tcctgaagac 1680 ggctccctaa acactaccaa atag 1704 <210> 8 <211> 1704 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1704) <223> TGF-beta receptor type-2 isoform 2 precursor [Mus musculus] <400> 8 atgggtcggg ggctgctccg gggcctgtgg ccgctgcata tcgtcctgtg gacgcgcatc 60 gccagcacga tcccgccgca cgttcccaag tcggttaaca gtgatgtcat ggccagcgac 120 aatggcggtg cggtcaagct tccacagctg tgcaagtttt gcgatgtgag actgtccact 180 tgcgacaacc agaagtcctg catgagcaac tgcagcatca cggccatctg tgagaagccg 240 catgaagtct gcgtggccgt gtggaggaag aacgacaaga acattactct ggagacggtt 300 tgccacgacc ccaagctcac ctaccacggc ttcactctgg aagatgccgc ttctcccaag 360 tgtgtcatga aggaaaagaa aagggcgggc gagactttct tcatgtgtgc ctgtaacatg 420 gaagagtgca acgattacat catcttttcg gaagaataca ccaccagcag tcccgacctg 480 ttgttggtca ttatccaagt gacgggtgtc agcctcctgc ctccgctggg gattgccata 540 gctgtcatca tcatcttcta ctgctaccgt gtccaccggc agcagaagct gagcccgtcc 600 tgggagagca gcaagccccg gaaactgatg gatttcagtg acaattgtgc catcatcctg 660 gaggacgacc gctccgacat cagctccacg tgcgccaaca acatcaacca caacacggag 720 ctgctgccca tcgagctgga cacgctggtg gggaagggcc gcttcgccga ggtctacaag 780 gccaagctga agcagaacac ctcagagcag tttgagaccg tggctgtcaa gatcttcccc 840 tacgaggagt actcctcgtg gaaaacagag aaggacatct tctccgatat caacctgaag 900 catgagaaca tcctgcagtt cctgacggcc gaggagcgga agacagagct gggcaagcag 960 tactggctga tcacggcgtt ccacgcgaag ggcaacctgc aggagtacct cacgaggcat 1020 gtcatcagct gggaggacct gaggaagctg ggcagctccc tggcccgggg catcgctcat 1080 ctccacagtg accacactcc ttgtgggagg cccaagatgc ccattgttca cagggacctc 1140 aagagctcta acatcctagt gaagaacgac ttgacctgtt gcctgtgtga cttcgggctg 1200 tccttgcgcc tggaccctac tctgtctgtg gatgacctgg ccaacagcgg gcaggtggga 1260 acggcaagat acatggcccc ggaagttcta gaatccagga tgaatctgga aaacgtggag 1320 tcgttcaagc agacggatgt ctactccatg gctctggtac tctgggaaat gacgtcccgc 1380 tgcaatgctg tgggagaagt gaaggattac gagcccccat ttggttccaa ggtgcgggag 1440 cacccctgtg tggagagcat gaaagacagt gtgctgagag accgagggcg gccggaaatt 1500 cccagcttct ggctcaacca ccagggcatc cagatcgtgt gtgagacttt gaccgagtgc 1560 tgggaccatg accccgaagc ccgtctcaca gcacagtgtg tggcagagcg cttcagtgag 1620 ctggagcatc cggagagact ctctgggagg agctgctccc aggagaagat tccagaagat 1680 ggctcgctga acactaccaa atag 1704 <210> 9 <211> 425 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE <222> (1)..(425) <223> Mothers against decapentaplegic homolog 3 isoform 1 [Homo sapiens] <400> 9 Met Ser Ser Ile Leu Pro Phe Thr Pro Pro Ile Val Lys Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Lys Lys Gly Glu Gln Asn Gly Gln Glu Glu Lys Trp Cys Glu 20 25 30 Lys Ala Val Lys Ser Leu Val Lys Lys Leu Lys Lys Thr Gly Gln Leu 35 40 45 Asp Glu Leu Glu Lys Ala Ile Thr Thr Gln Asn Val Asn Thr Lys Cys 50 55 60 Ile Thr Ile Pro Arg Ser Leu Asp Gly Arg Leu Gln Val Ser His Arg 65 70 75 80 Lys Gly Leu Pro His Val Ile Tyr Cys Arg Leu Trp Arg Trp Pro Asp 85 90 95 Leu His Ser His His Glu Leu Arg Ala Met Glu Leu Cys Glu Phe Ala 100 105 110 Phe Asn Met Lys Lys Asp Glu Val Cys Val Asn Pro Tyr His Tyr Gln 115 120 125 Arg Val Glu Thr Pro Val Leu Pro Pro Val Leu Val Pro Arg His Thr 130 135 140 Glu Ile Pro Ala Glu Phe Pro Pro Leu Asp Asp Tyr Ser His Ser Ile 145 150 155 160 Pro Glu Asn Thr Asn Phe Pro Ala Gly Ile Glu Pro Gln Ser Asn Ile 165 170 175 Pro Glu Thr Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ser Glu Asp Gly Glu Thr Ser 180 185 190 Asp His Gln Met Asn His Ser Met Asp Ala Gly Ser Pro Asn Leu Ser 195 200 205 Pro Asn Pro Met Ser Pro Ala His Asn Asn Leu Asp Leu Gln Pro Val 210 215 220 Thr Tyr Cys Glu Pro Ala Phe Trp Cys Ser Ile Ser Tyr Tyr Glu Leu 225 230 235 240 Asn Gln Arg Val Gly Glu Thr Phe His Ala Ser Gln Pro Ser Met Thr 245 250 255 Val Asp Gly Phe Thr Asp Pro Ser Asn Ser Glu Arg Phe Cys Leu Gly 260 265 270 Leu Leu Ser Asn Val Asn Arg Asn Ala Ala Val Glu Leu Thr Arg Arg 275 280 285 His Ile Gly Arg Gly Val Arg Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Glu Val Phe 290 295 300 Ala Glu Cys Leu Ser Asp Ser Ala Ile Phe Val Gln Ser Pro Asn Cys 305 310 315 320 Asn Gln Arg Tyr Gly Trp His Pro Ala Thr Val Cys Lys Ile Pro Pro 325 330 335 Gly Cys Asn Leu Lys Ile Phe Asn Asn Gln Glu Phe Ala Ala Leu Leu 340 345 350 Ala Gln Ser Val Asn Gln Gly Phe Glu Ala Val Tyr Gln Leu Thr Arg 355 360 365 Met Cys Thr Ile Arg Met Ser Phe Val Lys Gly Trp Gly Ala Glu Tyr 370 375 380 Arg Arg Gln Thr Val Thr Ser Thr Pro Cys Trp Ile Glu Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Gly Pro Leu Gln Trp Leu Asp Lys Val Leu Thr Gln Met Gly Ser 405 410 415 Pro Ser Ile Arg Cys Ser Ser Val Ser 420 425 <210> 10 <211> 425 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> UNSURE <222> (1)..(425) <223> mothers against decapentaplegic homolog 3 [Mus musculus] <400> 10 Met Ser Ser Ile Leu Pro Phe Thr Pro Pro Ile Val Lys Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Lys Lys Gly Glu Gln Asn Gly Gln Glu Glu Lys Trp Cys Glu 20 25 30 Lys Ala Val Lys Ser Leu Val Lys Lys Leu Lys Lys Thr Gly Gln Leu 35 40 45 Asp Glu Leu Glu Lys Ala Ile Thr Thr Gln Asn Val Asn Thr Lys Cys 50 55 60 Ile Thr Ile Pro Arg Ser Leu Asp Gly Arg Leu Gln Val Ser His Arg 65 70 75 80 Lys Gly Leu Pro His Val Ile Tyr Cys Arg Leu Trp Arg Trp Pro Asp 85 90 95 Leu His Ser His His Glu Leu Arg Ala Met Glu Leu Cys Glu Phe Ala 100 105 110 Phe Asn Met Lys Lys Asp Glu Val Cys Val Asn Pro Tyr His Tyr Gln 115 120 125 Arg Val Glu Thr Pro Val Leu Pro Pro Val Leu Val Pro Arg His Thr 130 135 140 Glu Ile Pro Ala Glu Phe Pro Pro Leu Asp Asp Tyr Ser His Ser Ile 145 150 155 160 Pro Glu Asn Thr Asn Phe Pro Ala Gly Ile Glu Pro Gln Ser Asn Ile 165 170 175 Pro Glu Thr Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ser Glu Asp Gly Glu Thr Ser 180 185 190 Asp His Gln Met Asn His Ser Met Asp Ala Gly Ser Pro Asn Leu Ser 195 200 205 Pro Asn Pro Met Ser Pro Ala His Asn Asn Leu Asp Leu Gln Pro Val 210 215 220 Thr Tyr Cys Glu Pro Ala Phe Trp Cys Ser Ile Ser Tyr Tyr Glu Leu 225 230 235 240 Asn Gln Arg Val Gly Glu Thr Phe His Ala Ser Gln Pro Ser Met Thr 245 250 255 Val Asp Gly Phe Thr Asp Pro Ser Asn Ser Glu Arg Phe Cys Leu Gly 260 265 270 Leu Leu Ser Asn Val Asn Arg Asn Ala Ala Val Glu Leu Thr Arg Arg 275 280 285 His Ile Gly Arg Gly Val Arg Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Glu Val Phe 290 295 300 Ala Glu Cys Leu Ser Asp Ser Ala Ile Phe Val Gln Ser Pro Asn Cys 305 310 315 320 Asn Gln Arg Tyr Gly Trp His Pro Ala Thr Val Cys Lys Ile Pro Pro 325 330 335 Gly Cys Asn Leu Lys Ile Phe Asn Asn Gln Glu Phe Ala Ala Leu Leu 340 345 350 Ala Gln Ser Val Asn Gln Gly Phe Glu Ala Val Tyr Gln Leu Thr Arg 355 360 365 Met Cys Thr Ile Arg Met Ser Phe Val Lys Gly Trp Gly Ala Glu Tyr 370 375 380 Arg Arg Gln Thr Val Thr Ser Thr Pro Cys Trp Ile Glu Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Gly Pro Leu Gln Trp Leu Asp Lys Val Leu Thr Gln Met Gly Ser 405 410 415 Pro Ser Ile Arg Cys Ser Ser Val Ser 420 425 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for human collagen I gene <400> 11 caagaggaag gccaagtcga g 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for human collagen I gene <400> 12 ttgtcgcaga cgcagatcc 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse collagen I gene <400> 13 atctcctggt gctgatggac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse collagen I gene <400> 14 accttgtttg ccaggttcac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human Firbronectin gene <400> 15 gacgactccc ttttctcctc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for human Fibronectin gene <400> 16 ctcatctccc tcctcactca 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse Fibronectin gene <400> 17 accgacagtg gtgtggtcta 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse Fibronectin gene <400> 18 caccataagt ctgggtcacg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human a-SMA gene <400> 19 gaccgaatgc agaaggagat 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for human a-SMA gene <400> 20 ccaccgatcc agacagagta 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for mouse a-SMA gene <400> 21 gtcccagaca tcagggagta a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for mouse a-SMA gene <400> 22 tcggatactt cagcgtcagg a 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human E-cadherin gene <400> 23 tcccaataca tctcccttca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for human E-cadherin gene <400> 24 tcacacacgc tgacctctaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human and mouse GAPDH gene <400> 25 tcaacggatt tggtcgtatt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for human and mouse GAPDH gene <400> 26 ggaagatggt gatgggattt 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human and mouse 18sRNA gene <400> 27 ctttctgctg ccctcacct 19 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for human and mouse 18sRNA gene <400> 28 tccccaaact ccacagtctc 20 <210> 29 <211> 1747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse TBRII isoform b-Flag gene <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Eco RI site <220> <221> misc_feature <222> (1715)..(1720) <223> SalI site <220> <221> misc_feature <222> (1724)..(1747) <223> Flag sequence <220> <221> misc_feature <222> (10)..(1713) <223> mouse TBRII isoform b <400> 29 gaattcacca tgggtcgggg gctgctccgg ggcctgtggc cgctgcatat cgtcctgtgg 60 acgcgcatcg ccagcacgat cccgccgcac gttcccaagt cggttaacag tgatgtcatg 120 gccagcgaca atggcggtgc ggtcaagctt ccacagctgt gcaagttttg cgatgtgaga 180 ctgtccactt gcgacaacca gaagtcctgc atgagcaact gcagcatcac ggccatctgt 240 gagaagccgc atgaagtctg cgtggccgtg tggaggaaga acgacaagaa cattactctg 300 gagacggttt gccacgaccc caagctcacc taccacggct tcactctgga agatgccgct 360 tctcccaagt gtgtcatgaa ggaaaagaaa agggcgggcg agactttctt catgtgtgcc 420 tgtaacatgg aagagtgcaa cgattacatc atcttttcgg aagaatacac caccagcagt 480 cccgacctgt tgttggtcat tatccaagtg acgggtgtca gcctcctgcc tccgctgggg 540 attgccatag ctgtcatcat catcttctac tgctaccgtg tccaccggca gcagaagctg 600 agcccgtcct gggagagcag caagccccgg aaactgatgg atttcagtga caattgtgcc 660 atcatcctgg aggacgaccg ctccgacatc agctccacgt gcgccaacaa catcaaccac 720 aacacggagc tgctgcccat cgagctggac acgctggtgg ggaagggccg cttcgccgag 780 gtctacaagg ccaagctgaa gcagaacacc tcagagcagt ttgagaccgt ggctgtcaag 840 atcttcccct acgaggagta ctcctcgtgg aaaacagaga aggacatctt ctccgatatc 900 aacctgaagc atgagaacat cctgcagttc ctgacggccg aggagcggaa gacagagctg 960 ggcaagcagt actggctgat cacggcgttc cacgcgaagg gcaacctgca ggagtacctc 1020 acgaggcatg tcatcagctg ggaggacctg aggaagctgg gcagctccct ggcccggggc 1080 atcgctcatc tccacagtga ccacactcct tgtgggaggc ccaagatgcc cattgttcac 1140 agggacctca agagctctaa catcctagtg aagaacgact tgacctgttg cctgtgtgac 1200 ttcgggctgt ccttgcgcct ggaccctact ctgtctgtgg atgacctggc caacagcggg 1260 caggtgggaa cggcaagata catggccccg gaagttctag aatccaggat gaatctggaa 1320 aacgtggagt cgttcaagca gacggatgtc tactccatgg ctctggtact ctgggaaatg 1380 acgtcccgct gcaatgctgt gggagaagtg aaggattacg agcccccatt tggttccaag 1440 gtgcgggagc acccctgtgt ggagagcatg aaagacagtg tgctgagaga ccgagggcgg 1500 ccggaaattc ccagcttctg gctcaaccac cagggcatcc agatcgtgtg tgagactttg 1560 accgagtgct gggaccatga ccccgaagcc cgtctcacag cacagtgtgt ggcagagcgc 1620 ttcagtgagc tggagcatcc ggagagactc tctgggagga gctgctccca ggagaagatt 1680 ccagaagatg gctcgctgaa cactaccaaa tagggtcgac atggactaca aggacgacga 1740 cgacaag 1747 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAGA box containing oligonucleotide sequence <400> 30 tcgagagcca gacaaaaagc cagacattta gccagacac 39

Claims

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글루코사민 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로서 포함하는 섬유증을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 섬유증은 신장섬유증인 것인 약학적 조성물.
청구항 4에 있어서, 그의 약학적으로 허용가능한 염은 글루코사민 히드로클로리드(GS-HCl), 글루코사민 술페이트 또는 그의 조합인 것인 약학적 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 섬유증은 TGF-β1-유도된 것인 약학적 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 섬유증은 Smad3의 인산화에 의하여 유도된 것인 약학적 조성물.
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글루코사민 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로서 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 세포 중의 타입 II TGF-β 수용체의 N-연결 글리코실화를 저해하는 방법으로, 상기 개체는 인간을 제외하는 것인 방법.
청구항 4 내지 7 중 어느 하나의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법으로, 상기 개체는 인간을 제외하는 것인 방법.