KR101502798B1 - 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료 조성물 및 그 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 특히 간 성상세포 생장 억제 효능. 간 성상세포 관련 인자 mRNA 발현량 감소 효능, 간 성상세포 관련 인자 단백질 발현량 감소 효능이 우수한 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은, (A) 붉나무로부터 붉나무 조각을 채취하여 건조하고 분쇄하는 단계; (B) 분쇄한 붉나무 조각을 메탄올을 포함하는 극성용매와 혼합하는 단계; 및 (C) 분쇄한 붉나무 조각과 극성용매와의 혼합물로부터 붉나무 메탄올 추출물을 추출한 후 여과하고 진공 농축 및 동결 건조하는 단계;를 포함한다.
본 발명은, (A) 붉나무로부터 붉나무 조각을 채취하여 건조하고 분쇄하는 단계; (B) 분쇄한 붉나무 조각을 메탄올을 포함하는 극성용매와 혼합하는 단계; 및 (C) 분쇄한 붉나무 조각과 극성용매와의 혼합물로부터 붉나무 메탄올 추출물을 추출한 후 여과하고 진공 농축 및 동결 건조하는 단계;를 포함한다.
Description
본 발명은 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 특히 간 성상세포 생장 억제 효능. 간 성상세포 관련 인자 mRNA 발현량 감소 효능, 간 성상세포 관련 인자 단백질 발현량 감소 효능이 우수한 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
간 섬유화는 세포 외 기질(Extracellular Matrix)의 과다한 침착으로 정의될 수 있다. 간 성상세포는 세포 외 기질을 생산하는 주요 생산 원천으로 활성화되면 근섬유모세포 유사 형태로 변화하며, 세포 증식의 증가, 교원질(Collagen Type I and III)을 포함한 각종 세포 외 기질의 생성 증가, α-SMA의 발현 증가, 세포 수축성의 증가 등을 야기한다.
이처럼 인체에 유해한 영향을 미치는 간 성상세포의 활성을 억제할 수 있다면 간 섬유화를 예방하거나 치료함으로써 유의미한 의학적 용도로 사용될 수 있게 된다.
종래 간 섬유화를 예방하거나 치료하기 위한 상당수 연구들이 있어 왔는데, 예를 들어 한국등록특허 제10-0448552호 '산삼 배양근 추출물을 함유하는 간 섬유화 치료용 조성물'은, 자연산 산삼의 뿌리를 이용하여 수득한 산삼 배양근의 추출물이 간 섬유화 치료 효과를 가짐을 확인하고 이를 간 섬유화 치료용 조성물로서 이용하는 기술에 관한 것이다.
그러나 종래 붉나무 추출물의 간 섬유화 예방 또는 치료 효능에 주목하여 이를 약제학적 조성물 등에 접목하는 시도는 연구된바 없었다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료 조성물 및 그 제조 방법과, 붉나무 메탄올 추출물 또는 간 섬유화 치료 조성물을 포함하는 제형화된 조성물, 생약제제, 건강보조식품 등을 제공하는 것이다.
본 발명은 붉나무 메탄올 용매 추출물을 함유하는 간 섬유화 치료 조성물을 제공하며, 특히 상기 메탄올 용매는 메탄올 100 중량부에 대해 물 1 내지 20 중량부 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜을 1 내지 20 중량부 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 간 섬유화 치료 조성물에 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제, 시럽제 또는 식용음료의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 가하여 제형화된 조성물, 간 섬유화 치료 조성물을 포함하는 생약제제 또는 건강보조식품을 제공한다.
또한 본 발명은 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료 조성물 제조 방법을 제공하며, (A) 붉나무로부터 붉나무 조각을 채취하여 건조하고 분쇄하는 단계; (B) 분쇄한 붉나무 조각을 메탄올을 포함하는 극성용매와 혼합하는 단계; 및 (C) 분쇄한 붉나무 조각과 극성용매와의 혼합물로부터 붉나무 메탄올 추출물을 추출한 후 여과하고 진공 농축 및 동결 건조하는 단계;를 포함한다.
이때, 상기 (A) 단계는, (A1) 붉나무 조각을 채취하여 채취한 붉나무 조각을 15 ℃ 내지 20 ℃의 온도 조건을 유지하면서 3일 내지 5일간 건조하는 단계; 및 (A2) 건조한 붉나무 조각을 입도가 0.1 mm 내지 5 mm를 갖도록 분쇄하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 이때, 상기 (B) 단계의 극성용매는 메탄올 100 중량부에 대해 물 1 내지 20 중량부 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜을 1 내지 20 중량부 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 한다.
또한 이때, 상기 (C) 단계는, (C1) 추출 온도를 40 ℃ 내지 60 ℃로 유지하면서 1일 내지 5일 동안 붉나무 메탄올 추출물을 추출하는 단계; (C2) 추출한 붉나무 메탄올 추출물을 40 ℃ 내지 60 ℃에서 진공 농축하고 -60 ℃ 내지 -80 ℃에서 동결 건조하는 단계; 및 (C3) 동결 건조한 붉나무 메탄올 추출물을 용기에 주입한 후 -1 ℃ 내지 -10 ℃에서 저온 보관하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
그리고 이때, 상기 (C) 단계 이후에, (D) 진공 농축 및 동결 건조한 붉나무 메탄올 추출물에 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제, 시럽제 또는 식용음료의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 가하여 제형화하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료 조성물 및 그 제조 방법과, 붉나무 메탄올 추출물 또는 간 섬유화 치료 조성물을 포함하는 제형화된 조성물, 생약제제, 건강보조식품 등을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 MTT assay를 이용한 세포 독성 확인 결과.
도 2는 간 성상세포 분리 및 배양 결과.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 붉나무 메탄올 추출물의 간 성상세포 생장 억제 결과.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 붉나무 메탄올 추출물의 간 성상세포 관련 인자 mRNA 발현량 확인 결과.
도 5는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 붉나무 메탄올 추출물의 간 성상세포 관련 인자 단백질 발현량 확인 결과.
도 2는 간 성상세포 분리 및 배양 결과.
도 3은 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 붉나무 메탄올 추출물의 간 성상세포 생장 억제 결과.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 붉나무 메탄올 추출물의 간 성상세포 관련 인자 mRNA 발현량 확인 결과.
도 5는 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 붉나무 메탄올 추출물의 간 성상세포 관련 인자 단백질 발현량 확인 결과.
본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 할 것이다.
또한, 본 발명에 관련된 공지 기능 및 그 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는, 그 구체적인 설명을 생략하였음에 유의해야 할 것이다.
붉나무(Rhus chinensis)는 한국, 일본, 중국, 인도 등에 분포하는 옻나무과의 관목으로서 다른 옻나무와는 달리 독성이 없으며 굵은 가지가 드물게 자라고 작은 가지에는 갈색 털들이 분포한다.
본 발명자들은 메탄올 추출용매를 이용하여 붉나무로부터 추출한 추출물이 인체를 포함하는 생체 내에서 우수한 간 섬유화 예방 또는 치료 효능을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였으며, 구체적으로 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 붉나무 메탄올 추출물의 간 성상세포 생장 억제 효능. 간 성상세포 관련 인자 mRNA 발현량 감소 효능, 간 성상세포 관련 인자 단백질 발현량 감소 효능 확인 등의 실험을 거친 끝에 우수한 간 섬유화 예방 또는 치료 효능을 확인하였다.
이에 본 발명은, 우수한 간 섬유화 예방 또는 치료 효능을 나타내는 붉나무 메탄올 추출물을 함유하는 간 섬유화 예방 또는 치료 조성물과, 그 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 붉나무 메탄올 추출물에 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제, 시럽제 또는 식용음료의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 가하여 제형화된 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 생약제제, 건강보조식품 또는 음료를 제공한다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 붉나무 메탄올 추출물 추출 방법에 관해 상세히 설명한다.
먼저 붉나무로부터 붉나무 조각을 채취하여 건조하였다.
구체적으로, 붉나무의 줄기, 뿌리, 잎, 꽃, 열매 등 부위에서 무작위적으로 붉나무 조각을 채취하되 10 그루 이상의 붉나무로부터 붉나무 조각을 채취하였으며 반복 실험을 위해 충분한 붉나무 조각을 확보하였다.
그 다음, 채취한 붉나무 조각을 15 ℃ 내지 20 ℃의 온도 조건을 유지하면서 3일 내지 5일간 건조하였다.
다음으로, 건조한 붉나무 조각을 분쇄하였다.
건조한 붉나무 조각은 고른 입자를 가지도록 분쇄되었으며 입도가 0.1 mm 내지 5 mm 사이에 분포되도록 하였다.
다음으로, 분쇄된 붉나무를 메탄올을 포함하는 극성용매와 혼합하였다.
이때 혼합하는 극성용매는 100% 메탄올이거나, 메탄올 100 중량부에 대해 물 1 내지 20 중량부 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜을 1 내지 20 중량부 혼합한 혼합용매를 사용하였다.
또한 혼합하는 극성용매의 중량은 분쇄된 붉나무 중량의 3배 내지 5배인 것이 바람직한데, 구체적으로는 분쇄한 붉나무 100g에 대하여 메탄올 99.9%, 물 0.1%로 이루어진 혼합 극성용매를 400g 혼합하였다.
다음으로, 붉나무 혼합물로부터 붉나무 메탄올 추출물을 추출한 후 여과하고 진공 농축 및 동결 건조함으로써 본 발명에 따른 붉나무 메탄올 추출물을 수득한다.
이때, 추출 방법으로는 냉침 추출법, 온침 추출법 또는 열 추출법 등을 사용할 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파추출기 또는 분획기를 이용할 수 있고, 추출 온도를 40 ℃ 내지 60 ℃로 유지하면서 1일 내지 5일 동안 초음파추출기를 이용하여 추출하였다.
구체적으로, 추출 온도를 45 ℃로 유지하며 3일간 추출하였는데, 특히 15분간 초음파 처리(Sonication) 후 2시간 정치시키는 과정을 1일에 10회 반복하면서 초음파추출기(Sonicator)를 이용하여 추출하였다.
또한 여과 과정은 여과 필터로서 무형광 솜을 사용하여 수행하였으며 여과 처리 후 시간이 경과할수록 침전물이 발생하므로 바로 진공 농축을 수행하는 것이 바람직하다.
또한 진공 농축은 40 ℃ 내지 60 ℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 동결 건조를 통해 분말 형태의 붉나무 메탄올 추출물을 수득하였고, 평균 수득률은 10% 이상으로 평가되었다.
구체적으로는 진공 농축은 45 ℃에서 수행하였고, 감압 농축기(Rotary Evaporator, N-1000 SWD, EYELA)를 사용하였다.
동결 건조에는 Biotron Corporation의 Modul Spin 40을 사용하였으며 20시간 내지 30시간, 특히 24시간 동안 -60 ℃ 내지 -80 ℃의 온도를 가하였다.
그리고 실험 시료 등으로서의 사용을 위해 수득한 붉나무 메탄올 추출물을 튜브에 넣고 -1 ℃ 내지 -10 ℃의 온도에서 저온 보관하였으며, 용량이 20 mg ± 0.5 mg인 튜브를 15개 이상 확보하여 그 중에서 실험 대상 시료를 무작위로 추출하면서 실험을 수행하였고, 평균값을 실험 결과로서 채택하였다.
실험에 있어서는 간 성상세포를 실험 대상으로 활용하였으며, 간 성상세포는 간에서 분리된 뒤 배양 접시에서 별다른 처치 없이 자연적으로 활성화되는 특징을 가지므로 체외 실험에서 각종 약제의 항 섬유 효과와 섬유화 기전의 연구에 사용될 수 있다.
실험 예
본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 붉나무 메탄올 추출물의 간 섬유화 예방 또는 치료 효과를 확인하기 위한 실험은, MTT assay를 이용한 세포 독성 확인, 간 성상세포 분리 및 배양, 붉나무 메탄올 추출물의 간 성상세포 생장 억제 확인, RT-PCR을 이용한 간 성상세포 관련 인자 mRNA 발현량 확인, Western blot를 이용한 간 성상세포 관련 인자 단백질 발현량 확인 등으로 이루어졌다.
먼저, MTT Assay를 이용하여 본 발명에 따른 붉나무 메탄올 추출물의 정상 간세포에서의 세포 독성을 확인하였다.
이러한 세포 독성 확인 결과는 도 1에서 확인할 수 있으며, 이러한 결과는 붉나무 메탄올 추출물을 24 시간 동안 처리한 결과이다.
다음으로, 간 성상세포를 분리한 다음 8일이 경과 후 활성화된 사실을 확인하였는데, 이러한 결과는 도 2에서 확인할 수 있다.
도 2에서의 A 내지 E는 각각 간 성상세포를 분리한 이후 1일, 2일, 4일, 6일, 8일 경과 후의 사진이며, 8일이 소요된 때 간 성상세포가 활성화되었음을 확인할 수 있다.
그리고 붉나무 메탄올 추출물이 간 성상세포의 생장을 억제함을 확인하였는데, 도 3을 참조하면, 활성화된 간 성상세포에 붉나무 메탄올 추출물을 처리하면 활성화된 간 성상세포의 수가 감소함을 확인할 수 있다.
도 3에서, 간 성상세포는 500 μg/ml의 붉나무 메탄올 추출물에 24시간 동안 노출되었으며, 100배의 배율에 의한 현미경 사진으로 확인한 결과 활성화된 간 성상세포의 수가 감소하였다.
다음으로, 간 성상세포 관련 인자인 mRNA 발현량을 확인하였는데, 도 4에 도시한 바와 같이, PDGF를 제외한 COL1A2, TGF-β 및 α-SMA mRNA의 감소를 확인할 수 있었다.
도 4에서, 활성화된 간 성상세포에 대해 24 시간 동안 붉나무 메탄올 추출물이 처리되었으며 발현량은 RT-PCR에 의해 측정되었다.
또한 간 성상세포 관련 인자의 단백질 발현량을 확인하였으며, 도 5에 도시한 바와 같이, 간 성상세포 관련 인자 COL1A2 및 Smad의 단백질 발현량이 붉나무 메탄올 추출물 처리 시 감소함을 확인할 수 있었다.
도 5에서, 24 시간 동안 붉나무 메탄올 추출물이 처리되었으며 COL1A2 및 Smad의 단백질 발현량은 western blot assay에 의하여 측정되었다.
이상으로 본 발명의 기술적 사상을 예시하기 위한 바람직한 실시 예와 관련하여 설명하고 도시하였지만, 본 발명은 이와 같이 도시되고 설명된 그대로의 구성 및 작용에만 국한되는 것이 아니며, 기술적 사상의 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대해 다수의 변경 및 수정 가능함을 당업자들은 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 그러한 모든 적절한 변경 및 수정과 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주하여야 할 것이다.
Claims (10)
- 붉나무 메탄올 용매 추출물을 함유하는 간 섬유화 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 메탄올 용매는 메탄올 100 중량부에 대해 물 1 내지 20 중량부 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜을 1 내지 20 중량부 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 하는 간 섬유화 치료용 약학 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 간 섬유화 치료용 약학 조성물에 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제 또는 시럽제 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 가하여 제형화된 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 간 섬유화 치료용 약학 조성물을 포함하는 생약제제.
- 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료용 약학 조성물 제조 방법에 있어서,
(A) 붉나무로부터 붉나무 조각을 채취하여 건조하고 분쇄하는 단계;
(B) 분쇄한 붉나무 조각을 메탄올을 포함하는 극성용매와 혼합하는 단계; 및
(C) 분쇄한 붉나무 조각과 극성용매와의 혼합물로부터 붉나무 메탄올 추출물을 추출한 후 여과하고 진공 농축 및 동결 건조하는 단계;를 포함하는 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료용 약학 조성물 제조 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 (A) 단계는,
(A1) 붉나무 조각을 채취하여 채취한 붉나무 조각을 15 ℃ 내지 20 ℃의 온도 조건을 유지하면서 3일 내지 5일간 건조하는 단계; 및
(A2) 건조한 붉나무 조각을 입도가 0.1 mm 내지 5 mm를 갖도록 분쇄하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료용 약학 조성물 제조 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 (B) 단계의 극성용매는 메탄올 100 중량부에 대해 물 1 내지 20 중량부 또는 탄소수 1 내지 4의 알콜을 1 내지 20 중량부 혼합한 혼합용매인 것을 특징으로 하는 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료용 약학 조성물 제조 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 (C) 단계는,
(C1) 추출 온도를 40 ℃ 내지 60 ℃로 유지하면서 1일 내지 5일 동안 붉나무 메탄올 추출물을 추출하는 단계;
(C2) 추출한 붉나무 메탄올 추출물을 40 ℃ 내지 60 ℃에서 진공 농축하고 -60 ℃ 내지 -80 ℃에서 동결 건조하는 단계; 및
(C3) 동결 건조한 붉나무 메탄올 추출물을 용기에 주입한 후 -1 ℃ 내지 -10 ℃에서 저온 보관하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료용 약학 조성물 제조 방법.
- 제5항에 있어서,
상기 (C) 단계 이후에,
(D) 진공 농축 및 동결 건조한 붉나무 메탄올 추출물에 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제 또는 시럽제의 형태로서 제제학적으로 허용되는 부형제를 가하여 제형화하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 붉나무 메탄올 추출물을 포함하는 간 섬유화 치료용 약학 조성물 제조 방법.
- 붉나무 메탄올 용매 추출물을 함유하는 간 섬유화 개선용 건강기능식품 조성물.
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