KR101495407B1 - 인간화 항-ｃｄｃｐ１ 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 CDCP1에 대한 인간화 항체(항-CDCP1 항체), 그의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

인간화 항-ＣＤＣＰ１ 항체{Humanized anti-CDCP1 antibodies}
본 발명은 인간 CDCP1에 대한 인간화 항체(항-CDCP1 항체), 그의 제조 방법, 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물, 및 그의 용도에 관한 것이다.
인간 CDCP1((CUB 도메인 함유 단백질 1, B345, CD318, SIMA135, TRASK; 서열번호 29 및 돌연변이 R525Q(즉, 서열번호 29의 아미노산 위치 525에서 아르기닌(R)을 글루타민(Q)으로 치환) 및/또는 돌연변이 G709D(즉, 서열번호 29의 아미노산 위치 709에서 글리신(G)을 아스파르트산(D)으로 치환)를 갖는 변이체들)은 3개의 세포외 CUB 도메인을 함유하는 막관통 단백질이다. 이 단백질은 유방암, 대장암 및 폐암에서 과발현되는 것으로 밝혀져 있다. 그의 발현 수준은 암종 세포의 전이 능력과 상관관계가 있다(문헌[Uekita, T. 등, Am. J. Pathol. 172 (2008) 1729-1739]). 이 단백질은 암 세포주에서 타이로신 인산화되는 것으로 밝혀졌다(WO　2002/004508; 문헌[Scherl-Mostageer, M. 등, Oncogene 20 (2001) 4402-8; Hooper, J., D. 등, Oncogene 22 (2003) 1783-94; Perry, S., E. 등, FEBS Lett. 581 (2007) 1137-42; Brown, T., A. 등, J. Biol. Chem. 279 (2004) 14772-14783; Ota, T. 등, Nat. Genet. 36 (2004) 40-45]). 별개의 동종형(isoform)들을 코딩하는, 선택적 스플라이싱된 전사 변이체들이 보고되었다.
WO　2002/004508은 CDCP1을 종양 관련 항원 B345로서 언급한다. WO　2004/074481은 전이성 종양 세포에서 발현되는 당단백 항원 SIMA135로서의 CDCP1에 관한 것이다. WO　2005/042102는 난소암에 관여하는 단백질로서 CDCP1에 관한 것이다. WO 2007/005502는 CDCP1을 표적화하는 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
US　2004/0053343 (및 문헌[Conze, T. 등, Ann. N. Y. Acad. Sci. 996 (2003) 222-6 및 Buehring, H.J. 등, Stem Cells 22 (2004) 334-43])은 특정한 줄기세포군들을 동정하기 위한 CDCP1 항체에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 CUB4 항체(기탁번호 DSM ACC2551)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
a) 인간화되고,
b) 상기 VH 서열 내에서:
위치 57에 트레오닌(T) 대신 라이신(K)을 포함하고, 위치 60에 프롤린(P) 대신 발린(V)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트(Kabat)에 따라 부여된다).
본 발명의 또다른 양태는 CUB4 항체(기탁번호 DSM ACC2551)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
a) 인간화되고,
b) 상기 VL 서열 내에서:
위치 33에 발린(V) 대신 류신(L)을 포함하고, 위치 47에 트립토판(W)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여된다).
본 발명의 또다른 양태는 CUB4 항체(기탁번호 DSM ACC2551)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
a) 인간화되고,
b) 상기 VH 서열 내에서:
위치 57에 트레오닌(T) 대신 라이신(K)을 포함하고, 위치 60에 프롤린(P) 대신 발린(V)을 포함하며;
상기 VL 서열 내에서:
위치 33에 발린(V) 대신 류신(L)을 포함하고, 위치 47에 트립토판(W)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여된다).
바람직하게는, 본 발명의 따른 인간화 항체는 중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체는 경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 18인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 23 또는 서열번호 24인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 18인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인간화 항체는 상기 항체가 인간 IgG1 서브클래스(subclass) 항체인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명의 인간화 항체는 상기 항체가 Asn297에서 당 사슬로 글리코실화되어, 상기 당 사슬 내의 푸코오스 양이 65% 이하인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 추가적인 구현예는 본 발명에 따른 인간화 항체를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 추가적인 구현예는 암 치료를 위한, 본 발명에 따른 인간화 항체를 포함하는 상기 약학적 조성물이다.
또한, 본 발명은 암 치료를 위한, 본 발명에 따른 인간화 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 암 치료를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명에 따른 인간화 항체의 용도를 포함한다.
본 발명은 본 발명에 따른 인간화 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 또한, 본 발명은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현시킬 수 있는, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명에 따른 항체의 재조합 생산을 위한, 그와 같은 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 따른 핵산을 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내에서 발현시키는 단계 및 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 인간화 항체의 제조 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 그와 같은 재조합 방법에 의해 수득된 항체를 포함한다.
또한, 본 발명은 암과 같은 질환을 갖는 것으로 진단받은 (따라서 암 치료와 같은 치료를 필요로 하는) 환자에게 본 발명에 따른 항체의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓는 환자의 치료 방법을 제공한다. 상기 항체는 바람직하게는 약학적 조성물로서 투여된다.
이제 놀랍게도, 본 발명에 따른 CDCP1 항체 CUB4의 특이적 인간화 버젼이, 종래 기술에 공지된 인간화로부터 유래한 다른 인간화 버젼들과 비교하여 개선된 CDCP1-결합 특성을 보인다는 것이 밝혀졌다. 이는 CDRH2 및/또는 CDRL1, 및 경쇄 골격 내의 특이적 아미노산 변화에 기인한다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 CDCP1 항체 CUB4의 특이적 인간화 버젼은, 키메라 및 마우스 CUB4 항체와 비교하여 개선된 생체 내 종양 성장 억제를 보인다.
도 1 마우스(mVH-CUB4) 항체의 VH 도메인 아미노산 서열(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3이 굵은 문자로 표기됨) 및 상이한 인간화 CUB4 항-CDCP1 항체의 VH 도메인 아미노산 서열(본 발명에 따른 특이적 개질 부분이 굵은 문자로 표기됨).
도 2 마우스(mVL-CUB4) 항체의 VL 도메인 아미노산 서열(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3이 굵은 문자로 표기됨) 및 상이한 인간화 CUB4 항-CDCP1 항체의 VL 도메인 아미노산 서열(본 발명에 따른 특이적 개질 부분이 굵은 문자로 표기됨).
도 3 상이한 인간화 항-CDCP1 항체 CUB4의 상대 결합 비율. 키메라 CUB4(chHC4 = 인간 IgG1 불변 영역을 갖는 마우스 VH 및 VL) 항체에 대한 상이한 인간화 VH 및 VL 도메인 조합의 결합 비율이 표시됨.
도 4 키메라 글리코엔지니어링된(GE) CUB4 및 야생형(wt = 비글리코엔지니어링된) 키메라 CUB4 항체 및 인간 IgG 음성 대조군의 ADCC와 비교한, 65% 이하의 푸코오스 양을 갖는 글리코엔지니어링된(GE) 인간화 CUB4 항체 제69 GE호의 시험관 내 ADCC.
도 5a 및 5b 인간화 CUB4 항체 제69호 및 제135호, 키메라 CUB4 항체 및 마우스 CUB4 항체의, 인간 폐암 H322M 이종이식편(xenograft)에서의 생체 내 종양 성장 억제.
CUB4 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 서열번호 2의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, DE10242146(EP　1 396 501, US　7,541,030)에서 유래한 기탁번호 DSM ACC2551(DSMZ)를 갖는, 기탁된 항체를 지칭한다. 상기 CUB4 항체는 인간 CDCP1에 특이적으로 결합한다(제DSM ACC2551 (DSMZ)호 기탁은 에버하르트-칼스-대학 튀빙겐, 유니브크리시탓츠클리니쿰 튀빙겐, 가이스웨그 37276 튀빙겐(Eberhard-Karls-University Tubingen, Univcrsitasklinikum Tubingen, Geissweg 372076 Tubingen.)에 의해 이루어졌다).
본 명세서에서 사용되는 용어 "인간화된(being humanized)"은, 서열번호 1의 VH 및 서열번호 2의 VL을 갖는 마우스 CUB4 항체에 기반하며, (인간 불변 영역과의 교잡(chimerization) 후) 상기 VH 및 VL이 뮤린 CDR을 인간 항체의 외곽 영역(framework region) 내로 그래프팅함으로써 인간화된 것인 항체를 지칭한다(예를 들면, 문헌[Riechmann, L. 등, Nature 332 (1988) 323-327; 및 Neuberger, M., S., 등, Nature 314 (1985) 268-270; Queen, C. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; 미국 등록특허 제5,530,101호; 미국 등록특허 제5,585,089호; 미국 등록특허 제5,693,761호; WO 90/07861; 및 미국 등록특허 제5,225,539호를 참조한다). 중쇄 및 경쇄 가변 외곽 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유래될 수 있다. 인간 항체 서열은 자연적으로 존재하는 인간 항체의 서열일 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 가변 외곽 영역은 예를 들면, Lefranc, M.P., Current Protocols in Immunology (2000) - 부록 1P A.1P.1 내지 A.1P.37에 기재되어 있고, IMGT, 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템®(국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템®)(http://imgt.cines.fr) 또는 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk를 통해 접근가능하다.
본 발명에 따른 인간화 항체는 추가적으로,
a) VH의 CDRH2 내의 특이적 돌연변이(돌연변이 T57K 및 P60V), 및/또는
b) VL의 CDRL1 내(돌연변이 V33L) 및 VL의 외곽 영역 내(위치 47에서 인간 VL 외곽 아미노산에서 마우스 아미노산 W로의 역돌연변이)의 특이적 돌연변이를 갖는다.
그와 같은 인간화 CUB4 항체 내의 돌연변이는 놀랍게도 (그와 같은 개질을 갖지 않는 인간화 CUB4 항체와 비교하여) 개선된 결합 특성을 야기한다. 또한, 그와 같은 CDR 및/또는 외곽 내 개질은 (키메라 및 마우스 모(parent) 항체와 비교하여) 개선된 생체 내 종양 성장 억제를 갖는 본 발명에 따른 인간화 항체를 생성시킨다.
본 발명의 일 양태는 CUB4 항체(기탁번호 제 DSM ACC2551 호)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
인간화되고,
상기 VH 서열 내에서:
위치 57에 트레오닌(T) 대신 라이신(K) (CDRH2 내), 및 위치 60에 프롤린(P) 대신 발린(V) (CDRH2 내)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여됨). 이는 서열번호 1이 VH의 CDRH2 내에 돌연변이 T75K 및 P60V를 포함한다는 것을 의미한다.
본 발명의 또다른 양태는 CUB4 항체(기탁번호 제 DSM ACC2551 호)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
인간화되고,
상기 VL 서열 내에서:
위치 33에 발린(V) 대신 류신(L) (CDRL1 내), 및 위치 47에 (인간 VL 외곽 영역에서 유래한 아미노산 대신) 트립토판(W)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여됨). 이는 서열번호 2가 VH의 CDRL1 내에 돌연변이 V33L을 포함하고, 외곽 영역 VL 내 위치 47에서 인간 아미노산에서 마우스 아미노산 W로의 역돌연변이를 포함한다는 것을 의미한다.
본 발명의 또다른 양태는 CUB4 항체(기탁번호 제DSM ACC2551)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
인간화되고,
상기 VH 서열 내에서:
위치 57에 트레오닌(T) 대신 라이신(K) (CDRH2 내), 및 위치 60에 프롤린(P) 대신 발린(V) (CDRH2 내)을 포함하고;
상기 VL 서열 내에서:
위치 33에 발린(V) 대신 류신(L) (CDRL1 내), 및 위치 47에 트립토판(W)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여된다). 이는 서열번호 1이 VH의 CDRH2 내에 돌연변이 T57K 및 P60V를 포함하고, 서열번호 2가 VL의 CDRL1 내 돌연변이 V33L, 및 VL의 외곽 영역 내의 위치 47에서 인간 아미노산에서 마우스 아미노산 W으로의 역돌연변이를 포함한다는 것을 의미한다.
본 발명의 또다른 양태는 CUB4 항체(기탁번호 제DSM ACC2551)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
인간화되고,
상기 VL 서열 내에서:
위치 33에 발린(V) 대신 류신(L) (CDRL1 내), 및 위치 47에 (인간 VL 외곽 영역에서 유래한 아미노산 대신) 트립토판(W)을 포함하는 것을 특징으로 하고;
상기 VL 서열 내에서:
위치 21에 (인간 VL 외곽 영역으로부터 유래한 아미노산 대신) 메티오닌(M)을 더 포함하는 것을 추가적인 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여됨).
본 발명의 또다른 양태는 CUB4 항체(기탁번호 DSM ACC2551)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
인간화되고,
상기 VH 서열 내에서:
위치 57에 트레오닌(T) 대신 라이신(K) (CDRH2 내) 및 위치 60에 프롤린(P) 대신 발린(V) (CDRH2 내)을 포함하고;
상기 VL 서열 내에서:
위치 33에 발린(V) 대신 류신(L) (CDRL1 내), 및 위치 47에 (인간 VL 외곽 영역에서 유래한 아미노산 대신) 트립토판(W)을 포함하는 것을 특징으로 하고;
상기 VL 서열 내에서:
위치 21에 (인간 VL 외곽 영역으로부터 유래한 아미노산 대신) 메티오닌(M)을 (더) 포함하는 것을 추가적인 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여됨).
본 발명의 또다른 양태는 CUB4 항체(기탁번호 DSM ACC2551)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
인간화되고,
상기 VL 서열 내에서:
위치 33에 발린(V) 대신 류신(L) (CDRL1 내), 및 위치 47에 (인간 VL 외곽 영역에서 유래한 아미노산 대신) 트립토판(W)을 포함하는 것을 특징으로 하고;
상기 VL 서열 내에서:
위치 21에 (인간 VL 외곽 영역으로부터 유래한 아미노산 대신) 메티오닌(M); 위치 24에 세린(S) 대신 글리신(G) 또는 아르기닌(R) (CDRL1 내), 및 위치 25에 발린(V) 대신 알라닌(A) (CDRL1)을 (더) 포함하는 것을 추가적인 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여된다).
본 발명의 또다른 양태는 CUB4 항체(기탁번호 DSM ACC2551)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
인간화되고,
상기 VH 서열 내에서:
위치 57에 트레오닌(T) 대신 라이신(K) (CDRH2 내) 및 위치 60에 프롤린(P) 대신 발린(V) (CDRH2 내)을 포함하고;
상기 VL 서열 내에서:
위치 33에 발린(V) 대신 류신(L) (CDRL1 내), 및 위치 47에 (인간 VL 외곽 영역에서 유래한 아미노산 대신) 트립토판(W)을 포함하는 것을 특징으로 하고;
상기 VL 서열 내에서:
위치 21에 (인간 VL 외곽 영역으로부터 유래한 아미노산 대신) 메티오닌(M); 위치 24에 세린(S) 대신 글리신(G) 또는 아르기닌(R) (CDRL1 내), 및 위치 25에 발린(V) 대신 알라닌(A) (CDRL1)을 (더) 포함하는 것을 추가적인 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여된다).
본 발명의 또다른 양태는 CUB4 항체(기탁번호 DSM ACC2551)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
인간화되고,
상기 VL 서열 내에서:
위치 33에 발린(V) 대신 류신(L) (CDRL1 내), 및 위치 47에 (인간 VL 외곽 영역에서 유래한 아미노산 대신) 트립토판(W)을 포함하는 것을 특징으로 하고;
상기 VL 서열 내에서:
위치 24에 세린(S) 대신 글리신(G) 또는 아르기닌(R) (CDRL1 내), 및 위치 25에 발린(V) 대신 알라닌(A) (CDRL1)을 (더) 포함하는 것을 추가적인 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여된다).
본 발명의 또다른 양태는 CUB4 항체(기탁번호 DSM ACC2551)의, 서열번호 1의 가변 중쇄 도메인(VH) 및 서열번호 2의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체로서,
인간화되고,
상기 VH 서열 내에서:
위치 57에 트레오닌(T) 대신 라이신(K) (CDRH2 내) 및 위치 60에 프롤린(P) 대신 발린(V) (CDRH2 내)을 포함하고;
상기 VL 서열 내에서:
위치 33에 발린(V) 대신 류신(L) (CDRL1 내), 및 위치 47에 (인간 VL 외곽 영역에서 유래한 아미노산 대신) 트립토판(W)을 포함하는 것을 특징으로 하고;
상기 VL 서열 내에서:
위치 24에 세린(S) 대신 글리신(G) 또는 아르기닌(R) (CDRL1 내), 및 위치 25에 발린(V) 대신 알라닌(A) (CDRL1)을 (더) 포함하는 것을 추가적인 특징으로 하는 항체이다(모든 위치 번호는 카바트에 따라 부여된다).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 18인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 23 또는 서열번호 24인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 18인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 14인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 15인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 16인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 17인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 18인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는
중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 23인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는 상기 항체가 인간 IgG1 서브클래스 항체인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는 상기 항체가 Asn297에서 당 사슬에 의해 글리코실화되어, 상기 당 사슬 내의 푸코오스 양이 65% 이하인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 인간화 항체의 바람직한 구현예들은, 표 1에 제시된 바와 같은, 인간화 가변 중쇄 도메인 VH 및 인간화 가변 경쇄 도메인 VL의 하기 조합들 중 하나를 갖는 것을 특징으로 한다(하기 실시예 번호 참조).
인간화 가변 중쇄 도메인 VH 및 인간화 가변 경쇄 도메인 VL 의 바람직한 조합
인간화 CUB4 항체 실시예 번호 VH (서열번호) VL (서열번호)
80 hHC4-H (서열번호 3) hLC-M (서열번호 14)
69 hHC4-H (서열번호 3) hLC-L2 (서열번호 15)
47 hHC4-H (서열번호 3) hLC-K (서열번호 16)
58 hHC4-H (서열번호 3) hLC-L (서열번호 17)
36 hHC4-H (서열번호 3) hLC-J (서열번호 18)
102 hHC4-H (서열번호 3) hLC-b (서열번호 19)
113 hHC4-H (서열번호 3) hLC-c (서열번호 20)
91 hHC4-H (서열번호 3) hLC-a (서열번호 21)
124 hHC4-H (서열번호 3) hLC-d (서열번호 22)
135 hHC4-H (서열번호 3) hLC-e (서열번호 23)
146 hHC4-H (서열번호 3) hLC-f (서열번호 24)
따라서, 본 발명의 일 구현예는 서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 또는 서열번호 24의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 14의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 15의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 16의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 17의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 18의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 19의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 20의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 21의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 22의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 23의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 24의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명에 따른 인간화 항체의 더욱 바람직한 구현예들은 표 2에 제시된 바와 같은, 인간화 가변 중쇄 도메인 VH와 인간화 가변 경쇄 도메인 VL의 하기 조합들 중 하나를 갖는 것을 특징으로 한다. 그와 같은 인간화 항체를 포함하는 조합들은 표 2에 제시된 바와 같은, 하기 실시예 번호들을 참조한다.
인간화 가변 중쇄 도메인 VH 과 인간화 가변 경쇄 도메인 VL 의 보다 바람직 한 조합
인간화 CUB4 항체 실시예 번호 VH (서열번호) VL (서열번호)
80 hHC4-H (서열번호 3) hLC-M (서열번호 14)
69 hHC4-H (서열번호 3) hLC-L2 (서열번호 15)
47 hHC4-H (서열번호 3) hLC-K (서열번호 16)
58 hHC4-H (서열번호 3) hLC-L (서열번호 17)
36 hHC4-H (서열번호 3) hLC-J (서열번호 18)
따라서, 본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 18의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
본 발명의 일 구현예는
서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH), 및
서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 또는 서열번호 18의 가변 경쇄 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체이다.
용어 "카바트 번호화(Kabat numbering)" 또는 "카바트에 따른 번호 부여(numbering according to Kabat)" 또는 "EU 지수(EU index)"는, 달리 명시되지 않은 경우, 문헌[Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]에서와 같은 EU 지수를 사용한, 예를 들면, IgG 항체 내 잔기들에 대한 번호 부여로 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체(monoclonal antibody)" 또는 "단일클론 항체 조성물(monoclonal antibody composition)"은, 단일 아미노산 조성을 갖는 항체 분자들의 제제를 지칭한다.
용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 통상적으로 재조합 DNA 기법에 의해 제조된, 마우스에서 유래한 가변 영역, 즉 결합 영역, 및 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래한 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 단일클론 항체를 지칭한다. 마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 특히 바람직하다. 그와 같은 마우스/인간 키메라 항체는 마우스 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 DNA 절편, 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 절편을 포함하는 발현된 면역글로불리 유전자의 산물이다. 본 발명에 포함되는 "키메라 항체"의 다른 형태는, 본래 항체의 클래스 또는 서브클래스로부터 개질 또는 변형된 클래스 또는 서브클래스인 형태이다. 그와 같은 "키메라" 항체는 "클래스가 전환된 항체(class-switched antibodies)"로도 지칭된다. 키메라 항체를 제조하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려진 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 형질감염 기법을 포함한다(예를 들면, 문헌[Morrison, S., L. 등, Proc. Natl. Acad Sci. 미국 81 (1984) 6851-6855]; 미국 등록특허 제5,202,238호 및 제5,204,244호를 참조한다).
인간 CDCP1((CUB 도메인 함유 단백질 1, B345, CD318, SIMA135, TRASK; 서열번호 29, 및 돌연변이 R525Q(즉, 서열번호 29의 아미노산 위치 525에서 아르기닌(R)을 글루타민(Q)으로 치환) 및/또는 돌연변이 G709D(즉, 서열번호 29의 아미노산 위치 709에서 글리신(G)을 아스파르트산(D)으로 치환)를 갖는 변이체)은 3개의 세포외 CUB 도메인을 포함하는 막관통 단백질이다. 이 단백질은 유방암, 대장암 및 폐암에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다(문헌[Uekita, T. 등, Am. J. Pathol. 172 (2008) 1729-1739]). 그의 발현 수준은 암종 세포의 전이 능력과 상관관계가 있다. 상기 단백질은 암 세포주에서 타이로신 인산화되는 것으로 나타났다(WO　2002/004508; 문헌[Scherl-Mostageer, M. 등, Oncogene 20 (2001) 4402-8; Hooper, J., D. 등, Oncogene 22 (2003) 1783-94; Perry, S.E. 등, FEBS Lett. 581 (2007) 1137-42; Brown, T.A. 등, J. Biol. Chem. 279 (2004) 14772-14783; Ota, T. 등, Nat. Genet. 36 (2004) 40-45]). 별개의 동종형들을 코딩하는, 선택적 스플라이싱된 전사 변이체들이 보고된 바 있다.
본 명세서에서 사용되는, "인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는(specifically binding to human CDCP1)"은 인간 CDCP1 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 결합 친화성은 1.0 x 10-8 mol/l 이하(예를 들면, 1.0 x 10-8 mol/l 내지 1.0 x 10-13 mol/l)의 KD 값, 바람직하게는 5.0 x10-9 mol/l 이하(예를 들면, 5.0 x 10-9 mol/l 내지 1.0 x 10-13 mol/l)의 KD 값이다. 결합 친화성은 표면 플라즈몬 공명 기법(surface plasmon resonance technique)과 같은, 표준 결합 분석을 이용하여 측정된다(Biacore®).
용어 "에피토프(epitope)"는 항체와 특이적으로 결합할 수 있는 인간 CDCP1의 단백질 결정부를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 화학적으로 활성을 띠는 표면 분자군으로 구성되며, 일반적으로 에피토프는 특이적인 삼차원적 구조 특성 및 특이적인 전하 특성을 갖는다. 입체형태(conformational) 및 비입체형태 에피토프는, 변성 용매의 존재 하에서 전자와의 결합은 소실되지만 후자의 경우는 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
본 명세서에서 사용되는 "가변 도메인(variable domain)"(경쇄의 가변 도메인(VL), 중쇄(VH)의 가변 도메인)은 항체를 항원에 결합시키는데 직접적으로 관여하는 경쇄 및 중쇄 도메인 각각의 쌍을 의미한다. 가변 경쇄 및 중쇄 도메인은 동일한 일반 구조를 갖고, 각각의 도메인은 3개의 "초가변 영역(hypervariable region)" (또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결된, 서열이 광범위하게 보존되는 4개의 외곽(FR) 영역을 포함한다. 외곽 영역은 β 시트 입체형태를 취하며, CDR은 상기 β 시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 사슬 내의 CDR은 외곽 영역에 의해 그의 3차 구조로 유지되고, 다른 사슬에서 유래한 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 수행하고, 따라서 본 발명의 추가적인 목적을 제공한다.
"외곽(framework)" 또는 "FR" 영역은 본 명세서에서 정의된 초가변 영역 잔기들을 제외한 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N 말단에서부터 C 말단 방향으로, 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의 및/또는 "초가변 루프(hypervariable loop)"에서 유래한 잔기에 따라 결정된다.
용어 "항체의 항원 결합부(antigen-binding portion of an antibody)"는 본 명세서에서 사용되는 경우, 항원 결합의 원인이 되는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원 결합부는 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"에서 유래한 아미노산 잔기들을 포함한다. 본 발명의 용어 항체의 "항원 결합부"는 항원에 대한 결합 부위의 다양한 친화도에 기여하는 6개의 상보성 결정 영역(CDR)들을 포함한다. 3개의 중쇄 가변 도메인 CDR(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3개의 경쇄 가변 도메인 CDR(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)이 존재한다. 용어 "CDRH1"은 카바트에 의해 계산된 중쇄 가변 영역의 CDR1 영역을 의미한다. CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3는 중쇄(H) 또는 경쇄(L)에서 유래한 각각의 영역들을 의미한다. CDR 및 외곽 영역(FR)의 범위는 수집된 아미노산 서열 데이터베이스와 비교함으로써 결정되며, 여기서 상기 영역들은 전술된 카바트 등에 따라, 서열 중에서의 변산도(variability)에 따라 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산(nucleic acid)" 또는 "핵산 분자(necleic acid molecule)"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중가닥 DNA이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "아미노산(amino acid)"은 알라닌(3글자 코드: ala, 1글자 코드: A), 아르기닌(arg, R), 아스파라긴(asn, N), 아스파르트산(asp, D), 시스테인(cys, C), 글루타민(gln, Q), 글루탐산(glu, E), 글리신(gly, G), 히스티딘(his, H), 이소루신(ile, I), 루신(leu, L), 라이신(lys, K), 메티오닌(met, M), 페닐알라닌(phe, F), 프롤린(pro, P), 세린(ser, S), 트레오닌(thr, T), 트립토판(trp, W), 타이로신(tyr, Y) 및 발린(val, V)을 포함하는, 천연적으로 존재하는 카르복시 α-아미노산의 군을 의미한다.
본 발명에 따른 항체는 불변 영역이 인간 유래의 불변 영역이고, 바람직하게는 인간 IgG1 서브클래스의 불변 영역인 것을 특징으로 한다. 불변 영역은 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 N-말단에서 C-말단 방향으로, 항체 불변 중쇄 도메인 1(CH1), 항체 힌지 영역(HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2(CH2) 및 항체 중쇄 불변 도메인 3(CH3)을 포함하고, 선택적으로는, 서브클래스 IgE 항체의 경우, 항체 중쇄 불변 도메인 4(CH4)를 포함한다. 경쇄 불변 영역은 항체 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함한다. 항체 경쇄 불변 도메인(CL)은 κ(카파) 또는 λ(람다)일 수 있다. 그와 같은 불변 사슬은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 카바트, E.A.에 의해 개시되어 있다(예를 들면, 문헌[Johnson, G. and Wu, T., T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218]을 참조한다). 예를 들면, 유용한 IgG1 서브클래스의 인간 중쇄 불변 영역은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 유용한 인간 경쇄 불변 영역은 서열번호 27의 카파-경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하고; 또다른 유용한 인간 경쇄 불변 영역은 서열번호 28의 람다-경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
항체의 "Fc 부위(Fc part)"는 항원과 항체의 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. "항체의 Fc 부위(Fc part of an antibody)"는 숙련된 기술자에게 잘 알려진 용어로서, 항체의 파파인 절단에 기반하여 정의된다. 그의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되고, 이들 중 여럿은 서브클래스(아형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가적으로 분류될 수 있다. 중쇄 불변 영역에 따라, 면역글로불린의 상이한 클래스는 α, δ, ε, γ 및 μ로 각각 지칭된다.
항체의 Fc 부위는 보체 활성화, C1q 결합 및 Fc 수용체 결합에 기반하는ADCC(항체 의존성 세포 매개 세포독성) 및 CDC(보체 의존성 세포독성)에 직접적으로 관여한다. 보체 활성화(CDC)는 보체 인자 C1q와 대부분의 IgG 항체 서브클래스의 Fc 부위의 결합에 의해 개시된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향은 특정한 조건에 의존적인 반면, C1q와의 결합은 Fc 부위 내의 정해진 결합 부위에 기인한다. 그와 같은 결합 부위는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Boackle, R.J. 등, Nature 282 (1979) 742-743; Lukas, T.J. 등, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. 및 Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R. 등, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E. 등, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E. 등, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. 등, J. Virology 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A. 등, Immunology 86 (1995) 319-324; EP　0307434]에 개시되어 있다. 그와 같은 결합 부위는 예를 들면, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329이다(카바트, E.A.의 EU 지수에 따른 번호 부여, 하기를 참조). 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 일반적으로 보체 활성화 및 C1q 및 C3 결합을 보이는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화시키지 않고, C1q 및 C3와 결합하지 않는다.
본 발명에 따른 항체는 인간에서 유래한 Fc 부위, 및 바람직하게는 인간 불변 영역의 다른 모든 부분들을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "인간에서 유래한 Fc 부위(Fc part derived from human origin)"는 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 인간 항체의 Fc 부위, 바람직하게는 IgG1 서브클래스에서 유래한Fc 부위, 인간 IgG1 서브클래스로부터 유래한 변이된 Fc 부위(바람직하게는 L234A + L235A에서 돌연변이를 갖는 것), 인간 IgG4 서브클래스로부터 유래한 Fc 부위 또는 인간 IgG4 서브클래스로부터 유래한 변이된 Fc 부위(바람직하게는 S228P에서 돌연변이를 갖는 것)인, Fc 부위를 의미한다. 가장 바람직한 것은 서열번호 26 또는 31을 갖는 인간 IgG1 서브클래스, 돌연변이 L234A 및 L235A를 갖는 인간 IgG1 서브클래스, 서열번호 32를 갖는 인간 IgG4 서브클래스, 또는 돌연변이 S228P를 갖는 인간 IgG4 서브클래스의 인간 중쇄 불변 영역이다.
용어 "항체 의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)"은 효과기 세포의 존재 하에서, 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 표적 세포의 용해를 지칭한다. ADCC는 바람직하게는, CDCP1 발현 세포의 제제를 신선하게 단리된 PBMC 또는 연막(buffy coat)으로부터 정제된 효과기 세포, 예컨대 단핵구 또는 자연 살해(NK) 세포 또는 영구적으로 생장하는 NK 세포주와 같은, 효과기 세포의 존재 하에 본 발명에 따른 항체로 처리함으로써 측정한다.
용어 "보체 의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)"은 보체 인자 C1q와 대부분의 IgG 항체 서브클래스의 Fc 부위의 결합에 의해 개시되는 과정을 의미한다. C1q와 항체의 결합은 소위 결합 부위에서의, 정해진 단백질-단백질 상호작용에 기인한다. 그와 같은 Fc 부위 결합 부위는 당해 기술분야에 공지되어 있다(상기를 참조). 그와 같은 Fc 부위 결합 부위는, 예를 들면, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, 및 P329를 갖는 것을 특징으로 한다(카바트의 EU 지수에 따른 번호 부여). 서브클래스 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체들은 일반적으로 C1q 및 C3 결합을 포함하는 보체 활성화를 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화하지 않으며, C1q 및/또는 C3와 결합하지 않는다.
단일클론 항체의 세포 매개 효과기 기능은 문헌[Umana, P. 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 미국 등록특허 제6,602,684호에 기술된 바와 같이, 항체의 올리고당 성분을 엔지니어링함으로써 향상시킬 수 있다. 가장 흔히 사용되는 치료용 항체인, IgG 형 항체는 각각의 CH2 도메인의 Asn297에 보존된 N-결합 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297에 결합된 2개의 복합 바이안테너리(biantennary) 올리고당은 CH2 도메인 사이에 묻혀 있어 폴리펩티드 골격과 광범위한 접촉부를 형성하며, 이들의 존재는 항체가, 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)과 같은 효과기 기능을 매개하도록 하는데 필수적이다(문헌[Lifely, M., R. 등, Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R. 등, Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., 및 Morrison, S., L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32]). 문헌[Umana, P. 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 WO　99/54342는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서, 이분된(bisected) 올리고당의 생성을 촉매화하는 글리코실트랜스퍼라제인, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 Ⅲ("GnTⅢ")의 과발현이 항체의 인 비트로 ADCC 활성을 유의하게 증가시킨다는 것을 보였다. Asn297 탄수화물의 조성 변화 또는 그의 제거 또한 FcγR 및 C1q와의 결합에 영향을 미쳤다(문헌[Umana, P. 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J. 등, Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y. 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S. 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L. 등, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L. 등, J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C. 등, J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147]).
단일클론 항체의 세포 매개 효과기 기능을 향상시키는 방법은 예를 들면, WO 2005/044859, WO　2004/065540, WO 2007/031875, 문헌[Umana, P. 등, Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180], WO　99/154342, WO　2005/018572, WO　2006/116260, WO　2006/114700, WO　2004/065540, WO　2005/011735, WO　2005/027966, WO　1997/028267, US　2006/0134709, US　2005/0054048, US　2005/0152894, WO　2003/035835 및 WO　2000/061739 또는 예를 들면, 문헌[Niwa, R. 등, J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T. 등, J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473]; WO 03/055993 및 US　2005/0249722]에 보고되어 있다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는 Asn297에서 당사슬로 글리코실화되며(상기 항체가 IgG1 또는 IgG3 서브클래스의 Fc 부위를 포함하는 경우), 상기 당 사슬 내의 푸코오스 양은 65% 이하이다(카바트에 의해 번호 부여). 또다른 구현예에서, 상기 당 사슬 내의 푸코오스 양은 5% 내지 65%, 바람직하게는 20% 내지 40%이다. 대안적인 구현예에서, 상기 푸코오스 양은 Asn297에서 Fc 영역의 올리고당 중 0%이다. 본 발명에 따른 "Asn297"은 Fc 영역의 위치 297 부근에 위치한 아미노산 아스파라긴을 의미한다. 항체의 경미한 서열 차이에 기반하여, Asn297은 위치 297의, 수 개의 아미노산(통상적으로 ±3개 아미노산 이하)의 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 글리코실화 항체는 인간 IgG1 서브클래스 또는 IgG3 서브클래스인 IgG 서브클래스 항체이다. 추가적인 구현예에서, 상기 당 사슬 내의 N-글리콜릴뉴라민산(NGNA)의 양은 1% 이하이고/이거나, N-말단 알파-1,3-갈락토오스의 양은 1% 이하이다. 상기 당 사슬은 바람직하게는, CHO 세포에서 재조합에 의해 발현된 항체의 Asn297에 결합된 N-결합된 글리칸의 특성을 보인다.
용어 "당 사슬은 CHO 세포에서 재조합에 의해 발현된 항체의 Asn297에 결합된 N-결합된 글리칸의 특성을 보인다(The sugar chains show characteristics of N-linked glycans attached to Asn297 of an antibody recombinantly expressed in a CHO cell)"는 본 발명에 따른 항체의 Asn297에서의 당 사슬이 푸코오스 잔기를 제외하고는, 예를 들면, WO　2006/103100에 보고된 것와 같은 비-개질된 CHO 세포에서 발현된 동일한 항체의 당 사슬과 동일한 구조 및 당 잔기 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "NGNA"는 당 잔기 N-글리콜릴뉴라민산을 의미한다.
인간 IgG1 또는 IgG3의 글리코실화는 Asn297에서 말단에 최대 2개의 Gal 잔기를 갖는, 코어 푸코실화 바이안테너리 복합체 올리고당 글리코실화로서 발생한다. IgG1 또는 IgG3 서브클래스의 인간 불변 중쇄 영역은 문헌[Kabat, E., A. 등, supra, 및 Brueggemann, M. 등, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W. 등, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527]에 의해 상세하게 보고되어 있다. 이 구조는 말단 Gal 잔기의 양에 따라 G0, G1 (α-1,6- 또는 α-1,3-), 또는 G2 글리칸 잔기로 지칭된다(문헌[Raju, T., S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53]). 항체 Fc 부위의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들면, 문헌[Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207]에 기술되어 있다. 비-글리코개질된 CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현된 항체들은 일반적으로, 85% 이상의 양으로 Asn297에서 푸코실화된다. 항체의 개질된 올리고당은 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이분된, 환원/비푸코실화된 올리고당은 하이브리드이다. 또다른 구현예에서, 상기 이분된, 환원/비푸코실화된 올리고당은 복합체이다.
본 발명에 따르면, "푸코오스의 양(amount of fucose)"은 MALDI-TOF 질량 분광분석에 의해 측정되고, 평균값으로서 계산된, Asn297에 부착된 모든 글리코구조(예컨대, 복합체, 하이브리드 및 고-만노오스 구조)의 합계에 대하여, Asn297에서의 당 사슬 내의 푸코오스의 양을 의미한다(예를 들어, WO　2008/077546 참조). 푸코오스의 상대적인 양은 MALDI-TOF에 의한, N-글리코시다제 F 처리된 샘플에서 동정된 모든 글리코구조(예컨대, 각각 복합체, 하이브리드 및 올리고- 및 고-만노오스 구조)에 대한 푸코오스-함유 구조의 백분율이다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 재조합적 수단에 의해 생산된다. 그와 같은 방법들은 당해 기술분야에 널리 알려져 있으며, 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현, 및 항체 폴리펩티드의 후속적 단리 및 통상적으로 약학적으로 허용가능한 순도로의 정제를 포함한다. 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄 또는 이들의 단편을 코딩하는 핵산을 표준 방법에 따라 발현 벡터 내에 삽입한다. 발현은 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모 또는 대장균 세포와 같은, 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 수행되고, 상기 항체를 세포(용해 후 상청액 또는 세포)로부터 회수한다.
항체의 재조합적 생산은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 문헌[Makrides, S., C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. 등, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880]에 기술되어 있다.
항체는 온전한 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 정제는 다른 세포 성분 또는 기타 오염물, 예를 들면, 다른 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해, 알칼라인/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당해 기술분야에 잘 알려진 기타 기법들을 포함한, 표준 기법에 의해 수행된다(문헌[Ausubel, F. 등 (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 참조).
NSO 세포 내에서의 발현이 예를 들면, 문헌[Barnes, L.M. 등, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; 및 Barnes, L.M. 등, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270]에 기술되어 있다. 일과성 발현(transient expression)은 예를 들면, 문헌[Durocher, Y. 등, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9]에 기술되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 문헌[Orlandi, R. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Norderhaug, L. 등, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87]에 기술되어 있다. 바람직한 일과성 발현 시스템(HEK 293)이 문헌[Schlaeger, E.J., 및 Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83; 및 Schlaeger, E.J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199]에 개시되어 있다.
원핵 세포에 적합한 대조 서열은 예를 들면, 프로모터, 선택적으로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 시그널을 사용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적인 관계가 있는 경우에 "작동가능하게 결합된(operably linked)"다. 예를 들어, 전구-서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(secretory leader)를 위한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전구-단백질(pre-protein)로서 발현되는 경우에 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동가능하게 결합되거나; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 주는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 결합되거나; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 용이하게 하도록 위치되는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 결합된다. 일반적으로, "작동가능하게 결합된"은 결합된 DNA 서열이 인접하며, 분비 리더의 경우, 인접하고 판독 프레임 내에 존재한다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 결합은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 결합기가 통상적인 실시에 따라 사용된다.
단일클론 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예컨대 단백질 A-세파로스 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 매질로부터 적절히 분리된다. 단일클론 항체를 코딩하는 DNA 및 RNA는 통상적인 과정에 의해 용이하게 단리되고, 서열분석(sequencing)될 수 있다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA 및 RNA의 공급원으로서 사용될 수 있다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터에 삽입시킬 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 HEK 293 세포, CHO 세포 또는 흑색종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜, 숙주 세포에서 재조합 단일클론 항체의 합성을 달성한다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "세포(cell)," "세포주(cell line)," 및 "세포 배양물(cell culture)"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 모든 그와 같은 표기들은 후대를 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체(transformant)" 및 "형질전환된 세포(transformed cell)"는 최초 대상 세포, 및 이식(transfer) 횟수와 무관하게 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 후대들은 의도적 또는 우연한 돌연변이로 인해 DNA 함량에 있어서 정확히 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 본래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된, 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 후대가 포함된다. 별도의 표기가 의도되는 경우는 문맥으로부터 명확할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형질전환(transformation)"은 벡터/핵산을 숙주 세포 내로 이식하는 방법을 지칭한다. 강한 세포벽 장벽을 갖지 않는 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 형질감염은 예를 들면, 문헌[Graham, F., L., and van der Eb, Virology 52 (1973) 456-467]에 기술된 바와 같은 칼슘 포스페이트 침전법에 의해 수행된다. 그러나, 핵 주입 또는 원형질체 융합과 같은, DNA를 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법들이 또한 사용될 수 있다. 원핵 세포 또는 실질적인 세포벽 구조물을 함유하는 세포가 사용되는 경우, 예를 들면, 형질감염의 한 방법은 문헌[S.N. 등, PNAS 69 (1972) 2110-2114]에 기술된 바와 같은, 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리이다.
본 명세서에서 사용되는 "발현(expression)"은 핵산이 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA(전사체로도 지칭됨)가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 상기 전사체 및 코딩된 폴리펩티드를 총칭하여 유전자 산물로 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래하는 경우, 진핵 세포에서의 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"벡터(vector)"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 사이에 이식시키는 핵산 분자, 특히 자가 복제성 핵산 분자이다. 상기 용어는 DNA 또는 RNA의 세포 내로의 삽입(예를 들면, 염색체 통합(chromosomal integration)) 목적으로 주로 기능하는 벡터, DNA 또는 RNA의 복제 목적으로 주로 기능하는 복제 벡터, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역 목적으로 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 또한, 전술된 기능들 중 하나 이상을 제공하는 벡터가 포함된다.
"발현 벡터(expression vector)"는 적절한 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 전사되고 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템(expression system)"은 통상적으로, 원하는 발현 산물을 생산하도록 기능할 수 있는 발현 벡터로 구성된 적합한 숙주 세포를 지칭한다.
본 발명의 일 양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물이다. 본 발명의 또다른 양태는 약학적 조성물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 항체의 용도이다. 본 발명의 추가적인 양태는 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법이다. 또다른 양태에서, 본 발명은 약학적 담체와 함께 제제화된, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 조성물, 예를 들면 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 그와 같은 CDCP1 항체 CUB4의 특이적 인간화 버젼은, 예를 들어 다른 항-CDCP1 항체와 비교하여 암의 치료에 특히 유용한 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 암의 치료를 위한 상기 약학적 조성물이다.
본 발명의 또다른 양태는 암의 치료를 위한 본 발명에 따른 인간화 항체이다.
본 발명의 또다른 양태는 암 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명에 따른 인간화 항체의 용도이다.
본 발명의 또다른 양태는 암 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 인간화 항체를 투여하는 단계에 의한, 암을 앓는 환자의 치료 방법이다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적 담체(pharmaceutical carrier)"로는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연 제제, 및 생리학적으로 허용가능한 기타 담체가 포함된다. 바람직하게는, 상기 담체는 정맥 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 비경구 투여, 척추 투여 또는 상피 투여(예를 들면 주사 또는 주입에 의한)에 적합하다.
본 발명의 조성물은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 숙련된 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 화합물의 소정의 투여 경로에 의해 투여하기 위해, 화합물을 그의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나, 상기 물질과 함께 공동투여할 필요가 있을 수 있다. 예를 들면, 상기 화합물은 적절한 담체, 예를 들면, 리포솜 또는 희석제 중에 개체에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제로는 염수 및 수성 완충 용액이 포함된다. 약학적 담체로는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석(extemporaneous) 제제용 멸균 분말이 포함된다. 약학적 활성 물질을 위한 그와 같은 매질 및 작용제의 사용은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 문구 "비경구 투여(parenteral administration)" 및 "비경구 투여된(administered parenterally)"은 통상적으로는 주사에 의한, 장관 투여 및 국소 투여가 아닌 투여 방식들을 의미하고, 이에 한정되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내(intracapsular) 투여, 안와내 투여, 심장내, 피내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하, 각피하(subcuticular), 관절강내, 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수내, 경막외(epidual) 및 흉골내 주사 및 주입이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "암(cancer)"은 예를 들면, 폐암, 비소세포 폐(NSCL)암, 세기관지 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암(stomach cancer, gastric cancer), 대장암, 유방암, 자궁암, 난관암, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨 병(Hodgkin's Disease), 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연부 조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종(mesothelioma), 간세포암, 담도암, 중추신경계(CNS) 신생물, 척추 종양, 뇌관교종(brain stem glioma), 다형성 교아종(glioblastoma multiforme), 성상세포종(astrocytoma), 신경집종(schwanoma), 뇌실막세포종(endymona), 수아세포종(medulloblastoma), 수막종, 편평상피세포암종, 뇌하수체 선종, 림프종 또는 림프구성 백혈병일 수 있으며, 상기 암 중 어느 하나의 난치성 버젼, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 그와 같은 암은 유방암, 난소암, 자궁경부암, 폐암 또는 전립선암이고, 보다 바람직하게는, 폐암이다. 바람직하게는, 그와 같은 암은 CDCP1 발현 또는 과발현, 보다 바람직하게는 CDCP1 과발현을 나타내는 것을 특징으로 한다.
이 조성물은 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제들을 또한 포함할 수 있다. 미생물 존재의 방지는 상기 멸균 과정 및 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 또한 당, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약학적 제형의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은, 흡수를 지연시키는 작용제들을 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는, 본 발명의 화합물 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투여 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서, 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 있어서 원하는 치료적 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배설 속도, 치료의 지속기간, 사용된 특정 조성물과 병용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료대상 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 전반적 건강상태 및 과거 병력, 및 의학 분야에 잘 알려진 기타 인자들을 포함한, 다양한 약동학적 인자에 좌우된다.
상기 조성물은 멸균되어야 하고, 조성물이 주사기에 의해 전달될 수 있을 정도로 유동성을 나타내야 한다. 물 외에, 담체는 바람직하게는, 등장성 완충 염 용액이다.
적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우, 조성물 중에 등장화제, 예를 들면, 당, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 다가알코올 및 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직하다.
하기 실시예, 서열목록 및 도면들은 본 발명의 이해를 돕기 위한 목적으로 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 제시되어 있다. 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않으면서, 하기 제시된 방법에 있어서 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
서열 목록의 아미노산 서열의 설명
서열번호 1 CUB4의 중쇄 가변 도메인 VH (기탁번호 DSM ACC2551)
서열번호 2 CUB4의 경쇄 가변 도메인 VL (기탁번호 DSM ACC2551)
서열번호 3 hHC4-H - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 4 hHC4-c - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 5 hHC4-a - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 6 hHC4-d - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 7 hHC4-04 - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 8 hHC4-K - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 9 hHC4-K2 - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 10 hHC4-I - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 11 hHC4-07 - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 12 hHC4-03 - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 13 hHC4-b - CUB4의 인간화된 VH
서열번호 14 hLC4-M - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 15 hLC4-L2 - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 16 hLC4-K - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 17 hLC4-L - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 18 hLC4-J - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 19 hLC4-b - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 20 hLC4-c - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 21 hLC4-a - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 22 hLC4-d - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 23 hLC4-e - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 24 hLC4-f - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 25 hLC4-I - CUB4의 인간화된 VL
서열번호 26 인간 유래의 IgG1 불변 중쇄 영역(코카시안(Caucasian) 알로타입)
서열번호 27 인간 유래의 카파 불변 경쇄 영역
서열번호 28 인간 유래의 람다 불변 경쇄 영역
서열번호 29 인간 CDCP1
서열번호 30 인간 CDCP1의 세포외-도메인-(ECD)-포함 절편
서열번호 31 인간 유래의 IgG1 불변 중쇄 영역(아프로아메리칸(Afroamerican) 알로타입)
서열번호 32 인간 유래의 IgG4 불변 중쇄 영역
실시예 1
항원 특이적 ELISA
스트렙타비딘 결합 단백질(SBP)과 융합된 가용성 CDCP1 세포외 도메인(CDCP1-ECD)(서열번호 30)을 스트렙타비딘 플레이트 상에 포획시켰다. 상기 항체와 SBP-CDCP1-ECD의 최적 결합을 정의하기 위해, 독일 베른리에트 소재의 마이크로코트(MicroCoat)(고유번호 1734776-001)에 의해 전달받은 384-웰 폴리스티렌 플레이트(NUNC, 스트렙타비딘-코팅됨)를 순수하고 단계별로 희석된 HEK293 상청액(BSA/IMDM 완충액: 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbeccos Medium) 중에 용해된, 100 mg/ml BSA 분획 V, 로슈(Roche) 10735078001)로 코팅하였다. 마우스 CUB4 항체의 검량선을 사용하여, 마이크로타이터 플레이트의 스트렙타비딘 결합능에 대한 HEK293 상청액의 최적 희석 인자를 확인하였다. 표준 코팅에 대하여, SBP-CDCP1-ECD를 함유하는 HEK293 상청액을 희석시키고(1:15 내지 1:40), 2 내지 8 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다(웰 당 25 ㎕). 결합하지 않은 잔여 SBP-CDCP1-ECD를 제거하기 위해 마이크로타이터의 강력한 세정이 필요하다.
인간화 CUB4 항체 및/또는 참조 항체(인간 불변 영역 및 서열번호 1 및 2의 마우스 VH 및 VL을 포함하는 키메라(chHC4) CUB4 항체)를 희석하지 않거나, 12 단계 희석을 사용하여 시험하였다. 웰 당 12.5 ㎕의 각각의 샘플들을 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 이들을 PBS-T(PBS 중 0.1% 트윈 20)를 사용하여 강력하게 세정한 후, 인간 항체에 대한 HRP(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 코드 번호: 109-036-098, 1:10000 희석)와 결합된 염소 항-인간 IgG 항체 25 ㎕를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 강력한 세정 후에, ABTS 정제(로슈 디아그노스틱스 게임베하(Roche Diagnostics GmbH), 카탈로그 번호: 1112422)를 사용하여 항체의 결합을 검출하였다. 표준 광도계를 사용하여 405 nm/492 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
도 3에, 키메라(chHC4) CUB4 항체에 대한 인간화 VH 및 VL의 상이한 조합의 결합 비율이 제시되어 있다. 결과는
a) VH의 CDRH2에서의 특이적 돌연변이(돌연변이 T57K 및 P60V)(VH 도메인: hHC4-H(서열번호 3) 참조), 및/또는
b) VL의 CDRL1에서의 특이적 돌연변이(돌연변이 V33L) 및 VL 외곽 영역 내 위치 47에서의, 인간 아미노산에서 마우스 아미노산 W으로의 돌연변이; (VL 도메인: hLC4-M(서열번호 14), hLC4-L2(서열번호 15), hLC4-K(서열번호 16), hLC4-L(서열번호 17), hLC4-J(서열번호 18) 참조)를 갖는 특이적인 개질된 인간화 항체가, 그와 같은 특이적 개질을 포함하지 않는 인간화 CUB4 항체에 비해, 놀랍게도 분명하게 개선된 결합 특성을 초래한다는 것을 보여준다.
실시예 2
항- CDCP1 항체와 (인간 CDCP1 의 세포외 도메인 ECD 를 포함하는) 서열번호 30의 인간 CDCP1 의 세포외 -도메인-( ECD )-포함 단편의 결합에 대한 특성 규명:
친화성 측정을 위해, 30 ㎍/ml 항 마우스 Fcγ 항체(염소에서 유래, 잭슨 이뮤노 리서치 JIR115-005-071)를 SPR 기기(바이아코어(Biacore) T100)에서 표준 아민-커플링 및 블로킹 화학반응에 의해 CM-5 센서 칩의 표면에 결합시켰다. 접합 후에, 상이한 항-CDCP1 항체들을 5 ㎕/분의 유속으로 25 ℃에서 주사하고, 뒤이어 30 ㎕/분으로 CDCP1 ECD의 연속 희석액 (0 nM 내지 1000 nM)을 주사하였다. 결합 실험을 위한 런닝 완충액으로서 PBS/0.1% BSA를 사용하였다. 그 다음, pH 2.0의 10 mM 글리신-HCl 용액을 60초 펄스로 사용하여 칩을 재생시켰다.
열역학적 파라미터(KD, 결합 상수) 및 동력학적 파라미터(kon 비율, koff 비율) 계산치를 랑그뮈르(Langmuir) 1:1 결합 모델을 사용하여 계산하였다.
본 발명에 따른 인간화 항체의 예시적 결합 파라미터
인간화 항-CDCP1 항체 ka
[1/Ms]		 kd
[1/s]		 t½diss.
[분]		 KD
[nM]
47 2.0E+05 7.5E-04 15.4 3.77
69 2.1E+05 5.2E-04 22.1 2.55
80 2.5E+05 8.8E-04 13.1 3.53
91 1.8E+05 1.0E-03 11.2 5.60
102 1.9E+05 1.1E-03 11.0 5.40
135 1.4E+05 1.1E-03 10.3 8.30
실시예 3
글리코엔지니어링된 인간화 CUB4 항체(인간화 CUB4 항체 GE )의 제조
아미노산 서열 서열번호 3 및 서열번호 15(항체 69)에 해당하는 전장(full) 항체 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을, MPSV 프로모터의 조절 하에, 합성 폴리A 부위의 상류에, 포유동물 발현 벡터(경쇄에 대한 벡터 및 중쇄에 대한 벡터) 내로 서브클로닝하였으며, 각각의 벡터는 EBV OriP 서열을 운반한다.
칼슘 포스페이트-형질감염법을 이용하여, 포유동물 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 사용하여 HEK293-EBNA 세포를 공동-형질감염시켜 항체를 생산시켰다. 대수 생장기의 HEK293-EBNA 세포들을 칼슘 포스페이트법에 의해 형질감염시켰다. 비개질된 항체의 생산을 위해, 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터들만을 1:1 비율로 사용하여 세포들을 형질감염시켰다. 글리코엔지니어링된 항체의 생산을 위해, 세포들을 4개의 플라스미드, 즉 항체 발현을 위한 2개의 플라스미드, 융합 GnTIII 폴리펩티드 발현을 위한 1개의 플라스미드(GnT-III 발현 벡터) 및 만노시다제 II 발현을 위한 1개의 플라스미드(골지 만노시다제 II 발현 벡터)를, 각각 4:4:1:1의 비율로 공동-형질감염시켰다. 세포들을 10% FCS로 보강된 DMEM 배양 배지를 사용하여 T 플라스크에서 유착성(adherent) 단층 배양물로서 생장시키고, 50 내지 80% 컨플루언시일 때 형질감염시켰다. T150 플라스크의 형질감염을 위해, 1500만개의 세포들을 형질감염 24시간 전에 FCS로 보강된(최종 농도 10% V/V) 25 mL DMEM 배양 배지에 시딩하고, 세포들을 밤새 5% CO2 대기 하에, 37 ℃에서 인큐베이터 내에 두었다. 형질감염될 각각의 T150 플라스크에 대해, 경쇄 및 중쇄 발현 벡터 간에 균등하게 분배된 94 ㎍의 총 플라스미드 벡터 DNA, 최종 부피 469 ㎕의 물, 및 469 ㎕의 1M CaCl2 용액을 혼합하여 DNA, CaCl2 및 물로 이루어진 용액을 준비하였다. 이 용액에, 938 ㎕의 50 mM HEPES, 280 mM NaCl, pH 7.05의 1.5 mM Na2HPO4 용액을 첨가하고, 즉시 10초 동안 혼합하고, 실온에서 20초 동안 정치시켰다. 현탁액을 2% FCS로 보강된 DMEM 10 mL로 희석시키고, 기존의 배지 대신 T150에 첨가하였다. 그 다음, 형질감염 배지 13 mL를 추가적으로 첨가하였다. 세포들을 37 ℃, 5% CO2에서 약 17 내지 20시간 동안 인큐베이션한 다음, 배지를 25 ml DMEM, 10% FCS로 교환하였다. 상기 조절된(conditioned) 배양 배지를, 형질감염 7일 후에 210 x g에서 15분 동안, 원심분리에 의해 수확하고, 용액을 멸균 여과시키고(0.22 ㎛ 필터), 최종 농도 0.01 % w/v의 소듐 아지드를 첨가하고, 4 ℃로 유지하였다.
분비된 항체인, 글리코엔지니어링된 인간화 CUB4 항체 제69호(인간화 CUB4 항체 제69 GE호)를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제한 후, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하고, 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, 100 mM 글리신의 pH 6.7 용액으로 완충액을 교환하여 수퍼덱스(Superdex) 200 컬럼(아메르샴 파마시아(Amersham Pharmacia)에서 최종 크기 배제 크로마토그래피 단계를 수행하고, 순수한 모노머 IgG1 항체를 수집하였다. 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도로부터 항체 농도를 추정하였다. 상기 항체의 Fc 영역에 결합된 올리고당을 MALDI/TOF-MS에 의해 (예를 들면, WO 2008/077546에 기술된 바와 같이) 분석하였다. 항체를 PVDF 막 위 또는 용액 내에 고정화하고, 올리고당을 PNGaseF 소화에 의해 항체로부터 효소적으로 방출시켰다. 그로부터 얻어진, 방출된 올리고당을 함유하는 소화 용액을, 즉시 MALDI/TOF-MS 분석을 위해 준비하거나, MALDI/TOF-MS 분석용 샘플 준비 전에 EndoH 글리코시다제를 사용하여 추가적으로 소화시켰다.
추가적인 실험에서, HEK293-EBNA 세포 대신 CHO 세포에서 4개의 플라스미드, 즉 항체 발현을 위한 2개의 플라스미드, 융합 GnTIII 폴리펩티드 발현을 위한 1개의 플라스미드(GnT-III 발현 벡터) 및 만노시다제 II 발현을 위한 1개의 플라스미드(골지 만노시다제 II 발현 벡터)를 각각 4:4:1:1의 비율로 사용한 공동-형질감염에 의해, 글리코엔지니어링된 인간화 CUB4 항체(인간화 CUB4 항체 GE) 항체 69 및 135를 제조하였다. 분석된 Asn297에서의 당쇄 내 푸코오스 양은 50 내지 10%였다.
실시예 4
인간화 CUB4 항체의 인 비트로 ADCC
표적 세포 PC-3(DSMZ #ACC 465, 전립선암종, 햄 F12 영양 혼합물(Ham's F12 Nutrient Mixture) + 2 mM L-알라닐-L-글루타민 + 10 % FCS에서 배양) 및 H322M (비소세포 폐암종, RPMI1640 + 2 mM L-알라닐-L-글루타민 + 10 % FCS에서 배양)을 대수 생장기에 트립신/EDTA(Gibco # 25300-054)을 사용하여 수집하였다. 세척 단계 및 세포수 및 생존능(viability) 확인 단계 후, 필요한 분취량(aliquot)을 칼세인을 포함한 세포 인큐베이터에서 37 ℃에서 30분 동안 표지화시켰다(Invitrogen #C3100MP; 1개의 바이알을 5 mL 배지 내의 5 Mio 세포에 대해, 50 ㎕ DMSO 중에 재현탁시킴). 그 후, 세포들을 AIM-V 배지로 3회 세척하고, 세포 수 및 생존능을 확인하고, 세포수를 0.3 Mio/mL로 조정하였다.
한편, 제조자의 프로토콜에 따라(400 g에서 1회 및 350 g에서 2회의 세척 단계, 각각 10분) 밀도 구배 원심분리(Histopaque-1077, 시그마(Sigma) # H8889)에 의해 효과기 세포로서 PBMC를 준비하였다. 세포수 및 생존능을 확인하고, 세포수를 15 Mio/mL로 조정하였다.
100 ㎕ 칼세인-염색된 표적 세포들을 둥근바닥 96-웰 플레이트에 도포하고, 50 ㎕의 희석된 항체 및 50 ㎕의 효과기 세포를 첨가하였다. 일부 실험에서, 상기 표적 세포들을 10 mg/mL Redimune 농도로, Redimune®NF 리퀴드(ZLB 베링(Behring))과 혼합하였다.
대조군으로서, 항체를 포함하지 않는 공동 배양 표적 세포 및 효과기 세포에 의해 결정된 자발적 용해, 및 표적 세포만의 1% 트리톤 X-100 용해에 의해 결정된 최대 용해가 사용되었다. 플레이트를 가습 세포 인큐베이터 내에서, 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
표적 세포의 사멸을, 세포독성 검출 키트(LDH 검출 키트, 로슈 # 1 644 793)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 손상된 세포로부터의 LDH 방출을 측정함으로써 평가하였다. 요약하면, 투명한 편평 바닥 96 웰 플레이트 내에, 각각의 웰로부터 얻은 100 ㎕ 상청액과, 키트에서 얻은 100 ㎕의 기질을 혼합하였다. 기질의 발색 반응의 Vmax 값을 ELISA 판독기에서 490nm으로 10분 이상 측정하였다. 특이적 항체-매개 사멸의 백분율을 다음과 같이 계산하였다: ((A - SR)/(MR - SR)×100, 식에서, A는 특정 항체 농도에서의 Vmax의 평균이고, SR은 자발적 방출의 Vmax의 평균이고, MR은 최대 방출의 Vmax의 평균이다.
추가적인 판독으로서, 손상되지 않은 표적 세포의 칼세인 보유량(retention)을, 잔여 표적 세포를 붕산염 완충액(5 mM 붕산나트륨 + 0.1 % 트리톤)에 용해시키고, 형광 플레이트 판독기에서 칼세인 형광을 측정함으로써 평가하였다.
도 4는 키메라 글리코엔지니어링된(GE) CUB4 및 야생형(wt = 비글리코엔지니어링된 키메라 CUB4 항체) 및 인간 IgG 음성 대조군의 ADCC와 비교한, 65% 이하의 푸코오스 양을 갖는 글리코엔지니어링된(GE) 인간화 CUB4 항체 제69 GE호의 인 비트로 ADCC를 나타낸다.
실시예 5
DU -145 세포 내의 CDCP1 인산화 자극
6웰 당 2 x 105개의 Du-145 세포를 2mM L-글루타민(시그마 카탈로그 제G7513호), 2 mM 소듐 파이로베이트, 10 % FCS(PAA 카탈로그 제E15-0011호)을 포함하는 DMEM(Paa 카탈로그 제E15-0011호)에서 밤새 배양하였다. 세포들을 20㎍/ml의 상이한 인간화 CUB4 항체와 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 세포들을 신선하게 준비된, 얼음처럼 찬 RIPA 용해 완충액(RIPA - Puffer 1 % NP40, 1 % DOC, 0.1 % SDS, 150 mM NaCl, 10 mM 트리스/HCl, pH 7.4, 에탄올 중 1 mM PMSF, 10 ㎍/mL 아프로티닌, 0.4 mM 오르토바나다트(Orthovanadat))을 사용하여 용해시켰다. 10분 후에, 얼음 상에서 세포 용해물을 10000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상기 용해물을 SDS-PAGE 상에서 표준 프로토콜에 따라 분리하고, 웨스턴 블롯에 의해 니트로셀룰로오스로 옮겼다. 항-포스포티로신 항체(4G10) 또는 항-포스포CDCP1 항체에 의해 웨스턴 블롯을 검출하였다. 인산화된 CDCP1의 강도를 밀도계 스캐닝(densiometric scanning) (Biorad GS 800 밀도계)에 의해 결정하였다.
인간화 CUB4 항체의 ( 키메라 CUB4 대비) 자극 백분율(%)
인간화 CUB4 항체 번호 자극 백분율
키메라 CUB4 100 %
80 133 %
69 112 %
47 96 %
135 72 %
모든 인간화 CUB4 항체 제80호, 제69호, 제47호 및 제135호는 DU-145 세포에서 CDCP1 인산화의 자극을 보였다.
실시예 6
인간화 CUB4 항체의 생체 내 종양 억제
A) 시험명 : CDCP1 _ PZ _ H322M _007
본 생체 내 시험은 NCI-H322M 비소세포 폐암 모델에서, 키메라 항-CDCP1 항체 CUB4와 CUB4 항체의 인간화 버젼의 효능을 비교할 목적으로 수행하였다.
H322M 비소세포 폐암 세포를 NCI 컬렉션으로부터 수득하였다. 종양세포주를 5% CO2에서, 물이 포화된 대기 중에 37 ℃에서, 10% 우태아 혈청 및 2 mM L-글루타민으로 보강된 RPMI 1640 배지에서 일상적으로 배양하였다. 세포 이식을 위해 계대 4를 사용하였다.
인간 비소세포 폐암 세포주 H322M를, 마우스의 우측 옆구리에 마트리겔과 함께 피하 접종((5x106개의 세포)하였다.
동물 처리는 세포 이식후 19일 경과시, 무작위화(randomisation) 일자에 시작하였다. 항체를 시험 19일차, 26일차, 33일차, 40일차 및 47일차에, 표시된 투여량인 25 mg/kg로 복강내(i.p.) q7d 투여하였다. 또한, 상기 동일한 날에, 상응하는 비히클을 투여하였다. 투여 용량은 10 mL/kg이었다.
인간화 CUB4 항체 제69호는 서열번호 3 및 서열번호 15의 VH 및 VL에 기반한다.
인간화 CUB4 항체 제135호는 서열번호 3 및 서열번호 23의 VH 및 VL에 기반한다.
군:
처리군 1: 비히클;
처리군 2: 키메라 CUB4 (25 mg/kg i.p);
처리군 3: 인간화 CUB4 항체 제69호 (25 mg/kg i.p);
처리군 4: 인간화 CUB4 항체 제135호 (25 mg/kg i.p).
도 5a에서, 인간화 CUB4 항체 제69호 및 제135호 및 키메라 항체의 인간 폐암 H322M 이종이식편에서의 생체 내 종양 성장 억제, 및 키메라 CUB4 항체와 비교시, 인간화 CUB4 항체 제69호 및 제135호의 분명히 개선된 생체 내 종양 성장 억제가 나타나 있다.
B) 시험명 : CDCP1 _ PZ _ H322M _004
본 생체 내 시험은 NCI-H322M 비소세포 폐암 모델에서, 뮤린 항-CDCP1 항체와 키메라 항-CDCP1 항체 CUB4(인간 IgG1 불변 영역을 갖는 마우스 VH 및 VL)의 효능을 비교하기 위해 수행하였다.
H322M 비소세포 폐암 세포를 NCI 컬렉션으로부터 수득하였다. 종양세포주를 5% CO2에서 물이 포화된 대기 중에, 37 ℃에서, 10% 우태아 혈청 및 2 mM L-글루타민으로 보강된 RPMI 1640 배지에서 일상적으로 배양하였다. 세포 이식을 위해 계대 4를 사용하였다.
인간 비소세포 폐암 세포주 H322M를, 마우스의 우측 옆구리에 마트리겔과 함께 피하 접종((5x106개의 세포)하였다.
동물 처리는 세포 이식 후 17일 경과시, 무작위화 일자에 시작하였다. 항체를 시험 종료일인 59일차까지, 표시된 투여량인 10 mg/kg로 복강내(i.p.) q7d 투여하였다. 또한, 상기 동일한 날에, 상응하는 비히클을 투여하였다. 투여 용량은 10 mL/kg이었다.
군:
처리군 1: 비히클;
처리군 4: 뮤린 CUB4 (10 mg/kg i.p);
처리군 5: 키메라 CUB4 (10 mg/kg i.p).
도 5b에서, 마우스 CUB4 항체 및 키메라 CUB4 항체의 인간 폐암 H322M 이종이식편에서의 생체 내 종양 성장 억제, 및 마우스 CUB4 항체와 비교시 키메라 CUB4 항체의 개선된 생체 내 종양 성장 억제가 나타나 있다.
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Ser Asp Phe Tyr 20 25 30 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 35 40 45 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 65 70 75 80 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 85 90 95 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 29 <211> 836 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Ala Gly Leu Asn Cys Gly Val Ser Ile Ala Leu Leu Gly Val Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ala Ala Arg Leu Pro Arg Gly Ala Glu Ala Phe Glu Ile 20 25 30 Ala Leu Pro Arg Glu Ser Asn Ile Thr Val Leu Ile Lys Leu Gly Thr 35 40 45 Pro Thr Leu Leu Ala Lys Pro Cys Tyr Ile Val Ile Ser Lys Arg His 50 55 60 Ile Thr Met Leu Ser Ile Lys Ser Gly Glu Arg Ile Val Phe Thr Phe 65 70 75 80 Ser Cys Gln Ser Pro Glu Asn His Phe Val Ile Glu Ile Gln Lys Asn 85 90 95 Ile Asp Cys Met Ser Gly Pro Cys Pro Phe Gly Glu Val Gln Leu Gln 100 105 110 Pro Ser Thr Ser Leu Leu Pro Thr Leu Asn Arg Thr Phe Ile Trp Asp 115 120 125 Val Lys Ala His Lys Ser Ile Gly Leu Glu Leu Gln Phe Ser Ile Pro 130 135 140 Arg Leu Arg Gln Ile Gly Pro Gly Glu Ser Cys Pro Asp Gly Val Thr 145 150 155 160 His Ser Ile Ser Gly Arg Ile Asp Ala Thr Val Val Arg Ile Gly Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Gly Thr Val Ser Arg Ile Lys Met Gln Glu Gly Val 180 185 190 Lys Met Ala Leu His Leu Pro Trp Phe His Pro Arg Asn Val Ser Gly 195 200 205 Phe Ser Ile Ala Asn Arg Ser Ser Ile Lys Arg Leu Cys Ile Ile Glu 210 215 220 Ser Val Phe Glu Gly Glu Gly Ser Ala Thr Leu Met Ser Ala Asn Tyr 225 230 235 240 Pro Glu Gly Phe Pro Glu Asp Glu Leu Met Thr Trp Gln Phe Val Val 245 250 255 Pro Ala His Leu Arg Ala Ser Val Ser Phe Leu Asn Phe Asn Leu Ser 260 265 270 Asn Cys Glu Arg Lys Glu Glu Arg Val Glu Tyr Tyr Ile Pro Gly Ser 275 280 285 Thr Thr Asn Pro Glu Val Phe Lys Leu Glu Asp Lys Gln Pro Gly Asn 290 295 300 Met Ala Gly Asn Phe Asn Leu Ser Leu Gln Gly Cys Asp Gln Asp Ala 305 310 315 320 Gln Ser Pro Gly Ile Leu Arg Leu Gln Phe Gln Val Leu Val Gln His 325 330 335 Pro Gln Asn Glu Ser Asn Lys Ile Tyr Val Val Asp Leu Ser Asn Glu 340 345 350 Arg Ala Met Ser Leu Thr Ile Glu Pro Arg Pro Val Lys Gln Ser Arg 355 360 365 Lys Phe Val Pro Gly Cys Phe Val Cys Leu Glu Ser Arg Thr Cys Ser 370 375 380 Ser Asn Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Lys His Lys Ile Ser Phe Leu 385 390 395 400 Cys Asp Asp Leu Thr Arg Leu Trp Met Asn Val Glu Lys Thr Ile Ser 405 410 415 Cys Thr Asp His Arg Tyr Cys Gln Arg Lys Ser Tyr Ser Leu Gln Val 420 425 430 Pro Ser Asp Ile Leu His Leu Pro Val Glu Leu His Asp Phe Ser Trp 435 440 445 Lys Leu Leu Val Pro Lys Asp Arg Leu Ser Leu Val Leu Val Pro Ala 450 455 460 Gln Lys Leu Gln Gln His Thr His Glu Lys Pro Cys Asn Thr Ser Phe 465 470 475 480 Ser Tyr Leu Val Ala Ser Ala Ile Pro Ser Gln Asp Leu Tyr Phe Gly 485 490 495 Ser Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Lys Gln Ile Gln Val Lys Gln Asn 500 505 510 Ile Ser Val Thr Leu Arg Thr Phe Ala Pro Ser Phe Arg Gln Glu Ala 515 520 525 Ser Arg Gln Gly Leu Thr Val Ser Phe Ile Pro Tyr Phe Lys Glu Glu 530 535 540 Gly Val Phe Thr Val Thr Pro Asp Thr Lys Ser Lys Val Tyr Leu Arg 545 550 555 560 Thr Pro Asn Trp Asp Arg Gly Leu Pro Ser Leu Thr Ser Val Ser Trp 565 570 575 Asn Ile Ser Val Pro Arg Asp Gln Val Ala Cys Leu Thr Phe Phe Lys 580 585 590 Glu Arg Ser Gly Val Val Cys Gln Thr Gly Arg Ala Phe Met Ile Ile 595 600 605 Gln Glu Gln Arg Thr Arg Ala Glu Glu Ile Phe Ser Leu Asp Glu Asp 610 615 620 Val Leu Pro Lys Pro Ser Phe His His His Ser Phe Trp Val Asn Ile 625 630 635 640 Ser Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gly Lys Gln Leu Asp Leu Leu Phe Ser 645 650 655 Val Thr Leu Thr Pro Arg Thr Val Asp Leu Thr Val Ile Leu Ile Ala 660 665 670 Ala Val Gly Gly Gly Val Leu Leu Leu Ser Ala Leu Gly Leu Ile Ile 675 680 685 Cys Cys Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Asn Lys Gly Pro Ala Val 690 695 700 Gly Ile Tyr Asn Gly Asn Ile Asn Thr Glu Met Pro Arg Gln Pro Lys 705 710 715 720 Lys Phe Gln Lys Gly Arg Lys Asp Asn Asp Ser His Val Tyr Ala Val 725 730 735 Ile Glu Asp Thr Met Val Tyr Gly His Leu Leu Gln Asp Ser Ser Gly 740 745 750 Ser Phe Leu Gln Pro Glu Val Asp Thr Tyr Arg Pro Phe Gln Gly Thr 755 760 765 Met Gly Val Cys Pro Pro Ser Pro Pro Thr Ile Cys Ser Arg Ala Pro 770 775 780 Thr Ala Lys Leu Ala Thr Glu Glu Pro Pro Pro Arg Ser Pro Pro Glu 785 790 795 800 Ser Glu Ser Glu Pro Tyr Thr Phe Ser His Pro Asn Asn Gly Asp Val 805 810 815 Ser Ser Lys Asp Thr Asp Ile Pro Leu Leu Asn Thr Gln Glu Pro Met 820 825 830 Glu Pro Ala Glu 835 <210> 30 <211> 663 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Ala Gly Leu Asn Cys Gly Val Ser Ile Ala Leu Leu Gly Val Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ala Ala Arg Leu Pro Arg Gly Ala Glu Ala Phe Glu Ile 20 25 30 Ala Leu Pro Arg Glu Ser Asn Ile Thr Val Leu Ile Lys Leu Gly Thr 35 40 45 Pro Thr Leu Leu Ala Lys Pro Cys Tyr Ile Val Ile Ser Lys Arg His 50 55 60 Ile Thr Met Leu Ser Ile Lys Ser Gly Glu Arg Ile Val Phe Thr Phe 65 70 75 80 Ser Cys Gln Ser Pro Glu Asn His Phe Val Ile Glu Ile Gln Lys Asn 85 90 95 Ile Asp Cys Met Ser Gly Pro Cys Pro Phe Gly Glu Val Gln Leu Gln 100 105 110 Pro Ser Thr Ser Leu Leu Pro Thr Leu Asn Arg Thr Phe Ile Trp Asp 115 120 125 Val Lys Ala His Lys Ser Ile Gly Leu Glu Leu Gln Phe Ser Ile Pro 130 135 140 Arg Leu Arg Gln Ile Gly Pro Gly Glu Ser Cys Pro Asp Gly Val Thr 145 150 155 160 His Ser Ile Ser Gly Arg Ile Asp Ala Thr Val Val Arg Ile Gly Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Gly Thr Val Ser Arg Ile Lys Met Gln Glu Gly Val 180 185 190 Lys Met Ala Leu His Leu Pro Trp Phe His Pro Arg Asn Val Ser Gly 195 200 205 Phe Ser Ile Ala Asn Arg Ser Ser Ile Lys Arg Leu Cys Ile Ile Glu 210 215 220 Ser Val Phe Glu Gly Glu Gly Ser Ala Thr Leu Met Ser Ala Asn Tyr 225 230 235 240 Pro Glu Gly Phe Pro Glu Asp Glu Leu Met Thr Trp Gln Phe Val Val 245 250 255 Pro Ala His Leu Arg Ala Ser Val Ser Phe Leu Asn Phe Asn Leu Ser 260 265 270 Asn Cys Glu Arg Lys Glu Glu Arg Val Glu Tyr Tyr Ile Pro Gly Ser 275 280 285 Thr Thr Asn Pro Glu Val Phe Lys Leu Glu Asp Lys Gln Pro Gly Asn 290 295 300 Met Ala Gly Asn Phe Asn Leu Ser Leu Gln Gly Cys Asp Gln Asp Ala 305 310 315 320 Gln Ser Pro Gly Ile Leu Arg Leu Gln Phe Gln Val Leu Val Gln His 325 330 335 Pro Gln Asn Glu Ser Asn Lys Ile Tyr Val Val Asp Leu Ser Asn Glu 340 345 350 Arg Ala Met Ser Leu Thr Ile Glu Pro Arg Pro Val Lys Gln Ser Arg 355 360 365 Lys Phe Val Pro Gly Cys Phe Val Cys Leu Glu Ser Arg Thr Cys Ser 370 375 380 Ser Asn Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Lys His Lys Ile Ser Phe Leu 385 390 395 400 Cys Asp Asp Leu Thr Arg Leu Trp Met Asn Val Glu Lys Thr Ile Ser 405 410 415 Cys Thr Asp His Arg Tyr Cys Gln Arg Lys Ser Tyr Ser Leu Gln Val 420 425 430 Pro Ser Asp Ile Leu His Leu Pro Val Glu Leu His Asp Phe Ser Trp 435 440 445 Lys Leu Leu Val Pro Lys Asp Arg Leu Ser Leu Val Leu Val Pro Ala 450 455 460 Gln Lys Leu Gln Gln His Thr His Glu Lys Pro Cys Asn Thr Ser Phe 465 470 475 480 Ser Tyr Leu Val Ala Ser Ala Ile Pro Ser Gln Asp Leu Tyr Phe Gly 485 490 495 Ser Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Lys Gln Ile Gln Val Lys Gln Asn 500 505 510 Ile Ser Val Thr Leu Arg Thr Phe Ala Pro Ser Phe Arg Gln Glu Ala 515 520 525 Ser Arg Gln Gly Leu Thr Val Ser Phe Ile Pro Tyr Phe Lys Glu Glu 530 535 540 Gly Val Phe Thr Val Thr Pro Asp Thr Lys Ser Lys Val Tyr Leu Arg 545 550 555 560 Thr Pro Asn Trp Asp Arg Gly Leu Pro Ser Leu Thr Ser Val Ser Trp 565 570 575 Asn Ile Ser Val Pro Arg Asp Gln Val Ala Cys Leu Thr Phe Phe Lys 580 585 590 Glu Arg Ser Gly Val Val Cys Gln Thr Gly Arg Ala Phe Met Ile Ile 595 600 605 Gln Glu Gln Arg Thr Arg Ala Glu Glu Ile Phe Ser Leu Asp Glu Asp 610 615 620 Val Leu Pro Lys Pro Ser Phe His His His Ser Phe Trp Val Asn Ile 625 630 635 640 Ser Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gly Lys Gln Leu Asp Leu Leu Phe Ser 645 650 655 Val Thr Leu Thr Pro Arg Thr 660 <210> 31 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 32 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325

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  10. 서열번호 3의 가변 중쇄 도메인(VH)을 포함하고,
    서열번호 15 또는 서열번호 23의 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 CDCP1에 특이적으로 결합하는 항체.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서,
    중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
    경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 15인 것을 특징으로 하는 항체.
  13. 제10항에 있어서,
    중쇄 가변 도메인(VH)이 서열번호 3이고,
    경쇄 가변 도메인(VL)이 서열번호 23인 것을 특징으로 하는 항체.
  14. 제10항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 인간 IgG1 서브클래스 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  15. 제10항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 Asn297에서 당 사슬로 글리코실화되어, 상기 당 사슬 내의 푸코오스 양이 65% 이하인 것을 특징으로 하는 항체.
  16. 제10항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체를 포함하는 암의 치료를 위한 약학적 조성물.
  17. 제10항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료를 위한 항체.
  18. 삭제
  19. 제10항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항체를 코딩하는 핵산.
  20. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 제19항에 따른 핵산을 발현시킬 수 있는, 제19항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  21. 제20항에 따른 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
  22. 제10항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 재조합 인간화 항체의 제조 방법으로서, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 상기 재조합 인간화 항체를 엔코딩하는 핵산을 발현시키는 단계 및 상기 세포 또는 세포 배양 상등액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 특징으로 하는 제조 방법.
  23. 제22항의 방법에 의해 수득되는 항체.
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