KR101470888B1

KR101470888B1 - 곰취 발효물을 함유하는 간 보호용 조성물

Info

Publication number: KR101470888B1
Application number: KR1020130162595A
Authority: KR
Inventors: 유근형; 이선엽; 양현모; 함영안; 최정민; 박가희; 이민정; 이수응; 이용진
Original assignee: 재단법인춘천바이오산업진흥원
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2014-12-15

Abstract

본 발명은 곰취 추출물에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 접종하여 배양시킨 곰취 발효물을 함유하는 간 보호 및 간 기능 개선용 식품 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 곰취 추출물에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 접종하여 배양시킨 곰취 발효물을 함유하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

Description

곰취 발효물을 함유하는 간 보호용 조성물{Composition for liver protection containing the fermented extract of Ligularia fischeri}

본 발명은 간 보호용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 곰취 발효물을 함유하는 간 보호용 조성물에 관한 것이다.

간은 영양분의 대사 및 저장, 혈류량 조절과 방어, 유해 물질의 해독 등을 담당하는 종합적인 화학공장이라고 할 수 있다. 특히 외부에서 체내로 유입되는 대부분의 약물 및 화학물질은 간에서 대사되며 때문에 간은 이들 물질을 해독할 수 있는 효소 시스템(cytochrome P450)의 활성이 높다. 간세포로 약물 및 화학물질이 유입될 경우 세포의 cytochrome P450 효소는 이러한 화합물을 수용성 유도체로 전환시켜 체외로 쉽게 배설될 수 있게 한다. 그러나 이러한 생체 내 변화(biotransformation)는 유입된 화합물을 보다 반응성이 큰 물질로 전환시켜 오히려 세포를 공격하여 독성을 유발하는 과정으로 진행될 수도 있다(Park BK, et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 45:177-202, 2005). 이와 같은 작용으로 인하여 활성산소종(reactive oxygen species; ROS)이 과량 생성될 수 있고 반응성이 큰 자유 라디칼(free radical)은 세포내 소기관 및 구성 분자들을 공격하여 산화적 스트레스를 유발하고 세포의 손상 및 질환을 야기할 수 있다. 위와 같은 독특한 대사 작용으로 인하여 간은 약물 및 화학물질에 의한 산화적 스트레스에 노출될 가능성이 큰 기관이다.

간질환은 과도한 스트레스, 음주, 흡연 및 약물에 의해 빈번히 일어나고 있으며, 인체에 치명적인 위험을 가하므로 사회적으로 지대한 관심의 대상이 되고 있다. 간질환은 일반적으로 간조직의 섬유화가 간경화 진행된 다음 최종적으로 간암으로 발전되는 일련의 과정을 거치게 되며, 바이러스성 간질환, 알코올성 간질환, 약물 독성에 의한 간질환, 간 조직에 지방이 축적되는 지방간, 면역계통의 이상으로 인한 자가 면역성간질환, 독성물질의 과대한 축적에 의한 대사성간질환 등 다양한 원인에 의해서 나타난다.

간과 관련된 여러 질환들을 감별하기 위해서는 몇 가지 생화학적 검사들을 종합적으로 해석하는 것이 필요한데, 이를 위하여 몇 검사 항목들을 묶어 간 기능 검사로 통칭한다. 주요 검사로는 AST, ALT, ALP, GGT 등이 있고, 이외에도 총 단백질, 알부민, 젖산탈수소효소(LDH; lactate dehydrogenase), 암모니아 등의 항목을 더하여 검사하는 경우도 많다.

AST(aspartate aminotransferase, 아스파르테이트 아미노전이요소)와 ALT(alanine aminotransferase, 알라닌 아미노전이요소)는 간세포 내에 존재하는 효소들로 주로 간세포가 손상을 받는 경우에 혈중으로 방출되어 혈중 수치가 증가하게 된다. 급성 간세포 손상 초기에는 간세포 내 농도가 높은 AST가 ALT보다 더 많이 증가하지만 24~48시간 뒤에는 반감기가 더 긴 ALT가 더 높아진다. 다만 알코올성 간염에서는 AST가 더 증가한다. 만성 간세포 손상에서는 ALT가 더 높은 경우가 흔하다. 그 외에 약물 복용, 비알코올성 지방간, 비만 등에서도 만성적으로 높아져 있을 수 있다.

ALP(alkaline phosphatase, 알칼리성 인산분해효소)는 간세포 내의 쓸개관(담관)에 존재하는 효소로, 주로 쓸개즙(담즙) 배설 장애에서 빠르게 상승한다.

GGT(gamma(γ)-glutamyl transferase, 감마-글루타밀전이효소)는 간세포 내 쓸개관(담관)에 존재하는 효소로 ALP와 함께 쓸개즙(담즙) 배설 장애를 판단하는 데에 사용된다. 만성 음주자에서도 상승할 수 있다.

LDH(lactate dehydrogenase)는 심장질환, 간질환, 악성종양 및 백혈병, 용혈성 및 악성빈혈 등에서 증가하며, 급성간염에서 AST, ALT와 동일하게 간세포로부터 유리되어 증가하고 황달을 동반한 독성간염에서 약 10배 정도 증가하는 것으로 알려졌다.

한편, 천연물로부터 인간의 질병을 예방·치료할 수 있는 신물질의 탐색은 과거부터 많은 과학자들의 연구대상이 되어왔다. 이와 같은 천연 자원의 개발로 현재 사용되고 있는 의약품의 50% 이상이 천연물로부터 유래되었으며 미국 FDA로부터 승인된 의약품이 120종으로 시장규모는 약 10조 달러에 이르고 있다. 항 간독성 활성을 갖는 천연물의 탐색 및 개발도 많이 이루어지고 있으나 실제 치료제로 사용중이거나 임상시험을 거친 예는 소수에 불과하다(Thabrew MI and Hughes RD., Phytother. Res., 10:461-467, 1996).

간 건강에 도움을 주는 개별인정형 기능성 원료로는 밀크씨슬추출물, 브로콜리스프라우트분말, 표고버섯균사체, 표고버섯균사체추출물, 복분자추출분말이 있고 알코올성 손상으로부터 간 보호에 도움을 주는 기능성 원료는 헛개나무과병 추출물과 유산균발효다시마 추출물이 있다(식품의약품안전처, 2013).

또한, 간 보호용 조성물에 대한 종래기술로는 대한민국 등록특허 제 10-0477957호(구기자로부터 분리된 간 보호 활성을 갖는 신규 피롤유도체 및 이를 함유한 조성물), 대한민국 등록특허 제10-0633851호(가열건조처리된 산마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 보호 또는 간질환의 예방 및 치료용 조성물), 대한민국 등록특허 제10-1106499호(헛개나무 어린가지 추출물을 포함하는 간 보호 효과용 식품 조성물) 등이 있다.

한편, 곰취는 국화과(Compositae)의 넓은 잎을 특징으로 하는 취의 일종으로 일본, 중국, 동부 시베리아 등지에서 자생하고 우리나라에서는 주로 전국의 깊은 산 고원지대에서 자생하고 있으며, 최근에는 강원도 지역 위주로 인공재배가 이루어지고 있다. 곰취는 어린잎이 식용으로 사용되어 나물 무침이나 쌈, 혹은 녹즙의 형태로 광범위하게 섭취되고 있다. 곰취는 각종 비타민과 미네랄을 함유하고 있어서, 다른 채소류에 비해 비교적 높은 영양소 함량을 보인다(Cho and Kim, 2005). 곰취는 예로부터 기침, 가래, 다리 아픔, 요통, 두통, 백일해, 천식에 효험을 나타내며, 혈액순환을 활발하게 한다고 알려져 있다. 민간에서는 황달, 고혈압, 간장병에 사용했으며, 전염성피부병과 고름집에 잎을 찧어 붙이곤 했다. Bae 등(2009)과 Ham 등(1998)은 곰취 추출물을 이용하여 암세포에 대한 증식억제효과를 확인하였고, 항돌연변이성 및 유전독성억제 효과 등을 규명하였다.

본 발명의 발명자들은 곰취의 활용가치를 높이고, 유산균을 이용한 발효로 곰취의 간 보호 활성을 높이기 위하여 예의연구한 결과 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.

본 발명은 인체 독성이 없으며, 총 폴리페놀 함량이 높아 항산화 활성이 우수하고, 이에 따라 D-GalN(D-Galactosamine), 에탄올 및 지방산으로 의해 증가된 GGT(gamma(γ)-glutamyl transferase), AST(aspartate aminotransferase), LDH(lactate dehydrogenase), ALT(alanine aminotransferase) 활성을 효과적으로 감소시킬 수 있는 간 보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 지방축적 억제효과도 우수하고, SOD(superoxide dismutase) 활성을 증가시키며 지질의 산화를 억제시킴으로써 D-GaIN, 에탄올 및 지방산으로 인한 간 손상을 효과적으로 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 간 보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곰취 발효물을 함유하는 것을 특징으로 하는 간 보호 및 간 기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 곰취 발효물을 함유하는 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 곰취 발효물이 곰취 추출물에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 접종하여 배양시킨 것을 특징으로 한다.

본 발명은 곰취 발효물을 함유하는 간 보호용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 곰취 추출물에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 접종하여 배양시킨 곰취 발효물을 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 곰취 발효물은 곰취 추출물에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 접종하여 배양한 것인데, 바람직하게는 곰취 추출물에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 0.01 ~ 2% 접종하여 25±5℃에서 70 ~ 74시간 동안 배양한 것이 좋다. 이때, 배양온도가 상기 범위보다 높아지면 배양 중 생균수가 감소하여 배양에 적합하지 않다.

또한, 본 발명의 곰취 추출물의 추출방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 곰취의 잎을 깨끗하게 세척하고 건조한 후 분쇄한 분쇄물에 2배 내지 20배, 바람직하게는 약 5배 내지 15배의 물을 용매로 70 ~ 90℃, 바람직하게는 80℃ 추출온도에서 환류 냉각 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 초고압 추출 등의 추출방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 동결건조하여 수득 가능하다.

본 발명의 곰취 발효물은 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)에 의한 발효에 의하여 곰취 추출물에 비하여 총 폴리페놀 함량이 대폭 증가하며, 이에 따라 항산화 효과도 대폭 증가한다. 또한, 본 발명의 곰취 발효물은 D-GalN(D-Galactosamine), 에탄올 및 지방산으로 의해 증가된 GGT(gamma(γ)-glutamyl transferase), AST(aspartate aminotransferase), LDH(lactate dehydrogenase), ALT(alanine aminotransferase) 활성을 효과적으로 감소시킬 수 있으며, 지방축적 억제효과도 매우 높다. 본 발명의 곰취 발효물은 항산화 활성을 증가시켜 D-GalN, 에탄올 및 지방산으로 인한 간 손상을 완화시키는데 매우 효과적이다.

또한, 본 발명의 곰취 발효물은 GGT, AST, ALT 및 LDH의 효소 활성을 감소시키고 SOD(superoxide dismutase) 활성을 증가시키며 지질의 산화를 억제시킴으로써 D-GaIN, 에탄올 및 지방산으로 인한 간 손상을 효과적으로 예방할 수 있다.

한편, 본 발명의 간 보호용 조성물은 간 보호 및 간 기능 개선용 식품 조성물일 수 있다. 이때, 본 발명의 곰취 발효물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 이 때, 식품 중의 상기 곰취 발효물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%로 가할 수 있다.

본 발명의 간 보호 및 간 기능 개선용 식품 조성물은 건강기능식품으로 이용될 수 있으며, 이때 정제, 캡슐제, 환제, 액제등의 형태를 포함한다. 또한, 본 발명의 간 보호 및 간 기능 개선용 식품 조성물은 건강 기능성 음료 조성물로 이용될 수 있으며, 이때, 곰취 발효물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

한편, 본 발명의 간 보호용 조성물은 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 이용될 수도 있다. 여기서 간 질환으로는 바이러스성 간질환, 알코올성 간 질환 등이 있다. 본 발명의 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 포함되는 곰취 발효물의 함량은, 예방 및 치료제의 사용방법, 복용자의 상태, 질환의 종류 및 질환의 중증 정도에 따라 바람직하게 조절하는 것이 좋다.

본 발명의 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 예방 및 치료제가 약제인 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가적으로 포함될 수 있다.

본 발명의 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUID EXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLASMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 간 질환 예방 또는 치료용 조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 이해 변화될 수 있다.

본 발명의 곰취 발효물은 인체 독성이 없으며, 총 폴리페놀 함량이 높아 항산화 활성이 우수하고, 이에 따라 D-GalN(D-Galactosamine), 에탄올 및 지방산으로 의해 증가된 GGT(gamma(γ)-glutamyl transferase), AST(aspartate aminotransferase), LDH(lactate dehydrogenase), ALT(alanine aminotransferase) 활성을 효과적으로 감소시킬 수 있어 D-GalN(D-Galactosamine), 에탄올 및 지방산으로 인한 간 손상을 효과적으로 개선, 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 곰취 발효물은 지방축적 억제효과도 우수하고, SOD(superoxide dismutase) 활성을 증가시키며 지질의 산화를 억제시킴으로써 D-GalN, 에탄올 및 지방산으로 인한 간 손상을 효과적으로 개선, 예방 또는 치료할 수 있다.

이에 본 발명의 곰취 발효물은 간 기능을 위한 건강식품분야 또는 약학분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

도 1은 곰취 열수 추출물 배지에 각각 3종의 유산균 접종 후 25℃에서 72시간 배양하면서 24시간마다 pH 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 곰취 열수 추출물 배지에 각각 3종의 유산균 접종 후 37℃에서 72시간 배양하면서 24시간마다 pH 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 곰취 열수 추출물 배지에 각각 3종의 유산균을 접종하여 25℃에서 72시간 배양하면서 24시간마다 생균수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 곰취 열수 추출물 배지에 각각 3종의 유산균을 접종하여 37℃에서 72시간 배양하면서 24시간마다 생균수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 HPLC 분석법에 의한 카페오일퀴닉산(CQA, caffeoylquinic acid) 표준품의 검량선이다.
도 6은 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 카페오일퀴닉산(CQA)의 HPLC 크포마토그램이다. A: 카페오일퀴닉산, B : 곰취 열수 추출물(1mg/mL), C : 곰취 열수 추출 발효물(1mg/mL)
도 7은 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물을 24 시간 처리하였을 경우 처리농도에 따른 RAW 264.7 세포의 생존율을 나타낸다. Normal : 무처리, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml), LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml), LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml)
도 8은 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물을 48 시간 처리하였을 경우 처리농도에 따른 RAW 264.7 세포의 생존율을 나타낸다. Normal : 무처리, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml), LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml), LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml)
도 9는 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물을 24 시간 처리하였 경우 처리농도에 따른 Hep G2 세포의 생존율을 나타낸다. Normal : 무처리, LA-10 : 곰취 열수 추출물(10㎍/ml), LA-50 : 곰취 열수 추출물(50㎍/ml), LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml), LA-300 : 곰취 열수 추출물(300㎍/ml), LAF-10 : 곰취 열수 추출 발효물(10㎍/ml), LAF-50 : 곰취 열수 추출 발효물(50㎍/ml), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml), LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml)
도 10은 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물을 48 시간 처리하였 경우 처리농도에 따른 Hep G2 세포의 생존율을 나타낸다. Normal : 무처리, LA-10 : 곰취 열수 추출물(10㎍/ml), LA-50 : 곰취 열수 추출물(50㎍/ml), LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml), LA-300 : 곰취 열수 추출물(300㎍/ml), LAF-10 : 곰취 열수 추출 발효물(10㎍/ml), LAF-50 : 곰취 열수 추출 발효물(50㎍/ml), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml), LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml)
도 11은 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 총 폴리페놀 함량이다. LA : 곰취 열수 추출물, LAF : 곰취 열수 추출 발효물
도 12는 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 ABTS 라디칼 소거능이다. LA : 곰취 열수 추출물, LAF : 곰취 열수 추출 발효물
도 13은 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 DPPH 라디칼 소거능이다. LA : 곰취 열수 추출물, LAF : 곰취 열수 추출 발효물
도 14는 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 NO 소거능이다. Normal : 무처리, Control : 1㎍/ml LPS, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 1㎍/ml LPS, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 1㎍/ml LPS, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 1㎍/ml LPS, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 1㎍/ml LPS, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 1㎍/ml LPS, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 1㎍/ml LPS
도 15는 30mM D-GalN이 처리된 Hep G2 세포에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 GGT 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : 30mM D-GalN, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 30mM D-GalN, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 30mM D-GalN, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 30mM D-GalN, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 30mM D-GalN, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 30mM D-GalN, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 30mM D-GalN
도 16은 30mM D-GalN이 처리된 Hep G2 세포에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 AST 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : 30mM D-GalN, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 30mM D-GalN, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 30mM D-GalN, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 30mM D-GalN, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 30mM D-GalN, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 30mM D-GalN, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 30mM D-GalN
도 17은 30mM D-GalN이 처리된 Hep G2 세포에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 LDH 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : 30mM D-GalN, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 30mM D-GalN, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 30mM D-GalN, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 30mM D-GalN, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 30mM D-GalN, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 30mM D-GalN, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 30mM D-GalN
도 18은 5% 에탄올이 처리된 Hep G2 세포에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 GGT 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : 5% 에탄올, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 5% 에탄올, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 5% 에탄올, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 5% 에탄올, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 5% 에탄올, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 5% 에탄올, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 5% 에탄올
도 19는 5% 에탄올이 처리된 Hep G2 세포에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 AST 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : 5% 에탄올, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 5% 에탄올, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 5% 에탄올, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 5% 에탄올, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 5% 에탄올, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 5% 에탄올, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 5% 에탄올
도 20은 5% 에탄올이 처리된 Hep G2 세포에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 LDH 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : 5% 에탄올, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 5% 에탄올, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 5% 에탄올, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 5% 에탄올, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 5% 에탄올, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 5% 에탄올, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 5% 에탄올
도 21은 800μM 지방산이 처리된 Hep G2 세포에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 GGT 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : 800μM 지방산, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 800μM 지방산, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 800μM 지방산, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 800μM 지방산
도 22는 800μM 지방산이 처리된 Hep G2 세포에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 AST 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : 800μM 지방산, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 800μM 지방산, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 800μM 지방산, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 800μM 지방산
도 23은 800μM 지방산이 처리된 Hep G2 세포에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 LDH 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : 800μM 지방산, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 800μM 지방산, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 800μM 지방산, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 800μM 지방산
도 24은 800μM 지방산이 처리된 Hep G2 세포에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 지질축적율을 나타낸다. Normal : 무처리, Control : 800μM 지방산, LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 800μM 지방산, LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 800μM 지방산, LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 800μM 지방산, LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 800μM 지방산
도 25는 800μM 지방산이 처리된 Hep G2 세포에서 축적된 지질의 현미경 사진이다. (A) Normal : 무처리, (B) LA-100 : 곰취 열수 추출물(100㎍/ml) + 800μM 지방산, (C) LA-200 : 곰취 열수 추출물(200㎍/ml) + 800μM 지방산, (D) LA-300: 곰취 열수 추출물(300㎍/ml) + 800μM 지방산, (E) Control : 800μM 지방산, (F) LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100㎍/ml) + 800μM 지방산, (G) LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200㎍/ml) + 800μM 지방산, (H) LAF-300: 곰취 열수 추출 발효물(300㎍/ml) + 800μM 지방산
도 26은 D-GalN 유도 모델에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 GGT 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : D-GalN 처리(2ml/kg, 체중당), LA-100 : 곰취 열수 추출물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-400: 곰취 열수 추출물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-400: 곰취 열수 추출 발효물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당)
도 27은 D-GalN 유도 모델에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 AST 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : D-GalN 처리(2ml/kg, 체중당), LA-100 : 곰취 열수 추출물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-400: 곰취 열수 추출물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-400: 곰취 열수 추출 발효물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당)
도 28은 D-GalN 유도 모델에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 ALT 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : D-GalN 처리(2ml/kg, 체중당), LA-100 : 곰취 열수 추출물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-400: 곰취 열수 추출물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-400: 곰취 열수 추출 발효물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당)
도 29는 D-GalN 유도 모델에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 LDH 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : D-GalN 처리(2ml/kg, 체중당), LA-100 : 곰취 열수 추출물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-400: 곰취 열수 추출물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-400: 곰취 열수 추출 발효물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당)
도 30은 D-GalN 유도 모델에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 동맥경화지수(AI)를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : D-GalN 처리(2ml/kg, 체중당), LA-100 : 곰취 열수 추출물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-400: 곰취 열수 추출물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-400: 곰취 열수 추출 발효물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당)
도 31은 D-GalN 유도 모델에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 HTR를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : D-GalN 처리(2ml/kg, 체중당), LA-100 : 곰취 열수 추출물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-400: 곰취 열수 추출물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-400: 곰취 열수 추출 발효물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당)
도 32는 D-GalN 유도 모델에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 SOD 활성 효과를 나타낸다. Normal : 무처리, Control : D-GalN 처리(2ml/kg, 체중당), LA-100 : 곰취 열수 추출물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-400: 곰취 열수 추출물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-400: 곰취 열수 추출 발효물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당)
도 33은 D-GalN 유도 모델에서 곰취 열수 추출물과 곰취 열수 추출 발효물의 처리에 따른 MDA함량을 나타낸다. Normal : 무처리, Control : D-GalN 처리(2ml/kg, 체중당), LA-100 : 곰취 열수 추출물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-200 : 곰취 열수 추출물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LA-400: 곰취 열수 추출물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-100 : 곰취 열수 추출 발효물(100mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-200 : 곰취 열수 추출 발효물(200mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당), LAF-400: 곰취 열수 추출 발효물(400mg/kg, 체중당) + D-GalN(2ml/kg, 체중당)
도 34는 간 조직 병리학적 분석결과로, 정상식이군의 광학현미경 관찰결과를 나타낸다(A : H&E 염색 × 200, B : MT 염색 × 200).
도 35는 간 조직 병리학적 분석결과로, 대조군과 곰취 열수 추출물 투여군의 광학현미경 관찰결과를 나타낸다(H&E 염색 × 200). A : 대조군(D-GalN 처리 2ml/kg, 체중당), B : LA-100(곰취 열수 추출물 100mg/kg, 체중당 + D-GalN 2ml/kg, 체중당), C : LA-200(곰취 열수 추출물 200mg/kg, 체중당 + D-GalN 2ml/kg, 체중당), D : LA-400(곰취 열수 추출물 400mg/kg, 체중당 + D-GalN 2ml/kg, 체중당)
도 36는 간 조직 병리학적 분석결과로, 대조군과 곰취 열수 추출 발효물 투여군의 광학현미경 관찰결과를 나타낸다(H&E 염색 × 200). A : 대조군(D-GalN 처리 2ml/kg, 체중당), B : LAF-100(곰취 열수 추출 발효물 100mg/kg, 체중당 + D-GalN 2ml/kg, 체중당), C : LAF-200(곰취 열수 추출 발효물 200mg/kg, 체중당 + D-GalN 2ml/kg, 체중당), D : LAF-400(곰취 열수 추출 발효물 400mg/kg, 체중당 + D-GalN 2ml/kg, 체중당)

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실험예 1 : 곰취 열수 추출물의 발효를 위한 유산균의 선정

곰취 열수 추출물의 발효능 평가를 위해 속슬렛 추출장치(MS-EAM,MISUNG, Yangju, Korea)를 이용하여 곰취 분말 시료에 10배의 증류수를 가하고 80℃에서 8시간 환류냉각하여 곰취를 열수 추출하였다. 곰취 열수 추출물을 5,000rpm에서 30분간 원심분리 하고 와트만 No. 1 필터를 이용하여 여과하였으며, 4N NaOH를 이용하여 pH를 7.0으로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균하여 사용하였다. 멸균 후 25℃ 및 37℃까지 냉각한 후 MRS broth에 2회 이상 계대배양 한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K8 (KCTC 10887BP), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) IDCC 3302 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) IDCC 3201를 각각의 곰취 열수 추출물 배지에 1%씩 접종하고 25℃ 및 37℃에서 72시간 배양하면서 경시적으로 pH 및 생균수를 측정하였다.

여기서, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K8 (KCTC 10887BP), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) IDCC 3302 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) IDCC 3201는 일동후디스(주)로부터 공급받아 MRS broth (Difco)에 3회 이상 계대 배양한 후, 3,000rpm에서 20분간 원심분리를 실시하고 cell pellet에 glycerol(Sigma) 및 skim milk(Sigma)가 함유된 MRS broth를 혼합하고 vial에 1mL씩 분주하여 -80℃ deep-freezer(Thermo)에 보관하면서 본 실험에 사용하였다.

도 1은 곰취 열수 추출물 배지에 각각 3종의 유산균 접종 후 25℃에서 배양하면서 24시간마다 pH 변화를 측정한 결과를 나타낸다. 이에 의하면, 배양 24시간에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 접종한 배지에서 pH 4.9로 가장 낮게 나타났으며, 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophils) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)를 접종한 배지의 경우에는 pH 5.8 및 5.7로 나타났다.

도 2는 곰취 열수 추출물 배지에 각각 3종의 유산균 접종 후 37℃에서 배양하면서 24시간마다 pH 변화를 측정한 결과를 나타낸다. 이에 의하면, 25℃에서와 동일하게 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 접종한 배지에서 pH 4.9로 가장 낮게 나타났으며, 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)를 접종한 배지의 경우에는 25℃와 비교하여 pH가 5.4 및 5.3로 다소 낮게 나타났으나 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)에 비해서는 높게 나타났다.

도 3은 곰취 열수 추출물 배지에 각각 3종의 유산균을 접종하여 25℃에서 72시간 배양하면서 24시간마다 생균수를 측정한 결과를 나타낸다. 이에 의하면, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)의 경우 배양 24시간에 생균수가 급격하게 증가하여 배양 72시간까지 높은 생균수를 유지하는 것으로 나타났으나, 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)의 경우 곰취 열수 추출물 배지 내에서 거의 생장을 하지 못한 것으로 나타났다.

도 4는 곰취 열수 추출물 배지에 각각 3종의 유산균을 접종하여 37℃에서 72시간 배양하면서 24시간마다 생균수를 측정한 결과를 나타낸다. 이에 의하면, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)의 경우 배양 24시간에 급격하게 생균수가 증가하였고 그 후 서서히 생균수가 감소하는 것으로 나타났으며, 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus)의 경우 배양 48시간에 생균수가 증가하여 배양 72시간까지 생균수를 유지하였으며, 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)의 경우 배양 24시간에 생균수가 증가하여 배양 72시간까지 생균수를 유지하는 것으로 나타났다.

이상 종합하면, 저온에서 생장이 우수하고 식물로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)이 곰취 열수 추출물의 발효에 적합한 것으로 판단되었다.

실시예 : 곰취 열수 추출 발효물의 제조

속슬렛 추출장치를 이용하여 곰취 분말 시료에 10배의 증류수를 가하고 80℃에서 8시간 환류냉각 추출한 후 5,000rpm에서 30분간 원심분리 하였다. 와트만 No. 1 필터를 이용하여 여과한 후 4N NaOH를 이용하여 pH를 7.0으로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균하였으며, MRS broth (Difco)에 2회 이상 계대배양한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)를 1% 접종하고 25℃에서 72시간 배양하였다. 발효한 시료를 5,000rpm에서 30분간 원심분리한 후 와트만 No. 1 필터를 이용하여 여과하였으며, 감압농축(N-1110, EYELA, Tokyo, Japan) 후 동결건조(PVTF20R, ILSHINBIOBASE, Dongduchun, Korea)하여 곰취 열수 추출 발효물을 최종 수득하였으며, 수율은 25.47±1.16(%)였다. .

비교예 : 곰취 열수 추출물의 제조

속슬렛 추출장치를 이용하여 곰취 분말 시료에 10배의 증류수를 가하고 80℃에서 8시간 환류냉각 추출한 후 5,000rpm에서 30분간 원심분리 하였다. 와트만 No. 1 필터를 이용하여 여과한 후 감압농축(N-1110, EYELA, Tokyo, Japan)하고 동결건조(PVTF20R, ILSHINBIOBASE, Dongduchun, Korea)하여 곰취 열수 추출물을 최종 수득하였으며, 수율은 26.27±1.65였다.

실험예 2 : 곰취 열수 추출 발효물 및 곰취 열수 추출물의 HPLC 분석

실시예의 곰취 열수 추출 발효물과 비교예의 곰취 열수 추출물을 PBS을 이용하여 1mg/mL 농도로 용해한 후 10분 동안 초음파 처리하고 4,000rpm에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 0.45μm 시린지 필터로 여과 후 분석시료로 사용하였다. 5종의 카페오일퀴닉산(caffeoylquinic acid) 분석을 위해 4-O-caffeoylquinic acid (4CQA), 5-O-caffeoylquinic acid (5CQA),3,4-di-O-caffeoylquinic acid(3,4DCQA), 3,5-di-O-caffeoylquinic acid (3,5DCQA) 및 4,5-di-O-caffeoylquinic acid(4,5DCQA) 표준품은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 社로부터 구매하여 사용하였다.

정량을 위한 검량선을 작성하기 위해 각 표준물질이 100ug/mL이 되도록 혼합 후 희석하여 5, 10, 25㎍/mL 농도로 제작하여 이용하였다. HPLC 분석조건은 하기 표 1과 같이 시행하였으며, 분석에 사용한 HPLC는 UFLC LC-20AD (Shimadzu, Japan)를 사용하였고 검출기는 UV/VIS SPD-20A를 이용하여 실시예와 비교예의 곰취 열수 추출 발효물 및 곰취 열수 추출물 내 5종의 카페오일퀴닉산(caffeoylquinic acid) 함량을 분석하였다.

도 5는 카페오일퀴닉산(CQA, caffeoylquinic acid) 표준품의 검량선이다. 이에 의하면, 각 카페오일퀴닉산의 상관계수(R2)가 0.999이상으로 나타나 높은 직선성을 나타냄을 알 수 있었다.

도 6은 실시예와 비교예의 곰취 열수 추출 발효물과 곰취 열수 추출물의 카페오일퀴닉산(CQA)의 HPLC 크포마토그램이다. 이에 의하면, 30분이내에 5종의 CQA가 완전히 분리되어 나오는 확인할 수 있었으며, 용리순서는 5CQA, 4CQA, 4,5DCQA, 3,5DCQA, 3,4DQCA의 순으로 용리되었으며, 각 피크의 선택성이 좋아 각 표준물질에 대한 분석이 가능한 것으로 나타났다. 또한, 발효물과 열수 추출물 간의 성분 검출 패턴은 거의 유사한 것으로 나타났으나, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 발효에 의해 곰취 열수 추출물에서 검출되는 4번 피크가 곰취 열수 추출 발효물에서는 소실된 것으로 나타났다.

표 2는 실시예와 비교예의 곰취 열수 추출 발효물과 곰취 열수 추출물의 5종의 CQA의 함량을 나타낸다. 이에 의하면, 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 에 의한 발효에 의해 모든 CQA가 유의적으로 증가하였으며, 특히 5CQA, 3,4DCQA 및 4,5DCQA의 경우 곰취 열수 추출물과 비교하여 곰취 열수 추출 발효물에서 약 2.0배 증가하는 것으로 나타났다.

실험예 3 : 곰취 열수 추출 발효물의 세포독성 평가

< RAW 264.7 cell에 대한 세포독성 >

곰취 열수 추출 발효물의 세포독성 평가를 위해 RAW 264.7 cell (ATCC^®TIB-71^TM)을 구입하여 사용하였다. RAW 264.7 cell을 24 웰 플레이트(well plate)에 2.0×10⁵cells/well 농도로 접종(seeding)하고 24시간 동안 CO₂인큐베이터에서 배양한 후 PBS를 이용하여 세포를 2회 세척(washing)하였으며, 0.2μm 시린지 필터(PALL, USA)로 여과하여 각각의 농도로 희석한 곰취 열수 추출 발효물과 곰취 열수 추출물을 500μL씩 24 웰 플레이트에 분주하고 24 및 48시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 추가 배양하였다. 배양 24 및 48시간에 CCK-8 (Dojindo, Japan)를 50μL씩 24 웰 플레이트에 분주한 후 CO₂ 인큐베이터에서 4시간 배양하고 450nm에서 ELISA reader (Molecular devise, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

도 7은 실시예와 비교예의 곰취 열수 추출 발효물과 곰취 열수 추출물을 24 시간 처리하였 경우 RAW 264.7 cell의 생존율을 나타낸다. 이에 의하면, 곰취 열수 추출물 및 발효물을 24시간 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

도 8은 실시예와 비교예의 곰취 열수 추출 발효물과 곰취 열수 추출물을 48 시간 처리하였 경우 RAW 264.7 cell의 생존률을 나타낸다. 이에 의하면, 곰취 열수 추출물을 250 및 500㎍/mL 농도로 48시간 처리하였을 때 RAW 264.7 cell의 생존률이 다소 감소하는 것으로 나타났으나 유의성은 없는 것으로 나타났으며(p>0.05), 곰취 열수 추출 발효물의 경우 모든 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

< Hep G2 cell에 대한 세포독성 >

곰취 열수 추출 발효물의 세포독성 평가를 위해 Hep G2 cell (ATCC^®HB-8065^TM)을 구입하여 사용하였다. Hep G2 cell을 24 웰 플레이트에 2.0×10⁵ cells/well 농도로 접종하고 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 PBS를 이용하여 세포를 2회 세척하였으며, 0.2μm 시린지 필터 (PALL, USA)로 여과하여 각각의 농도로 희석한 곰취 열수 추출물과 발효물을 500μL씩 24 웰 플레이트에 분주하고 24 및 48시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 추가 배양하였다. 배양 24 및 48시간에 CCK-8 (Dojindo, Japan)를 50μL씩 24 웰 플레이트에 분주한 후 CO₂인큐베이터에 4시간 배양하고 450nm에서 ELISA reader (Molecular devise, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

도 9은 실시예와 비교예의 곰취 열수 추출 발효물과 곰취 열수 추출물을 24 시간 처리하였 경우 Hep G2 cell의 생존율을 나타낸다. 이에 의하면, 곰취 열수 추출물 및 발효물을 24시간 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

도 10은 실시예와 비교예의 곰취 열수 추출 발효물과 곰취 열수 추출물을 48 시간 처리하였을 경우 Hep G2 cell의 생존률을 나타낸다. 이에 의하면, 곰취 열수 추출물 및 발효물을 48시간 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다.

이상 종합하면, 곰취 열수 추출 발효물을 각종 식품소재나 기능성 원료로 사용이 가능할 것으로 판단되었다.

실험예 4 : 곰취 열수 추출 발효물의 총 폴리페놀 함량

실시예와 비교예의 곰취 열수 추출 발효물과 곰취 열수 추출물을 각각 3차 증류수에 1mg/mL 농도로 용해하고 0.2μm 시린지 필터(PALL, USA)를 이용하여 여과한 후 96 웰 플레이트(SPL Life sciences)에 20μL 분주하고 Folin & Ciocalteu's phenol reagent (Sigma)를 20μL 첨가한 후 10% Na₂CO₃ (Sigma)를 20μL 첨가하였다. 96 웰 플레이트에 140μL의 3차 증류수를 가하고 상온에서 1시간 반응시킨 후 700nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀의 함량은 tannic acid (Sigma)를 이용하여 검량선을 작성하고 700nm에서 측정한 흡광도 값을 대입하여 총 폴리페놀의 함량을 산출하였으며, 그 결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 의하면, 총 폴리페놀 함량이 곰취 열수 추출물의 경우 41.45mg/g이었으며, 곰취 열수 추출 발효물의 경우 124.31mg/g으로, 곰취 열수 추출 발효물은 곰취 열수 추출물과 비교하여 총 폴리페놀 함량이 약 3배 이상 증가한 것으로 나타났다.

실험예 5 : 곰취 열수 추출 발효물의 항산화 활성

< ABTS 라디칼 소거능 >

7mM ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid, 5mL)와 140mM Potassium peroxodisulfate(88μL)를 혼합 후 빛이 차단된 실온에서 하루 이상 방치하여 양이온 라디칼을 안정화 시킨 후 스톡 솔루션(stock solution)으로 사용하였다. 스톡 솔루션을 에탄올로 희석(1 : 88) 후, 734nm에서 흡광도가 0.70 ± 0.02가 되도록 조절하여 ABTS 용액을 제조하였다. ABTS 라디칼 소거능 측정을 위해 ABTS 용액 150μL 및 0.2μm 시린지 필터(PALL, USA)로 여과하여 각각의 농도로 희석한 실시예와 비교예의 곰취 열수 추출 발효물과 곰취 열수 추출물을 150μL씩 혼합하여 10분간 반응시킨 후 734nm에서 흡광도 측정하였으며, 그 결과는 도 12에 나타내었다.

도 12에 의하면, 곰취 열수 추출물 보다 곰취 열수 추출 발효물이 높은 ABTS 라디칼 소거능을 보였다. 추출물의 농도가 10, 50 및 100μg/mL의 범위에서 곰취 열수 추출물은 각각 11.99, 53.69, 91.99%의 소거율을 보였고, 곰취 열수 추출 발효물은 각각 16.56, 77.44, 97.95%로 곰취 열수추출물과 비교하여 유의하게 증가하였다(p<0.05).

< DPPH 라디칼 소거능 >

DPPH 라디칼 소거활성은 Brand-Williams 등의 방법을 응용하였다. 150μM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)용액 100μL와 각각의 농도로 희석한 곰취 열수 추출 발효물 100μL을 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 13에 나타내었다.

도 13에 의하면, 상기 ABTS 라디칼 소거능을 비교한 결과와 유사하게 곰취 열수 추출 발효물이 곰취 열수 추출물과 비교하여 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였다.

< NO 소거능 >

24 웰 플레이트에서 2.5×10⁵ cells/well 농도로 RAW 264.7 cell을 접종하고 18시간 동안 배양한 후 각각의 웰에 LPS 및 0.2μm 시린지 필터(PALL, USA)로 여과하여 각각의 농도로 희석한 곰취 열수 추출물과 발효물을 처리하고 24시간 동안 CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 상등액을 96 웰 플레이트에 50㎕씩 분주하고 Griess reagent kit (Promega)을 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO 함량은 아질산염(nitrite) 표준곡선을 작성하고 540nm에서 측정한 흡광도 값을 대입하여 NO 함량을 산출하였으며, 그 결과는 도 14에 나타내었다.

도 14에 의하면, LPS를 처리하지 않은 정상군과 비교하여 대조군의 경우 유의하게 NO가 증가하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물의 경우 300μg/mL 농도에서 유의하게 NO 생성이 억제되는 것으로 나타났으나(p<0.05), 곰취 열수 추출발효물의 경우 모든 처리 농도에서 유의하게 NO 생성이 억제되는 것으로 나타났다(p<0.05).

실험예 6 : Hep G2 cell을 이용한 곰취 열수 추출 발효물의 간세포 보호효과

< D-GalN 간독성에 대한 곰취 열수 추출 발효물의 간세포 보호효과 >

Hep G2 cell을 24 웰 플레이트에 2.0×10⁵ cells/well 농도로 접종하고 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 PBS를 이용하여 세포를 2회 세척하였으며, 0.2μm 시린지 필터(PALL, USA)로 여과한 후 각각의 농도로 희석한 곰취 열수 추출물 및 발효물을 500μL씩 24 웰 플레이트에 분주하고 48시간 동안 CO₂인큐베이터에서 추가 배양하였다. 배양 48시간에 PBS를 이용하여 cell을 2회 세척하고 DMEM (Invitrogen, USA)에 희석한 30mM D-GalN을 500μL씩 24 웰 플레이트에 분주한 후 CO₂ 인큐베이터에서 48시간 배양하였다. 배양 후 웰 플레이트를 4,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 회수하고 생화학분석기(Konelab 20B, Thermo scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 AST (aspartate aminotransferase), GGT(gamma(γ)-glutamyl transferase) 및 LDH (lactate dehydrogenase)를 측정하였으며, 그 결과는 도 15 내지 17에 나타내었다.

도 15에 의하면, Hep G2 cell에 D-GalN을 처리한 대조군의 경우 정상군에 비하여 유의하게 GGT 활성이 증가하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물 200 및 300μg/mL 처리 농도에서 대조군에 비해 GGT 활성이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(p<0.05). 곰취 열수 추출 발효물의 경우 모든 농도에서 대조군에 비해 유의하게 효소의 활성이 감소하였다(p<0.05).

도 16에 의하면, 대조군의 경우 정상군과 비교하여 AST 활성이 유의하게 증가하였으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물 및 발효물의 경우 100μg/mL 농도에서 AST 활성이 증가하는 것으로 나타났다. 곰취 열수 추출물의 경우 200 및 300μg/mL 처리 농도에서 대조군과 비교하여 AST가 감소하는 경향이 나타났으며, 곰취 열수 추출 발효물의 경우 처리농도 200 및 300μg/mL에서 AST 활성이 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물에 비하여 감소폭이 높은 것으로 나타났다.

도 17에 의하면, LDH의 경우 AST와 유사한 경향을 보였으며, 곰취 열수 추출 발효물 200 및 300μg/mL 처리 농도에서 대조군과 비교하여 유의하게 LDH 활성이 감소하는 것으로 나타났다.

< 에탄올 간독성에 대한 곰취 열수 추출 발효물의 간세포 보호효과 >

Hep G2 cell을 24 웰 플레이트에 2.0×10⁵ cells/well 농도로 접종하고 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 PBS를 이용하여 세포를 2회 세척하였으며, 0.2μm 시린지 필터 (PALL, USA)로 여과한 후 각각의 농도로 희석한 곰취 열수 추출물 및 발효물을 500μL씩 24 웰 플레이트에 분주하고 48시간 동안 CO₂인큐베이터에서 추가 배양하였다. 배양 48시간에 PBS를 이용하여 cell을 2회 세척하고 DMEM (Invitrogen, USA)에 희석한 5% 에탄올을 500μL씩 24 웰 플레이트에 분주한 후 CO₂ 인큐베이터에서 48시간 배양하였다. 배양 후 웰 플레이트를 4,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 회수하고 생화학분석기(Konelab 20B, Thermo scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 AST (aspartate aminotransferase), GGT(gamma(γ)-glutamyl transferase) 및 LDH (lactate dehydrogenase)를 측정하였으며, 그 결과는 도 18 내지 20에 나타내었다.

도 18에 의하면, Hep G2 cell에 에탄올을 처리한 대조군의 경우 정상군과 비교하여 유의하게 GGT 활성이 증가하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물 300μg/mL 처리군에서 대조군과 비교하여 GGT 활성이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(p<0.05). 곰취 열수 추출 발효물의 경우 모든 처리군에서 대조군에 비해 유의하게 효소의 활성이 감소하였으며(p<0.05), 곰취 열수 추출 발효물 300μg/mL 처리군에서 GGT 활성이 가장 낮게 나타났다.

도 19에 의하면, 대조군의 경우 정상군과 비교하여 AST 활성이 유의하게 증가하였으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물 및 발효물의 경우 대조군과 비교하여 모든 처리농도에서 유의하게 AST 활성이 감소하는 것으로 나타났으며(p<0.05), GGT 측정결과와 같이 곰취 열수 추출 발효물 300μg/mL 처리군에서 AST 활성이 대조군과 비교하여 가장 낮게 나타났다(p<0.05).

도 20에 의하면, LDH의 경우 AST와 유사한 경향을 보였으며, 곰취 열수 추출물 및 발효물의 경우 모든 처리농도에서 대조군과 비교하여 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 곰취 열수 추출 발효물 300μg/mL 처리 농도에서 LDH 활성이 대조군과 비교하여 가장 낮게 나타났다(p<0.05).

< 지방산 처리에 따른 곰취 열수 추출 발효물의 간세포 보호효과 >

Sophie 등의 방법에 따라 팔미트산(Sigma, USA) 및 올레산(Sigma, USA)는 이소프로필 알코올을 이용하여 80μM 농도로 제조하고 팔미트산과 올레산을 6:4 비율로 혼합하였으며, 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, Sigma, USA)이 첨가된 DMEM(Invitrogen, USA)을 이용하여 800μM로 희석한 후 본 실험에서 지방산으로 사용하였다.

Hep G2 cell을 24 웰 플레이트에 2.0×10⁵ cells/well 농도로 접종하고 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 PBS를 이용하여 세포를 2회 세척하였으며, 0.2μm 시린지 필터(PALL, USA)로 여과한 후 각각의 농도로 희석한 곰취 열수 추출물 및 발효물을 500μL씩 24 웰 플레이트에 분주하고 48시간 동안 CO₂인큐베이터에서 추가 배양하였다. 배양 48시간에 PBS를 이용하여 cell을 2회 세척하고 800μM로 희석한 지방산을 500μL씩 24 웰 플레이트에 분주한 후 CO₂ 인큐베이터에서 48시간 배양하였다. 48시간 배양 후 웰 플레이트를 4,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 회수하고 생화학분석기(Konelab 20B, Thermo scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 GGT, AST 및 LDH를 측정하였으며, 그 결과는 도 21 내지 23에 나타내었다.

Hep G2 cell에 축적된 지방 염색을 위해 세포를 PBS를 이용하여 1회 세척하고 10% 포르말린을 각각의 웰에 500μL씩 분주하였으며, 5분 후 포르말린을 제거하였다. 포르말린 제거 후 10% 포르말린을 500μL씩 추가적으로 각각의 웰에 분주하고 하루 동안 실온에서 세포고정을 실시하였다. 세포고정 후 포르말린을 제거하고 500μL씩 60% 이소프로필 알코올을 분주하여 세포를 세척하였으며, 웰에 남아 있는 이소프로필 알코올을 완전히 건조한 후 Oil red O를 이용하여 10분간 실온에서 지방 염색을 실시하였다. 염색 후 3차 증류수를 이용하여 세포를 4회 세척하고 광학현미경(Leica, Germany)을 이용하여 염색된 지방을 관찰하였으며, 그 결과는 도 25에 나타내었다. 곰취 열수 추출 발효물의 지방축적 억제 효과를 평가하기 위해 현미경 관찰 후 웰에 95% 이소프로필 알코올을 500μL 씩 분주하고 실온에서 10분간 지방에 염색된 Oil red O를 탈색하였으며, 탈색된 Oil red O를 96 웰 플레이트에 옮겨 520nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 도 24에 나타내었다.

도 21에 의하면, 지방산 처리시 정상군과 비교하여 대조군의 경우 GGT 활성이 유의하게 증가하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물의 경우 200 및 300μg/mL 처리군에서 감소하는 것으로 나타났고 발효물의 경우 모든 처리군에서 GGT 활성이 감소하는 것으로 나타났으나 유의성은 없는 것으로 나타났다(P>0.05).

도 22에 의하면, 곰취 열수 추출물은 300μg/mL 처리군에서 유의하게 AST 활성이 감소하였으며(p<0.05), 발효물의 경우 모든 처리군에서 대조군과 비교하여 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(P<0.05).

도 23에 의하면, 곰취 열수 추출물 및 발효물에서 모든 LDH 활성이 감소하는 것으로 나타났으나, 곰취 열수 추출물의 경우 대조군과 비교하여 유의성은 없는 것으로 나타났으며, 곰취 열수 추출 발효물의 경우 200 및 300μg/mL 처리군에서 대조군과 비교하여 유의하게 감소하는 것으로 나타났다.

도 24에 의하면, 곰취 열수 추출물 및 발효물에서 지방 축적 억제효과가 있는 것으로 나타났는데, 곰취 열수 추출물의 경우 300μg/mL 처리군에서 대조군과 비교하여 유의하게 감소한 반면(p<0.05), 곰취 열수 추출 발효물의 경우 200 및 300μg/mL 처리군에서 대조군과 비교하여 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(p<0.05).

도 25에 의하면, 정상군과 비교하여 대조군에서 과도하게 지방이 축적된 것을 관찰할 수 있었으며, 곰취 열수 추출물과 발효물을 처리한 군에서는 대조군과 비교하여 지방 축적이 억제되는 것을 육안으로 확인할 수 있었으며, 특히 곰취 열수 추출 발효물의 경우 지방 축적 억제 효과가 훨씬 큰 것으로 나타났다. 곰취 열수 추출 발효물의 경우 LDH 활성이 200 및 300μg/mL 처리한 군에서 대조군과 비교하여 각각 32.0 및 48.1% 감소하는 것으로 나타나 곰취 열수 추출 발효물이 지방축적 억제효과가 높음을 확인할 수 있었다.

이상 종합하면, 곰취 열수 추출 발효물은 항산화 활성을 증가시켜 D-GalN, 에탄올 및 지방산으로 인한 간 손상을 완화시키는데 매우 효과적임을 알 수 있었다.

실험예 7 : D-GalN 간염 모델에 대한 곰취 열수 추출 발효물의 간 기능 개선

< 실험동물 사육 및 식이 >

생후 6주령의 Sprague Dawley(SD, male) Rat을 대한바이오링크(Choongbuk, Korea)로부터 분양 받아 일정한 조건(온도 22±1℃, 습도 55±3%, 명암주기 12시간)하에서 일주일간 적응기간을 거친 후 각 군당 5마리씩 정상식이군(normal), 대조군(control), 곰취 열수 추출물(체중당 100, 200, 400mg/kg) 및 곰취 열수 추출 발효물 투여군(체중당 100, 200, 400mg/kg)으로 구분하여 3주간 사육하였다. 시작일부터 3주간 매일 오전 10시에 곰취 열수 추출물 및 곰취 열수 추출 발효물을 체중당 100, 200, 400mg/kg 농도가 되도록 염분(saline)에 현탁 후 zonde를 이용하여 경구투여 하였다. 물과 식이는 임의로(ad libitum) 급이하였으며, 식이의 조성은 표 3과 같다. 본 동물실험은 (재)춘천바이오산업진흥원 동물실험윤리위원회의 승인을 거쳐 진행하였다(CBF IACUC No. 2013-004).

< 시료 채취 및 분석 >

실험 마지막 날 오전 10시에 시료를 경구투여 후 오후 2시에 saline에 용해시킨 D-GalN을 체중당 2mL/kg 용량으로 rat의 복강에 투여하고 18시간 동안 절식시켰다. 마취제로 zoletil(25mg/kg)과 xylazine(5mg/kg)를 혼합 사용 마취하였으며, 마취 후 개복하여 경추를 절단하고 심장에서 혈액 채혈 및 간 조직 적출을 실시하였다. 분리한 혈액은 원심분리기(Eppendorf, centrifuge 5810R, Germany)를 이용하여 4℃, 4,000rmp 에서 20분간 원심분리하여 혈청을 분리하고 -80℃ deep freezer (Thermo)에 보관 후 사용하였으며, 간 조직은 혈액 제거 후 2～3개로 절편하여 액체질소에 급냉시키고 효소활성 측정 전까지 -80℃ deep-freezer에 보관 후 실험에 사용하였다.

< 혈청분석 >

채혈한 전혈(whole blood)로부터 혈청을 분리 후 혈청 중 간 기능효소 및 지질분석은 생화학분석기(Konelab 20B, Thermo scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 간 주요지표 효소인 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase), GGT (gamma(γ)-glutamyl transferase), LDH (lactate dehydrogenase)를 측정하여 도 26 내지 29에 나타내었다.

도 26에 의하면, 정상식이군과 비교하여 대조군에서 GGT 활성이 178% 증가하였으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물과 발효물 200 및 400mg/kg 투여군에서 대조군과 비교하여 유의하게 감소하였다(p<0.05). 특히 곰취 열수 추출 발효물은 400mg/kg 투여군의 경우 GGT 활성이 42% 감소한 것으로 나타났다(p<0.05).

도 27에 의하면, 정상식이군과 비교하여 대조군의 경우 AST 활성이 1,820% 증가하였으며(p<0.05), 곰취 열수 추출 발효물 200 및 400mg/kg 투여군에서 AST 활성이 각각 43%, 48% 대조군과 비교하여 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(p<0.05).

도 28에 의하면, 정상식이군과 비교하여 대조군의 경우 ALT 활성이 3,778% 증가하였으며(p<0.05), 곰취 열수 추출 발효물 200 및 400mg/kg 투여군에서 대조군과 비교하여 ALT 활성이 각각 40% 및 58% 감소하는 것으로 나타났다.

이에 의하면, 곰취 열수 추출 발효물을 체중당 200 및 400mg/kg 투여한 경우 대조군과 비교하여 AST 및 ALT 활성이 곰취 열수 추출물에 비해 큰 폭으로 감소하는 것을 알 수 있었다.

도 29에 의하면, 정상식이군과 비교하여 대조군의 경우 LDH 활성이 444% 유의하게 증가하였고(p<0.05), 곰취 열수 추출 발효물 100, 200 및 400mg/kg 투여군의 경우 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 56, 65 및 68% 유의하게 감소하는 것으로 나타났다(p<0.05).

또한 심혈관계질환의 위험도 판정에 사용되는 동맥경화지수(AI : atherogenic index) 및 HTR (high density lipoprotein cholesterol by total cholesterol ratio)은 하기 수학식 1, 2로 계산하여 도 30, 31에 나타내었다.

[수학식 1]

동맥경화지수(AI) ＝ (총 콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤) / HDL 콜레스테롤

[수학식 2]

HTR ＝HDL 콜레스테롤 / 총 콜레스테롤

도 30에 의하면, 대조군의 경우 정상식이군과 비교하여 동맥경화지수가 7배 증가하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물의 경우 400mg/kg 투여군에서 대조군과 비교하여 유의하게 감소하는 것으로 나타났다. 곰취 열수 추출 발효물의 경우 모든 투여군에서 대조군과 비교하여 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다.

도 31에 의하면, 정상식이군과 비교하여 대조군에서 HTR 수치가 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물 400mg/kg 투여군에서 대조군과 비교하여 유의하게 증가하는 것으로 나타났다(p<0.05). 곰취 열수 추출 발효물의 경우 모든 투여군에서 대조군과 비교하여 유의하게 증가하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다.

< 간 조직의 항산화효소 활성 및 과산화지질 함량 측정 >

혈액을 제거한 간 조직 1g에 5배의 RIPA 완충액(20mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM Na2EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40, 1% 소듐 디옥시콜레이드(sodium deoxycholate), 2.5mM 소듐 피로포스페이트(sodium pyrophosphate), 1mM 베타-글리세로포스페이트(beta-glycerophosphate), 1mM Na₃VO₄, 1g/ml leupeptin, Cell Signaling, Danver, CO, USA)를 가하여 간 조직을 호모게나이져(HS-30E, DAIHAN, Seoul, Korea)로 4℃에서 10분간 균질하고 균질한 조직을 4,000rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 4℃에서 13,000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포기질(cytosol)을 분리하였다. 세포기질에 존재하는 SOD의 활성도는 McCord 등(21)의 방법을 변형하여 측정하였다. 잔틴(Xanthine)이 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 반응으로 생성된 과산화물 음이온(superoxide anion)에 의해 시토크롬(cytochrome) c의 변화속도가 감소하는 것으로 SOD 활성을 측정하였다. 2mL의 혼합용액(5μM xanthine, 2μM cytochrome c, 0.1mM EDTA, 50mM Tris-HCl 완충액, pH 7.8)을 큐벳(cuvette)에 넣은 후 20μL의 세포기질을 첨가하고 0.2U/mL의 잔틴산화효소를 첨가하여 550nm에서 흡광도를 측정하여 도 32에 나타내었다. 과산화지질(MDA) 함량은 Brindeiro 등(22)의 방법에 따라 균질한 간 조직에 TBA 시약 (Cell Biolabs,San Diego, CA, USA) 를 첨가하고 95℃에서 60분간 열처리하였다. 열처리 후 얼음에서 냉각하고 13,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 회수하였으며, 회수한 상등액을 마이크로 튜브에 300μL씩 분주하고 동량의 n-부탄올을 첨가하여 교반하였다. 교반 후 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 n-부탄올 층을 회수하고 회수한 n-부탄올 층을 532nm에서 흡광도를 측정하여 도 33에 나타내었다.

도 32에 의하면, 대조군의 경우 정상식이군과 비교하여 SOD 활성이 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 곰취 열수 추출물 400mg/kg 투여군에서 대조군과 비교하여 유의하게 증가하는 것으로 나타났고, 곰취 열수 추출 발효물의 경우 200 및 400mg/kg 투여군에서 유의하게 SOD 활성이 증가하였다.

도 33에 의하면, D-GalN 단독 투여한 대조군에서 MDA 함량이 유의하게 증가하는 것으로 나타났으며(p<0.05), 곰취 열수 추출 발효물 400mg/kg 투여군의 경우 대조군과 비교하여 MDA 함량이 가장 감소하는 것으로 나타났다.

이상 종합하면, 곰취 열수 추출 발효물은 GGT, AST, ALT 및 LDH의 활성을 감소시키고 SOD 활성 증가 및 지질의 산화를 억제시킴으로써 D-GalN으로 인한 간 손상을 효과적으로 예방할 수 있음을 알 수 있었다.

< 간 조직 병리학적 분석 >

부검을 통하여 간의 좌 우엽에서 각각 2개의 절편을 떼어내고 10% 포르말린에 고정을 한 후 함수-탈수 처리를 거쳐 파라핀 블록을 제작하여 4m 두께의 미세절편을 만들어 슬라이드 글라스에 부착시켰다. 제작된 슬라이드는 Hematoxylin and Eosin (H&E) 염색과 Masson's trichrome (MT) 염색을 시행하여 광학현미경으로 관찰하였다. 간 조직의 병리소견 정도를 정량적으로 나타내기 위하여 현미경 200배 시야에서 관찰되는 소견의 개수를 이용하여 등급을 정하여 통계에 이용하였다(Grove 등, 2009). 조직 염색판독은 H&E 염색슬라이드에서 지방증(steatosis), 단핵구세포 군집(mononuclear cell collection), 문맥역 염증(portal tract inflammation) 정도 및 세포사멸(apoptosis) 여부를 관찰하였으며, MT 염색슬라이드로 섬유증(fibrosis) 여부를 파악하였다. 조직학적 검경은 각 실험군 조직시료에 대해 이중 맹검으로 평가하였다.

도 34는 정상식이군의 광학현미경 관찰결과를 나타낸다(A : H&E 염색 × 200, B : MT 염색 × 200). A 부분에 의하면 간 소포 구조가 잘 보존됨을 알 수 있으며, B 부분에 의하면 섬유증이나 콜라겐 침적은 없는 것을 알 수 있었다.

도 35는 간 조직 병리학적 분석결과로, 대조군과 곰취 열수 추출물 투여군의 광학현미경 관찰결과를 나타낸다(H&E 염색 × 200). 여기서, 화살표는 세포사멸된 세포를 나타낸다. 이에 의하면, 대조군(A 부분)에서는 세포사멸된 세포나 그룹이 빈번하게 관찰되었으며, 곰취 열수 추출물 100mg/kg 투여군(B 부분)에서는 세포사멸된 세포가 빈번하게 관찰되었고 동시에 단핵구세포군집이 가끔 관찰되었으며, 곰취 열수 추출물 200, 400mg/kg 투여군(C, D 부분)에서는 세포사멸된 세포수가 감소하는 경향이 나타났다.

도 36은 간 조직 병리학적 분석결과로, 대조군과 곰취 열수 추출 발효물 투여군의 광학현미경 관찰결과를 나타낸다(H&E 염색 × 200). 여기서, 화살표는 세포사멸된 세포를 나타낸다. 이에 의하면, 대조군(A 부분)에서는 세포사멸된 세포나 그룹이 빈번하게 관찰된 반면, 곰취 열수 추출 발효물 100, 200, 400mg/kg 투여군(B, C, D 부분)에서는 가끔 세포사멸된 세포가 관찰되었고, 가벼운 간문맥 염증이 나타남에 그쳤다.

이상 종합하면, 곰취 열수 추출 발효물은 대조군과 비교하여 세포사멸 지수, 문맥역 염증 지수 등을 개선시킬 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

삭제
곰취 추출물에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 접종하여 배양시킨 곰취 발효물을 함유하는 것을 특징으로 하는 간 보호 및 간 기능 개선용 식품 조성물.
삭제
곰취 추출물에 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum)을 접종하여 배양시킨 곰취 발효물을 함유하는 것을 특징으로 하는 간 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.