KR101434879B1 - 암 조직 타겟팅 박테리아 기반의 마이크로로봇 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체 내에서 암 조직에 대하여 특이적으로 타겟팅 될 수 있는 박테리아 기반의 마이크로비드를 제공하기 위하여, 바이오틴(biotin)이 표면에 결합된 갖는 박테리아와 스트렙타비딘(streptavidin)이 표면에 코팅되고, 약물이 물리적으로 봉입된 마이크로비드를 포함하는 암 조직에 대한 약물운반체을 제공한다.
Description
본 발명은 박테리아 기반의 마이크로로봇에 관한 것으로서, 더 상세하게는 암 조직을 타겟팅하는 박테리아 기반의 마이크로로봇에 관한 것이다.
박테리아-기반 마이크로로봇은 수 내지 수백 μm 크기의 미세구조체의 표면 중 일부에 박테리아가 부착된 구조를 갖고 있으며, 박테리아의 편모운동과 질병표적능을 이용하여 병소에 상기 미세구조체를 이동시킴으로써, 상기 미세구조체 내에 봉입된 약물 및/또는 질병치료용 박테리아를 이용하여 질병을 치료할 수 있는 본 발명자들에 의해 최초로 개발된 신개념 약물전달 시스템이다(한국등록특허 제 1003149호).
구형 미세구조체를 포함하는 박테리아-기반 마이크로로봇의 제조를 위해서 상기 미세구조체의 표면의 특정 영역에 선택적으로 박테리아를 부착시키는 기술을 이용한다. 대한민국 공개특허 제2011-0093324호를 통하여 미세구조체를 제조할 때 한 쪽 반구는 박테리아가 잘 부착하는 소수성 물질을, 다른 반구는 박테리아가 잘 부착되지 않는 친수성 물질을 사용하여 제조하는 방법이 알려져 있다. 또한, 한 가지 단일한 물질로 미세구조체를 제조한 후, 특정 반구 표면만 표면처리를 하여 특정 반구에만 박테리아가 부착되도록 하는 기술이 알려져 있다.
그러나 상기 첫 번째 방법은 친수성 물질과 소수성 물질 사이의 반발력 때문에, 제조가 용이하지 않고, 두 번째 방법은 과정이 복잡하고 수율이 높지 않다는 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 스트렙타비딘(streptavidin)과 바이오틴(biotin)의 결합력을 이용하여 마이크로비드 표면에 박테리아를 부착시킨 박테리아 기반의 마이크로로봇 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 바이오틴(biotin)이 표면에 결합된 박테리아와 스트렙타비딘(streptavidin)이 표면에 코팅되고, 적어도 하나 이상의 약물이 봉입된 마이크로비드를 포함하는 암 조직에 대한 약물운반체가 제공된다.
상기 약물운반체에 있어서, 상기 박테리아는 Salmonella, Clostridium, Bifidobacterium, E. coli, Yersinia enterocohtica, Listeria monocytogenies, Mycoplasma hominis 또는 Streptococcus일 수 있다. 바람직하게는 Salmonella일 수 있으며, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis 또는 Salmonella enteritidis일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Salmonella typhimurium일 수 있다.
또한, 상기 약물운반체에 있어서, 상기 박테리아는 ppGpp 합성능이 결여된 변이체일 수 있으며, 상기 박테리아는 ppGpp 합성을 위한 ppGpp 씬세타아제를 코딩하는 불활성화된 relA 유전자 또는 spoT 유전자를 포함할 수 있다.
또한, 상기 박테리아는 약독화된(attenuated) 박테리아일 수 있다.
또한, 상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 약물은 마커유전자, 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 또는 지질일 수 있으며, 마커 유전자일 수 있다. 상기 마커 유전자는 형광단백질 또는 발광단백질을 코딩하는 유전자, 또는 단순포진바이러스의 티미딘인산효소(herpes simplex virus thymidine kinsease), 도파민수용체(dopamine receptor), 소마토스타틴 수용체(somatostatin receptor), 소디움-요오드 수송체(sodium-iodide transporter), 철 수용체, 트렌스페린 수용체(transferrin receptor), 페리틴(ferritin) 또는 철 수송체(magA)를 포함하는 핵의학 또는 MRI 영상용 마커를 코딩하는 유전자일 수 있다.
또한, 상기 화학물질은 항암제일 수 있으며, 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 시타라빈(cytarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 펜토스타틴(pentostatin), 메토트렉세이트(methotrexate), 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 덱사메타손(dexamethasone)에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 약물은 화학물질 약물(chemotherapeutic agents)이고, 상기 박테리아는 상기 약물을 생성하도록 유전변형(genetically modified)될 수 있다.
또한, 상기 마이크로비드는 생분해성/생적합성 고분자 물질로 제작될 수 있으며, 상기 마이크로비드는 생분해성/생적합성 고분자 물질을 이용하여 제조된 약물 캡슐 또는 박테리아의 캡슐을 포함할 수 있다.
상기 생분해성/생적합성 고분자 물질은 키토산, 그 염 및 그 유도체; 덱스트란 및 그 유도체; 아카시아 검(Acacia gum); 트라가칸친(Tragacanthin); 히알루론산(Hyaluronic acid), 그 염 및 그 유도체; 펙틴(Pectin), 그 염 및 그 유도체; 알긴산(Alginic acid), 그 염 및 그 유도체; 아가(Agar); 갈락토만난(Galactomannan), 그 염 및 그 유도체; 잔탄(Xanthan), 그 염 및 그 유도체; 베타-사이클로덱스트린(-Cyclodextrin), 그 염 및 그 유도체; 아밀로오스(Amylose, 수용성 전분), 그 염 및 그 유도체; 글리콜 키토산(Glycol chitosan), 그 염 및 그 유도체; 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxylmethyl cellulose, CMC), 그 염 및 그 유도체; 히드록시에틸 셀룰로오스(Hydroxyethyl cellulose, HPS), 그 염 및 그 유도체; 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스(Hyroxypropyl methyl cellulose, HPMC), 그 염 및 그 유도체; 메틸셀룰로오스(Methyl cellulose), 그 염 및 그 유도체; 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(Cellulose acetate phthalate), 그 염 및 그 유도체; 젤라틴(Gelatin), 그 염 및 그 유도체; 및 프로타민 설페이트(Promaine sulfate); 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트) [Poly(-hydroxyethyl methacrylate), PHEMA]; 폴리아크릴아미드(Poluacrylamide, PA); 폴리비닐알코올(Polyvunyl alcohol, PVA); 폴리아크릴산(Polyacrylic acid, PAA); 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene gylcol, PEG); 폴리(에틸렌옥사이드-b-프로필렌 옥사이드) [Poly(ethylene oxide-b-propylene oxide), PER-PPO]; 및 폴리리아신(Polylyasine)에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 약물운반체에 있어서, 상기 마이크로비드는 직경이 5 μm 이하일 수 있으며, 1-5 μm 범위일 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, (a) 상술한 약물운반체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 상기 약물운반체에는 암 치료용 약물이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, (a) 상술한 약물운반체; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 이미지용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 바이오틴(biotin)이 표면에 결합된 갖는 박테리아와 스트렙타비딘(streptavidin)이 표면에 코팅된 마이크로비드를 포함하는 암 조직에 대한 약물운반체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 조직으로의 약물운반 방법이 제공된다.
상기 암 조직으로의 약물운반 제공 방법에 있어서, 상기 박테리아는 Salmonella, Clostridium, Bifidobacterium, E. coli, Yersinia enterocohtica, Listeria monocytogenies, Mycoplasma hominis 또는 Streptococcus일 수 있으며, 바람직하게는 박테리아는 Salmonella일 수 있다. 상기 박테리아는 Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis 또는 Salmonella enteritidis일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 박테리아는 Salmonella typhimurium일 수 있다.
또한, 상기 방법에 있어서, 상기 박테리아는 ppGpp 합성능이 결여된 변이체일 수 있으며, 상기 박테리아는 ppGpp 합성을 위한 ppGpp 씬세타아제를 코딩하는 불활성화된 relA 유전자 또는 spoT 유전자를 포함할 수 있다.
또한, 상기 박테리아는 약독화된(attenuated) 박테리아일 수 있다.
또한, 상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 약물은 마커유전자, 화학물질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 또는 지질일 수 있다.
또한, 상기 마커 유전자는 형광단백질 또는 발광단백질을 코딩하는 유전자, 또는 단순포진바이러스의 티미딘인산효소(herpes simplex virus thymidine kinsease), 도파민수용체(dopamine receptor), 소마토스타틴 수용체(somatostatin receptor), 소디움-요오드 수송체(sodium-iodide transporter), 철 수용체, 트렌스페린 수용체(transferrin receptor), 페리틴(ferritin) 또는 철 수송체(magA)를 포함하는 핵의학 또는 MRI 영상용 마커를 코딩하는 유전자일 수 있다.
또한, 상기 화학물질은 항암제일 수 있으며, 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 시타라빈(cytarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 펜토스타틴(pentostatin), 메토트렉세이트(methotrexate), 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 덱사메타손(dexamethasone)에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기 약물은 화학물질 약물(chemotherapeutic agents)이고, 상기 박테리아는 상기 약물을 생성하도록 유전변형(genetically modified)될 수 있다.
또한, 상기 마이크로비드는 생분해성/생적합성 고분자 물질로 제작될 수 있으며, 상기 마이크로비드는 생분해성/생적합성 고분자 물질을 이용하여 제조된 약물 캡슐 또는 박테리아의 캡슐을 포함할 수 있다. 상기 생분해성/생적합성 고분자 물질은 키토산, 그 염 및 그 유도체; 덱스트란 및 그 유도체; 아카시아 검(Acacia gum); 트라가칸친(Tragacanthin); 히알루론산(Hyaluronic acid), 그 염 및 그 유도체; 펙틴(Pectin), 그 염 및 그 유도체; 알긴산(Alginic acid), 그 염 및 그 유도체; 아가(Agar); 갈락토만난(Galactomannan), 그 염 및 그 유도체; 잔탄(Xanthan), 그 염 및 그 유도체; 베타-사이클로덱스트린(-Cyclodextrin), 그 염 및 그 유도체; 아밀로오스(Amylose, 수용성 전분), 그 염 및 그 유도체; 글리콜 키토산(Glycol chitosan), 그 염 및 그 유도체; 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxylmethyl cellulose, CMC), 그 염 및 그 유도체; 히드록시에틸 셀룰로오스(Hydroxyethyl cellulose, HPS), 그 염 및 그 유도체; 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스(Hyroxypropyl methyl cellulose, HPMC), 그 염 및 그 유도체; 메틸셀룰로오스(Methyl cellulose), 그 염 및 그 유도체; 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(Cellulose acetate phthalate), 그 염 및 그 유도체; 젤라틴(Gelatin), 그 염 및 그 유도체; 및 프로타민 설페이트(Promaine sulfate); 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트) [Poly(-hydroxyethyl methacrylate), PHEMA]; 폴리아크릴아미드(Poluacrylamide, PA); 폴리비닐알코올(Polyvunyl alcohol, PVA); 폴리아크릴산(Polyacrylic acid, PAA); 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene gylcol, PEG); 폴리(에틸렌옥사이드-b-프로필렌 옥사이드) [Poly(ethylene oxide-b-propylene oxide), PER-PPO]; 및 폴리리아신(Polylyasine)에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 방법은 상기 약물을 정맥 내 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, (a) 상술한 약물운반체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 약물운반체에는 암 치료용 약물이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 암 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, (a) 상술한 약물운반체; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 이미지 방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 약물 및/또는 치료용 박테리아가 스트렙타비딘과 바이오틴의 결합력에 의하여 마이크로비드와 강력하게 결합됨으로써, 생체 내(in vivo)에서도 그 결합이 유지되어 암 특이적으로 이동됨에 따라 항암 치료효과를 제공할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇에 이용되는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 항암 효과를 확인한 면역염색 결과 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇에 이용되는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 암에 대한 주화성을 확인하기 위하여 제작한 3-챔버(도 2a), 챔버의 정상적인 작동성(도 2b), 및 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)(도 2c)와 박테리아 기반의 마이크로로봇(도 2d)의 암에 대한 주화성을 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp)), 마이크로비드를 투여한 동물 모델에서 형광(도 4a) 및 근적외선(도 4b)를 확인한 사진 및 박테리아 기반의 마이크로비드를 투여한 군의 형광(도 4c) 및 근적외선(도 4d)를 확인한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp)), 마이크로비드를 투여한 동물 모델로부터 암 조직을 적출한 후, 근적외선을 관찰한 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp))(6a), 마이크로비드(6b) 또는 박테리아 기반의 마이크로로봇(6c) 투여 1일 째 되는 동물 모델의 암 조직 면역염색법을 이용하여 암에 대한 주화성을 확인한 그림이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp))(7a), 마이크로비드(7b) 또는 박테리아 기반의 마이크로로봇(7c) 투여 3일 째 되는 동물 모델의 암 조직 면역염색법을 이용하여 암에 대한 주화성을 확인한 그림이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇을 구성하는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)와 마이크로비드가 생체 내에서 결합되어 있는지 공초점 현미경의 z-stack 기능을 이용하여 확인한 면역염색사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로봇을 구성하는 마이크로비드의 크기에 따른 항암효과를 비교한 결과로서, S. typhimurium 균주(ppGpp) 3, 6 μm 마이크로비드 및 상기 마이크로비드를 이용하여 제조한 마이크로봇을 투여한 동물 모델에서 형광(도 9a, b, c), 근적외선(도 9d, e, f) 및 상기 동물 모델로부터 추출한 암조직의 근적외선(도 9g)을 확인한 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇에 이용되는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 암에 대한 주화성을 확인하기 위하여 제작한 3-챔버(도 2a), 챔버의 정상적인 작동성(도 2b), 및 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)(도 2c)와 박테리아 기반의 마이크로로봇(도 2d)의 암에 대한 주화성을 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇을 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp)), 마이크로비드를 투여한 동물 모델에서 형광(도 4a) 및 근적외선(도 4b)를 확인한 사진 및 박테리아 기반의 마이크로비드를 투여한 군의 형광(도 4c) 및 근적외선(도 4d)를 확인한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp)), 마이크로비드를 투여한 동물 모델로부터 암 조직을 적출한 후, 근적외선을 관찰한 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp))(6a), 마이크로비드(6b) 또는 박테리아 기반의 마이크로로봇(6c) 투여 1일 째 되는 동물 모델의 암 조직 면역염색법을 이용하여 암에 대한 주화성을 확인한 그림이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp))(7a), 마이크로비드(7b) 또는 박테리아 기반의 마이크로로봇(7c) 투여 3일 째 되는 동물 모델의 암 조직 면역염색법을 이용하여 암에 대한 주화성을 확인한 그림이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇을 구성하는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)와 마이크로비드가 생체 내에서 결합되어 있는지 공초점 현미경의 z-stack 기능을 이용하여 확인한 면역염색사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로봇을 구성하는 마이크로비드의 크기에 따른 항암효과를 비교한 결과로서, S. typhimurium 균주(ppGpp) 3, 6 μm 마이크로비드 및 상기 마이크로비드를 이용하여 제조한 마이크로봇을 투여한 동물 모델에서 형광(도 9a, b, c), 근적외선(도 9d, e, f) 및 상기 동물 모델로부터 추출한 암조직의 근적외선(도 9g)을 확인한 사진이다.
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 "약물운반체(drug delivery system)"는 약독화된 박테리아와 생분해성/생적합성 고분자 물질로 제작된 마이크로비드가 결합된 박테리아 기반의 마이크로로봇을 의미한다. 상기 약독화된 박테리아는 표면에 존재하는 다수의 OmpA 단백질과 바이오틴(biotin)이 공유결합으로 결합되어 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 마이크로비드는 스트렙타비딘(streptavidin)이 표면에 코팅되어 있어, 스트렙타비딘-바이오틴의 결합력에 의하여 생체 내체서 결합을 유지하며, 암 조직 특이적으로 이동하여 항암 효과를 제공한다. 이러한 약물운반체는 본 발명의 실시예를 통하여 생체 내(in vivo)에서도 강력하게 그 결합이 유지되며, 암 조직을 타겟팅되는 효과를 제공할 수 있음을 확인하였다.
본 문서에서 사용되는 "약독화"는 미생물의 병원성을 감소시키도록 변형시키는 것을 의미한다. 약독화는 미생물을 환자에게 투여한 경우 독성 및 다른 부작용을 감소시킬 목적으로 이루어진다. 약독화 박테리아는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 약독화는 박테리아가 숙주세포에서 생존하도록 하는 독성인자(virulence factor)를 결실시키거나 또는 파괴하여 달성된다. 상기 결실 및 파괴는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 상동성 재조합, 화학적 변이유발, 조사 변이유발 또는 트랜스포존 변이유발 등과 같은 방법에 의해 실시된다. 결실된 경우 약독화를 초래할 수 있는 Salmonella의 독성인자의 예는 다음과 같다: 5'-아데노신 모노포스페이트(Biochenko et al., 1987, Bull. Eksp. Biol. Med. 103: 190-192), 사이토라이신(Libby et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91: 489-493), 디펜신 내성 loci(Fields et al., 1989, Science 243: 1059-62), DNAK(Buchmeier et al., 1990, Science 248: 730-732), 핌브리애(Ernst et al., 1990, Infect. Immun. 58: 2014-2016), GroEL(Buchmeier et al., 1990, Science 248: 730-732), Inv loci(Ginocchio et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5976-5980), 리포단백질(Stone et al., 1992, J. Bacteriol. 174: 3945-3952), LPS(Gianella et al., 1973, J. Infect. Dis. 128: 69-75), PhoP 및 PhoQ(Miller et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5054-5058), Pho 활성화 유전자(Abshiro et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 3734-3743), PhoP 및 PhoQ 조절 유전자(Behlau et al., 1993, J. Bacteriol. 175: 4475-4484), 포린(Tufano et al., 1988, Eur. J. Epiderniol. 4: 110- 114), 독성인자(Loos et al., 1994, Immun. Infekt. 22: 14-19; Sansonetti, 1992, Rev. Prat. 42: 2263-2267). 약독화 박테리아에 대한 내용은 WO 96/40238에 상세하게 개시되어 있으며, 이 특허문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 문서에서 사용되는 "불활성화된 relA 유전자 및/또는 spoT 유전자"는 유전자의 전사 또는 해독, 유전자 산물의 활성의 손상(impairment)을 초래하는 relA 유전자 및/또는 spoT 유전자의 변형(modifications)을 의미한다. 이런 유전자 변형은 ppGpp 씬세타아제 코딩 서열(CDS)의 불활성화뿐만 아니라 이의 프로모터의 불활성화도 포함될 수 있다. 박테리아 지놈 상에서 목적한 유전자만의 특이적 불활성화는 코딩하는 유전자의 전체 또는 하나 이상의 부분 영역에서 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 돌연변이시킴으로써 가능하다. 예들 들어, 유전자의 결실 및 유전자로의 이형 서열(heterogenous sequence)의 삽입은 유전자의 절단(truncation), 넌센스 돌연변이(nonsense mutation), 프레임쉬프트 돌연변이(frameshift mutation), 미스센스 돌연변이(missense mutation) 등을 초래할 수 있다. 이러한 유전자의 특이적 불활성화는 당업계에서 확립된 방법을 통하여 수행할 수 있다. 한편 유전자의 결실은 당업계에 공지된 다양한 변이유발(mutagenesis) 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예컨대, relA 유전자 또는 spoT 유전자의 결실은 PCR 돌연변이유발법 및 카세트 돌연변이유발법으로 실시할 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). ppGpp 합성 결여는 본 발명의 박테리아가 암 조직으로 타겟팅하는 데에 있어서 결정적인 기여를 한다.
본 문서에서 사용되는 약물운반체의 "화학물질"은 암-타겟팅 박테리아 세포 내에 화학물질이 내포되어 있다는 것뿐만 아니라, 암-타겟팅 박테리아가 화학물질을 생성시킬 수 있도록 하는 유전자들이 포함되어 있는 것도 포괄하는 의미를 갖는다.
본 문서에서 사용되는 약물운반체의 "펩타이드 또는 폴리펩타이드"는 암-타겟팅 박테리아 세포 내에 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 내포되어 있는 것뿐만 아니라, 암-타겟팅 박테리아가 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있도록 하는 유전자를 포함하고 있는 것도 포괄하는 의미를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 암-타겟팅 박테리아는 암의 치료에 유용한 단백질을 코딩하는 외래 유전자 또는 siRNA, shRNA를 포함할 수 있으며, 이 경우 암-타겟팅 박테리아는 유전자치료제 역할을 한다.
본 문서에서 사용되는 약물운반체의 "핵산"분자는 바람직하게는 암-타겟팅 박테리아에서 작동하는 프로모터에 작동적으로 결합되어(operatively linked to) 있다. 상기 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션(translation)을 조절하게 된다. 운반되는 핵산분자는 벡터 시스템으로 구축되어 운반될 수 있으며, 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 벡터는 전사를 진행시킬 수 있는 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터, T7 프로모터, pBAD, Tet 프로모터, trc 프로모터, pepT 프로모터, sulA 프로모터, pol 11(dinA) 프로모터, ruv 프로모터, uvrA 프로모터, uvrB 프로모터, uvrD 프로모터, umuDC 프로모터, lexA 프로모터, cea 프로모터, caa 프로모터, recN 프로모터 및 pagC 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열(예: rrnB 터미네이터)을 포함하는 것이 일반적이다. 이외에도 암 조직에 선택적으로 발현되는 프로모터도 포함된다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
또한, 본 발명에서 이용되는 외래 핵산분자에 의해 발현되는 단백질이 박테리아 세포 외로 분비되는 것을 용기하게 하기 위하여, 바람직하게는 외래 핵산분자는 리더 서열(또는 시그널 서열)을 추가적으로 포함한다. 본 발명에 적합한 리더 서열은 특별하게 제한되지 않으며, 예를 들어 pelB, gene , ompA, ompB, ompC, ompD, ompE, ompF, ompT, phoA 및 phoE 등의 리더 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 암-타겟팅 박테리아에 의해 운반되는 핵산분자는 트랜스포존-매개 염색체 삽입(transposon-mediated chromosomal integration)되어 운반될 수도 있다. 이 경우, 트랜스포존 플라스미드가 사용되며 상기 플라스미드는 목적의 핵산분자가 삽입된 트랜스포존을 포함하고, 이 트랜스포존이 박테리아 지놈에 삽입된다. 적합한 트랜스포존의 예는 TO, Tn9, Tn1O 및 Tn5를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 문서에서 사용되는 "유효량"은 상술한 본 발명의 치료 효능을 발휘하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약제학적 조성물은 비경구로 투여되는 것이 바람직하고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 적합한 1일 투여량은, 0.0001-100 mg/kg(체중)이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 일 실시예에 따른 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "이미지용 조성물"은 다양한 표지물질 이미징 방법에 적용되어 암을 이미징하는데 이용된다. 예를 들어, 표지물질이 자성 물질로 이루어진 경우 자기공명(MR), 표지물질이 양전자방출동위원소인 경우에는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT, Single Photon Emission Computed Tomography) 또는 양전자 방출 단층촬영 (PET, Positron Emission Tomography)에 사용될 수 있다. MR 이미징 방법 및 장치는, D. M. Kean and M. A. Smith, Magnetic Resonance Imaging: Principles and Applications (William and Wilkins, Baltimore 1986), 미국 특허 제6,151,377호, 제6,144,202호, 제6,128,522호, 제6,127,825호, 제6,121,775호, 제6,119,032호, 제 6,115,446호, 제6,111,410호 및 제602,891호에 개시되어 있다. PET 이미징 방법 및 장치는, 미국 특허 제6,151,377호, 제6,072,177호 제5,900,636호, 제5,608,221호, 제5,532,489호 제5,272,343호 및 제5,103,098호에 기재되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. SPECT 이미징 방법 및 장치는, 미국 특허 제6,115,446호, 제6,072,177호, 제5,608,221호, 제5,600,145호, 제5,210,421호 및 제5,103,098호에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 표지물질이 발광, 형광 또는 화학발광 물질인 경우 광학 이미징 및 분광 (Optical Imaging and Spectroscopy) 이미징으로 암조직에 대한 이미지를 얻을 수 있다. 이러한 이미징의 일반적인 내용은 미국 특허 제5,650,135호에 개시되어 있다. 또한 표지물질이 X-ray 진단제인 바륨 셀페이트 및 요오드가 결합되거나 초음파 검사용 진단제인 마이크로버블 등인 경우에는 X-ray 및 초음파 검사에도 사용될 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "암 치료방법"은 약제학적으로 유효한 양의 약물운반체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 의미하며, 상기 약물운반테에 암 치료용 약물이 포함되어 있는 방법을 의미한다. 상기 치료는 항생제를 주입함으로써 간단하게 종결시킬 수 있다. 사용될 수 있는 항생제의 예는 사이프로플록사신, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 도면에 도시된 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 도면에 도시된 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇에 이용되는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 항암 효과를 확인한 면역염색 결과 사진이다. S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 항암효과를 확인하기 위하여, 대장암 세포 CT-26, 유방암 세포 4T1 및 NIH3T3세포를 포함하는 알긴산 수화겔 비드에 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)를 적재한 후, 사멸된 세포를 특이적으로 염색하는 EthD-1 항체를 이용하여 면역염색을 수행하였다. 그 결과, 대장암 및 유방암 세포를 포함하는 알긴산 수화겔만이 적색으로 염색되며, 상기 균주의 암 세포 사멸 효과가 확인되었다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇에 이용되는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 암에 대한 주화성을 확인하기 위하여 제작한 3-챔버(도 2a), 챔버의 정상적인 작동성(도 2b), 및 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)(도 2c)와 박테리아 기반의 마이크로로봇(도 2d)의 암에 대한 주화성을 확인한 도이다. 본 발명자는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 암 특이적인 주화성을 확인하기 위하여 발명자의 종래 연구를 통하여 개발된 3-챔버를 이용하여 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 암에 대한 주화성을 확인하였다. 그 결과, 대장암 및 유방암 세포로의 이동을 선호하는 것을 확인하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇을 개략적으로 도시한 개요도이다
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp)), 마이크로비드를 투여한 동물 모델에서 형광(도 4a) 및 근적외선(도 4b)를 확인한 사진 및 박테리아 기반의 마이크로비드를 투여한 군의 형광(도 4c) 및 근적외선(도 4d)를 확인한 사진이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇의 암에 대한 주화성을 생체 내(in vivo)에서 확인하기 위하여 암 동물 모델을 이용하였다. 암 동물 모델의 꼬리 정맥을 통하여 S. typhimurium 균주(ΔppGpp), 마이크로비드 또는 박테리아 기반의 마이크로로봇을 각각 투여한 후, 3일이 경과한 후, 형광 및 근적외선 측정을 통하여 S. typhimurium 균주(ΔppGpp) 및 마이크로비드의 위치를 확인하였다. 그 결과, 암 조직에서 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 형광이 관찰되었으나, 마이크로비드의 경우 운동성이 결여되어 있어 암 조직에서 근적외선이 관찰되지 않았다. 박테리아 기반의 마이크로로봇의 근적외선은 자발형광으로 인한 간섭으로 암 조직으로 이동된 것을 확인하지 못하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp)), 마이크로비드를 투여한 동물 모델로부터 암 조직을 적출한 후, 근적외선을 관찰한 사진이다. 도 4를 통하여 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇을 구성하고 있는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)만이 암 조직으로 이동되었음이 확인되었다. 이에, 마이크로비드가 상기 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)와 결합되어 암 조직으로 이동되는지를 암 조직을 적출한 후 확인하였다. 투여 3일째 되는 동물 모델의 암 조직을 적출한 후 관찰한 결과, 암 조직에서 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇에서만 근적외선이 관찰되었다. 이러한 결과는 스트렙타비딘과 바이오틴이 본 발명의 박테리아 기반의 마이크로로봇을 구성하는 박테리아와 마이크로비드를 생체 내에서 결합을 유지시켜, 암세포 특이적인 타겟팅을 할 수 있음을 입증하는 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp))(6a), 마이크로비드(6b) 또는 박테리아 기반의 마이크로로봇(6c) 투여 1일 째 되는 동물 모델의 암 조직 면역염색법을 이용하여 암에 대한 주화성을 확인한 그림이다. 암 조직을 DAPI, GFP, 및 Cy5.5 항체를 이용하여 조직염색을 수행한 결과, S. typhimurium 균주(ΔppGpp)를 투여한 군에서는 GFP 발현이(도 6a), 마이크로비드를 투여한 군에서는 형광이 전혀 관찰되지 않았으며(도 6b), 박테리아 기반의 마이크로로봇을 투여한 군에서는 GFP와 약하게 Cy5.5 형광이 관찰되었다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아(S. typhimurium 균주(ΔppGpp))(7a), 마이크로비드(7b) 또는 박테리아 기반의 마이크로로봇(7c) 투여 3일 째 되는 동물 모델의 암 조직 면역염색법을 이용하여 암에 대한 주화성을 확인한 그림이다. 도 7과 유사한 결과를 나타냈으며, 투여일수가 증가함에 따라 박테리아 기반의 마이크로로봇을 투여한 군에서 Cy5.5의 형광이 좀더 강하게 관찰되었다. 이러한 결과는 스트렙타비딘과 바이오틴 결합에 의하여 S. typhimurium 균주(ΔppGpp와 마이크로비드가 생체 내(in vivo)에서 결합을 유지하고 있으며, 암 특이적인 주화성을 나타냄을 입증하는 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇을 구성하는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)와 마이크로비드가 생체 내에서 결합되어 있는지 공초점 현미경의 z-stack 기능을 이용하여 확인한 면역염색사진이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로봇 투여 3일째 되는 동물 모델의 암 조직을 적출하여 면역염색법을 수행한 후, 공초점 현미경의 z-stack 기능을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 동일한 위치에 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)와 마이크로비드의 형광이 위치하는 것을 관찰할 수 있었다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로봇을 구성하는 마이크로비드의 크기에 따른 항암효과를 비교한 결과로서, S. typhimurium 균주(ppGpp) 3 μm 및 6 μm 마이크로비드 및 상기 마이크로비드를 이용하여 제조한 마이크로봇을 투여한 동물 모델에서 형광(도 9a, b, c), 근적외선( 도 9d, e, f) 및 상기 동물 모델로부터 추출한 암조직의 근적외선(도 9g)을 확인한 사진이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로봇을 구성하는 비드의 크기에 따른 마이크로봇의 항암효과를 비교하기 위하여, 3 μm 및 6 μm 마이크로비드를 이용하여 제조한 마이크로봇을 암 동물모델에 투여한 후, 암 조직으로의 운동성 및 암 주화성을 발광 및 근적외선을 통하여 확인하였다. 3 μm 마이크로비드를 이용한 경우, 발광과 Cy 5.5 형광이 좀더 강하였으나, 이러한 형광은 간섭이 발생할 수 있어, 암조직을 추출하여 직접 확인하였다. 그 결과, 도 9g에서 확인된 바와 같이, 3 μm 마이크로비드를 이용하여 제조한 마이크로봇을 주사한 군의 암 조직에서만 Cy5.5 형광이 관찰되었다. 즉, 마이크로봇을 구성하는 마이크로비드에 따라, 항암 효과에 차이가 있을 수 있음을 의미한다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 박테리아 기반의 마이크로로봇의 제작
1-1: 플라스미드
pBAD-pelB-RLuc8 (pBP-Rluc8) 플라스미드는 종래기술에 따라 구축하였다. 보다 상세하게는, Renilla 루시퍼라아제의 특정 변이체인 RLuc8을 8개의 선호적 변이들의 조합으로 제조하고 이를 pBAD/Myc-His A 플라스미드(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 삽입시켰다. pelB 리더 서열을 루시퍼라아제 유전자의 N-말단에 결합시켰다.
1-2: 박테리아 균주
본 실험에 이용된 약독화 S. typhimurium 균주(ΔppGpp), SHJ2037 (relA::cat, spoT::kn)는 본 발명자들의 종전 논문에 기재된 것이다. relA 유전자 및 spoT 유전자를 결손시켜 ppGpp(Guanosine 5'-diphosphate 3'-diphosphate) 합성능이 결여된 약독화 S. typhimurium 균주(ΔppGpp) SHJ2037는 기탁번호 KCTC 10787bP로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원내 유전자은행에 기탁되어 있다. 50 μg/ml 카나마이신(Sigma)을 포함하는 LB 배지(Difco Laboratories)에서 격렬하게 공기공급을 하면서 37℃에서 Salmonella를 성장시켰다. 생발광 이미징을 위하여, 상기 ΔppGpp 균주를 생발광 리포터 유전자로 형질전환시켰다. S. typhimurium-Xen26(Xenogen-Caliper)의 박테리아 루시퍼라아제 유전자(lux)를 P22HT int 트랜스덕션 방법으로 SHJ2037 균주에 도입시켰다. 상기 균주를 50 μg/ml 카나마이신을 포함하는 LB 배지에서 배양하였다. pBAD-pelB-RLuc8 플라스미드를 SHJ2037 균주에 전기-형질전환 방식으로 도입시켰다. 암피실린(20 μg/ml)을 포함하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장하는 콜로니를 선별하였다.
1-3: 마이크로비드
PolyLink Protein Coupling 키트(Polysciences. Inc)를 이용하여 카르복실화(Carboxylate) 마이크로비드의 표면에 Cy5.5(eBioscience. Inc)에 결합된 스트렙타비딘(streptavidin)(eBioscience. Inc)을 코팅하였다. 형광 물질의 경우, 에너지가 약해 피부를 뚫고 나오는데 한계가 있어 근적외선 파장대를 가진 Cy5.5 형광물질을 이용하여 마이크로비드의 표면을 코팅하였다.
1-4: 박테리아 기반의 마이크로로봇
그 후, S. typhimurium 균주(ΔppGpp)에 200㎍/㎖ 바이오틴(biotin)(Thermo Scientific. Inc)을 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 상기 바이오틴은 박테리아의 세포 표면에 많이 존재하는 OmpA와 결합하는 특징을 가지고 있다.
그 후, 상기 바이오틴이 함유된 배지에서 배양된 박테리아와 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로비드는 3X107:1X107 로, 약 3:1의 비율로 30분 동안 상기 코팅된 비드를 박테리아 배지에서 첨가하여 반응시켜, 박테리아 기반의 마이크로로봇을 제조하였다.
실시예 2: 3-챔버 미세유체 칩의 제조
본 발명자의 이전 발명을 참조하여 미세유체 칩을 제조하였다(한국 출원번호 10-2011-0085207 참조). 본 발명자들은 슬라이드 글래스 위에 두께 5 mm의 PDMS(polydimethylsiloxane) 층을 생성시켰는데, PDMS 층에 상하가 관통된 세 개의 원형 챔버(직경 10 mm)를 5~20 mm 간격으로 일렬로 형성시킨 뒤, 인접한 챔버들 사이에 폭 100 μm, 두께 100 μm의 채널들을 형성시켰다. 상기 세 개의 챔버 중 중앙의 챔버가 세포 또는 세포기반 마이크로로봇 로딩용 챔버이고, 이의 양옆에 형성된 두 개의 챔버는 분석대상 물질 로딩용 챔버이다.
그 후, 본 발명자들은 상기 미세유체 칩에 형성된 분석대상 물질 로딩용 챔버에 삽입할 세포 함유 수화겔 디스크를 하기와 같이 제조하였다. 알긴산(Alginate, Junsei Chemical Co.(Japan)) 2 g을 PBS(Phosphate Buffered Saline) 100 ㎖에 혼합하여 용해시킨 후, 2% 알긴산 1 ㎖에 각각 대장암 세포 CT-26(ATCC, Manassas, VA), 유방암 세포 4T1(ATCC, Manassas, VA) 및 정상세포인 NIH3T3(ATCC, Manassas, VA)를 1x106 cells/㎖의 세포 용액 1 ㎖을 혼합한 후, 40 mM CaCl2 용액에 세포를 포함한 1% 알긴산 100 ㎕를 떨어뜨려, 젤화반응을 유도하여 세포를 포함한 알긴산 수화겔 디스크를 제조하였다.
4-6주령 웅성 Balb/c 마우스(20 g, Samtaco, 경기도, 대한민국)를 실험에 이용하였다. 전남대학교 동물연구회에서 승인된 프로토콜 및 NIH(National Institute of Health)에서 발표한 실험동물 사육 및 이용에 대한 가이드(발표 85-23, 개정 1985)에 따라 모든 동물 사육, 실험 및 안락사를 실시하였다. 암세포를 피하주사로 이식하여 암 동물모델을 제조하였으며, 구체적인 동물 모델의 제조 방법은 하기 문헌에 기재된 바와 같다(Sheng-Nan Jiang et al., Mol. Ther., 18(3): 635?642, 2010). 이에 대한 대조군으로는 암 세포를 이식하지 않은 정상 마우스를 이용하였다. 상기 암 동물모델은 오른쪽 등 부위에 암이 발생되는 특징을 가지고 있으며, 이를 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇의 치료효과를 확인하였다.
실험예 1:
S. typhimurium
균주(ΔppGpp)의 항암효과 확인
알긴산(alginate, Junsei Chemical Co.(Japan)) 2 g을 PBS(Phosphate Buffered Saline) 100 ㎖에 혼합하여 용해시킨 후, 상기 알긴산 1 ㎖(2%)에 각각 대장암 세포 CT-26(ATCC, Manassas, VA) 및 유방암 세포 4T1(ATCC, Manassas, VA) 및 1x106 cells/㎖의 세포 용액 1 ㎖을 혼합한 후, 40 mM CaCl2 용액에 세포를 포함한 1% 알긴산 100 ㎕를 떨어뜨려, 젤화반응을 유도하여 세포를 포함한 알긴산 수화겔 비드를 제조하였다. 상기 비드를 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇에 이용되는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)(1x106 cfu/㎖)을 적재하였다. 6시간이 경과한 후, 최종 농도 4 μM의 농도로 EthD-1을 처리하여 세포를 염색하였다. 상기 EthD-1은 죽은 세포만을 선택적으로 적색으로 염색한다.
그 결과, 알긴산에 의하여 스페로이드(spheroid)를 형성한 비드 내에 적색으로 CT-26 및 4T1 세포가 염색되는 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 결과는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 암세포 사멸효과를 입증하는 것이다.
실험예 2: 박테리아 기반의 마이크로로봇의 주화성 확인
2-1: 3-챔버에서의 주화성 확인
상기 실험예 1에서 항암 효과를 확인한 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)가 암 세포에 대하여 선택적 주화성을 갖는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
우선, 상기 실시예 2에서 제조한 미세유체 칩의 채널이 적절히 작동하는지 확인하기 위해, 세포 또는 세포기반 마이크로로봇 로딩용 챔버에 청색 염료를 적재한 후, 청색 염료의 확산정도를 관찰하였다. 그 결과 도 2a에서 나타난 바와 같이, 청색 염료가 세포 또는 세포기반 마이크로로봇 로딩용 챔버로부터 멀어질수록 농도가 떨어지는 정상적인 확산 양상이 나타났다(도 2a 참조). 이러한 결과는 상기 실시예 2의 3-챔버 미세유체 칩이 정상적으로 작동하는 것을 입증하는 것이다.
S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 챔버 내에서의 암 세포에 대한 주화성을 확인하기 위하여 알긴산을 이용하여 스페로이드(spheroid) 형태의 세포를 포함한 알긴산 수화겔 비드을 제조하였고, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색법을 이용하여 수화겔 비드 내에 존재하는 세포를 염색하였다(도 2b 참조).
그 후, 상기 3-챔버 미세유체 칩에서의 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 암 세포에 대한 주화성을 확인하였다. 상기 실시예 2에서 제조한 3-챔버 미세유체 칩을 100 mm 세포배양 접시에 올려놓은 후, PBS 20 ㎖을 부어 상기 미세유체 칩이 완전히 잠기고, 챔버와 채널 내에 기포가 발생하지 않도록 한 뒤, 상기 실시예 2에서 제조한 세포 함유 수화겔 디스크를 분석대상 물질 로딩용 챔버에 적재하여 완전히 가라앉도록 하였다.
그런 다음, 마이크로 챔버 중앙에 S. typhimurium 균주(ΔppGpp) 또는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇(1x106 cfu/㎖)을 적재하였다. 그 후 20분간 5분 단위로 동일한 지점에 대하여 세포 밀도를 조사하였다. 박테리아 밀도는 직접 수를 카운팅하는 대신에 컴퓨터 프로그램(ImageJ, USA)을 이용하여 광학밀도(optical density)를 측정하였다(도 2c). 마이크로로봇의 경우 박테리아에 부착된 비드를 직접 카운팅하고, 이동거리를 측정하여 도 2d에 그래프로 그 결과를 나타냈다.
그 결과, 도 2c 내지 2d에서 나타난 바와 같이, S. typhimurium 균주(ΔppGpp)는 암세포인 CT-26과 4T1로의 이동을 선호함을 알 수 있었다. 이러한 결과는 상기 박테리아 기반의 마이크로로봇에서도 동일함을 알 수 있었다.
실험예 3: 동물 모델에서 박테리아 기반의 마이크로로봇의 암에 대한 운동성 및 주화성 확인
본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇의 암세포에 대한 선택적인 주화성 및 항암 효과를 생체 내(in vivo)에서 확인하기 위하여 동물모델을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
3-1: 암 동물 모델의 발광(luminescence) 및 근적외선 측정
상기 실시예 3에서 제조한 동물모델의 꼬리 정맥을 통하여 S. typhimurium 균주(ΔppGpp), 마이크로비드(3 μm) 또는 박테리아 기반의 마이크로로봇 100 ㎕를 각각 주사하였다. 주사 후, 1일, 3일 째 되는 날 IVIS(in vivo imaging system)를 이용하여 3 그룹 모두 발광(luminescence), 및 Cy5.5 필터를 이용한 근적외선을 측정하였다.
박테리아 생발광을 이미지하기 위하여, 냉각 CCD(charged couple detector) 카메라가 장착된 IVIS 100(Xenogen-Caliper, Hopkinton, MA)의 빛 차단 챔버에 마취된 살아있는 상기 동물 모델 마우스를 놓았다. 루시퍼라아제-발현 박테리아로부터 방출되는 광자를 수집하고 1분에 걸쳐 통합하였다. Living Image software v. 2.25(Xenogen-Caliper, Hopkinton, MA)를 이용하여 광자 카운트를 나타내는 슈도컬러 이미지를 마우스의 사진 상에 오버레이 하였다.
S. typhimurium 균주(ΔppGpp), 마이크로비드 또는 박테리아 기반의 마이크로비드를 투여한지 3일째 되는 날, 형광 및 근적외선을 관찰하였다. 도 4의 a에서 형광을 관찰한 결과, 마이크로비드를 투여한 군에서는 근적외선 물질만이 코팅되어 있어 발광(lumnescence)이 관찰되지 않았으나, S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 경우 암 세포에서 발광이 관찰되었다(도 4a). S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 경우 lux 유전자를 발현시키므로, 발광의 존재 여부로 균주의 이동을 확인할 수 있다. 또한, 근적외선 필터(Cy 5.5)를 이용하여 관찰한 결과 암 조직내에서 S. typhimurium 균주(ΔppGpp) 또는 마이크로비드가 관찰되지 않았으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로비드를 투여한 군에서만 Cy5.5 신호가 관찰되었다. 다만, 도 4의 b에서 관찰되는 바와 같이 마우스의 간과 위 부위에서 약하게 근적외선 신호가 관찰되었으나, 이는 쥐의 사료에 의해서 발생되는 자발형광(autofluorescence)으로, S. typhimurium 균주(ΔppGpp) 또는 마이크로비드에 의한 것이 아님을 확인하였다.
3-2: 암 조직의 근적외선 측정
상기 실험예 3-1에서 관찰된 바와 같이, 동물 모델을 대상으로 근적외선을 측정하였을 때, 자발형광(autofluorescence)에 의한 간섭이 발생하였다. 이에, 상기 동물 모델로부터 암 조직을 적출한 후, 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇이 실제 암 조직에 위치하는지 근적외선 필터(Cy5.5)를 이용하여 확인하였다.
상기 실시예 3-1과 동일하게 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇 투여 3일 째 되는 날, 동물 모델 마우스로부터 암 조직을 적출한 후, 근적외선 필터를 이용하여 적출한 암 조직의 근적외선을 관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 S. typhimurium 균주(ΔppGpp) 또는 마이크로비드를 투여한 동물 모델의 암 조직에서는 Cy5.5 형광이 관찰되지 않았다. 반면, 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로비드를 투여한 동물 모델의 암 조직에서는 Cy5.5 형광이 관찰되었다. 이러한 결과는 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)가 결합되지 않은 마이크로비드의 경우, 운동성 및 암에 대한 지향성능이 없으나, 상기 균주가 결합된 마이크로비드(박테리아 기반의 마이크로로봇)의 경우 암 조직을 특이적으로 타겟팅할 수 있음을 입증하는 것이다(도 5a).
또한, 동물에서 적출한 암 조직에서 특이적으로 발생하는 Cy5.5 형광량을 정량화하기 위하여 일정 영역당 발생하는 형광량을 측정하였다(도 5b).
3-3: 조직면역염색방법을 이용한 박테리아 기반의 마이크로비드의 암에 대한 운동성 및 주화성 확인
본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로비드의 암에 대한 운동성 및 주화성을 면역염색방법을 이용하여 재확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 S. typhimurium 균주(ΔppGpp), 마이크로비드 또는 박테리아 기반의 마이크로비드를 각각 투여한 후, 1일, 3일이 경과한 동물 모델을 4% 파라포름알데하이드로 관류(perfusion)시켜 조직을 고정시켰다. 그 후, 암 조직을 적출하여 30% 수크로오스를 포함하는 PBS에 넣어 탈수시킨 후, -80℃에서 조직을 냉동시켰다. 이어, 상기 조직을 냉동절편기(Cryomicrotome)을 이용하여 5 μm 두께로 자른 후, DAPI/Antifade (1:200; Invitrogen)를 이용하여 암 조직의 세포핵(청색)을, S. typhimurium 특이적 항체(1:80; santa cruz biotechnology, inc.)와 Alexa Fluor 488 chicken anti-rabbit (1:100, Invitrogen)를 이용하여 박테리아(녹색)를 염색하였다. 조직염색결과는 공초점 광학 현미경(Olympus)을 이용하여 확인하였다.
도 6은 투여 1일 후, 암 조직의 면역염색 결과를 나타낸 것으로, S. typhimurium 균주(ΔppGpp)(도 6a), 마이크로비드(도 6b), 및 박테리아 기반의 마이크로로봇(도 6c) 투여한 조직의 염색 사진이다. S. typhimurium 균주(ΔppGpp)를 투여한 군은 암 조직에서 녹색 형광이 관찰되었으나, 마이크로비드를 투여한 군은 적색 형광이 관찰되지 않았다. 그러나 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇을 투여한 군에서는 미약하게 적색 형광이 관찰되었다(도 6 참조).
또한, 도 7은 투여 3일 후, 암 조직의 면역염색 결과를 나타낸 것으로, 도 6과 동일한 결과가 관찰되었으며 투여일이 경과함에 따라 마이크로비드의 적색 형광이 1일째에 비하여 다소 강하게 관찰되었다(도 7 참조). 이러한 결과는 스트렙타비딘과 바이오틴의 결합력에 의하여 생체 내에서 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)가 마이크로비드의 표면에 강력하게 부착되어 있으며, S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 암 조직 특이적인 주화성으로 인하여 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇이 암 조직으로 이동된다는 것을 입증하는 것이다.
실험예 4: 동물 모델에서
S. typhimurium
균주(ΔppGpp)와 마이크로비드의 결합 확인
이어, 본 발명자는 공초점 현미경의 z-stack 기능을 이용하여, S. typhimurium 균주(ΔppGpp)와 마이크로비드가 결합되어 있는지를 재확인하였다.
우선, 상기 조직절편에서 녹색(S. typhimurium 균주(ΔppGpp))과 적색(마이크로비드)가 함께 존재하는 위치를 임의로 선정한 후(도 8a), 이를 z-stack 기능을 이용하여 형광의 동일한 곳에 위치하는지 확인하였다. 그 결과, 도 8b 및 8c에 나타난 바와 같이, 동일한 위치에서 녹색과 적색 형광이 관찰됨에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로비드는 암 조직 내에 강력하게 결합된 상태로 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 8b 및 C).
실험예 5: 마이크로비드의 크기에 따른 항암효과
본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아기반의 마이크로봇을 구성하는 마이크로비드의 크기에 따른 항암효과를 비교하였다. 구체적으로, 상기 실험예 1 내지 4에서 이용한 3 μm 마이크비드와 6 μm 마이크로비드를 이용하여 제조한 박테리아기반의 마이크로봇을 이용하여 암세포에 대한 선택적인 주화성 및 항암효과를 확인하였다.
5-1: 암 동물 모델의 발광 및 근적외선 측정
상기 실험예 3과 동일한 방법으로 발광(luminescence)을 측정하였다. 이때, 비교를 위하여 6 μm 마이크로비드를 이용하여 제조한 박테리아 기반의 마이크로봇을 주사한 동물모델을 더 제조하여, 3 μm 마이크로비드의 박테리아 기반의 마이크로봇과 비교하였다.
주사 후, 1일, 3일 째 되는 날, IVIS(in vivo imaging system)를 이용하여 발광(luminescence)을 측정하였다. 발광을 관찰한 결과, 마이크로비드의 크기에 따라 발광의 정도에 차이가 관찰되었다(도 9b, 9c). 6 μm 마이크로비드에 비하여 3 μm 마이크로비드를 이용하여 제조된, 마이크로봇의 발광이 강하였다. 이에 대한 대조군으로 도 9a에서 S. typhimurium 균주(ppGpp), 3 μm 마이크비드 및 6 μm 마이크비드를 각각 투여하였을 때의 발광을 관찰하였으며, S. typhimurium 균주(ppGpp)를 투여한 마우스에서 발광이 관찰되었다(도 9a)
주사 후, 1일, 3일 째 되는 날 IVIS(in vivo imaging system)를 이용하여 Cy5.5 필터를 이용한 근적외선을 측정하였다. 근적외선 필터(Cy 5.5)를 이용하여 관찰하였을 때에도, 6 μm 마이크로비드의 마이크로봇에 비하여, 3 μm 마이크로비드의 마이크로봇에서 Cy5.5 신호가 좀 더 강하게 관찰되었다(도 9e, 9f). 다만, 관찰되는 신호가 간과 위 부위에 걸쳐 발생하고 있어, 자발형광으로 생각되었다.
5-2: 암 조직의 근적외선 측정
근적외선의 관찰 결과, 자발형광에 의한 간섭이 발생되었기 때문에, 주사 3일 째 되는 날 동물모델로부터 암 조직을 추출한 후, 추출한 암 조직의 근적외선을 측정하였다.
그 결과, 도 9g에 나타난 바와 같이, 3 μm 마이크비드를 이용하여 제조한 마이크로봇을 투여한 동물모델의 조직에서만 Cy5.5 형광이 관찰되었으며, 6 μm 마이크비드를 이용하여 제조한 마이크로봇에서는 Cy5.5 형광이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 마이크로비드의 크기가 마이크로봇의 암 조직에 대한 운동성에 영향을 미친다는 것을 나타내는 것이다.
종합하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리아 기반의 마이크로로봇은 S. typhimurium 균주(ΔppGpp)의 암 조직에 대한 주화성으로 동물모델에서도 암 조직을 특이적으로 타겟팅(targeting)하며, 스트렙타비딘과 바이오틴의 결합을 적용함으로써, 암 조직 내에서 결합되어 치료효과를 충분히 제공할 수 있다.
본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
Claims (11)
- 바이오틴(biotin)이 표면에 결합된 Salmonella, Clostridium, Bifidobacterium, E. coli, Yersinia enterocohtica, Listeria monocytogenies, Mycoplasma hominis 및 Streptococcus로 구성된 군으로부터 선택되는 약독화 박테리아와 스트렙타비딘(streptavidin)이 표면에 코팅되고, 적어도 하나 이상의 항암제 또는 조영제가 봉입된 직경 1 내지 5 μm의 마이크로비드를 포함하는 암 조직에 대한 약물운반체.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 약독화 박테리아는 ppGpp 합성능이 결여된 변이체인, 약물운반체. - 제1항에 있어서,
상기 암은 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약물운반체. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 조영제는 형광단백질 또는 발광단백질을 코딩하는 유전자, 또는 단순포진바이러스의 티미딘인산효소(herpes simplex virus thymidine kinsease), 도파민수용체(dopamine receptor), 소마토스타틴 수용체(somatostatin receptor), 소디움-요오드 수송체(sodium-iodide transporter), 철 수용체, 트렌스페린 수용체(transferrin receptor), 페리틴(ferritin) 또는 철 수송체(magA)를 포함하는 핵의학 또는 MRI 영상용 마커를 코딩하는 유전자인, 약물운반체. - 제1항에 있어서,
상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 시타라빈(cytarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 펜토스타틴(pentostatin), 메토트렉세이트(methotrexate), 7-에틸-10-히드록시캄프토테신(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 덱사메타손(dexamethasone)에서 선택되는 1종 이상인, 약물운반체. - 제1항에 있어서,
상기 마이크로비드는 생분해성/생적합성 고분자 물질로 제작되는, 약물운반체. - 제8항에 있어서,
상기 생분해성/생적합성 고분자 물질은 키토산, 그 염 및 그 유도체; 덱스트란 및 그 유도체; 아카시아 검(Acacia gum); 트라가칸친(Tragacanthin); 히알루론산(Hyaluronic acid), 그 염 및 그 유도체; 펙틴(Pectin), 그 염 및 그 유도체; 알긴산(Alginic acid), 그 염 및 그 유도체; 아가(Agar); 갈락토만난(Galactomannan), 그 염 및 그 유도체; 잔탄(Xanthan), 그 염 및 그 유도체; 베타-사이클로덱스트린(β-Cyclodextrin), 그 염 및 그 유도체; 아밀로오스(Amylose, 수용성 전분), 그 염 및 그 유도체; 글리콜 키토산(Glycol chitosan), 그 염 및 그 유도체; 카르복시메틸 셀룰로오스(Carboxylmethyl cellulose, CMC), 그 염 및 그 유도체; 히드록시에틸 셀룰로오스(Hydroxyethyl cellulose, HPS), 그 염 및 그 유도체; 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스(Hyroxypropyl methyl cellulose, HPMC), 그 염 및 그 유도체; 메틸셀룰로오스(Methyl cellulose), 그 염 및 그 유도체; 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트(Cellulose acetate phthalate), 그 염 및 그 유도체; 젤라틴(Gelatin), 그 염 및 그 유도체; 및 프로타민 설페이트(Promaine sulfate); 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트) [Poly(β-hydroxyethyl methacrylate), PHEMA]; 폴리아크릴아미드(Poluacrylamide, PA); 폴리비닐알코올(Polyvunyl alcohol, PVA); 폴리아크릴산(Polyacrylic acid, PAA); 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene gylcol, PEG); 폴리(에틸렌옥사이드-b-프로필렌 옥사이드) [Poly(ethylene oxide-b-propylene oxide), PER-PPO]; 및 폴리리아신(Polylyasine)에서 선택되는 1종 이상인, 약물운반체. - (a) 상기 제1항, 제3항, 제4항, 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약물운반체의 약제학적 유효량; 및
(b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 상기 약물운반체에는 항암제가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 대장암 또는 유방암 치료용 약제학적 조성물. - (a) 상기 제1항, 제3항, 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 약물운반체; 및
(b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고, 상기 약물운반체에는 조영제가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 대장암 또는 유방암 이미지용 조성물.
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