KR102592184B1 - 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주 및 이의 용도 - Google Patents

약독화 살모넬라 갈리나룸 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자, type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능을 유도하는 유전자 (ssrAB), 및 Gifsy 2 prophage 유전자가 모두 결실된 신규한 약독화 살모넬라 균주, 및 이를 이용한 종양 치료 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

약독화 살모넬라 갈리나룸 균주 및 이의 용도 {Attenuated salmonella gallinarum and use thereof}
본 발명은 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자, type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능을 유도하는 유전자 (ssrA, ssrB, 또는 ssrAB), 및 Gifsy 2 prophage 유전자가 모두 결실된 신규한 약독화 살모넬라 균주, 및 이를 이용한 종양 치료 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
2019년 암으로 사망한 사람은 총 81,203명으로 전체 사망자의 27.5%가 암으로 사망하고 있다. 따라서, 암은 가장 일반적인 사망원인이라 할 수 있으며, 국가암정보센터에 따르면 전국 단위 암발생통계를 산출하기 시작한 1999년 이후 최근까지 그 발병률은 증가되고 있다.
발병률 증가 요인으로는 대기오염 등 환경오염물질의 증가와 같은 환경적 요인 및 식생활의 서구화에 따른 고지방식의 섭취, 음주 및 흡연과 같은 개인적인 요인의 증가에 따른다. 따라서, 암의 조기 예방 및 치료를 위한 항암 소재 개발의 중요성이 더욱더 중요해지고 있다. 또한, 뚜렷한 치료 방법이 없는 난치성 암종의 경우, 발병률은 낮지만 사망률이 높으므로 치료제 개발이 시급하다. 다만, 화합물 기반의 항암제는 암세포 외에도 전신에 작용하는 비특이성을 나타내는 경우가 많으므로, 부작용의 발생이 문제점으로 지적되고 있다.
한편, 박테리아 감염이 항암효과를 보인다는 보고 이후, 항종양 박테라아 균주 개발에 관련된 연구가 급격히 증가하였다. 최근 20년 동안 연구된 항종양 박테리아는 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 클로스트리디움 (Clostridium), 락토코쿠스 (Lactococcus), 시겔라 (Shigella), 비브리오 (Vibrio), 리스테리아 (Listeria), 에스케리키아 (Escherichia) 및 살모넬라 (Salmonella) 등이다. 다만, 이와 같은 균주를 사용한 암 치료의 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않은 상황이다.
상기 제시된 다양한 균주 중, 기존 개발된 약독화 살모넬라 균주의 경우 암 세포뿐만 아니라 다양한 정상 장기에 분포하여 암세포 표적화율이 낮아, 균주 자체에 의한 부작용이 문제되고 있다. 특히, 면역 기능이 약화된 환자나 노약자의 경우 약독화 살모넬라 균주에 의해서도 치명적인 패혈증이 유발될 수 있어, 치료 효과를 고려한다고 해도 개선책이 요구된다. 따라서, 종양 표적능 및 생체 내 안정성이 월등히 높으면서도 암 치료에 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 균주의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 생체 내 안전성이 높고, 종양 표적능, 생존율 및 치료능이 우수하면서도, 정상 장기에 대한 표적능 및 생존율이 매우 낮은 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주를 개발하기 위한 연구를 수행하여, 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-2015573호
본 발명은 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자, type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능을 유도하는 유전자, 및 Gifsy 2 prophage 유전자가 결실된, 신규한 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자, type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능을 유도하는 유전자, Gifsy 2 prophage 유전자 및 glmS 유전자가 결실된, 신규한 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 우수한 항종양 효과를 갖는 살모넬라 갈리나룸 SG4044 균주(미생물 수탁 번호: KCTC14541BP) 또는 SG4048 균주 (미생물 수탁 번호: KCTC14542BP)를 제공한다.
본 발명의 균주를 포함하는 종양 치료 또는 진단을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 균주를 피검체에 투여하는 단계; 상기 균주의 생물 발광 (bioluminescence)을 검출하는 단계; 및 생물 발광이 검출될 경우 피검체에 종양이 존재하는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 종양 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명은 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자, type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능을 유도하는 유전자, 및 Gifsy 2 prophage 유전자가 결실된 것을 특징으로 하는 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자, type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능을 유도하는 유전자, Gifsy 2 prophage 유전자 및 glmS 유전자가 결실된, 신규한 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주에 관한 것이다.
본 발명의 균주는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 glmS 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주에 관한 것이다.
상기 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자는 relA 또는 spoT일 수 있다.
상기 type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능을 유도하는 유전자는 유전체에 연속적으로 배열되어있는 ssrA, 또는 ssrB, 또는 ssrAB이다.
본 발명은 살모넬라 갈리나룸 SG4021 균주 (미생물 수탁 번호: KCTC13985BP)에서 relA, spoT, ssrAB 및 Gifsy 2 prophage 유전자가 결실된 약독화 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum) 균주에 관한 것이다.
본 발명은 살모넬라 갈리나룸 SG4021 균주 (미생물 수탁 번호: KCTC13985BP)에서 relA, spoT, ssrAB, Gifsy 2 prophage 및 glmS 유전자가 결실된 약독화 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum) 균주에 관한 것이다.
일 실시태양에서, 본 발명의 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주는 살모넬라 갈리나룸 SG4044 균주 (미생물 수탁 번호: KCTC14541BP)일 수 있다.
일 실시태양에서, 본 발명의 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주는 살모넬라 갈리나룸 SG4048 균주 (미생물 수탁 번호: KCTC14542BP)일 수 있다.
본 발명의 균주는 발광 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
상기 발광 유전자는 luxCDABE일 수 있다.
본 발명은 상기 균주를 포함하는 종양 진단 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 종양은 고형암 또는 선암종일 수 있고, 바람직하게 대장암, 췌장암, 폐암, 피부암 또는 유방암일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 상기 균주를 피검체에 투여하는 단계; 상기 균주의 생물 발광 (bioluminescence)을 검출하는 단계; 및 생물 발광이 검출될 경우 피검체에 종양이 존재하는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 종양 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명의 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 생성능 결여, type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능 상실 및 Gifsy 2 prophage 유전자 결실을 통해 제작된 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주는 종양을 특이적으로 표적화 할 수 있고, 종양 증식 저해 활성이 우수함과 동시에 종양 이외의 정상 조직의 피해를 최소화할 수 있으므로, 종양의 개선 또는 치료 및 영상화에 있어서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 야생형 (SG4021), ppGpp 결실 (SG4023) 및 ppGpp, ssrAB, Gypsi 2 prophage (SG4044) 결실 살모넬라 갈리나룸의 아미노산 요구도를 조사한 결과이다.
도 2는 야생형 살모넬라 갈리나륨 균주 (SG4021)의 정맥 투여에서, 각 투여량에 따른 마우스의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 ppGpp, ssrAB, Gypsi 2 prophage 결실 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4046)의 정맥 투여에서, 각 투여량에 따른 마우스의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 ppGpp 결실 살모넬라 티피뮤리움 균주 (SMR2130)의 정맥 투여에서, 각 투여량에 따른 마우스의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 GlmS + pLux 플라스미드로 형질전환된 glmS 결실 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4050) 및 야생형 살모넬라 균주 (SG4021)의 플라스미드의 안정성을 비교한 그래프이다.
도 6은 GlmS + pLux 플라스미드로 형질전환된 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4050)를 정맥 투여한 후 다양한 종양에 대한 표적화 결과를 생물 발광 신호 이미징을 통해 나타낸 사진이다.
도 7은 ppGpp, ssrAB, Gifsy 2 prophage 결실 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4044) 및 ppGpp 결실 살모넬라 티피뮤리움 균주 (SMR2130)를 정맥 내 투여한 CT26 세포가 이식된 마우스에서, 시간에 따른 종양의 부피를 나타낸 그래프 및 이식된 종양의 변화를 나타낸 사진이다 (N= 5/Group).
도 8은 ppGpp, ssrAB, Gifsy 2 prophage 결실 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4044) 및 ppGpp 결실 살모넬라 티피뮤리움 균주 (SMR2130)를 정맥 내 투여한 CT26 세포가 이식된 마우스에서, 시간에 따른 마우스의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 ppGpp, ssrAB, Gifsy 2 prophage 결실 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4046) 및 ppGpp 결실 살모넬라 티피뮤리움 균주 (SMR2130)를 정맥 내 투여한 CT26 세포가 이식된 마우스에서, 각 장기별 살모넬라 균주의 수를 시간에 따라 나타낸 그래프이다 (N= 5/Group).
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자, type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능을 유도하는 유전자, 및 Gifsy 2 prophage 유전자가 결실된 약독화 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum) 균주에 관한 것이다.
종래 박테리아를 이용한 항암표적치료 연구에 이용 빈도가 가장 높은 살모넬라 균주는 살모넬라 티피뮤리움이며, 살모넬라 티피뮤리움의 감염에 따른 병원성을 고려하여 반듯이 약독화 후 연구에 이용된다 (Forbes,N.S. (2010). Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nature Reviews Cancer, 10(11), 785-794.). 살모넬라 속은 혈청학적 분류법에 따라 대략 2500종으로 분류될만큼 다양하며 이중 일부 균주가 숙주 특이적 병원을 보유한다고 보고되었다 (Porwollik, S; Boyd, EF; Choy, C; Cheng, P; Florea, L; Proctor, E; McClelland, M (September 2004)). 예를 들어, 살모넬라 티피 (salmonella Typhi) 및 살모넬라 파라티피 (salmonella paratyphi)는 인간을 숙주로 하는 병원 기전을 보유하며, 살모넬라 티피뮤리움 (salmonella typhimurium)은 인간을 포함하여 소, 돼지, 양, 말, 설취류 등에 감염하여 병증을 유발한다고 보고되었다. 반면, 살모넬라 갈리나룸 (salmonella gallinarum)은 오직 조류에만 특이적으로 감염하여 병원성을 나타낸다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주는 인간에게 가장 안전하면서도 종양의 진단 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약독화"는 균주의 병원성이 감소하도록 변형된 것을 말한다. 균주는 약독화에 의하여, 종양 세포 이외의 정상 세포에서 균주의 병원성에 의해 나타날 수 있는 세포 독성 및 기타 부작용의 방지가 가능하다. 약독화 균주는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 약독화는 균주가 숙주 세포에서 생존하도록 하는 독성인자 (virulence factor)의 결실 또는 파괴에 의해 달성될 수 있으며, pab, proBC, nadA, pncB, pmi, rpsL, ompR, htrA, hemA, rfc, poxA, galU, aro, galE, cya, crp, cdt, pur, phoP, phoQ, ssa, guaA, guaB, clpP, clpX, fliD, flgK, flgL, relA, spoA 및 spoT 유전자, 및 ssaV, sseBCD, ssrAB, sopB, sseF, sseG를 포함한 살모넬라 패소제니시티 아일랜드 (salmonella pathogenicity island, SPI)에 암호화된 유전자들의 결실에 의해 달성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "ppGpp"는 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate)를 말하며, 구아노신 5`-이인산 3`-이인산 (guanosine 5`-diphosphage 3`-diphosphate) 또는 구아노신 3`5`-비스파이로인산 (guanosine 3`5`-bispyrophosphate)으로 혼용되어 사용될 수 있다. ppGpp는 세포 내 신호 전달 물질로, 살모넬라 갈리나룸 균주의 독성을 나타내도록 하는 유전자 중 특히 살모넬라 패소제니시티 아일랜드 (Salmonella Pathogenicity Island, SPI)에 암호화된 것들의 발현을 유도한다. 또한, 본 발명에서 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자는 relA 및 spoT 유전자를 의미할 수 있다.
relA 및 spoT 유전자의 동시 결실은 유전자의 전사 또는 번역, 유전자 산물의 활성의 손상 (impairment)을 초래하는 relA 및 spoT 유전자의 변형 (modifications)에 의해 달성될 수 있다. 이러한 유전자 변형은 ppGpp 합성효소 코딩 서열 (CDS)의 불활성화뿐만 아니라 이의 프로모터의 불활성화도 포함할 수 있다.
살모넬라 갈리나룸 균주의 게놈 상에서 목적한 유전자만의 특이적 불활성화는 유전자를 코딩하는 전체 또는 하나 이상의 부분 영역에서 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통한 돌연변이에 의해 달성될 수 있다. 예들 들어, 유전자의 결실 및 유전자로의 이형 서열 (heterogenous sequence)의 삽입에 의하여, 유전자의 절단 (truncation), 넌센스 돌연변이 (nonsense mutation), 틀이동 돌연변이 (frameshift mutation), 미스센스 돌연변이 (missense mutation) 등이 발생할 수 있다. 이와 같은 유전자의 특이적 불활성화는 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법을 통하여 수행될 수 있다. 한편, 유전자의 결실은 당업계에 공지된 다양한 변이유발 (mutagenesis) 방법을 통하여 수행될 수 있다. 예를 들어, relA 및 spoT 유전자의 결실은 PCR 돌연변이 유발법 및 카세트 돌연변이 유발법으로 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어, "type III 분비 시스템 (T3SS)"은 유전체 상에 연속적으로 배열되어 있는 ssrA 및 ssrB 유전자에 의해 조절된다. ssrB는 전사 조절자로 막 단백질인 ssrA에 의해 인산화되어 활성을 가진다. 따라서, 살모넬라 갈리나룸 유전체 상에서 상기 ssrA 및/또는 ssrB의 제거를 통한 기능 상실은 살모넬라 패소제니시티 아일랜드 2 (salmonella pathogenicity island 2, SPI2)에 포함된 오페론 및 유전자들 전체를 불활성화시키는 결과를 나타낼 수 있다. 살모넬라는 숙주로의 감염 후 SPI2로 인코딩된 type III 분비 시스템 (T3SS)를 배포하여 숙주 세포 기능을 수정하고 숙주 세포 내에서 번식한다.
본 발명에서, Gifsy 1 및 2는 박테리아를 표적으로 하는 바이러스 (박테리오파지, bacteriophage)를 의미한다. 본 발명자들은 야생형 살모넬라 갈리나룸의 유전체 검사 결과에 따라 Gifsy 2 prophage를 코딩하는 전체 유전자 서열이 포함되어 있는 것을 확인하였으며, 살모넬라 유전체 내에 삽입되어 있는 상기 유전자의 결실로 살모넬라의 병원성을 낮출 수 있다.
박테리아를 숙주로 하는 박테리오파지의 유전체 제거는 병원성을 낮춰 약독화에 도움을 준다.
따라서, relA, spoT, ssrAB 유전자 및 Gifsy 2 prophage를 코딩하는 유전자 전체가 결실된 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주는 야생형 살모넬라 갈리나룸 대비 독성이 백만배 이상 약화될 수 있으므로, 살모넬라 갈리나룸 균주의 효과적인 약독화가 가능하다.
glmS 유전자가 결실된 살모넬라 갈리나룸 균주는 펩티도글리칸 합성 성분인 D-glucosamine (GlcN) 또는 N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)이 부족하여 동물에서 용해될 수 있으므로, 항생제 내성 유전자 대신 glmS 유전자는 살모넬라 갈리나룸 균주의 선택적 결정 인자로 사용될 수 있다.
균형-치사 숙주-벡터 시스템 (balanced-lethal host-vector system)은 염색체 상의 glmS 결실 돌연변이를 상보하기 위한 glmS 유전자를 포함하는 플라스미드의 형질전환에 의하여 구축될 수 있다. glmS 유전자를 포함하는 플라스미드가 성공적으로 형질전환된 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주는 GlcN 또는 GlcNAc의 생합성이 가능하므로, GlcN 또는 GlcNAc이 부족한 환경에서도 생존이 가능하여 선택적 마커로 작용할 수 있다.
본 발명의 플라스미드는 당업계에서 사용되는 플라스미드, 예를 들어, pcDNA 시리즈, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 플라스미드는 하나 이상의 선택성 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 유전자가 이에 해당될 수 있다. 예를 들어, 글리포세이트 (glyphosate), 글루포시네이트암모늄 (glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 암피실린 (ampicillin), 카나마이신 (kanamycin), G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제에 대한 내성 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 플라스미드의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 플라스미드를 살모넬라 갈리나룸 균주에 도입하여 형질전환하는 방법은, 당업계에서 핵산을 세포 내로 도입하기 위하여 일반적으로 사용되는 방법일 수 있으며, 당업계에서 공지된 적합한 표준 기술을 선택하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 법, DEAE-텍스트란법, 양이온 리포좀법 및 초산 리튬-DMSO법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "작동가능하게 연결된"은 유전자 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 서열은 복제 원점 (replication origin), 프로모터 및 전사 종결 서열 (terminator) 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 전사 종결 서열은 폴리아데닐화 서열 (pA)일 수 있으며, 복제 원점은 f1 복제 원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 또는 BBV 복제 원점 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로모터"는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 프로모터는 특정 유전자의 전사 개시를 조절하는 전사 조절 서열 중 하나로, 약 100bp 내지 약 2500bp 길이의 폴리뉴클레오티드 단편일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터, T7 프로모터, pBAD 프로모터, Tet 프로모터, trc 프로모터, pepT 프로모터, sulA 프로모터, pol11(dinA) 프로모터, ruv 프로모터, uvrA 프로모터, uvrB 프로모터, uvrD 프로모터, umuDC 프로모터, lexA 프로모터, cea 프로모터, caa 프로모터, recN 프로모터 및 pagC 프로모터 및 합성된 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "발광 유전자"는 생체내 (in vivo) 또는 생체외 (ex vivo, in vitro) 영상 촬영이 가능할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 말하며, 다양한 유래의 생물발광 유전자 (예를 들어, 루시퍼라제 유전자), 화학 발광 유전자, 형광 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 유전자에 의해 발현되는 발광현상의 촬영장비는 당업계에 공지되어 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 발광 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 살모넬라 갈리나룸 균주는 종양을 표적화하므로, 종양의 시각적인 모니터링이 가능하여 종양 치료의 정확도 및 치료 효과를 높일 수 있다. 본 발명의 발광 유전자와 사용될 수 있는 영상장비는 사용하는 발광 유전자의 종류에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 "luxCDABE "는 루시퍼라제를 암호화하는 유전자 (luxA 및 luxB의 이종이량체)와 상기 루시퍼라제의 기질인 루시페린 (Tetradecanal)을 암호화하는 유전자 (luxC, luxD 및 luxE)를 모두 포함하고 있는 DNA 단편이다. 발광물질인 루시페린 (luciferin)이 세포 내에서 ATP에 의해 활성되어 활성 루시페린으로 변환되고, 활성 루시페린이 발광효소인 루시페라아제 (luciferase)의 작용에 의해 산화 루시페린으로 되면서 화학에너지를 빛에너지로 전환시켜 빛을 발하게 된다.
본 발명의 발광 유전자로 형질전환된 살모넬라 갈리나룸 균주에 의해 표적화된 종양세포는 발광 유전자에 의해 검출될 수 있으므로, 피검체의 종양 존재 여부 및 피검체에 존재하는 종양의 위치, 크기 및 시간의 경과에 따른 피검체에 존재하는 종양의 변화 양상 등에 대한 정보를 수득할 수 있다.
본 발명에서 대장암, 췌장암, 폐암, 피부암 및 유방암 세포주에 대한 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주의 표적화 및 항암 활성이 확인되었으며, 선암종 중 하나인 CT26 종양 마우스 모델에서 본 발명의 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주의 우수한 항암 효과가 확인되었다.
본 발명의 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주는 대장암, 췌장암, 폐암, 피부암 및 유방암 등 다양한 선암종 또는 고형암의 표적화 및 종양 억제 활성을 나타낼 수 있다.
선암 (adenocarcinoma)은 특히 선 (gland)을 구성하고 있는 세포에서 발생하는 암으로써 위, 장, 기관지, 자궁, 담낭 등의 점막을 비롯하여, 전립선, 소, 갑상선, 이자의 선 조직이나 배설기관에서 발생하는 암을 말한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
약독화 살모넬라 갈리나룸 균주 제작 및 종양 억제 활성 평가 방법
1-1. 살모넬라 균주 성장
1% NaCl을 함유한 LB 배지 (Difco Laboratories)에서 Salmonella spp를 37℃ 격렬한 공기 공급 (Vigorous aeration)으로 성장시켰다. 고체 지지 배지 (Solid support medium)는 1.5% 과립 한천 (Difco Laboratories)을 포함하여 제조하였으며, 항생제는 Sigma chemical에서 구매하였다. 필요한 경우, 항생제인 앰피실린 (Ampicillin, Amp), 카나마이신 (Kanamycin, Km) 및 클로람페니콜(Chloramphenicol, Cm)을 각각 100 ㎍/ml, 50 ㎍/ml 및 15 ㎍/ml의 농도로, N-아세틸-D-글루코사민 (N-acetyl-D-Glucosamine, GlcNAc)을 100 mg/ml 농도로 첨가하였다. 액체 배지 내의 박테리아 수는 hemocytometer를 이용하여 측정하였다.
1-2. 살모넬라 균주 계통
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 혈청형 갈리나룸 (Gallinarum) 돌연변이체는 한국 양계장에서 가금티푸스 (Fowl typhoid)가 있는 닭의 간에서 분리한 임상 분리주 (Clinical isolate)인 SG4021에서 유래된 것을 사용하였으며, SG4021 균주는 한국생명공학연구원에 2019년 10월 8일자로 기탁하였다 (미생물 수탁 번호: KCTC13985BP). 또한, SG4044 및 SG4048 균주를 한국생명공학연구원에 2021년 4월 20일자로 기탁하였다 (미생물 수탁 번호: KCTC14541BP, KCTC14542BP).
균주 계통 표시 방법
Salmonella gallinarum SG4021 Wild type-clinical isolate
SG4022 relA::kan R , spoT::cm R
SG4023 ΔrelA, ΔspoT
SG4030 ΔrelA, ΔspoT, glmS:: kan R
SG3005 ΔssrAB:: kan R
SG4041 (DJ1110) ΔrelA, Δspot, ssrAB:: kan R P22 (from SG3005) Transduction
SG4042(TH1001) Gifsy 2 prophage:: cm R Lambda-Red homologous recombination
SG4043(TH1004) SG4041, ΔrelA, Δspot, ssrAB:: kan R , Gifsy 2 prophage:: cm R P22 (from SG4042) Transduction
SG4044
(TH1005)		 SG4043, ΔrelA, Δspot, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage Transformation with pCP20
SG4045 SG4041, ΔrelA, Δspot, ΔsrAB Transformation with pCP20
SG4046 SG4045, ΔrelA, Δspot, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage:: cm R P22 (from SG4042) Transduction
SG4047 SG4044, ΔrelA, Δspot, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage, glmS:: kan R P22 (from SG4030) Transduction
SG4048 SG4047, ΔrelA, Δspot, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage, ΔglmS Transformation with pCP20
SG4049 SG4044, ΔrelA, Δspot, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage /GlmS + _ P Lux Transformation with GlmS + _ P Lux
SG4050 SG4048, ΔrelA, Δspot, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage, ΔglmS /GlmS + _ P Lux Transformation with GlmS + _ P Lux
Salmonella typhimurium SHJ2037 relA::kan R , spoT::cm R
SMR2130 ΔrelA, ΔspoT
모든 살모넬라 균주 계통은 Datsenko 및 Wanner (Proceedings of the National Academy of Sciences 97.12 (2000): 6640-6645)에 의해 개발된 방법에 따라 제작되었으며, 살모넬라 균주의 약독화는 ppGpp, ssrAB 및 Gifsy 2 prophage 결실 (ΔppGpp, ΔssrAB, ΔGypsi 2 prophage)에 의하여 유도되었다.
ppGpp 결실 돌연변이는 SG4021의 게놈에 relA::kan R 및 spot:: cm R 의 순차적 도입에 의해 유도되었다. ssrAB 결실 돌연변이는 SG4021의 게놈에 ssrAB::kan R 의 도입에 의해 유도되었다 (SG3005). ppGpp 및 ssrAB 결실 돌연변이의 제작을 위해, 우선 ppGpp 제작을 위해 도입된 항생제 저항성 유전자의 불활성화를 진행하였으며 (kan R 및 CM R ), ssrAB::kan R 을 포함하는 유전체를 보유한 SG3005 균주에 P22 박테리오파지 (bacteriophage)를 형질도입 (transduction)하여 ssrAB::kan R 유전자를 포함하는 박테리오파지를 생산하였다. 항생제 저항성 유전자의 불활성화는 FLP 재조합 효소 발현이 유도되는 pCP20 (Helper plasmid)의 형질전환 방법의 도입을 통해 완성되었으며, 본 발명을 위해 제작된 모든 돌연변이 살모넬라 갈리나룸의 항생제 저항성 유전자 결실 방법은 동일하다.
불활성화된 ppGpp 결실 돌연변이에 ssrAB::kan R 유전자를 포함하는 박테리오파지를 형질도입하여 ΔrelA, ΔspoT, ssrAB::kan R 돌연변이를 제작하였다 (SG4041). 야생형 살모넬라 갈리나룸 (clinical isolate)의 박테리오파지 (Gifsy 2 prophage) 유전체 존재 여부는 야생형 살모넬라 갈리나룸의 전체 유전체 서열 검사 방법을 통해 1종의 박테리오파지 유전체 (Gifsy 2 prophage)가 존재한다는 것이 확인되었으며, 약독화를 위해 해당 prophage 유전체는 Lambda-Red homologous recombination 방법을 이용하여 SG4021의 게놈의 prophage 유전자를 클로람페니콜 (Chloramphenicol, cm) 저항성 유전자로 치환하는 것 (Gifsy 2 prophage::cm R )을 통해 제거되었으며, Gifsy 2 prophage 유전체 결실 돌연변이 살모넬라 갈리나룸이 제작되었다 (SG4042).
ppGpp, ssrAB, Gifsy 2 prophage 결실 돌연변이 살모넬라 갈리나룸의 제작은 Gifsy 2 prophage::cm R 을 포함하는 박테리오파지 (P22, SG4042 균주 활용)를 우선 제작하고 SG4041 균주에 형질도입하는 것을 통해 제작되었다 (ΔrelA, ΔspoT, ssrAB::kan R , Gifsy 2 prophage::cm R ; SG4043). 약독화 살모넬라 갈리나룸의 항암제 개발에 있어 과도한 항생제 내성 문제의 회피를 위해 SG4043 균주에서 항생제 저항성 유전자가 모두 제거된 SG4044 (ΔrelA, ΔspoT, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage) 균주가 개발되었으며, 본 발명에서 제작한 약독화 살모넬라 균주의 효능 및 가치 평가를 위해 클로람페니콜 저항성 유전자만을 보유한 균주가 제작되었다 (ΔrelA, ΔspoT, ΔssrAB, Gifsy 2 prophage::cm R ; SG4046).
SG4046 균주 개발을 위해 카나마이신 (kanamycin) 저항성 유전자가 제거된 SG4045 (ΔrelA, ΔspoT, ΔssrAB) 균주가 제작되어 활용되었다. glmS 개방형 해독틀 (open reading frame) 위치에, 카나마이신 저항성 유전자 (kan R )를 운반하는 유전자는 40-뉴클레오티드 (nt) 상동성 신장 (homology extension) 및 pKD13을 주형으로 하는 20-nt 프라이밍 서열을 포함하는 각각 한 쌍의 60-nt 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 체인 반응 (Polymerase chain reaction, PCR)으로 생성되었다. 프라이머의 염기서열 및 서열번호는 하기 표 2에 나타내었다. PCR 반응에 사용된 주형 (template)은 야생형 살모넬라 갈리나룸의 bacterial chromosomal DNA가 이용되었다.
프라이머 프라이머 염기서열 (5`→3`) 서열번호
rel A::kan R Forward GTGGATCGCAAGCCTGGGAATTTCCAGCCAGCAGTCGTGTGAGCGCTTAGG TGTAGGCTGGAGCTGCTTC 서열번호 1
Reverse GTGCAGTCGCCGTGCATCAATCACATCCGGCACCTGGTTCAGCTTACCGAA TTCCGGGGATCCGTCGACC 서열번호 2
spot::cm R Forward TTAAGCGTCTTCGGCAGGCGTATCTCGTTGCACGTGACGCTCACGAGGGCT GTAGGCTGGAGCTGCTTC 서열번호 3
Reverse GCCAGATGTACGCGATCGCGTGCGGTAAGGCGAATAAAGGTACTATAGACC ATATGAATATCCTCCTTAG 서열번호 4
ssrAB:: kan R Forward ATGAATTTGCTCAATCTCAAGAATACGCTGCAAACATCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 서열번호 5
Reverse TTAATACTCTATTAACCTCATTCTTCGGGCACAGTTAAGTATTCCGGGGATCCGTCGACC 서열번호 6
Δ Gifsy 2 prophage:: cm R Forward TATAAATTTAATATACTAACCAGTAACCATATCAGTTATGACAGACAGGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 서열번호 7
Reverse AGAACACAGAGAAAATGTCATTGCATATGGTCAAAAAATAGACATATTTAGGTCCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTCC 서열번호 8
정제된 PCR 생성물을 전기천공법 (electrophoration)에 의해 pKD46을 보유하는 약독화 살모넬라 (ΔrelA, ΔspoT; SG4023)에 형질전환하였고, 이를 통해 glmS 유전자 결실 약독화 살모넬라 갈리나룸이 제작되었다 (ΔrelA, ΔspoT, glmS::kan R ; SG4030). glmS 유전자 결실 약독화 살모넬라 갈리나룸 (ΔrelA, ΔspoT, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage, glmS::kan R ) 제작을 위해 glmS::kan R 을 포함하는 P22 파지 (phage)가 우선 제작되었으며 (SG4030 균주 활용), 이후 SG4044 (ΔrelA, ΔspoT, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage)에 준비된 glmS::kan R 을 포함하는 P22 파지를 형질도입하여 ΔrelA, ΔspoT, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage, glmS::kan R (SG4047) 돌연변이 살모넬라 갈리나룸 균주가 제작되었다.
약독화 살모네라 갈리나룸의 항암제 개발에 있어 과도한 항생제 내성 문제의 회피를 위해 SG4047의 카나마이신 저항성 유전자는 상기와 동일한 방법을 통해 제거되어, 최종 균주인 ΔrelA, ΔspoT, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage, ΔglmS 살모넬라 갈리나룸 균주가 제작되었다 (SG4048).
살모넬라 균주는 특히 동물 내에서 생존에 필요하지 않는 리포터 유전자를 포함 및 운반하는 플라스미드를 방출하는 경향이 있으므로, 선택적 결정 인자를 위해 항생제 내성 유전자를 활용하는 것은 불가능하다. 따라서, 증식을 위한 필수 영양분으로 펩티도글리칸 합성성분인 D-glucosamine (GlcN) 또는 N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)이 부족하여 동물계에서 용해되는 glmS 결실 돌연변이 표현형을 이용하였다.
1-3. GlmS + pLux 플라스미드
생물 발광에 의한 종양 표적화 능력 평가 및 염색체 상의 glmS 유전자 결실을 보완하기 위하여, 살모넬라 갈리나룸 균주의 glmS 유전자를 통합시킨 균형 치사 숙주 벡터 시스템 (balanced lethal host vector system)을 제작하였다.
구체적으로, Photobacterium leiognathi의 lux 오페론 (luxCDABE, 약 9.5kbp)을 함유하는 pLux를 pUC19 플라스미드 백본에 XbaI 제한 효소 부위에 삽입하였다. Lux 오페론 카세트 및 glmS를 모두 함유하는 플라스미드를 제작하기 위하여, 살모넬라 갈리나룸 균주의 glmS 유전자를 특이적 프라이머로 증폭하였다. 프라이머의 염기서열 및 서열번호는 하기 표 3에 나타내었다. PCR 반응에 사용된 주형 (template)은 야생형 살모넬라 갈리나룸 (SG4021)의 bacterial chromosomal DNA가 이용되었다.
프라이머 프라이머 염기서열 (5`→3`) 서열번호
glmS Forward ACGCGGTCGACATGTGTGGAATTGTTGGCGCT 서열번호 9
Reverse ACGCGGTCGACTTACTCTACGGTAACCGATTTCGCC 서열번호 10
pLux 벡터와 증폭된 1.8kbp 단편을 Sal I 제한 효소를 이용하여 단편의 양 말단을 자르고, T4 디엔에이 라이게이즈 (T4 DNA ligase)에 의해 접합하는 방법을 통해 GlmS + pLux를 생성하였다.
제작된 GlmS + pLux로 형질 전환된 glmS 결실 돌연변이 살모넬라 갈리나룸 균주는 D-glucosamine (GlcN) 또는 N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)이 부족한 환경에서도 생존이 가능하며, 생물 발광을 나타내므로 광학 생물 발광 이미지에 의한 분석이 가능하다.
1-4. 종양 세포주
American type culture collection에서 마우스 (Murine) 유래 CT26 (결장 종양 세포주), 4T-1 (유방 종양 세포주), B16F10 (흑색 종양 세포주) 및 LL2 (LLC-1, 폐 종양 세포주)를 구입하였으며, National cancer institute_ Division of cancer treatment & Diagnosis (DCTD)로부터 마우스 (Murine) 유래 Panc02 (췌장 종양 세포주)를 구입하였다. 10% 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS) 및 1% 페니실린-스트랩토마이신을 함유하는 고 포도당 DMEM (Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium)에서 CT26, 4T-1, LLC-1 및 Panc02 세포주를 성장시켰으며, 10% 소태아혈청 및 1% 페니실린-스트랩토마이신을 함유하는 RPMI1640에서 B16F10 세포주를 성장시켰다.
1-5. 플라스미드 안정성 측정
12시간마다 보충되는 Flesh LB 배지에서 밤새 계대배양 (1/1000)하였다. 24시간마다 샘플을 채취하고 희석하였다. 엠피실린의 유무와 관계없이 GlcNAc가 보충된 LB 플레이트 위에 적절한 부피를 3회 스프레드하였다. 콜로니의 수를 사용하여 총 생존 세포 (콜로니 형성 단위, CFU) 및 플라스미드를 갖는 살모넬라 균주의 비율을 계산하였다.
1-6. 마우스 모델 제작
배양된 다양한 종양 세포주를 마우스의 우측 허벅지에 이종이식하여 마우스 종양 모델을 제작하였다. Samtako company (한국)에서 20 내지 30kg의 5 내지 8주령 암컷 마우스를 구입하였다. 승인된 프로토콜에 따라 모든 동물에 대한 관리, 실험 및 안락사가 수행되었다.
피하 (Subcutaneous) 종양을 갖는 마우스를 하기의 방법으로 제작하였다. 시험관 내에서 배양된 실시예 1-4의 종양 세포주를 수거하고, 30ml PBS에 현탁시킨 다음, CT26, 4T-1, LLC-1 및 B16F10 세포주는 1x106개를, Panc02 세포주는 1x107개를 마우스 우측 허벅지에 피하 주사하였다. CT26 및 4T-1 세포주는 Balb/C 마우스에, LLC-1, Panc02 및 B16F10 세포주는 C57/BL6 마우스에 이식하였다.
종양 세포 이식 후, 종양의 크기가 60mm3에 도달하였을 때, 실시예 1-3의 GlmS + pLux로 형질전된, glmS 결실 돌연변이 약독화 살모넬라 갈리나룸 (SG4050)을 약 5x108 CFU로 정맥 주사하였고, 실시예 1-2의 ppGpp, ssrAB, Gifsy 2 prophage 결실 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4044 또는 SG4046, 5x108 CFU) 또는 ppGpp 결실 살모넬라 티피뮤리움 (SMR2130, 1x107 CFU) 균주를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다.
1-7. 마우스 내부 장기별 살모넬라 균주 분포 평가
살모넬라 균주의 생존 수를 평가하기 위하여, 마우스 그룹 (n=5)에 약 1x107 CFU ΔppGpp 살모넬라 티피뮤리움 (SMR2130) 및 약 5x108 CFU ΔppGpp, ΔssrAB, Gifsy 2 prophage (SG4046) 살모넬라 갈리나룸 균주를 정맥 투여한 후 1, 3, 5, 10, 15일째에 마우스를 희생하여 장기를 수집하고, 장기 조직을 균질화기를 사용하여 0.05% Tween-20을 함유하는 멸균 PBS에서 균질화하였다. 균질액으로부터 살모넬라 균주를 회수하고, 카나마이신 50㎍/ml 및 클로람페니콜 15㎍/ml를 함유하는 한천 플레이트 상에 스프레딩하여 정량화하였다.
1-8. 종양 크기 및 마우스 생존율 분석
하기의 계산식으로 종양 부피를 계산하였다.
[계산식]
종양 부피 (mm3) = (종양 길이 x 종양 높이 x 종양 폭) /2
모든 동물 실험은 전남대학교 동물 실험 윤리위원회 (NO. CNUIACUC-H-2016-15)에 의해 승인되었고, 지침에 따라 종양 부피가 1,500mm3 이상인 마우스는 희생하였으며, Gehan-Breslow-Wlicoxon 테스트에 따라 마우스의 생존율을 평가하였다.
1-9. 광학 생물 발광 이미징
종양을 표적으로 하는 지표로서 살모넬라 균주의 생물 발광 (Bioluminescence)을 이용하여 이미징하였다. 종양 표적능을 위하여 마우스를 2% 이소플루란으로 마취시킨 다음, 냉각 CCD (charged couple detector) 카메라가 장착된 IVIS100 (Caliper, Hopkinton, MA, USA)의 빛 차단 챔버에 놓았다. 루시퍼라제 발현 살모넬라 갈리나룸 균주로부터 방출되는 광자를 수집하고 1분에 걸쳐 통합하였다. Living image software v.2.25 (Xenogen-Caliper, Hopkinton, MA)를 이용하여 광자 카운트를 나타내는 슈도 컬러 이미지를 마우스의 사진상에 오버레이하였다.
1-10. 통계 분석
SPSS 18.0 통계 패키지 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. Two-tail Student`s t-test를 사용하여 대조군과 치료군 사이의 종양 성장의 통계적 유의성을 결정하였다. 0.05 이하의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었으며, 모든 데이터를 평균 ± SD로 표시하였다.
[실시예 2]
약독화 살모넬라 갈리나룸 균주의 생체 내 독성 여부 및 플라스미드 안정성 확인
2-1. 살모넬라 갈리나룸 균주의 아미노산 요구 확인
하기 도 1에 나타낸 바와 같이, 살모넬라 갈리나룸 야생종은 Leucine (Leu)이 첨가된 최소배지에서만 자라며, Arginine (Arg)과 Phenylalanine (Phe)이 첨가되면 그 성장이 개선되는 것을 확인하였다. ppGpp 결실 약독화 살모넬라 갈리나룸은 이외에도 Isoleucine (Ile), Lysine (Lys), Serine (Ser) 및 Valine (Val)이 첨가된 최소 배지에서 성장하였다. 따라서, ppGpp 결실 살모넬라 갈리나룸은 ppGpp 결실 살모넬라 티피뮤리움 (LT2)과 비교하여 요구되는 아미노산이 적은 것을 확인하였다 (Tedin and Norel, J Bacteriol, 2001, 183:6184-6196).
2-2. 살모넬라 갈리나룸 균주의 생체 내 독성 평가
세균성 암 치료에 살모넬라 갈리나룸 균주를 적용하기 위하여, 먼저 정맥 내 (intra vein, IV) 경로를 통해 야생형 살모넬라 갈리나룸 균주를 주사한 후 마우스 생존율을 분석하였다.
하기 도 2에 나타낸 바와 같이, 마우스에 야생형 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4021)를 정맥 투여할 경우, Fowls에서만 장티푸스가 유발되었음에도 불구하고 약 105 CFU 이상을 투여하였을 때 모든 마우스가 사망하였다.
2-3. 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주의 생체 내 독성 평가에 따른 투여 용량 확인
상기 실시예 2-2에서 야생형 살모넬라 갈리나룸 균주는 마우스 생체 내 독성을 보유하는 것으로 확인되어, ppGpp, ssrAB, Gifsy 2 prophage 결실을 통해 살모넬라 갈리나룸 균주를 약독화하였다.
구체적으로, ΔppGpp, ΔssrAB, Gifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4046) 및 DppGpp 살모넬라 티피뮤리움 균주 (SMR2130)를 Blab/C 마우스에 정맥 투여하여 마우스 생존율을 분석하였다.
장기별 균주 분포 검사시 정확한 균수 확인을 위하여 항생제 마커를 포함하는 SG4046를 사용하였다.
하기 도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, ΔppGpp, ΔssrAB, Gifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4046)의 경우 약 5x108 CFU까지 마우스가 생존한 것을 확인하였고, ΔppGpp 살모넬라 티피뮤리움 균주 (SMR2130)의 경우 약 1x107 CFU까지 마우스가 생존한 것을 확인하였다.
종양 표적능 및 항종양 효과가 확인된 약독화 살모넬라 티피뮤리움 (A1-R)의 실험 결과를 확인하였을 때, 변형된 리포폴리사카라이드, msbB 결실 돌연변이 (VNP20009) 및 ΔrfaG / ΔrfaD 이중 돌연변이를 갖는 균주는 약 1x106 내지 약 1x107 CFU의 범위에서 치료 범위가 형성되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 약독화 살모넬라 갈리나룸은 약독화 살모넬라 타이피뮤리움에 비해 생체 내 안정성이 약 15배 이상 높으므로 더욱 우수한 안정성을 갖는 것을 알 수 있다.
또한, 생체 내 안정성이 확보된 것으로 인정되는 대장균 (Escherichia. Coli)의 유효 투여량이 약 1x108 CFU (투여 경로: Intra vein, IV)인 것과 비교하면, 본 발명의 약독화 살모넬라 갈리나룸의 생체내 안정성은 현저히 우수한 것을 알 수 있다.
2-4. 플라스미드 안정성 확인
형질전환된 플라스미드의 안정성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-5를 수행하여 플라스미드의 소실 여부를 평가하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 야생형 살모넬라 균주 (SG4021)에 의해 운반된 플라스미드의 99%가 4일째 소실된 반면, glmS 결실 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4050)에 의해 운반된 플라스미드는 완전히 유지되는 것을 확인하였다.
이후의 실험에서는 종양 형성 마우스에서 살모넬라 갈리나룸 균주를 시각화하기 위하여, 상기 실시예 1-3의 GlmS + pLux로 형질전환된, 염색체 상에 돌연변이 glmS 유전자를 보유하는 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4050)를 사용하였다.
[실시예 3]
약독화 살모넬라 갈리나룸 균주에 의한 종양 표적화 확인
ΔppGpp, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주의 종양 표적화를 확인하기 위하여, 실시예 1-9를 수행하여 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주의 생물 발광 신호를 이미징하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, ΔppGpp, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage, ΔglmS 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4050) 주사 직후 (20분, 0 Day post injection (dpi))에는 생체 내 발광 신호는 주로 내피 기관 (간 및 비장)에서 검출되는 것을 확인하였지만, 주사 3일 후 (3 dpi)의 생체 내 발광 신호는 이식된 종양 조직에서만 나타나는 것을 확인하였다. 특히, 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주는 4개의 서로 다른 마우스 라인에 이식된 모든 종양을 특이적으로 표적화하는 것을 확인하였다.
따라서, ΔppGpp, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage, ΔglmS 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4048)는 우수한 종약 표적화 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
[실시예 4]
CT26 종양 마우스 모델에서 ΔppGpp, Δ ssrAB , ΔGifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주의 항암 효과 확인
4-1. 약독화 살모넬라 갈리나룸의 항종양 효과 및 생존 기간 연장 확인
CT26 세포가 이식된 Blab/C 마우스에 약 5x108 CFU ΔppGpp, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4044)를 정맥 내 투여하였으며, 대조군으로 PBS 처리군 및 ΔppGpp 살모넬라 티리뮤리움 균주 (1x107 CFU, SMR2130)를 사용하여 ΔppGpp, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주의 생체 내 항종양 활성을 상기 실시예 1-8 및 1-10을 수행하여 분석하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 약 5x108 CFU ΔppGpp, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4044)를 대장 종양 형성 마우스에 처리한 결과, 대조군과 비교하여 종양 성장이 유의하게 지연되는 것을 확인하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, ΔppGpp, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주 (SG4044)를 처리한 그룹은 대조군보다 생존 기간이 약 2배 이상 연장된 것을 확인하였다. 측정된 생명 연장 기간은 ΔppGpp 살모넬라 티리뮤리움 균주 처리 그룹에서는 약 24일, PBS 처리 그룹에서는 15일이었으며, ΔppGpp, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주로 처리된 그룹의 평균 생존 기간은 38일이었다.
4-2. 마우스 내 살모넬라 균주 분포 패턴 확인
마우스 내 살모넬라 갈리나룸 균주의 분포 패턴을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-7을 수행하여 시간에 따른 마우스 장기별 살모넬라 균수 분포를 평가하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, ΔppGpp, ΔssrAB, Gifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주 (5x108, SG4046) 및 ΔppGpp 살모넬라 티피뮤리움 균주 (1x107, SMR2130)를 투여한 군 모두에서 주사 3일 후 (3 dpi)에 종양 내에서 가장 많은 살모넬라 균주가 관찰되었으며, 종양 내에서 10일 동안 유사한 수준으로 균수를 보유하다가 10일 이후에 점차 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 약독화 살모넬라 티피뮤리움 (SMR2130)의 경우, 주사 1일 후 (1 dpi) 간에 106 CFU/g, 비장에 107 CFU/g, 폐, 신장 및 심장에 104 CFU/g, 혈청에 102 CFU/g으로 존재하는 것을 확인하였으며, 이러한 정상 조직 내 균수는 혈액 샘플을 제외한 기타 다른 조직에서 실험 기간 동안 동일한 수준이 검출되었다. 반면, 약독화 살모넬라 갈리나룸 (SG4046)의 경우, 주사 1일 후 (1 dpi) 약독화 살모넬라 티피뮤리움 (SMR2130)과 유사한 수준의 균수가 검출되었지만, 이후 점차 감소하여 15일에는 완전히 제거된 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 ΔppGpp, ΔssrAB, ΔGifsy 2 prophage 살모넬라 갈리나룸 균주는 종양을 특이적으로 표적하여 항종양 효과를 나타내므로, 다른 장기에 부작용 우려없이 항종양 용도로 사용될 수 있는 것을 알 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC13985BP 20191008 한국생명공학연구원 KCTC14541BP 20210420 한국생명공학연구원 KCTC14542BP 20210420
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Claims (16)

  1. 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자, type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능을 유도하는 유전자, 및 Gifsy 2 prophage를 암호화하는 전체 유전자가 결실된 것을 특징으로 하는 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주.
  2. 제1항에 있어서, 추가로 glmS 유전자가 결실된 것을 특징으로 하는 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 구아노신 4인산 (Guanosine tetraphosphate, ppGpp) 합성효소를 암호화하는 유전자는 relA 또는 spoT인 것을 특징으로 하는 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 type III 분비 시스템 (type III secretion system, T3SS)의 기능을 유도하는 유전자는 ssrA, ssrB 또는 ssrAB인 것을 특징으로 하는 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 균주는 살모넬라 갈리나룸 SG4021 균주 (미생물 수탁 번호: KCTC13985BP)에서 relA, spoT, ssrAB, 및 Gifsy 2 prophage 전체 유전자가 결실된 것을 특징으로 하는, 약독화 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum) 균주.
  6. 제2항에 있어서, 상기 균주는 살모넬라 갈리나룸 SG4021 균주 (미생물 수탁 번호: KCTC13985BP)에서 relA, spoT, ssrAB, Gifsy 2 prophage 전체 유전자, 및 glmS 유전자가 결실된 것을 특징으로 하는, 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주.
  7. 제1항에 있어서, 상기 균주는 살모넬라 갈리나룸 SG4044 균주(미생물 수탁 번호: KCTC14541BP)인 것을 특징으로 하는, 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주.
  8. 제2항에 있어서, 상기 균주는 살모넬라 갈리나룸 SG4048 균주 (미생물 수탁 번호: KCTC14542BP) 인 것을 특징으로 하는, 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주.
  9. 제2항에 있어서, 상기 균주는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 glmS 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 것을 특징으로 하는 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주.
  10. 제1항에 있어서, 상기 균주는 발광 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로하는 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주.
  11. 제10항에 있어서, 상기 발광 유전자는 luxCDABE인 것을 특징으로 하는 약독화 살모넬라 갈리나룸 균주.
  12. 제1항 내지 제11항의 어느 한 항의 균주를 포함하는 종양 진단 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 종양은 고형암인 것을 특징으로 하는, 종양 진단 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 종양은 선암종인 것을 특징으로 하는, 종양 진단 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 상기 종양은 대장암, 췌장암, 폐암, 피부암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암인 것을 특징으로 하는 종양 진단 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 제10항의 균주를 피검체에 투여하는 단계;
    상기 균주의 생물 발광 (bioluminescence)을 검출하는 단계; 및
    생물 발광이 검출될 경우 피검체에 종양이 존재하는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 종양 진단을 위한 정보 제공 방법.
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