KR101434500B1 - 검정콩으로부터 추출한 안토시아닌을 포함하는 전립선암의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 검정콩에서 추출한 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 전립선암의 예방, 치료 또는 개선용 약학 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 검정콩에서 추출한 안토시아닌을 유효성분으로 포함하는 전립선암의 예방, 치료 또는 개선용 약학 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
전립선암은 미국에서는 남성암 중 1위, 우리나라에서는 5위를 차지할 정도로 높은 발병률과 사망률을 가지고 있는 중요한 전립선 질환이다 (Jemal A, et al. CA Cancer J Clin 2009; 59: 225-249; Jung KW, et al., J Korean Med Sci 2009; 24: 995-1003). 전이성 전립선암 환자는 초기에 남성 호르몬의 생성을 차단하거나 기능을 억제시키는 남성 호르몬 박탈 요법으로 치료를 받으며, 대부분의 환자가 처음에는 호르몬 요법에 좋은 반응을 보이지만, 평균 18~24개월 후에는 호르몬 요법에 반응하지 않는 남성 호르몬 비의존성 상태로 진행되어서, 혈중 전립선특이항원(PSA)치가 상승하고 통증이 나타나며 1-2년 이내에 사망에 이르게 된다. 결국 대부분의 전립선암으로 인한 사망은 호르몬 불응성 전립선암(Hormone refractory prostate cancer, HRPC)으로의 진행에 의해 발생한다고도 볼 수 있다.
전립선암은 현재 개발된 치료법으로는 그 치료 효과가 미흡하며, 평균 생존기간도 약 40~60주에 불과하여 통증완화 및 삶의 질 향상을 위한 치료가 주로 시행된다. 진통제 투여, 항암 화학치료제 사용, 통증이 심한 전이 부위에 대한 방사선 치료, 전신 골전이로 인한 통증에 대한 스트론튬-89 투여, 골전이에 대한 약물 투여 등이 시행되며, 최근 일부에서 유전자 치료법, 면역 요법과 같은 시험적인 치료방법의 개발이 시도되고 있으나 그 효과는 아직 속단하기 이른 상황이다. 즉 호르몬 불응성 전립선암 환자들에게 효과적인 치료방법의 개발이 절실히 필요한 실정이며 따라서 이에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
한편, 검정콩은 필수 지방산, 레시틴, 섬유질 및 사포닌 등을 함유하고 있어 고혈압, 당뇨병, 동맥경화 및 비만증과 같은 성인병의 예방 및 치료에 효과가 있다고 알려져 있다. 검정콩에 함유된 식물성 섬유는 변비는 물론 대장암 예방효과도 있다고 알려져 있으며, 동의보감에서는 검정콩에 대하여 오장을 보호하고 12경을 도와 장을 따스하게 하며 종기를 없애고 절임증을 치료하는 효과가 있다고 언급하고 있다.
또한, 검정콩에 포함되어 있는 색소성분인 안토시아닌은 수용성 색소 배당체 물질로서, 항산화 작용, 노화억제작용 및 항균작용 등이 알려져 있다. 안토시아닌은 하이드록실기의 개수와 특정 하이드록실기의 메틸화에 의해 크게 6종의 안토시아니딘으로 구분되고, 안토시아니딘과 결합된 당의 종류와 아실기의 종류 및 결합 위치에 따라 수백종으로 구분되는데, 각 안토시아닌의 종류에 따라 그 활성에 차이가 있는 것으로 알려지고 있다.
검정콩 유래의 안토시아닌의 의약 용도와 관련하여, 국내등록특허 제10-0832240호는 검정콩 껍질로부터 추출한 안토시아닌의 창상 치료용도를 제공하고 있으며, 국내등록특허 제10-0785466호는 검정콩에서 추출한 안토시아닌이 NF-kB의 활성을 억제하고 심장의 허혈-재관류로 인한 심근괴사를 억제함으로써 동맥경화 및 심장병을 치료하는 용도를 제공하고 있다. 또한, 국내등록특허 제10-0880876호는 검정콩 껍질로부터 추출한 안토시아닌을 피부 피판이나 조직의 허혈-재관류 손상의 치료 용도를 제공하고 있으며, 국내공개특허 제10-2010-0127017호는 당뇨 치료 용도로 제공하고 있다. 그러나 상기 문헌들을 포함하여 선행 문헌의 어디에도 검정콩에서 추출된 안토시아닌의 전립선암에 대한 의학적 효과에 대해서는 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 전립선암에 효과적인 치료제를 개발하기 위하여 노력한 결과, 검정콩 유래의 안토시아닌이 전립선암 세포주 DU-145 의 세포 생장을 저해하고 세포 사멸을 유도한다는 것과 세포 사멸의 메커니즘을 확인할 수 있었다. 나아가, DU-145 세포의 이식으로 전립선암을 유도한 누드 마우스 모델에서 안토시아닌의 투여로 인해 종양 형성이 현저히 억제됨을 확인하였다. 이에, 검정콩 유래의 안토시아닌이 인 비트로 및 인 비보에서 모두 전립선암 치료 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 검정콩에서 추출한 안토시아닌을 포함하는 전립선암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 검정콩에서 추출한 안토시아닌을 포함하는 전립선암의 예방 및 개선을 위한 식품 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 검정콩에서 추출한 안토시아닌을 포함하는 전립선암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 검정콩에서 추출한 안토시아닌을 포함하는 전립선암의 예방 및 개선을 위한 식품 조성물에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명에서 검정콩에서 추출한 안토시아닌은 델피니딘-3-O-글루코사이드(delphinidin-3-O-glucoside), 시아니딘-3-글루코사이드(cyanidin-3-O-glucoside) 및 피투니딘-3-O-글루코사이드(petunidin-3-O-glucoside)를 포함하는 것이다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 검정콩에서 추출한 안토시아닌은 델피니딘-3-O-글루코사이드 15 내지 35 중량%, 시아니딘-3-글루코사이드 55 내지 75 중량%, 및 피투니딘-3-O-글루코사이드 1 내지 10 중량%를 포함하는 것이다.
또한 바람직하게, 본 발명의 조성물은 전립선암, 특히 호르몬 불응성 전립선암에 대한 예방, 치료 및 개선 효과가 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 검정콩은 델피니딘-3-O-글루코사이드, 시아니딘-3-글루코사이드 및 피투니딘-3-O-글루코사이드를 다량 함유하고 있는 한, 그 품종에 특별한 제한을 두지 않고 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 검정콩 품종의 예로, 국내에서 육성된 청자, 청자 2호, 청자 3호, 일품검정, 일품검정 2호, 대흑 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 청자 3호를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 델피니딘-3-O-글루코사이드 15 내지 35중량%, 시아니딘-3-글루코사이드 55 내지 75 중량%, 및 피투니딘-3-O-글루코사이드 1 내지 10중량%를 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 조성물은 델피니딘-3-O-글루코사이드 10 내지 30중량%, 시아니딘-3-글루코사이드 60 내지 70 중량%, 및 피투니딘-3-O-글루코사이드 3 내지 10 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명에서 검정콩에서 안토시아닌의 추출은, 델피니딘-3-O-글루코사이드, 시아니딘-3-글루코사이드 및 피투니딘-3-O-글루코사이드을 함유하는 한, 추출 방법 및 추출 용매를 불문하고 본 발명의 범위에 포함된다. 바람직하게, 본 발명의 검정콩 추출물은, 검정콩 또는 검정콩 종피를 물, C3 내지 C5의 케톤, 및 C1 내지 C4의 직쇄 또는 분지형 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 얻어진 추출물, 그 추출물에서 물, C5 내지 C7의 알칸, C1 내지 C4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 분획된 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다. 바람직한 추출용매는 물 또는 에탄올이다.
또한 본 발명에서 검정콩에서 안토시아닌의 추출은, 통상의 식물 추출물의 제조방법에 따라 수행할 수 있으며, 바람직하게는 열수 추출, 가압 추출, 환류 추출, 온침 추출, 초음파 추출 등에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기한 바와 같이 제조된 추출물은 이후 감압 여과과정을 수행하거나 추가로 농축 및/또는 동결건조를 수행하여 농축하거나 용매를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에서의 검정콩 추출물은 통상적 방법으로 건조된 건조물과 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물을 포함하는 의미로 사용된다.
바람직하게, 본 발명에서 전립선암은 호르몬 불응성 전립선암일 수 있다.
호르몬 불감성 전립선암은 호르몬 요법에 반응하지 않는 남성 호르몬 비의존성 상태의 전립선암을 말한다.
본 발명의 조성물의 전립선암에 대한 예방, 치료 및 개선 활성은, 호르몬 비의존성 전립선암 세포주인 DU-145 세포 및 상기 전립선암 세포를 누드 마우스에 이식한 동물 모델을 통하여 인 비트로 및 인 비보 상에서 직접적으로 입증되었다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 검정콩에서 추출한 안토시아닌의 항증식성 효과 및 아포토시스 유도 효과를 알아보기 위하여, 본 발명자들은 안드로겐-비의존성 DU-145 인간 전립선암 세포주에서 실험을 하였다.
구체적으로, MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 분석을 사용하여 세포 생장 및 생존률을 측정하고, DNA 래더링을 통하여 세포사멸을 측정하였다. 카스파아제가 세포사멸 유도에 관여하는지 알아보기 위하여, 활성 카스파아제의 단백질 수준의 변화 및 안토시아닌에 의한 세포사멸 마커의 수준의 변화를 측정하였다. 또한 안토시아닌이 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR) 발현 및 혈청 전립선특이항원(prostate specific antigen, PSA) 생성 조절에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 특정 농도에서 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 6주령의 수컷 BALB/c 누드 마우스에 2주간 8mg/kg 의 안토시아닌을 처리한 후 2x106 DU-145 세포를을 옆구리에 피하 투여하여 이종이식편을 만들었다. 캘리퍼를 사용하여 매일 종양의 부피를 측정하였고 (길이 X 넓이2)/2 의 공식에 따라 계산하였다.
안토시아닌을 세포에 처리한 결과 세포 생장이 농도 의존적으로 유의하게 저해됨을 확인할 수 있었고 (도 1A), 안토시아닌을 DU-145 세포에 후처리한 24시간 후 IC50 값이 60~90μM으로 확인되었으며 (도 1B), DNA 래더링에서 DNA 단편이 관찰되었다 (도 1C). 또한, 안토시아닌의 처리로 세포에서 Bcl-2 의 단백질 수준이 유의적으로 감소하면서 동시에 Bax 단백질의 수준이 증가하였고, 이러한 결과는 안토시아닌이 세포사멸을 유도하는 데 p53 및 Bcl-2(Bax/Bcl2 비율)이 관여한다는 것을 나타낸다(도 2). 또한, 안토시아닌을 처리한 실험군이 대조군에 비하여 PSA 의 수준이 상당히 감소한 것으로 나타났으며, AR 발현의 감소가 관찰되었으며(도 3), 이종이식편에서, 비히클 처리한 마우스에 비하여 안토시아닌 처리한 마우스에서 접종 8주 및 12주 후에 통계적으로 유의한 정도로 종양 발달의 차이가 관찰되었다 (P<0.01; 도 4).
이들 데이터를 종합하여, 본 발명자들은 안토시아닌이 인 비보 시스템에서 DU-145 세포의 종양형성(tumorigenicity)을 억제하거나 지연시키는 효과적인 항암제로 개발될 수 있다는 결론을 내리게 되었다.
이상과 같이, 본 발명은 DU-145 세포 및 이를 이용한 전립선암 동물 모델을 통하여 검정콩 유래의 안토시아닌이 전립선암 세포의 생장을 억제하고 세포 사멸을 유도함으로써 종양 형성을 저해하는데 기여할 수 있음을 처음으로 규명하였다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우, 상기 조성물 내의 상기 안토시아닌 또는 검정콩 추출물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 바람직하게는 0.001 내지 50중량%인 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
상기 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 적어도 한 가지 이상의 부형제 및/또는 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함될 수 있다.
상기 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 보다 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물의 투여량은 유효성분을 기준으로 1일 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 하는 것이 좋으나 이에 제한되는 것은 아니다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육, 피하주사 등에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 유효성분의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 사용될 경우, 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 식품은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 각종 식품, 건강기능 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 식품의 예로서 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 건강기능식품, 음료, 식품첨가제 또는 음료첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
또한, 상기 식품에 있어서, 상기 안토시아닌 또는 검정콩 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.00001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 식품이 음료인 경우에는 식품 전체의 부피 100 ml 를 기준으로 0.001 g 내지 50 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 10 g의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 검정콩에서 추출한 안토시아닌을 포함하는 조성물은 전립선암 세포주 DU-145 의 세포 생장을 저해하고 세포 사멸을 유도하며, 전립선암 동물 모델에서 종양 형성을 현저히 저해하는 효과가 있어, 전립선암 치료를 위한 약학적 및 식품학적 응용이 가능하다.
도 1은 안토시아닌이 DU-145 세포의 생존률에 미치는 영향을 나타낸다. (A) 는 DU-145 세포에 특정 농도의 안토시아닌을 24, 48 및 72 시간에 처리하고 MTT 분석을 통해 세포 생존률을 분석한 결과를 나타낸다. (B) 는 DU-145 세포에 안토시아닌을 24시간 처리한 후 세포 생존률을 분석한 결과를 나타낸다. (C) 는 특정 농도의 안토시아닌을 처리한 DU-145 세포에서 세포사멸이 유도됨을 DNA 래더링 분석으로 확인한 것이다.
도 2는 안토시아닌이 DU-145 세포에서 p53, Bax, 및 Bcl-2 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 p53, Bax, 및 Bcl-2의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타내고, (B)는 β-actin에 대한 상대적인 Bax 의 농도 분석 결과를 나타내고, (C)는 β-actin에 대한 상대적인 Bcl-2의 농도 분석 결과를 나타내고, (D)는 Bax/Bcl-2를 나타내며, (E)는 β-actin에 대한 상대적인 p53의 농도 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 안토시아닌이 DU-145 세포에서 PSA 생성 및 안드로겐 수용체(AR) 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A) 는 AR 및 PSA 에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타내고, (B) 는 β-actin에 대한 PSA 의 상대적인 값을 나타낸 농도 분석 결과를 나타내며, (C) 는 β-actin에 대한 AR 의 농도 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 무흉선 누드 마우스에 DU-145 세포 이종이식편을 확립한 후 안토시아닌을 접종한 실험군과 안토시아닌을 접종하지 않은 대조군에서 시간(주, weeks)에 따른 종양의 부피(mm3)를 나타낸 것이다.
도 2는 안토시아닌이 DU-145 세포에서 p53, Bax, 및 Bcl-2 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A)는 p53, Bax, 및 Bcl-2의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타내고, (B)는 β-actin에 대한 상대적인 Bax 의 농도 분석 결과를 나타내고, (C)는 β-actin에 대한 상대적인 Bcl-2의 농도 분석 결과를 나타내고, (D)는 Bax/Bcl-2를 나타내며, (E)는 β-actin에 대한 상대적인 p53의 농도 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 안토시아닌이 DU-145 세포에서 PSA 생성 및 안드로겐 수용체(AR) 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A) 는 AR 및 PSA 에 대한 웨스턴 블랏 결과를 나타내고, (B) 는 β-actin에 대한 PSA 의 상대적인 값을 나타낸 농도 분석 결과를 나타내며, (C) 는 β-actin에 대한 AR 의 농도 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 무흉선 누드 마우스에 DU-145 세포 이종이식편을 확립한 후 안토시아닌을 접종한 실험군과 안토시아닌을 접종하지 않은 대조군에서 시간(주, weeks)에 따른 종양의 부피(mm3)를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 안토시아닌의 추출 및 성분 분석
본 실험에 사용된 검은콩은 농촌진흥청으로부터 제공 받았으며 본 연구진의 이전 연구(Jang H. et al., J Agric Food Chem 58:12686-91, 2010)에서 시행한 방법과 동일한 방법으로 추출 및 성분 분석을 시행하였다. 검정콩 청자 3호의 종피를 손으로 벗겨 500 g 준비한 후 4℃에서 2일간 80% 에탄올(0.1% 아세트산) 2000ml 로 두 번 추출하였다. 추출된 용액을 0.45 um 필터를 통해 여과시키고 회전 증발기(35℃) 에서 농축하여 안토시아닌 조추출물을 수득하였다. 동결건조에 의해 조추출물 내 잔존 용매를 제거하고 얻어진 적색의 파우더를 -70℃에 보관하였다.
Dionex Ultimate 3000 series (Dionex Softron GmbH, Germering, Germany)를 이용하여 HPLC (High per-formance liquid chromatography)를 시행하여 검은콩 종피의 추출물의 성분을 분석한 결과, 델피니딘-3-O-글루코사이드(Dp3glc), 시아니딘-3-글루코사이드(Cy3glc), 및 피투니딘-3-O-글루코사이드(Pt3glc)로 확인되었고 각 성분의 구성비는 다음과 같았다 (표 1).
| 안토시아닌 함량 (품종: 청자 3호) | 총합 | |||
| Dp3glc | Cy3glc | Pt3glc | ||
| ug/g | 3049.0 | 8277.2 | 791.7 | 12117.9 |
| 중량% | 25.2 | 68.3 | 6.5 | 100 |
실시예
2. 세포 배양
정상 전립선 세포주 RWPE-1 (ATCC, Manassas, VA, USA) 및 안드로겐-비의존성 전립선암 세포주 DU145 (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)을, 10% FBS, L-글루타민 (300 mg/L), 25 mM HEPES, 및 25 mM NaHCO3 이 첨가된 RPMI 1640에서 배양하였다.
실시예
3. 세포 생존력 분석
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 분석을 통하여 세포 생장 및 생존력을 평가하였다. RWPE-1 및 DU-145 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다 (5 X 103 cells per well in 100 mL). RPMI 1640 배지에서 24시간 동안 배양한 후, 세포에 다양한 농도의 안토시아닌(0, 30, 60, 또는 120μM)을 24, 48 또는 72시간 동안 처리하여, 안토시아닌이 세포 생존력에 미치는 영향을 평가하였다. 처리 단계가 끝날 때, 배지를 제거하고 0.5 mg mL- 1 의 MTT 를 첨가하였다. 4시간 후, 각 웰에 DMSO (200 mL)을 첨가하고 570 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 약물 처치에 대한 세포 민감도는 50%의 세포 저해가 나타나는 약물 농도(IC50)로 표현하였다. 모든 실험은 3회 실시하였다.
실시예
4.
DNA
laddering
분석
비히클(vehicle) 또는 안토시아닌(24 또는 48시간 동안 60 또는 120μM)을 처리한 DU-145 세포(5 X 105 cells mL-1)를 PBS 로 세척하였다. 200μl의 결합/용해 버퍼를 첨가하고, 총 부피가 400μl이 되도록 조정하고, 혼합하였다. 15-25℃에서 10분간 인큐베이션 후, 100μl의 이소프로판올을 첨가하고 교반하였다. 샘플을 수집 튜브에 부착된 필터 튜브에 첨가하고 800rpm 에서 1분간 원심분리하였다. 세척 버퍼(500μl)를 첨가하고 800rpm 에서 1분간 2회 원심분리하고, 세번째에는 13,000 rpm 에서 10초간 원심분리하였다. 용출 버퍼(100μl)를 첨가하고, 800rpm 에서 1분간 원심분리하였다. 마지막으로, 1% 아가로스 젤 상에서 75 V로 1.5시간 동안 전기영동하고, 자외선 하에서 확인하였다. 트랜스펙션된 세포 및 대조군 세포의 아포토시스 여부는 DNA laddering 분석법(Gong, J., F. Traganos, and Z. Darzynkiewicz, Anal Biochem, 1994. 218(2): p.314-9)으로 확인하였다.
실시예
5.
웨스턴
블랏
분석
비히클(vehicle) 또는 안토시아닌(24 또는 48시간 동안 60 또는 120μM)을 처리한 DU-145 세포(5 X 105 cells mL-1)를 4℃, 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 추추출하고, 100μl의 용해 버퍼로 상온에서 30분간 처리하여 용해시켰다. 상층액을 추출하고, BCA (bicinchonic acid) 어세이 (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하였으며, SDS-PAGE 젤 상에서 전기영동하였다. 니트로셀룰로오스막으로 옮긴 후, 막을 5% skim milk 로 차단한 다음, 항-p53 항체(1:1,000; Abcam, Cambridge, UK), 항-Bcl-2 항체 (1:1,000; Abcam, Cambridge, UK), 항-Bax 항체, 항-PSA 항체 (1:1,000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 항-AR 항체 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 멤브레인을 TBS-T (TBS, 0.1% Tween 20)로 세척하고, horseradish peroxidase가 결합된 2차 항-마우스 또는 항-래빗 항체 (Invitrogen Corporation, Paisley, UK)를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 로딩 차이를 조정하기 위하여, 멤브레인을 β-actin 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 reprobe 하였다. 화학발광 탐지 시스템(GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)을 이용하여 블랏을 분석하였고, Image J software (NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 농도 분석을 하였다.
실시예
6. 인 비보 종양 이종이식 분석(
In
vivo
tumor
xenograft
study
)
6주령의 수컷 BALB/c 누드 마우스(18-22 g)를 Samtaco Bio Co. (Osan, Korea)에서 제공받아 사용하였다. 1 주의 적응기간 후에, 동물들을 플라스틱 케이지 안에 유지하되 케이지 당 5 마리씩 두었다. 본 실험은 가톨릭대한교 성모병원의 동물실험 관련 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인을 받아 진행하였다 (IRB approval no. CUMC-2011-0026-02). 실험동물은 무작위적으로 2 그룹으로 나누었고(대조군, 안토시아닌 처리군), 각 군은 10마리씩 구성하였다. 안토시아닌 처리군의 동물은 안토시아닌(8 mg/kg)을 1mL 증류수에 녹여 8F red Rob-Nel 카테터를 통하여 하루에 한번씩 매일 12주간 경구 투여하였다. 대조군의 동물들은 같은 방식으로 같은 기간 동안 비히클(vehicle)을 투여하였다. 처치 2주 우에, 종양 이종이식편을 확립하기 위하여 DU-145 세포(2 X 106)를 0.1mL 배지에 현탁하고, 두 그룹의 마우스들의 우측으로 피하 접종하였다. 체중과 종양 부피를 매주 2회씩 캘리퍼를 사용하여 모니터링하였으며, (L X W2)/2 의 공식에 따라 계산하였다 (L 은 길이, W 는 넓이를 의미함).
실시예
7. 통계 분석
모든 실험은 3회씩 독립적으로 실시하였다. 모든 데이터는 평균±표준편차로 나타내었고, p<0.05는 통계학적으로 유의함을 나타낸다. 그룹 간의 전체적인 비교는 SPSS 프로그램(version 12.0)을 사용하여 수행하였다. Student's t-test 및 ANOVA 에 이어 Tukey's test 를 수행하여 그룹 간의 차이를 다중 비교하였다.
실험결과
1. 안토시아닌이
DU
-145 세포의 생장을 저해하고 세포사멸을 유도한다.
안토시아닌이 인간 DU-145 세포의 세포 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여, MTT 분석을 수행하였다. 세포에 안토시아닌을 처리한 결과 측정한 각 시간대에서(24, 48, 72시간) 농도 의존적으로 세포 생장이 유의적으로 저해되었다 (도 1A). 안토시아닌을 DU-145 세포에 처리한 24시간 후 IC50 값이 60~90 μM 으로 확인되었다 (도 1B). 안토시아닌이 세포 생장을 감소시키는 것이 세포사멸 유도와 관련있는지를 알아보기 위하여, 사멸 세포의 특징을 나타내는 세포성 DNA 단편을 검출하기 위한 DNA 래더링을 수행하였다. 특정 농도의 안토시아닌(24 또는 48시간 동안 60 또는 120μM)을 처리한 DU-145 세포로부터 총 DNA 를 분리하여 아가로스 젤 전기영동을 수행한 결과 DNA 래더링의 특징적인 패턴이 나타남을 확인할 수 있었다 (도 1C).
2.
DU
-145 세포에서 안토시아닌의 세포사멸 유도는
p53
및
Bcl
-
2 의
단백질 발현 변화와 관련이 있다.
DU-145 세포에서 안토시아닌이 세포사멸을 유도하는 메커니즘을 이해하기 위하여, 안토시아닌이 세포사멸 마커 발현 수준에 미치는 영향을 알아보았다. 웨스턴 블랏 분석 결과, 안토시아닌을 처리한 세포에서 p53 의 발현이 유의적으로 증가하였으며(도 2A, E), 안토시아닌의 처리로 세포에서 Bcl-2 의 단백질 수준이 유의적으로 감소하면서 Bax 단백질의 수준도 함께 증가함을 확인할 수 있었다(도 2A, B, C). 이러한 변화는 실질적으로 Bax/Bcl2 비율의 증가를 증가시켰으며, 이는 아포토시스에서 관찰되는 결과이다(도 2D). 이러한 결과는 안토시아닌 처리에 따라 p53 및 Bax/Bcl2 비율이 변화하면서 아포토시스를 촉진하는 것을 나타낸다.
3. 안토시아닌이
DU
-145 세포에서
PSA
생성 및 안드로겐 수용체 발현에 미치는 영향
안토시아닌이 임상에서 전립선암 치료의 주요 타겟인 AR 의 발현 조절 및 PSA 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 특정 안토시아닌 농도로 처리한 DU-145 세포에 대한 웨스턴 블랏 분석을 실시하였다. 안토시아닌을 처리하지 않은 DU-145 세포에서 AR 및 PSA 가 발현되었으나, 안토시아닌을 처리한 실험군의 경우 대조군에 비하여 PSA 의 발현 수준이 상당히 감소하였다 (도 3A, B). PSA 의 경우와 유사하게, 안토시아닌을 세포에 처리했을 때 AR 발현이 감소하였다 (도 3A, C).
4. 안토시아닌이 누드 마우스에서
DU
-145
이종이식편의
생장을 저해한다.
안토시아닌이 인 비보에서 종양 생장을 저해하는지를 알아보기 위하여, 무흉선의 누드 마우스에서 DU-145 종양 이종이식편을 확립하였다. 이 동물모델은 실험 과정 동안 유의적인 체중 변화를 나타내지 않았다. 총 12주 동안 매 4주마다 안토시아닌의 항종양 효과를 분석하였다. 안토시아닌을 후접종한 처음 4주에는 두 그룹 간에 초기 검출 시간 및 평균 종양 부피에 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 그러나 8주째에 비히클 처리한 마우스의 경우 평균 종양 부피가 317.3 mm3 으로 증가하였음에 반하여 안토시아닌을 처리한 마우스의 경우 동일 시점에서 평균 종양 부피가 119.5 mm3 로 나타났다. 12주째에는 대조군에서 종양이 831.3 mm3 까지 성장하였음에 반하여 안토시아닌을 처리한 군의 경우 동일 시점에서 종양 부피가 288.4 mm3 로 나타났다 (도 4). 또한, 대조군에서 1마리의 마우스가 사망하였다. 비히클 처리한 마우스와 비교하여 안토시아닌 처리한 마우스에서 후접종 후 8주째 및 12주째에 통계적으로 유의적인 종양 발달의 차이가 관찰되었다(P<0.01; 도 4).
Claims (8)
- 델피니딘-3-O-글루코사이드(delphinidin-3-O-glucoside) 15 내지 35 중량%, 시아니딘-3-글루코사이드(cyanidin-3-O-glucoside) 55 내지 75 중량% 및 피투니딘-3-O-글루코사이드(petunidin-3-O-glucoside) 1 내지 10 중량%를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 델피니딘-3-O-글루코사이드(delphinidin-3-O-glucoside) 15 내지 35 중량%, 시아니딘-3-글루코사이드(cyanidin-3-O-glucoside) 55 내지 75 중량% 및 피투니딘-3-O-글루코사이드(petunidin-3-O-glucoside) 1 내지 10 중량%를 포함하는, 호르몬 불응성 전립선암을 예방 또는 개선하기 위한 식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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| KR1020120109461A KR101434500B1 (ko) | 2012-09-28 | 2012-09-28 | 검정콩으로부터 추출한 안토시아닌을 포함하는 전립선암의 예방 및 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020120109461A KR101434500B1 (ko) | 2012-09-28 | 2012-09-28 | 검정콩으로부터 추출한 안토시아닌을 포함하는 전립선암의 예방 및 치료용 조성물 |
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Citations (2)
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| KR100785466B1 (ko) * | 2006-05-09 | 2007-12-13 | (주)천년약속 | 검정콩으로부터 추출한 안토시아닌을 함유하는 의약 조성물 |
| KR101182630B1 (ko) * | 2012-05-29 | 2012-09-14 | 강원대학교산학협력단 | 구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체 및 그의 합성방법 |
-
2012
- 2012-09-28 KR KR1020120109461A patent/KR101434500B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR100785466B1 (ko) * | 2006-05-09 | 2007-12-13 | (주)천년약속 | 검정콩으로부터 추출한 안토시아닌을 함유하는 의약 조성물 |
| KR101182630B1 (ko) * | 2012-05-29 | 2012-09-14 | 강원대학교산학협력단 | 구조적 안정성이 강화된 안토시아닌 유도체 및 그의 합성방법 |
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| KR20140043003A (ko) | 2014-04-08 |
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