KR100785466B1

KR100785466B1 - 검정콩으로부터 추출한 안토시아닌을 함유하는 의약 조성물

Info

Publication number: KR100785466B1
Application number: KR1020060041335A
Authority: KR
Inventors: 장기철; 신성철; 정종일; 김혜정; 정영기; 임학섭
Original assignee: (주)천년약속
Priority date: 2006-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2007-12-13
Also published as: KR20070108979A

Abstract

본 발명은 검정콩(Glycine max (L) Merr.)으로부터 추출한 시아니딘-3-글루코시드(cyanidin-3-glucoside), 델피니딘-3-글루코시드(delphinidin-3-glucoside) 및 피투니딘-3-글루코시드(petunidin-3-glucoside)를 함유한 안토시아닌(anthocyanin)을 유효성분으로 포함하는 의약 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 검정콩으로부터 추출한 안토시아닌이 혈관내피세포에서 TNF-α에 의해 발현되는 혈관 접착분자(VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1), 세포내 접착분자 (ICAM-1, intracellular adhesion molecule-1) 및 사이클로옥시게나아제-2(COX-2, cyclooxygenase-2)의 발현을 억제할 뿐만 아니라, NF-kB의 활성을 억제하여 동맥 경화의 원인 요소를 줄이고 심장의 허혈-재관류로 인한 심근괴사를 억제함으로써 동맥경화 및 심장병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

검정콩(Glycine max (L) Merr.), 안토시아닌(anthocyanin), 동맥경화, 허혈/재관류, 심근괴사, TNF-α, NF-kB

Description

검정콩으로부터 추출한 안토시아닌을 함유하는 의약 조성물 {Pharmaceutical composition containing anthocyanin derived from Glycine max (L) Merr}

도 1은 과산화수소에 의한 혈관내피세포 손상에 따른 안토시아닌의 세포보호 효과를 나타낸 그림이다. A는 안토시아닌 0 ~ 100ug/ml 농도 그 자체로서의 세포독성에 대한 효과를 세포생존율로 나타낸 그림이며, B는 1, 10, 50 및 100ug/ml의 안토시아닌을 전처리하고 1mM 과산화수소로 손상을 입힌 결과를 나타낸 그림이다.

도 2는 혈관내피세포에 TNF-α를 처리 후, 상기 TNF-α에 의한 혈관 접착분자(VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1), 세포내 접착분자(ICAM-1, intracellular adhesion molecule-1) 및 염증성 인자인 사이클로옥시게나아제-2(COX-2, cyclooxygenase-2)의 10, 50 및 100ug/ml의 안토시아닌 처리에 의한 발현 수준을 나타낸 그림이다. A는 웨스턴 블로팅 결과이며, B는 A를 정량화하여 히스토그램으로 표시한 것이다.

도 3은 TNF-α 처리에 의한 염증 관련 인자 NF-kB 및 p-IkBα의 10, 50 및 100ug/ml의 안토시아닌 처리에 의한 발현 수준을 웨스턴 블로팅으로 나타낸 그림이다. A는 NF-kB의 발현 수준(CE는 세포내 발현 수준, NE는 핵내 발현 수준)을 나타낸 것이고, B는 p-IkBα의 발현 수준을 나타낸 것이다.

도 4A는 혈관내피세포에 NF-kB-루시퍼라아제를 트랜스펙션(transfection) 시킨 후, TNF-α에 의한 NF-kB의 활성 수준을 루시퍼라아제의 형광도로써 나타낸 그림이고, 도 4B는 IkBα의 돌연변이인 pcDNA/IkBα-SR을 트랜스펙션 시킨 후, TNF-α에 의한 NF-kB의 활성에 IkBα의 관여여부를 루시퍼라아제의 형광도로써 나타낸 것이다. 도 4C는 안토시아닌을 처리한 후, 상기 도 4A와 동일하게 처리시 NF-kB의 활성 수준을 루시퍼라아제의 형광도로써 나타낸 그림이다.

도 5A ~ 5E는 쥐의 심장 관상혈관의 허혈/재관류에 의한 손상 정도를 나타낸 그림이다. 5F는 5A ~ 5E를 정량화하여 히스토그램으로 나타낸 것이다.

검정콩은 1998년 미국의 FDA에서 콩단백질에 대하여 관상심장질환 예방효과를 인정한 이래 많은 연구가 되어 왔으며, 필수 지방산, 레시틴, 섬유질, 사포닌 등을 함유하고 있어 고혈압, 당뇨병, 동맥경화, 비만증과 같은 성인병의 예방 및 치료에 효과가 있다고 알려져 있다. 검정콩에 함유된 식물성 섬유는 변비는 물론 대장암 예방효과도 있다고 알려져 있으며, 동의보감에서는 검정콩에 대하여 '이는 약으로 쓰며 오장을 보하고 12경을 도와 장을 따스하게 하며 종기를 없애고 절임증을 치료하는 효과가 있다'고 언급하고 있다.

또한, 검정콩에 포함되어 있는 색소성분인 안토시아닌은 항산화제로서 장복하는 경우에 노화를 방지하는 효과가 있으며, 콩 단백질인 이소플라본은 강력한 항암활성을 가지는 제니스틴을 비롯한 사포닌, 화이토스테롤을 포함하고 있으며 칼슘이 뼈에 흡수되도록 하는 역할도 한다. 특히, 검정콩의 껍질에는 글리시테인이라는 항암물질이 포함되어 있다.

검정콩 껍질의 색소성분인 안토시아닌은 수용성 색소 배당체로서, 하이드록실기의 개수와 특정 하이드록실기의 메칠화에 의해 크게 6종의 안토시아니딘으로 구분되고, 안토시아니딘과 결합된 당의 종류와 아실기의 종류 및 결합 위치에 따라 수백종으로 구분되어진다.

식물성 천연색소인 안토시아닌은 최근 여러 가지 생리활성이 있는 것으로 알려지고 있다. 예를 들면 노화억제작용, 항균작용, 돌연변이성 억제작용, 콜레스테롤 저하작용, 시력개선 효과, 혈관보호기능, 항궤양기능, 항산화기능 등이 알려져 있다. 이러한 생리활성은 모든 종류의 안토시아닌이 기본적으로 가지는 활성이지만, 최근 각 안토시아닌의 종류에 따라 그 활성의 차이가 있는 것으로 알려지고 있다.

안토시아닌 성분은 흔히 식물체의 꽃, 과실, 줄기, 잎, 뿌리 등에 함유되어 있는 물질로서, 현재 포도, 딸기, 올리브, 적양배추, 가지, 장미 등의 식물체로부터 추출하여 여러 가지 원료로 이용되고 있으나, 거의 조색소 상태로 추출하여 이용되고 있는 실정이다. 따라서, 안토시아닌 외에 다른 성분의 화합물이 공존하는 상태로 이용되는 경우가 많다.

이에 본 발명자들은 효과적인 심장 관련 질환의 예방 및 치료에 관한 연구를 진행하던 중, 검정콩으로부터 추출한 안토시아닌이 혈관 및 그 세포의 접착분자와 염증 단백질 등의 발현을 저해할 뿐만 아니라, 상기 물질 등과 관련된 전사인자인 NF-kB의 발현을 억제함을 밝혀내고, 그 결과 동맥 경화 및 허혈-재관류로 인한 심근괴사 등을 예방 또는 치유할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 검정콩으로부터 추출한 안토시아닌을 함유하여 동맥경화 및 심장병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용되는 의약 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 검정콩(Glycine max (L) Merr.)으로부터 추출한 시아니딘-3-글루코시드(cyanidin-3-glucoside), 델피니딘-3-글루코시드(delphinidin-3-glucoside) 및 피투니딘-3-글루코시드(petunidin-3-glucoside)를 함유한 안토시아닌(anthocyanin)을 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 동맥 경화 및 심장의 허혈-재관류로 인한 심장괴사의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 상기 안토시아닌을 함유한 조성물은 TNF-α에 의해 발현되는 혈관 접착분자(VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1), 세포내 접착분자(ICAM-1, intracellular adhesion molecule-1) 및 사이클로옥시게나아제-2(COX-2, cyclooxygenase-2)의 발현 억제와 NF-kB의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 정제된 안토시아닌은 시아니딘-3-글루코시드(cyanidin-3-glucoside), 델피니딘-3-글루코시드(delphinidin-3-glucoside) 및 피투니딘-3-글루코시드(petunidin-3-glucoside)를 함유하여 구성된다.
상기 정제된 안토시아닌은 바람직하게는 시아니딘-3-글루코시드(cyanidin-3-glucoside) 약 72%, 델피니딘-3-글루코시드(delphinidin-3-glucoside) 약 20% 및 피투니딘-3-글루코시드(petunidin-3-glucoside) 약 6%를 함유하여 구성된다.

본 발명에서는 과산화수소(H₂O₂)에 의한 혈관내피세포 손상에 따른 안토시아닌의 세포보호 효과를 조사하였다. 소의 대동맥 내피 세포(BAEC, Bovine aortic endothelial cell)에 안토시아닌을 단독으로 0 ~ 100ug/ml까지 농도 의존적으로 24시간 동안 처리한 결과, 안토시아닌 자체는 높은 농도에서도 세포에 유해하지 않은 것으로 나타났다(도 1A). 반면, 1mM 과산화수소의 처리 결과 대조군 세포에 비해 세포 생존율은 약 30%로 나타났다(도 1B). 그리고, 과산화수소를 처리하기 1시간 전에 안토시아닌을 1, 10, 50 및 100ug/ml 농도로 처리한 결과, 과산화수소에 의해 낮아진 생존율을 농도 의존적으로 크게 향상시켰다(도 1B).

염증 인자인 ICAM, VCAM 및 COX-2 등은 동맥경화, 허혈성 심장질환과 같은 관상동맥질환과 연관이 있다. 동맥 내피세포에 TNF-α(tumor necrosis factor-α)를 처리하면 이들 염증 인자들의 발현이 증가된다. TNF-α에 의해 증가되는 이들 염증 인자들의 발현 억제 효과를 검토하기 위해 각각 다른 농도로 안토시아닌을 전 처리한 후, TNF-α를 10ng/ml의 농도로 6시간 처리한 세포로부터 핵 및 세포질내 상기 염증 인자 단백질의 발현정도를 측정하였다. 그 결과, 안토시아닌 처리에 의해 TNF-α 처리로부터 유도되는 ICAM, VCAM 및 COX-2의 발현이 안토시아닌 농도에 비례하여 급격히 감소되었음을 알 수 있었다(도 2).

접착분자들(ICAM-1, VCAM-1) 및 COX-2와 같은 염증 관련인자들의 유전자는 NF-kB를 포함한 다수의 중요한 전사인자들의 결합부위들을 가지고 있다. NF-kB는 TNF-α를 포함한 다양한 염증자극에 의해 활성화된다. 또한, NF-kB와 결합하고 있던 NF-kB 활성화 저해제인 IkB가 인산화되면 IkBα와 NF-kB로 분리되며, 이에 자유로워진 NF-kB가 핵 안으로 이동하여 여러가지 유전자를 발현시키게 된다. 즉, IkB의 인산화 억제는 NF-kB를 묶어놓는 역할을 함으로써 NF-kB가 활성화되지 못하도록 하는 결과를 낳게 된다. 그러므로, 안토시아닌이 TNF-α에 의해 활성화되는 NF-kB에 어떻게 영향을 미치는지를 조사하기 위해서 NF-kB의 세포질에서 핵으로의 이동 및 NF-kB-루시퍼라아제의 트랜스펙션 후 루시퍼라아제 활성을 측정하였다(도 3, 도 4).

TNF-α의 단독 처리는 NF-kB의 세포질에서 핵으로의 이동을 증가시켰다. 그러나, 안토시아닌을 각 농도별로 전처리한 경우에는 NF-kB의 핵내로의 이동을 농도 의존적으로 감소시켰다(도 3A). 또한, 상기 안토시아닌의 전처리는 NF-kB 활성화 저해제인 IkB의 인산화를 농도 의존적으로 감소시키는 결과를 나타내었다(도 3B).

NF-kB-루시퍼라아제를 트랜스펙션한 후 TNF-α를 처리하였을때 비처리 대조군에 비해 약 2.6배 높은 루시퍼라아제 활성을 보였으나(도 4A), IkBα 돌연변이인 pcDNA/IkBα-SR가 함께 트랜스펙션된 경우 TNF-α는 루시퍼라아제 활성에 아무런 영향을 주지 못했다(도 4B). 그리고, NF-kB-루시퍼라아제로 트랜스펙션된 세포에 50ug/ml 안토시아닌을 처리한 경우에는 TNF-α 처리에 의한 NF-kB-루시페라제 활성이 효과적으로 감소되었다(도 4C).

상기의 결과들은 안토시아닌이 IkB의 인산화를 감소시킴으로써 TNF-α 처리에 의한 NF-kB의 활성을 억제한다는 것을 의미한다.

이하, 본 발명의 구성을 실시예 및 시험예를 들어 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1] 안토시아닌 추출 및 정제

진주 경상대학교 농경지에서 재배된 검은콩(Glycine max (L) Merr.) 껍질 200g을 이용하여 4℃에서 24시간동안 메탄올로 3회 반복하여 추출하였다. 이 추출액을 감압 농축하여 최종 부피가 200ml이 되게 희석하였다. 상기 안토시아닌이 포 함된 용액을 100ml로 농축한 다음, Amberlite XAD-7 컬럼과 Spephadex LH-20을 이용하여 안토시아닌을 정제하였다. 정제된 안토시아닌은 시아니딘-3-글루코시드(cyanidin-3-glucoside) 72%, 델피니딘-3-글루코시드(delphinidin-3-glucoside) 20% 및 피투니딘-3-글루코시드(petunidin-3-glucoside) 6%를 함유하여 구성되었다.

[시험예 1] 세포배양 및 과산화수소에 의한 세포 손상 후 안토시아닌 처리에 의한 세포생존율 측정

본 연구에 사용된 소의 대동맥 내피 세포(BAECs, Bovine aortic endothelial cell)를 100U/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신 및 10% heat-inactivated FBS가 포함된 DMEM 배지에서 5% 이산화탄소를 공급하면서 37℃에서 배양하였다. 배양된 세포에 실시예 1의 안토시아닌 1, 10, 50 및 100ug/ml를 각각 24시간동안 전처리한 후 과산화수소(H₂O₂) 1mM을 24시간동안 처리하여, MTT solution을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과는 도 1B에서 보는 바와 같이, 1mM의 과산화수소만 처리한 세포에서는 약 70%의 혈관내피세포(BAEC)가 손상을 입어 30%만이 살아남았으나, 안토시아닌을 전처리한 각각의 세포들은 과산화수소로 손상을 입힌 결과 농도 의존적인 생존율을 보였다.

[시험예 2] TNF-α로 처리된 BAEC 세포주의 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의한 분석

BAEC 세포주에 실시예 1의 안토시아닌을 각각 10, 50 및 100uM을 24시간동안 전처리하고, 염증성 사이토카인(cytokine)인 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 10nl/ml를 처치하여 6시간동안 배양한 후 이들 세포로부터 단백질을 분리하여 110V에서 1시간 30분동안 10% SDS-폴리아크릴아마이드겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동을 하였다. 전기영동으로 분리된 단백질들을 PVDF 막(membrane)으로 전이, 부착시켰다. 상기 막을 1차항체인 anti-ICAM-1, anti-VCAM-1, anti-COX-2, anti-phospho-IκBα, 또는 anti-NF-κB(p65) 항체들을 각각 1:500 농도로 5% 탈지유(non-skim milk)에 희석한 용액에 담근후, 4℃에서 16 ~ 18시간 동안 반응시켰다. 이 막을 TBS-T 용액으로 세척하고 다시 horseadish peroxidase(HRP)가 부착된 2차항체 IgG로 상온에서 1시간 반응시킨 후 웨스턴 블로팅 루미놀 시약 시스템(Western Blotting Luminol Reagent system)과 자동 방사선 사진술(autoradiography)로 발색시키고 분석하였다.

그 결과는 도 2A, 2B에서 보는 바와 같이, 안토시아닌 처리에 의해 TNF-α 처리로부터 유도되는 ICAM-1, VCAM-1 및 COX-2의 발현이 안토시아닌 농도에 비례하여 급격히 감소되었음을 알 수 있었다.

[시험예 3] TNF-α 및 안토시아닌 처리에 의한 NF-kB 활성 및 IkB의 인산화 검정

TNF-α의 단독 처리는 NF-kB의 세포질에서 핵으로의 이동을 증가시켰다. 그 러나, 실시예 1의 안토시아닌을 전처리한 경우 NF-kB의 핵내로의 이동을 농도 의존적으로 감소시켰다(도 3A). 또한, 안토시아닌은 TNF-α에 의한 IkB 인산화를 억제함으로써 TNF-α에 의한 NF-kB 활성화를 농도 의존적으로 감소시키는 결과를 나타내었다(도 3B).

[시험예 4] 트랜스펙션 후 TNF-α 및 안토시아닌 처리에 따른 NF-kB 활성 검정

트랜스펙션은 Gibco-BRL에서 제공된 Lipofection을 이용하여 이행되었다. 60mm 배양접시에 5 × 10⁵ cell을 분주한 후 다음날에 4ml의 PBS로 씻어내고 무혈청(serum-free) DMEM 배지에서 1ug의 empty vector(PGL3 and/or pcDNA3) + 0.5ug의 pRL-TK-루시퍼라아제, 1ug의 NF-kB-루시퍼라아제(luciferase) + 0.5ug의 pRL-TK-루시퍼라아제, 1ug의 pcDNA/IκBα-SR + 1ug의 NF-kB-루시퍼라아제, 1ug의 pcDNA/IκBα-SR + 0.5ug의 pRL-TK-루시퍼라아제로 각각 12시간씩 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 새로운 배지로 갈아준 후 24시간 배양후, 10ng/ml TNF-α를 6시간동안 처리한 다음, cell lysis buffer로 5분 동안 용해시킨 후 각 샘플을 회수하여, 15,000rpm에서 5분동안 원심분리하여 상등액의 세포 추출물을 얻어 루시퍼라아제 활성 측정에 이용하였다. 각 샘플의 루시퍼라아제 활성은 pRL-TK-루시퍼라아제 활성으로 표준화 하였다.

그 결과는 도 4A, 4B 및 4C에서 보는 바와 같이, NF-kB-루시퍼라아제 트랜스 펙션의 경우 TNF-α의 처리는 비처리 대조군에 비해 약 2.6배 높은 루시퍼라아제 활성을 보였으나(도 4A), IkBα 돌연변이인 pcDNA/IkBα-SR로 트랜스펙션된 경우 TNF-α는 루시퍼라아제 활성에 아무런 영향을 주지 못했다(도 4B). 상기의 이유인 즉, TNF-α는 IkBα를 인산화시켜 NF-kB를 활성시키므로, 따라서 IkBα의 돌연변이인 pcDNA/IkBα-SR를 함께 트랜스펙션시켰을때는 TNF-α가 NF-kB 활성화에 아무런 영향을 미치지 않았다. NF-kB-루시퍼라아제로 트랜스펙션된 세포에 실시예 1의 50ug/ml 안토시아닌의 처리는 TNF-α 처리에 의한 NF-kB-루시퍼라아제 활성을 효과적으로 감소시켰다(도 4C). 상기의 결과들은 안토시아닌이 IkBα의 인산화를 억제함으로써 TNF-α 처리에 의한 NF-kB의 활성을 억제한다는 것을 의미한다.

[시험예 5] 안토시아닌 처리 후 허혈/재관류로 인한 심장손상 정도의 감소 효과 검정

허혈/재관류 손상에 대한 안토시아닌의 보호 효과를 검정하기 위해 실험용 쥐(Spaugue-Dawley rat)를 각 군당 8 ~ 10마리씩 나누고, 상기 쥐의 심장 관상혈관을 묶기 1시간 전에 실시예 1의 안토시아닌을 각각 25mg/kg, 50mg/kg 및 100mg/kg씩 투여한 후, 30분간 혈관을 묶고 24시간 재관류시켜 심장의 손상정도를 관찰하였다(도 5). 도 5A ~ 5E 및 5F에서 보는 바와 같이, 안토시아닌의 투여는 농도 의존적으로 허혈/재관류로 인한 심장 경색의 정도를 유의성있게 감소시켰다. 안토시아닌이 투여되지 않은 대조군은 심장 경색 부위가 약 32%임에 반해, 안토시아닌 투여군은 각각 약 15%, 13% 및 9%의 심장 경색 부위를 보였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 검은콩 유래의 안토시아닌은 염증 유발인자에 의한 염증 관련 단백질들의 발현 증가를 현저히 억제하고, 허혈/재관류로 인한 심장 손상의 감소 효과를 나타내었다. 이에 검은콩 유래의 안토시아닌이 포함된 기능성 식품, 주류 및 의약품 등을 생산함으로써 국민건강에 기여할 수 있을 것이다.

Claims

시아니딘-3-글루코시드(cyanidin-3-glucoside), 델피니딘-3-글루코시드(delphinidin-3-glucoside) 및 피투니딘-3-글리코시드(petunidin-3-glucoside)를 36:10:3의 중량비로 함유하는 동맥경화의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
시아니딘-3-글루코시드(cyanidin-3-glucoside), 델피니딘-3-글루코시드(delphinidin-3-glucoside) 및 피투니딘-3-글리코시드(petunidin-3-glucoside)를 36:10:3의 중량비로 함유하는 심장의 허혈/재관류로 인한 심장괴사의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 TNF-α에 의해 발현되는 혈관 접착분자(VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1) 및 세포내 접착분자(ICAM-1, intracellular adhesion molecule-1)의 발현 억제와 NF-kB의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 조성물은 TNF-α에 의해 발현되는 혈관 접착분자(VCAM-1, vascular cell adhesion molecule-1) 및 세포내 접착분자(ICAM-1, intracellular adhesion molecule-1)의 발현 억제와 NF-kB의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.