KR101426406B1

KR101426406B1 - 인간의 점액성 장암 유전자 마커

Info

Publication number: KR101426406B1
Application number: KR1020110048374A
Authority: KR
Inventors: 정현철; 라선영; 노재경; 김남규; 강승희; 박찬희; 이귀연
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2011-05-23
Filing date: 2011-05-23
Publication date: 2014-08-08
Also published as: KR20110074831A

Abstract

본 발명은 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 인간의 점액성 장암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 점액성 장암과 비-점액성 장암 간에 차이를 나타내는 유전자를 과발현 또는 저발현에 따라 선별하고 이를 이용하여 보다 간편하고 정확하게 인간의 점액성 장암을 진단할 수 있다. 또한, 본 발명은 점액성 장암에서 과발현되는 유전자를 이용하여 점액성 장암-특이적 항암제를 스크리닝 방법을 제공한다. 따라서 종래의 육안에 의한 점액성 장암조직 확인 또는 장기간을 요하는 생화학적 점액성 장암 판단 방법에 비해, 본 발명은 보다 효율적이며 저비용으로 신속하게 점액성 장암을 진단 및 치료할 수 있다.

Description

인간의 점액성 장암 유전자 마커{Genetic Markers for Human Mucinous Colon Carcinoma}

본 발명은 인간의 점액성 장암 진단용 키트, 인간의 장암 마커를 검출하는 방법 및 인간 점액성 장암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

점액성(mucinous) 장암이란 장암의 한 부분으로서 세포 밖의 뮤신의 분포 정도가 장암의 50% 이상으로 포함하고 있을 때를 말한다. 점액성 장암은 비-점액성(non-mucinous) 장암과는 임상병리학적(clinicopathologic) 및 분자유전학적(molecular genetic)으로 많은 차이를 나타내는 것으로 알려져 있다. 임상병리학적으로 유럽과 미국에서는 전체 장암의 10% 정도로 발병하지만, 일본에서는 2.9%~7.4% 정도로 발병하는 것으로 알려져 있다. 비-점액성 장암과 비교하여 보았을 때, 점액성 장암은 50세 이하의 장암환자, 오른쪽 대장에서 많은 발병률을 나타내고 있다. 점액성 장암은 비-점액성 장암에 비해서 주변장기로의 전이와 림프절의 전이를 더 많이 나타내는 것으로 알려져 있으며, 특히 플루오로우라실(fluorouracil)을 기반으로 하는 약제에 내성을 가지고 있어 예후가 더 좋지 않아, 5년 생존률도 더 낮다. 분자유전학적으로, 최근의 몇몇 연구에서 마이크로세틀라이트 불안정성(microsatellite instability, MSI), CpG 메틸레이션(CpG methylation) 표현형질, MUC2 그리고 MUC5AC의 유전적 변이와 유전자간의 연관관계에 관한 연구가 수행되고 있다. 그러나 이러한 아직까지는 종양 형성능력과 같은 점액성 장암의 생물학적 특성과 유전학적 특징과의 연관관계를 명확하게 설명하지 못하고 있다.

이를 위해서는 점액성 장암의 특징을 구별할 수 있는 표적유전자를 선정하는 것이 무엇보다도 중요하다. 즉, 점액성 장암과 비-점액성 장암에 따라 유전자의 발현형태 및 발현량에 차이를 나타내는 유전자를 선별하여 각 유전자가 가지고 있는 특성을 파악하는 것이 중요하다.

마이크로어레이 기법은 한 번의 실험을 통하여 생물학적 특징에 따른 유전자의 발현 정도에 따라 차이를 나타내는 유전자를 구별할 수 있는 실험 기법으로, 본 발명에서 목적하고자 하는 점액성 장암 특이 유전자의 선별에 유용한 방법이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 점액성 장암과 비-점액성 장암 간의 차이를 신속하고 정확하게 구별할 수 있는 방법에 대해 연구한 결과, 마이크로어레이 분석을 통해 점액성 장암 조직에서 특이적으로 과발현되거나 또는 저발현되는 유전자들을 동정하는 방법을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 인간의 점액성 장암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 인간의 점액성 장암 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간 점액성 장암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 인간의 점액성 장암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 점액성 장암과 비-점액성 장암 간의 차이를 신속하고 정확하게 구별할 수 있는 방법에 대해 연구한 결과, 마이크로어레이 분석을 통해 점액성 장암 조직에서 특이적으로 과발현되거나 또는 저발현되는 유전자들을 동정하는 방법을 발견하였다.

장암은 십이지장암, 공장암, 회장암 및 대장암(직장암과 결장암)을 포함하는 개념으로, 인간에게 발생하는 대부분의 장암은 대장암과 직장암이 차지한다. 장암의 발생원인은 아직까지 확실하게 밝혀지지는 않았지만 가족성 대장용종증, 특발성 비특이성 궤양성 대장염, 대장 및 직장의 용종, 특히 이중에서도 융모성 선종인 경우 암으로 변화할 수 있는 병으로 잘 알려져 있다. 점액성(mucinous) 장암은 조직학적인 염색을 통해 뮤신의 분포가 종양 부위에서 50% 이상을 차지하는 경우를 말한다. 또한, 점액성 장암은 교질성암(colloidal carcinoma)과 본질적으로 동일하게 간주된다. 하지만, 많은 양의 뮤신(mucin)이 생산되지만 분비되지 않는 반지모양 암(signet-ring cell)과는 구별된다. 대부분의 장암은 별로 많지 않은 뮤신을 생산하며 뮤신의 분포 범위(10-50%)가 병의 징후에 영향을 주는 지는 확실하지 않다. 비-점액성 장암과 비교하여 점액성 장암의 발병률은 약 6-19% 정도에 이른다. 이러한 점액성 장암은 비-점액성 장암에 비하여 암 전이가 용이할 뿐만 아니라, 약제에 대한 내성이 증가하여 5년 생존률이 더 낮은 것으로 알려져 있다.

한편, 현재까지 알려져 있는 장암의 진단 방법으로는 잠혈검사, 종양표지자 검사, 장조영술, 내시경, 복부 초음파나 복부 컴퓨터 단층촬영 및 종양표지자 검사가 있으나, 이들 검사 방법은 비용 및 시간이 많이 들며, 특히 외부로 드러나지 않는 증상인 환자에 대해서는 부적합하다는 단점이 있다.

따라서 이러한 단점을 극복하기 위해 본 발명자들은 신속하고 정확하게 점액성 장암 여부를 판단할 수 있는 인간의 점액성 장암 진단용 키트를 개발하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “장암”은 장에서 발생하는 암으로 직장암, 대장암 및 장암의 전구체(예컨대, 선종성 폴립)까지 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 장암 진단용 키트는 마이크로어레이일 수 있다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 “상보적(complementary)”은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 “상보적”은 용어 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프로브는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 인간의 점액성 장암 진단용 키트는 혼성화에 기초하여 실시할 수 있다. 이 경우, 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브가 이용된다.

서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 프로브를 이용하여 혼성화-기초 분석을 하여 장암 여부를 판단할 수 있다. 또한, 본 발명의 인간의 장암 진단용 키트는 GenBank 접근 번호: AA040387; AA042990; AA054073; AA181085; AA278698; AA279145; AA400973; AA412284; AA452933; AA453310; AA459012; AA465495; AA481464; AA488868; AA490263; AA490497; AA598652; AA865729; AA872095; AA873578; AA922903; AA939100; AA971714; AA976544; AA995282; AI094854; AI147237; AI203404; AI269774; AI336626; AI341793; AI346446; AI349090; AI359768; AI369785; AI675714; AI688155; AI700308; AI990099; AI990501; AW009769; AW072118; AW073291; AW075441; AW082097; H04789; H10045; H13623; N30553; N35888; N62394; N63845; N63943; N74131; N74236; R09561; R73909; R99562; T70057; W47576; AA931716 및 AA933744로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열 또는 상기 뉴클레오타이드의 단편을 추가적으로 포함한다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P³² 및 S³⁵), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 생시료는, 바람직하게는 장암 세포, 가장 바람직하게는 대장암 또는 직장암 세포이다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 점액성 장암 마커를 검출하는 방법을 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 점액성 장암 여부를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 서열번호 제1서열 및 제2서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(정상 세포)보다 강하게 나오거나 서열번호 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료(정상 세포)보다 약하게 나오는 경우에는 점액성 장암으로 진단된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인간의 장암 진단용 키트는 유전자 증폭 키트일 수 있다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 진단용 키트를 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 조사한다. 본 발명은 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 분석하는 것이기 때문에, 분석 대상의 시료(예컨대, 장암 세포)에서 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 mRNA 양을 조사하여 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 결정한다.

따라서 본 발명은 원칙적으로 시료 내의 mRNA를 주형으로 하고 mRNA 또는 cDNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, TRIzol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 시료로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 이어, 유전자 증폭 반응을 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg²⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 cDNA를 적합한 방법으로 분석하여 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 조사한다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현 정도를 조사한다. 이러한 증폭 반응을 통하여, 생시료(biosamples)에서 서열번호 제1서열 및 제2서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 높게 나오거나 서열번호 제3서열로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현이 정상 시료(정상 세포)보다 낮게 나오는 경우에는 점액성 장암으로 진단된다.

따라서 본 발명의 장암 마커의 검출 방법을 cDNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 어닐링되는 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 분석하여 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현정도를 결정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 인간의 점액성 장암 진단용 키트에서 상기 서열번호 제1서열 및 제2서열로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열은 점액성 장암 조직에서 고발현 되고, 상기 서열번호 제3서열로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열은 점액성 장암 조직에서 저발현 된다.

본 명세서에서 뉴클레오타이드 서열을 언급하면서 사용되는 용어 “고발현”은 당업계에서 통상적으로 이용되는 유전자발현 분석 방법, 예컨대 실시간 RT-PCR 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 유전자발현 분석을 한 경우, 유전자발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 서열목록 제1서열 및 제2서열의 경우, 점액성 장암 시료에서 비-점액성 장암 시료과 비교하여 1.7-2.5 배 정도 고발현 된다. 본 명세서에서 뉴클레오타이드 서열을 언급하면서 사용되는 용어 “저발현”은 당업계에서 통상적으로 이용되는 유전자발현 분석 방법, 예컨대 실시간 RT-PCR 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 유전자발현 분석을 한 경우, 유전자발현이 많은 것으로 분석되는 경우를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 서열목록 제3서열의 경우, 점액성 장암 시료에서 비-점액성 장암 시료과 비교하여 2.5-3 배 정도 고발현 된다. 본 발명의 인간의 장암 진단용 키트 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 고발현 또는 저발현 여부를 분석함으로써, 점액성 장암을 진단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인간 장암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오타이드 서열 중에서 서열번호 제1서열 및 제2서열로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 고발현이 억제되거나 또는 서열번호 제3서열로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 저발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 인간 점액성 장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 바람직하게는, 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 인간의 장암 세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현량에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시료가 처리된 세포에서 서열번호 제1서열 내지 제3서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같으며, 측정 결과, 상기 뉴클레오타이드 서열 중에서 서열번호 제1서열 및 제2서열로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 고발현이 억제되거나 또는 서열번호 제3서열로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열의 저발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 인간 점액성 장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 인간의 점액성 장암 진단용 키트를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에 따르면, 점액성 장암과 비-점액성 장암 간에 따라 차이를 나타내는 유전자를 과발현 또는 저발현에 따라 선별하고 이를 이용하여 보다 간편하고 정확하게 인간의 점액성 장암을 진단할 수 있다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 점액성 장암에서 과발현되는 유전자를 이용하여 점액성 장암-특이적 항암제를 스크리닝 방법을 제공한다.

(ⅳ) 따라서 종래의 육안에 의한 점액성 장암조직 확인 또는 장기간을 요하는 생화학적 점액성 장암 판단 방법에 비해, 본 발명은 보다 효율적이며 저비용으로 신속하게 점액성 장암을 진단 및 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 마이크로어레이 실험 및 분석과정을 총괄적으로 나타낸 개략도이다.
도 2는 62개의 유전자들을 이용하여, 트레이닝 그룹과 테스트 그룹의 예측강도를 나타낸 그래프이다. X 축은 그룹에 따른 각 유전자 수에 따른 예측강도를 나타내며, Y 축은 예측정도를 나타내는 것이다.
도 3은 선별된 62개의 유전자 중에서 주성분분석법(Principal Component Analysis, GeneSpring 7.3, Agilent technologies, USA)를 통하여 선별된 50개의 유전자와 52개의 암조직 샘플의 관리 계층 분류(Supervised Hierarchical Clustering)를 나타낸 덴드로그램이다. 가로축은 샘플을, 세로축은 유전자를 나타내고 위쪽 및 왼쪽의 계통분류 도식(phylogeny tree)은 발현 정도가 유사한 그룹 별로 분류된 것을 나타낸다. NMC 및 MC는 각각 비-점액성 및 점액성 장암을 의미하며 녹색(2), 황색(3) 및 보라색(4)은 암의 진행 단계(TNM(tumors/nodes/ metastases))를 나타낸다.
도 4a는 마이크로어레이 분석을 통해 선별된 유전자들 중에서 무작위 선별을 통해서 RT-PCR 실험을 통하여 유의성 여부를 확인한 그래프이다. 도 4b는 각각의 유전자 레벨에서 마이크로어레이와 RT-PCR을 이용하여 4개의 유전자의 발현량 평균치를 비교하여 각 데이터간의 연관성을 나타낸 막대그래프이다(^* P < 0.05, ^** P < 0.005).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1 : 대상 환자 및 검체 채취

2003년부터 2006년까지 연세대학교 의과대학 신촌 세브란스병원, 연세 암센터에 내원하여 대장암으로 진단받은 환자들 중 임상병리학 진단을 통하여, 전체 종양중에서 뮤신을 50% 이상 포함하고 있는 39명의 점액성 장암조직과, 10% 이하의 뮤신을 포함하고 있는 71명의 비-점액성 장암조직을 이용하였다. 채취된 조직은 채취 직후 액체질소를 이용하여 급속 냉동하고 실험 시까지 -80℃에서 보관하였다. 모든 연구는 연세대학교 세브란스병원 임상연구 심의위원회(Institutional Review Board)가 승인한 동의서에 자의로 동의한 환자를 대상으로 진행하였다.

실시예 2 : RNA 추출 및 증폭

보관된 약 100 mg의 조직은 액체질소 내에서 막자와 막자사발을 이용하여 균질화 한 후, 1 mL의 트리졸(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 용해했다. 200 ㎕의 클로로포름을 넣고 4℃에서 10 분간 반응시킨 후, 4℃에서 14,000 rpm으로 25 분간 원심분리를 하여 상층액만을 분리시켰다. 분리된 상층액과 이소프로판올을 -20℃에서 30 분간 반응시킨 후, 4℃에서 14,000 rpm으로 25 분간 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA는 70% 에틸알코올로 수세하고, 상온에서 남아있는 알코올을 건조시키고, 초순수(ultra-pure water)에 녹였다. 전체 RNA의 양과 질은 나노드랍(Nanodrop, Nanodrop technology, Rockland, USA), 1% 아가로오스 젤 전기영동을 이용하여 확인했다. 대조군으로 사용할 Yonsei reference RNA (연세의대 암전이연구센터, Seoul, Korea)는 YCC-3, YCC-B1, HCT-116, SK-Hep-1, A549, HL-60, MOLT-4, HeLa, HT-1080, Caki-2, T98G의 11개 인간 종양 세포주로부터 추출한 같은 양의 전체 RNA를 섞어 준비했다.

RNA 증폭은 연세의대 암전이 연구센터의 표준 프로토콜에 따라 진행하였다. 먼저 4 ㎕의 전체 RNA를 주형으로 하여 일차 증폭을 수행했다. RNA 주형에 2 ㎍의 올리고-dT/T7 프라이머(5'-GGCCAGTAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-3', Genotech, Daejeon, Korea)와 9 ㎕의 RNase-결핍 물(RNase-free water)을 넣고 65℃에서 10 분간 반응시켰다. 반응 후 2분 간 얼음에서 식힌 후, 4 ㎕의 5 x first strand buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 ㎕의 100 mM DTT(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 ㎕의 10 mM dNTP mix(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 2 ㎕의 RNAsin (Promega, Madison, WI, USA), 2㎕의 SuperScript II(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 넣고 1시간 동안 42℃에서 역전사 반응을 시켰다.

이차 주형을 합성하기 위하여 일차 주형 cDNA가 만들어진 용액에 91 ㎕의 RNase-결핍 물, 30 ㎕의 5 x second strand buffer(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 3 ㎕의 10 mM dNTP mix, 10 U의 DNA 라이게이즈, 4 U의 DNA 중합효소 I, 2 U의 RNase H를 넣어 16℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후에 20 U의T4 DNA 중합효소(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가한 후 16℃에서 5분간 반응시켰고 1 M NaOH와 0.5 M EDTA 각각 10 ㎕씩을 첨가하여 65℃에서 10분 동안 반응을 비활성화했다. 그 후에 25 ㎕의 Tris-HCl을 이용하여 중화하고 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜(25:24:1) 97 ㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 Phase Lock GelTM (Eppendorf, Westbury, NY, USA)에 넣어 13,000 rpm으로 2분간 원심 분리하여 cDNA만을 정제했다. cDNA가 존재하는 상층액을 따로 분리하여 상층액 부피의 0.5배 만큼의 7.5M 암모늄 아세테이트와 2.5배 만큼의 95％ EtOH을 넣은 후, 4℃에서 13,000 rpm 이상으로 30 분간 원심 분리하여 cDNA 침점물을 얻고, 80% EtOH로 수세한 후 상온에서 건조시켰다. 건조된 cDNA 침점물은 RNase-결핍 물 8 ㎕를 넣어 용해했다.

In vitro 전사는 합성된 두 가닥의 cDNA를 이용하여 T7 MEGAscript kit(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하였다. 간략히 설명하면, 위에서 만들어진 8 ㎕의 cDNA 용액에 75 mM rATP, rUTP, rCTP, rGTP, 효소 혼합물, 10 x 반응 완충액을 각각 2 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 5시간 동안 반응시켰다. 이렇게 증폭된 mRNA는 RNeasy mini kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 정제하여 얻었으며, 증폭된 mRNA의 양과 질은 나노드랍과 1% 아가로스 젤 전기영동을 이용하여 평가하였다.

실시예 3 : cDNA 마이크로어레이 혼성화

cDNA 마이크로어레이는 알려진 유전자들과 EST를 포함하고 있는 17,104개의 유전자가 집적된 인간 17K cDNA 칩(CMRC-GT, Seoul, Korea)을 사용하였고 실험은 실험군과 reference RNA를 서로 비교하는 간접적 방법을 사용하였다. 이 때, 실험군은 Cy5-dUTP를 이용하여 염색 하고 reference RNA는 Cy3-dUTP로 염색 하였다.

이 과정은 CMRC 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 증폭된 mRNA 2 ㎍에 6 ㎍의 랜덤 프라이머(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 넣어 RNase-결핍 물로 전체 양이 21 ㎕가 되도록 맞춘 후 65℃에서 10 분간 반응시켰다. 그리고 증폭된 mRNA와 랜덤 프라이머 혼합 용액에 8 ㎕의 5 x first strand buffer, 4 ㎕의 100 mM DTT, 2 ㎕의 SuperScript II RT, 2 ㎕의 20 x low dT/dNTP mix, 1 ㎕의 RNAsin, 4 ㎕의 Cy3 혹은 Cy5-dUTP(Genomic Tree, Daejeon, Korea)를 첨가하여 42℃에서 1시간 30분간 반응을 시켰다. 0.1 M NaOH 15 ㎕를 첨가하여 RNA 주형을 분해시키고 65℃에서 30분간 두어 반응을 비활성화 하였다. 0.1 M NaOH와 동량의 0.1 M HCl로 중화한 후, QIA quick PCR 정제 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 Cy3 혹은 Cy5로 염색 된 프로브들만을 정제하고 200 ㎕의 초순수로 두 번씩 녹여냈다. 이렇게 얻어진 용액에 각각 20 ㎍의 인간 COT-1 DNA(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 효모 tRNA(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 폴리(A) RNA(Sigma, Saint Louis, MO, USA)를 넣고 Microcon YM-30 column(Millipore, Bedford, MA, USA)를 이용하여 최종 양이 40 ㎕가 되도록 농축시킨 후 100℃에서 2분간 변성한 후 사용했다.

cDNA 마이크로어레이 칩은 사용하기 전에 3.5 x SSC(Sodium chloride/Sodium Citrate buffer), 0.1% SDS(Sodium Dodesyl Sulfate), 10 ㎎/㎖ BSA(Bovine Serum Albumin)의 용액에서 42℃로 1시간 동안 전-혼성화(pre-hybridization)한 후 3차 증류수로 2번 수세하고 이소프로파놀을 이용하여 완전히 건조시킨 후 사용하였다. 농축된 프로브는 최종적으로 80 ㎕의 25% 포름아마이드, 5 x SSC, 0.1% SDS의 상태로 맞추어 준비된 cDNA 마이크로어레이 칩에 덮개유리를 얹고 그 틈으로 주입한 후, 42 ℃에서 16시간 동안 빛이 차단된 상태로 반응시켰다. 반응이 끝난 마이크로어레이는 순서대로 2 x SSC 및 0.1% SDS 용액, 1 x SSC 및 0.1% SDS 용액, 0.2 x SSC 용액, 0.05 x SSC 용액에서 각각 2분씩 수세하고 회전 건조기를 이용하여 건조시켰다.

혼성화가 끝난 마이크로어레이는 GenePix 4000B 스캐너(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)를 이용하여 형광 신호를 감지하고 GenePix pro 4.0 소프트웨어(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)를 이용하여 이미지화 하였다. 이때 비특이적 형광 신호에 의한 간섭을 최소화하기 위하여 배경제거방식(local background subtraction method)에 따라 배경 신호를 제거하고 수치화된 결과를 얻었다.

실시예 4 : 생물 정보학 기법을 이용한 결과 분석

도 1은 본 발명의 총체적인 개략도이며, 마이크로어레이 실험과 유전자 선발, 교차 확인법(cross validation) 및 예측을 포함하는 분석법을 나타낸다. 원시 데이터 표준화, 유전자 필터링, 분류 유전자 선별, 트레이닝 세트의 교차 확인, 테스트 및 독립세트의 클래스 예측은 GeneSpring 7.0 소프트웨어(Silicon Genetics, Redwood city, CA)와 마이크로어레이 예측분석법(Prediction Analysis of Microarray(PAM), EXCEL, http://www-stat.stanford.edu/~tibs/PAM/)을 사용하여 수행하였다. 전체 실험의 분석 내용은 도 1에 나타냈다.

점액성 장암 관련 유전자를 선별하기 위해서 각 실험군은 25명의 점액성 장암 샘플과 27명의 비-점액성 장암샘플을 트레이닝 그룹으로 선별하였다. Welch's t-test 방법을 이용하여 트레이닝 그룹에서 점액성 장암그룹과 비-점액성 장암그룹간의 오기각률(FDR, False Discovery Rate)이 0.05 이하로 유의하게 차이가 나는 유전자를 선별하였다. 선별된 유전자들은 예측분석법(PAM)을 이용하여 5명의 점액성 장암샘플과 4명의 비-점액성 장암샘플을 이용하여 예측 분석하였다. 선별된 유전자들은 SOURCE(http://source.stanford.edu) 데이터베이스를 이용하여 유전자 정보를 획득하였다. 선별된 유전자들 중에서 좀 더 효율적인 예측을 위한 점액성 장암관련 유전자를 선별하기 위해서 LOOCV(leave-one-out cross validation, R package, http://www.r-project.org/)방법을 이용하였다. 선별된 종양형성 관련 유전자들은 RT-PCR 방법을 이용하여 마이크로어레이 실험과 비교분석하였다.

실시예 5: 클래스 예측 유전자와 트레이닝 세트 내 교차 확인법 및 테스트 세트 내 조직 타입의 예측

상기 실시예 4에서 기술한 대로, 트레이닝 세트의 정상조직 또는 종양조직 간의 유전자 선별 분석법을 통하여 11,621개의 유전자에서 62개의 유전자를 선별하였고, 이들 유전자의 상대적인 발현변화 차이를 기초로 하여 주성분분석법(Principal Component Analysis, GeneSpring 7.3, Silicon Genetics, Redwood city, CA)을 통해 선별된 50개의 유전자를 선별하였다. 선별된 유전자들은 예측강도 1.519와 1.688에서 두 그룹간의 예측 정확도는 100%였다. 예측 강도가 1.688인 경우에 선별되는 50개의 유전자를 이용하여 계층분석법을 통하여 확인한 결과, 점액성 장암그룹과 비-점액성 장암그룹을 확연하게 구별하여 주는 것을 확인하였다.

표 1은 트레이닝 세트의 점액성 장암 조직과 비-점액성 장암 조직 간의 차이를 나타내는 62개 유전자를 나타낸 것이고, 점액성 장암조직과 비-점액성 장암조직의 평균발현 비율(Av. Ratio)은 트레이닝 세트 내 각각의 점액성 장암조직과 비-점액성 장암조직의 Cy5/Cy3 비율의 평균을 나타낸다.

	GenBank 접근번호	유전자 이름	점액성/비-점액성의 평균발현 비율
1	AA017125	SORT1	0.34
2	AA040387	XPNPEP2	-0.46
3	AA042990	SEMA3C	-0.82
4	AA127096	FUS	-0.49
5	AA155640	TCN1	1.46
6	AA181085	KDELR3	0.58
7	AA278698	HDHD1A	-0.61
8	AA279145	CAB39L	-0.98
9	AA282208		-0.56
10	AA282253	HERC3	-0.47
11	AA283090	CD44	0.61
12	AA412284	PVR	-0.81
13	AA446884	TRIM13	-0.32
14	AA453310	AMACR	-0.66
15	AA458870	CDC37	0.3
16	AA459012	LMBRD1	-0.56
17	AA465396	SLC25A37	0.51
18	AA481464	PPIB	0.62
19	AA488433	SLMO2	-0.71
20	AA488868	AYTL2	0.74
21	AA490263	NEK3	-0.85
22	AA490497	UBL3	-0.57
23	AA598652		-1.06
24	AA633997	YWHAQ	-0.34
25	AA669068	STAU1	-0.48
26	AA872095	YWHAB	-0.49
27	AA918102		-0.46
28	AA931716	TRIM7	0.91
29	AA933744	L1TD1	1.56
30	AA976544	MLPH	0.73
31	AA995282	FHL2	0.53
32	AI051281	C13orf23	-0.53
33	AI203404		0.73
34	AI269774	PHYH	-0.51
35	AI298104	AGL	-0.61
36	AI339538	SLC26A3	-2.47
37	AI349090		0.64
38	AI350851		0.72
39	AI359768	RHOU	-0.64
40	AI360206	C20orf112	-0.55
41	AI369785	NPDC1	0.76
42	AI393075	CYP4F3	-0.5
43	AI632018	TINAG	-0.35
44	AI654481	CLCN2	-0.36
45	AI688155	SEPHS2	-0.58
46	AI700308	PPP1R3D	-0.62
47	AI769855	DEFB1	-0.54
48	AI989542	CEBPA	-0.42
49	AI990104	MAPRE1	-0.37
50	AI990501	STMN2	-0.54
51	AW009769	TFF1	2.01
52	AW072118	FSCN1	1.15
53	AW073291	AGR2	1.71
54	AW082097	PI3	1.73
55	H04789	GYG2	-0.67
56	H10045	VAV3	-1.27
57	H14359	ELF4	-0.46
58	H73234	CDC42EP1	0.44
59	H87106		-0.8
60	N74236	MPP1	-0.86
61	R09561	CD55	0.82
62	W47576	ASAHL	-0.66

실시예 6 실시간(real-time) RT-PCR

마이크로어레이 실험에서 얻은 발현 비율의 유효성을 검증하기 위하여, 유전자 발현 양상을 확인하기 위해서 동일 mRNA를 가지고 실시간(real-time) RT-PCR을 수행하였다(Kim T.M. et al. Clin Cancer Res 11:79 (2005)). 이 반응 용액은 2.5 mM MgCl₂(Qiagen, CA), 2 ㎕의 cDNA, 20 pmol의 올리고뉴클레오타이드 프라이머로 이루어진 10 ㎕의 QuantiTect SYBR Green PCR mixture(Qiagen, CA, USA)가 포함된 총 20 ㎕의 부피를 가지고, Roter Gene 2072D 실시간 PCR 기계(Corbett Research, Sydney, Austrialia)에서 PCR은 95℃에서 15분(HotstarTaq^TM DNA 중합효소(Qiagen, CA, USA)를 활성화), 95℃에서 20초간 30주기(증폭), 50℃에서 30초, 72℃에서 45초 동안 수행하였다.

각 샘플에서 증폭된 형광 신호는 각 주기의 늦은 연장 단계에 측정했다. 각각의 유전자로부터 신호의 양을 측정하기 위해서 10배로 순차적으로 희석한 인간 게놈 DNA를 대조군으로 사용하였다. 표준 곡선은 희석시킨 게놈 DNA에서 베타-액틴의 유전자 발현에 대한 반응에서 RT-PCR 산물의 임의적 수치에 대해 측정한 역치 주기를 그림으로써 작성하였다. 역치 주기(Ct)값은 형광이 역치 값을 초과할 때 주기수로 결정된다. 음성 대조군은 주기 수가 35까지 증가하도록 형광 신호가 검출되지 않았다.

선별된 유전자 중에서 점액성 장암에서 증가발현 양상을 나타내는 TFF1(Trefoil factor 1, GeneBank 접근번호: AW009769, 제1서열), AGR2(Anterior gradient 2 homolog, GeneBank 접근번호: AW073291, 제2서열) 유전자와 감소발현 양상을 나타내는 SLC26A3(Solute carrier family 26 member 3, GeneBank 접근번호: AI339538, 제3서열) 및 뮤신과 관련된 유전자인 MUC2 유전자를 선별하여 상기 목적을 위해 사용하였다.

사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다: TFF1 정방향, 5'-TTGTGGTTTTCCTGGTGTCA-3', TFF1 역방향, 5'-CCGAGCTCTGGGACTAATCA-3'; AGR2 정방향, 5'-TCCCTTCCTTGAGCATTTTG-3', AGR2 역방향, 5'-GGCCTTGAGACTTGAAACCA-3'; SLC26A3 정방향, 5'-TGGCGCCACTATACTGCTAA-3', SLC26A3 역방향, 5'-TTCAAACTTTGGAACAAGATGG-3'; MUC2 정방향, 5'-TGGAAAGCAAGGACTGAACA-3', MUC2 역방향, 5'-TACACCCACATCGAGAGCTG-3'.

15개의 비-점액성 장암조직과 11개의 점액성 장암조직 유전자의 상대적인 발현 정도는 마이크로어레이 분석 및 실시간 RT-PCR에 의한 유전자 발현 비율과 상관관계를 보였다. 상호 관련 계수는 유전자의 발현 값을 마이크로어레이와 RT-PCR로 측정한 데이터를 비교함으로써 측정하였다. 마이크로어레이에 의한 3개 유전자의 발현과 이미 알려진 1개 유전자의 발현 패턴은 RT-PCR에 의해서 완전하게 동일했다(도 4).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Yonsei University <120> Genetic Markers for Human Mucinous Colon Carcinoma <130> PN110300 <150> KR 10-2009-0038011 <151> 2009-04-30 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgctggccct cggcaccctg gccaaggccc agacagagac gtgtacagtg gccccccgtg 60 aaagacagaa ttgtggtttt cctggtgtca cgccctccca gtgtgcaaat aagggctgct 120 gtttcgacga ccccgttcgt ggggtcccct ggtgcttcta tcctaatacc atcgacgtcc 180 ctccaaaaga ggagtgtgaa ttttagacac ttctgcaggg atctgcctgc atcctgacgc 240 ggtgccgtcc ccagcacggt gattagtccc agagctcggc tgccccctcc cccggacacc 300 tcagacacgc ttctgcagct gtgcctcggc tcacaacaca gattgactgc tctgactttg 360 actactcaaa attggcctaa aaattaaaag agatcgatat taaaaaaaaa aaaaaaa 417 <210> 2 <211> 507 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tggagaaaac agaacacccc caaaacattt attttttttt ttagaaaatc atggctcact 60 atggtagtat acaatattgt tttcacacat gtacacttga aaccaaattt ctaaaacttg 120 tttttcttaa aaaatagttg ttgtaacatt aaaccataac ctaatcagtg tgttcactat 180 gcttccacac tagccagtct tctcacactt cttctggttt caagtctcaa ggcctgacag 240 acagaagggc ttggagattt tttttcttta caattcagtc ttcagcaact tgagagcttt 300 cttcatgttg tcaagcaaca gagctgtatc tgcaggttcg taagcataga aacggtttga 360 atatcttcca gtgatatcgg ctctaactgt cagagatggg tcaacaaaca taatcctggg 420 gacatactgg ccatcaggag aaaggtgttt gtcagttggt tcataaacca nattgaggag 480 gacaaactgc tctgccaatt tctggat 507 <210> 3 <211> 491 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cactgtacaa ctgatttttt aatggaaata tattaatatg acctgtataa attatgagat 60 tcaaaacagt ggcgccacta tactgctaaa cctatgcatg aaggtagtga ctaggatgga 120 aatctgtcag tgctacaaaa atatgtatga acaaaataat tttcaccctt tgataaagct 180 acaagatata aaatttagaa tacttatata atttcatact agatatgtga aaaatatgcc 240 atgctagaac catcttgttc caaagtttga aacatattct gtcaaaaata ctcttcgtac 300 aatgtatgaa cttatcaata actttctggg tataaagttg tttttatgtc atagtcagat 360 gaagatcctt ctgaattata tgttgattag aattttgttt caactggcac ctcatatacc 420 cgattacgta atcctccatt tgtatttatg gtaaaatcaa tttttccatc tttttcctga 480 ctgggattaa a 491

Claims

서열번호 제3서열로 표시되는 올리고뉴클레오타이드, 상기 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 또는 상기 올리고뉴클레오타이드의 단편을 포함하는 인간의 점액성 장암 진단용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 것을 특징으로 하는 인간의 점액성 장암 진단용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭 키트인 것을 특징으로 하는 인간의 점액성 장암 진단용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 제3서열로 표시되는 올리고뉴클레오타이드는 점액성 장암 조직에서 저발현 되는 것을 특징으로 하는 인간의 점액성 장암 진단용 키트.
인간 장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 서열번호 제3서열로 표시되는 올리고뉴클레오타이드의 발현을 검출하는 방법을 통해 인간의 점액성 장암 마커를 검출하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 방법은 유전자 증폭 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 서열번호 제3서열로 표시되는 올리고뉴클레오타이드는 점액성 장암 조직에서 저발현 되는 것을 특징으로 하는 인간의 점액성 장암 진단용 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 장암 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 인간 점액성 장암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) 서열번호 제3서열로 표시되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 올리고뉴클레오타이드의 발현량을 측정하는 단계, 상기 서열번호 제3서열로 표시되는 올리고뉴클레오타이드의 저발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 인간의 점액성 장암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.