KR101411272B1 - ＨＩＶ Ｖｉｆ 돌연변이체 - Google Patents

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Abstract

Vif 야생형 공통서열(consensus sequence)을 도시하고 있는, 도 1A에 제시된 아미노산 서열의 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째 및 142번째 위치에 해당하는 아미노산 각각이 다른 아미노산으로 대체된, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 뉴클레오티드 서열이, HIV-1의 F12 논-프러듀서 변종의 Vif 서열을 도시하고 있는, 도 2에 제시된 아미노산 서열을 엔코딩하지 않는, 폴리뉴클레오티드.
HIV, Vif, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 대체, 돌연변이체, 벡터, 저항력

Description

ＨＩＶ Ｖｉｆ 돌연변이체{HIV VIF MUTNATS}
발명의 분야
본 발명은 렌티바이러스 벡터 및 인체면역결핍바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV)에 의한 중복감염(superinfection)을 포함하는 HIV 감염에 대한 저항력을 함양하는(imparting) 방법에서의 상기 렌티바이러스 벡터의 용도에 관한 것이다.
배경기술
AIDS는 개발도상국에서 주요한 사망원인들 중 하나에 해당하며, 상기 질환은 전국적인 규모로 확산되고 있는 실정이다. 그러나, HIV-1의 근절을 달성하기는 요원하다. 고효율 항-레트로바이러스 요법(highly active anti-retroviral therapy, HAART)의 장기간 사용이 복잡한 복용 섭생의 준수, 독성 부작용 및 높아진 원가 와 같은 결점 및 한계와 결부되어 있기는 하지만, 현재까지는, 상기 요법만이 AIDS의 발달 및 확산을 감소시킬 수 있는 유일한 효험있는 치료법이다(Richman et al., 2001). 부적절한 컴플라이언스와 함께, HIV-1 게놈(genome)의 높은 돌연변이율에서 기인하는, HIV-1의 서브타입내(intra-subtype) 및 서브타입간(inter-subtype)의 극심한 유전적 및 항원적 변이성(variability)은, HAART 약물에 대한 저항력뿐만 아니라, 복수의 클레이드-기반(clades-based) 예방 백신 개발에서의 반복된 실패도 또한 초래한다(Ho et al., 2002). 이에 기초하여, AIDS에 대한 대안적이고/이거나 부가적인 치료 전략의 개발이 필수적이다.
수년간의 전-임상 조사 결과, HIV-1 라이프 사이클이 수많은 레벨에서 방해될 수 있음이 밝혀졌으며, 적어도 항-HIV 유전자 요법에 대한 개념이 입증되었다(Buchschacher et al., 2001). 조혈모세포(Hematopoietic stem cells, HSCs), T-세포 전구체 또는 T 임파구는, 예를 들어, 바이러스 및 세포 유전자에 유도되는 리보자임, 데코이, 안티센스 및 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 분자를 엔코딩하는 유전자(Buchschacher et al., 2001; Jacque et al., 2002; Novina et al., 2002; Lee et al., 2002; Coburn et al., 2002; Qin et al., 2003), 또는 인트라킨(intrakines), 독소 및 단일쇄 항체(single chain antibodies)와 같은 단백질로 유전적으로 변형될 수 있다. 그러나, 바이러스 단백질 또는 항-HIV-1 리보자임의 트랜스도미넌트 돌연변이체를 발현시키는 레트로바이러스 벡터가 형질도입된 T 임파구를 이용한 초기 임상 시도는 실망적이었으며(Woffendin et al., 1996; Ranga et al., 1998; Wong-Staal et al., 1998), 이는 주로 유전학적으로 변형된 T 세포의 낮은 유전자 전달 효율, 불충분한 생착(engraftment) 및 짧은 생체내 영속성 때문에 빚어진 결과이다. 지금까지 수행된 대부분의 전-임상 및 임상 연구들은 MSC 또는 T-세포들을 형질도입시키기 위한 몰로니 설치류 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, MLV)에서 유래된 레트로바이러스 벡터의 사용에 기초하여 왔다. 그러나, MLV-유래 벡터들은 임상적 적용에 있어서 비-분열(non-dividing) HSC 및 T-세포들의 형질도입시의 빈약한 도입효율, 치료효과를 나타낼 수 있는 항-HIV 생성물의 불충분한 발현 및 종양유전자(oncogenes)의 삽입 활성에 의한 종양형성을 유발시키는 성향과 같은, 중요한 한계를 나타내었다(Baum et al., 2003).
항-HIV 유전자 요법의 가능한 표적들 중에 바이러스 감염 인자(viral infectivity factor, vif) 유전자가 있다. vif는 HIV-1의 4개의 부속 유전자들 중 하나이며, Rev-의존적 방식으로 바이러스 복제 후기에 발현된다(Cullen et al., 1998; Frankel et al., 1998). Vif 단백질은 소위 '증식불허용(non-permissive)' 세포들로의 높은 바이러스 감염을 위해 필요하며, 상기 세포들은 HIV-1의 천연 표적(T-세포 및 대식세포) 및 일부 T-세포 계열, 예를 들어, CEM, H9, 및 HUT 78을 포함한다(Fisher et al., 1987; Fouchier et al., 1996; Gabuzda et al., 1992; Sheehy et al., 2002; Simon et al., 1996; von Schedler et al., 1993). 상기한 필요성은 HIV-1에 대한 선천성 면역반응을 부여하는 최근에 확인된 CEM15/APOBEC-3G 단백질(Sheehy et al., 2002)의 활동에 대항하여 활동하는 Vif의 능력에 의존한다. 따라서, Vif 기능의 불능화 또는 방해가 항-HIV-1 요법의 대안적인 접근방법으로 대두되고 있다.
F12-vif는, 15개의 독특한 아미노산 치환을 내포하는, vif의 자연적인 돌연변이이며, HIV-1의 F12 논-프러듀서(non-producer)에서 최초로 발견되었다(Federico et al., 1989; Carlini et al., 1992; Carlini et al., 1996). 상기 F12 논-프러듀서 HIV는 중복감염된 HIV의 복제에 대한 장애를 유발하며 F12-Vif는 상기 프러듀서의 감소된 감염에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 그러나, 항- HIV 활성을 갖는 vif 돌연변이체 및 이러한 돌연변이체를 위한 효과적인 전달 시스템을 제공하여야 할 추가적인 필요성이 존재한다. 본 발명은 상기 문제점들을 극복하기 위한 것이다.
발명의 요약
본 발명자들은 HIV-1이 감염된 T-세포 계열에서의 생체외 HIV-1 복제를 억제하는데 매우 효과적인 vif의 신규한 돌연변이체를 개발하였다. 특히, 본 발명자들은 야생형 서열의 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째 및 142번째 위치에 해당하는 아미노산들의 아미노산 대체를 포함하는 Vif 단백질이 HIV에 대한 항바이러스 효과를 충분히 장기적으로 발휘한다는 것을 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들은 WT-Vif 서열문맥(context)내에 삽입된, 단지 6개의 독특한 아미노산 치환을 내포하는, F12-Vif(Chim3)중 45개 아미노산으로 구성된 지역이, HIV-1 감염으로부터 인간 T-림프구를 보호한다는 것을 발견하였다. 더 나아가, 본 발명자들은, F12-Vif와는 대조적으로, Chim3가 비-증식허용 세포에서의 Vif 결함 비리온(Δvif HIV-1) 복제를 회복시킬 수 없으며, 이러한 돌연변이체를 사용하는 것이 환자내부에 조용히 잠복하고 있는 Δvif HIV-1 변이종유래(quasispecies)과 조우하게 되는 상황에서 휠씬 더 안전하다는 것을 발견하였다.
본 발명의 일 구체예와 관련된 이점은 돌연변이체 Vif 도입유전자(transgene)가, HIV-1-감염된 세포에서만 활성화 되는, Tat-의존성, 야생형 HIV-1 LTR의 전사 조절하에 놓이게 되어, 형질도입된 HSC 및 이들의 자손에서 외래 항원의 불필요한 발현이 회피되며, 즉 HIV-1의 발현이 HIV-1 유도성 조절을 받게 된다는 것이다.
발명에 대한 설명
본 발명의 첫 번째 측면에 따르면, 도 1A의 아미노산 서열의 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째 및 142번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체된(즉, 상기 아미노산들은 제각기 H, I, S, P, R 및 V가 아님) Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 2의 아미노산 서열을 엔코딩하지 않는, 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 도 1A의 아미노산 서열의 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째 및 142번째 위치에 해당하는 아미노산 각각이 다른 아미노산으로 대체되고, 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 중 하나 이상이, 각각, I, I, K, N, V, N, R, R 및 N이 아닌, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I, K, N, V, N, R, R 및 N이 아니다.
일 구체예에서 도 1A의 아미노산 서열의 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째 및 142번째 위치에 해당하는 아미노산 각각이 다른 아미노산으로 대체되고, 22번째, 29번째, 41번째, 66번째, 80번째, 109번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산 모두가, 각각, I, I, K, V, N, R, R 및 N이 아니다.
바람직하게는 상기 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째 및 142번째 위치에 해당하는 아미노산 모두가, 각각, N, V, R, L, S 및 I로 대체된다.
일 구체예에서 상기 48번째 위치에 해당하는 아미노산이 N이다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산이 자연 생성 Vif내에 존재하는 아미노산이며, 예컨대, HXB2 접근번호(acc.#) K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 및 NL4-3 접근번호 M19921이나, 이에만 한정되는 것은 아니다(도 1A, 1B 및 1C 참조). 상기 위치들에 적당한 아미노산으로는 위치 22(K), 위치 29(M), 위치 41(R), 위치 48(N 또는 H), 위치 66(I), 위치 80(H), 위치 109(L), 위치 185(G), 위치 186(S)를 예로 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 도 1A의 아미노산 서열의 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째 및 185번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고(즉, 상기 아미노산들은 제각기 H, I, S, P, R, V 및 G가 아님), 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 중 하나 이상이, 각각, I, I, K, N, V, N, R 및 V가 아닌, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I, K, N, V, N, R 및 N이 아니다.
일 구체예에서, 도 1A의 아미노산 서열의 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째 및 185번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고, 22번째, 29번째, 41번째, 66번째, 80번째, 109번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I, K, N, R 및 N이 아니다.
바람직하게는 상기 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째 및 185번째 위치에 해당하는 아미노산들이 제각기 N, V, R, L, S, I 및 R로 대체된다.
일 구체예에서 상기 48번째 위치에 해당하는 아미노산이 N이다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산이 자연 생성 Vif내에 존재하는 아미노산이며, 예컨대, HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 및 NL4-3 접근번호 M19921이나, 이에만 한정되는 것은 아니다(도 1A, 1B 및 1C 참조). 상기 위치들에 적당한 아미노산으로는 위치 22(K), 위치 29(M), 위치 41(R), 위치 48(N 또는 H), 위치 66(I), 위치 80(H), 위치 109(L), 및 위치 186(S)를 예로 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 도 1A의 아미노산 서열의 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고(즉, 상기 아미노산들은 제각기 H, I, S, P, R, V , G 또는 S가 아님), 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째 및 109번째 위치에 해당하는 아미노산들 중 하나 이상이, 각각, I, I, K, N, V, N 및 R이 아닌, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 및 109번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I, K, N, V, N 및 R이 아니다.
일 구체예에서, 도 1A의 아미노산 서열의 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고, 22번째, 29번째, 41번째, 66번째, 80번째 및 109번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I, K, V, N 및 R이 아니다.
바람직하게는 상기 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들이 제각기 N, V, R, L, S, I, R 및 N으로 대체된다.
일 구체예에서 상기 48번째 위치에 해당하는 아미노산이 N이다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째 위치에 해당하는 아미노산이 자연 생성 Vif내에 존재하는 아미노산들이며, 예컨대, HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 및 NL4-3 접근번호 M19921이나, 이에만 한정되는 것은 아니다(도 1A, 1B 및 1C 참조). 상기 위치들에 적당한 아미노산으로는 위치 22(K), 위치 29(M), 위치 41(R), 위치 48(N 또는 H), 위치 66(I), 위치 80(H), 위치 109를 예로 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 도 1A의 아미노산 서열의 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고(즉, 상기 아미노산들은 제각기 L, H, I, S, P, R, V , G 또는 S가 아님), 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째 및 80번째 위치에 해당하는 아미노산들 중 하나 이상이, 각각, I, I, K, N, V 및 N이 아닌, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째 및 80번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I, K, N, V 및 N이 아니다.
일 구체예에서 도 1A의 아미노산 서열의 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고, 22번째, 29번째, 41번째, 66번째 및 80번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I, K, V 및 N이 아니다.
바람직하게는 상기 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들이 제각기 R, N, V, R, L, S, I, R 및 N으로 대체된다.
일 구체예에서 상기 48번째 위치에 해당하는 아미노산이 N이다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째 위치에 해당하는 아미노산이 자연 생성 Vif내에 존재하는 아미노산들이며, 예컨대, HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 및 NL4-3 접근번호 M19921이나, 이에만 한정되는 것은 아니다(도 1A, 1B 및 1C 참조). 상기 위치들에 적당한 아미노산으로는 위치 22(K), 위치 29(M), 위치 41(R), 위치 48(N 또는 H), 위치 66(I), 위치 80(H)를 예로 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 도 1A의 아미노산 서열의 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고(즉, 상기 아미노산들은 제각기 H, L, H, I, S, P, R, V , G 및 S가 아님), 22번째, 29번째, 41번째, 48번째 및 66번째 위치에 해당하는 아미노산들 중 하나 이상이, 각각, I, I, K, N 및 V가 아닌, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째 및 66번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I, K, N 및 V가 아니다.
일 구체예에서 도 1A의 아미노산 서열의 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고, 22번째, 29번째, 41번째 및 66번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I, K 및 V가 아니다.
바람직하게는 상기 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들이 제각기 N, R, N, V, R, L, S, I, R 및 N으로 대체된다.
일 구체예에서 상기 48번째 위치에 해당하는 아미노산이 N이다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째 및 66번째 위치에 해당하는 아미노산이 자연 생성 Vif내에 존재하는 아미노산들이며, 예컨대, HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 및 NL4-3 접근번호 M19921이나, 이에만 한정되는 것은 아니다(도 1A, 1B 및 1C 참조). 상기 위치들에 적당한 아미노산으로는 위치 22(K), 위치 29(M), 위치 41(R), 위치 48(N 또는 H), 위치 66(I)를 예로 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 도 1A의 아미노산 서열의 66번째, 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고(즉, 상기 아미노산들은 제각기 I, H, L, H, I, S, P, R, V , G 및 S가 아님), 22번째, 29번째, 41번째 및 48번째 위치에 해당하는 아미노산들 중 하나 이상이, 각각, I, I, K 및 N이 아닌, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째 및 48번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I, K 및 N이 아니다.
일 구체예에서 도 1A의 아미노산 서열의 66번째, 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고, 22번째, 29번째 및 41번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I 및 K가 아니다.
바람직하게는 상기 66번째, 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들이 제각기 V, N, R, N, V, R, L, S, I, R 및 N으로 대체된다.
일 구체예에서 상기 48번째 위치에 해당하는 아미노산이 N이다..
바람직하게는 상기 22번째, 29번째, 41번째 및 48번째 위치에 해당하는 아미노산이 자연 생성 Vif내에 존재하는 아미노산들이며, 예컨대, HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 및 NL4-3 접근번호 M19921이나, 이에만 한정되는 것은 아니다(도 1A, 1B 및 1C 참조). 상기 위치들에 적당한 아미노산으로는 위치 22(K), 위치 29(M), 위치 41(R), 위치 48(N, H)를 예로 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 도 1A의 아미노산 서열의 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고(즉, 상기 아미노산들은 제각기 H, I, H, L, H, I, S, P, R, V , G 및 S가 아님), 22번째, 29번째 및 41번째 위치에 해당하는 아미노산들 중 하나 이상이, 각각, I, I 및 K가 아닌, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번 및 41번째 위치에 해당하는 아미노산들 모두가, 각각, I, I 및 K가 아니다.
바람직하게는 상기 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들이 제각기 N, V, N, R, N, V, R, L, S, I, R 및 N으로 대체된다.
바람직하게는 상기 22번째, 29번째 및 41번째 위치에 해당하는 아미노산이 자연 생성 Vif내에 존재하는 아미노산들이며, 예컨대, HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 및 NL4-3 접근번호 M19921이나, 이에만 한정되는 것은 아니다(도 1A, 1B 및 1C 참조). 상기 위치들에 적당한 아미노산으로는 위치 22(K), 위치 29(M), 위치 41(R)을 예로 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 도 1A의 아미노산 서열의 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고(즉, 상기 아미노산들은 제각기 R, H, I, H, L, H, I, S, P, R, V , G 및 S가 아님), 22번째 및 29번째 위치에 해당하는 아미노산들 중 하나 이상이 I가 아닌, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는 상기 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들이 제각기 K, N, V, N, R, N, V, R, L, S, I, R 및 N으로 대체된다.
바람직하게는 상기 22번째 및 29번째 위치에 해당하는 아미노산이 자연 생성 Vif내에 존재하는 아미노산들이며, 예컨대, HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 및 NL4-3 접근번호 M19921이나, 이에만 한정되는 것은 아니다(도 1A, 1B 및 1C 참조). 상기 위치들에 적당한 아미노산으로는 위치 22(K), 위치 29(M)을 예로 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 22번째 및 29번째 위치에 해당하는 아미노산 둘 모두가 I가 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 도 1A의 아미노산 서열의 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들 각각이 다른 아미노산으로 대체되고(즉, 상기 아미노산들은 제각기 M, R, H, I, H, L, H, I, S, P, R, V , G 및 S가 아님), 22번째 위치에 해당하는 아미노산이 I가 아닌, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는 상기 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산들이 제각기 I, K, N, V, N, R, N, V, R, L, S, I, R 및 N으로 대체된다.
바람직하게는 상기 22번째 위치에 해당하는 아미노산이 자연 생성 Vif내에 존재하는 아미노산이며, 예컨대, HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 및 NL4-3 접근번호 M19921이나, 이에만 한정되는 것은 아니다(도 1A, 1B 및 1C 참조). 상기 위치에 적당한 아미노산으로는 K(리신)을 예로 들 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 이에만 한정되는 것은 아니나, 예컨대, HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 및 NL4-3 접근번호 M19921과 같은(도 1A, 1B 및 1C 참조), 자연 생성 Vif 서열에 삽입(embedment)된 도 2의 F12-Vif 서열의 126번째 내지 170번째 아미노산을 포함하는 키메릭 Vif(chimeric Vif) 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이점에 있어서, 자연 생성 Vif 서열은 F12-Vif가 아니다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본원에서 정의된 바와 같은 Vif 폴리펩티드 단편을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 단편이 도 2의 서열의 적어도 126번째 내지 170번째에 해당하는 아미노산을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는 상기 단편은 도 2의 서열중 적어도 126번째 내지 170번째 아미노산을 포함한다.
일 구체예에서 상기 단편은 도 2의 서열중 126번째 내지 170번째 아미노산으로 구성된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 Vif 폴리펩티드 단편을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 상기 단편은 도 1A의 야생형 서열에서 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째 및 142번째 위치에 해당하는 아미노산의 아미노산 대체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 단편은 도 1A의 야생형 서열의 185번째 위치에 해당하는 아미노산의 아미노산 대체를 더 포함한다.
또 다른 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 에 의해 엔코딩되는 단편은 도 1A의 야생형 서열의 186번째 위치에 해당하는 아미노산의 아미노산 대체를 더 포함한다.
또 다른 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 단편은 도 1A의 야생형 서열의 109번째 위치에 해당하는 아미노산의 아미노산 대체를 더 포함한다.
또 다른 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 단편은도 1A의 야생형 서열의 80번째 위치에 해당하는 아미노산의 아민노산 대체를 더 포함한다.
또 다른 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 단편은도 1A의 야생형 서열의 66번째 위치에 해당하는 아미노산의 아민노산 대체를 더 포함한다.
또 다른 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 단편은 도 1A의 야생형 서열의 48번째 위치에 해당하는 아미노산의 아민노산 대체를 더 포함한다.
또 다른 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 단편은 도 1A의 야생형 서열의 41번째 위치에 해당하는 아미노산의 아민노산 대체를 더 포함한다.
또 다른 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 단편은 도 1A의 야생형 서열의 29번째 위치에 해당하는 아미노산의 아민노산 대체를 더 포함한다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 22번째 위치의 아미노산이 I로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 29번째 위치의 아미노산이 I로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 41번째 위치의 아미노산이 K로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 48번째 위치의 아미노산이 N으로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 66번째 위치의 아미노산이 V로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 80번째 위치의 아미노산이 N으로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 109번째 위치의 아미노산이 R로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 127번째 위치의 아미노산이 N으로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 128번째 위치의 아미노산이 V로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 130번째 위치의 아미노산이 R로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 131번째 위치의 아미노산이 L로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 132번째 위치의 아미노산이 S로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 142번째 위치의 아미노산이 I로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 185번째 위치의 아미노산이 R로 변형된다.
바람직하게는 도 1A의 야생행 서열의 186번째 위치의 아미노산이 N으로 변형된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 도 4A에 제시된 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되거나 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 도 5A에 제시된 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되거나 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 도 15 또는 16에 제시된 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되거나 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 Vif 폴리펩티드 및 Vif 폴리펩티드 단편이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 도 4A 또는 4B에 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 상기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.
바람직하게는, 상기 벡터가 재조합 렌티바이러스 벡터이다.
바람직하게는, 상기 렌티바이러스 벡터가 HIV에서 유래할 수 있다.
바람직하게는, 상기 벡터가 바이러스 LTR에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 엔코딩한다.
바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 tat 및 rev 의존성이다.
바람직하게는 본 발명의 상기 벡터는 tat 및 rev 유전자를 포함하지 아니한다.
바람직하게는 본 발명의 상기 벡터는 HIV-1 유도성 조절하에서 상기 돌연변이체 Vif 또는 돌연변이체 Vif 단편을 발현시킬 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 상기 벡터는 gag, pol 및 env 유전자가 결함되어 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 상기 벡터는 선별 마커 유전자(selection marker gene)를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
바람직하게는 본 발명의 상기 벡터는 저 친화성 신경성장인자(low affinity nerve growth factor receptor, LNGFR)의 적어도 일부분을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함한다.
또 다른 일 구체예에서, 본 발명의 상기 벡터는 삽입된 프로바이러스(integrated provirus) 형태로 존재한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 본 발명의 벡터로부터 획득할 수 있는 레트로바이러스 입자가 제공된다.
바람직하게는 상기 레트로바이러스 입자는 슈도타이핑(pseudotyping)된다.
바람직하게는 상기 돌연변이체 Vif를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스의 긴 말단 반복서열(viral long terminal repeat, LTR)에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 본 발명의 상기 벡터 및 레트로바이러스의 gag-pol 및 레트로바이러스 또는 비레트로바이러스의 env를 포함하는, 본 발명에 따른 레트로바이러스 입자 생산 시스템이 제공된다. 특히, 슈도타이핑(pseudotyping)에 대한 개념은 종래 기술분야에 잘 알려져 있으며 본 발명에서 사용될 수 있다.
바람직하게는 상기 레트로바이러스 gag-pol 및 env는 다른 벡터에 존재한다.
바람직하게는 외막 단백질(envelope protein)은 RD114-TR, VSV-G, GALV 및 4070A로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 본 발명의 벡터 또는 레트로바이러스 입자로 감염 또는 형질도입된 세포가 제공된다.
바람직하게는 상기 세포는 T-세포이다.
바람직하게는 상기 세포는 단핵세포(monocyte), 대식세포(macrophage) 또는 림프구(lymphocyte)이다.
바람직하게는 상기 세포는 CD34+ 조혈전구세포(hematopoietic precursor cell) 또는 조혈세포(hematopoietic cell)이다.
바람직하게는 본 발명의 상기 세포는 HIV-1 유도성 조절하에서 돌연변이체 Vif를 발현시킨다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 약용으로 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 레트로바이러스 입자 또는 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 레트로바이러스 입자 또는 세포 및 약제학적으로 증식허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 HIV 감염 또는 관련 병태(condition)의 치료 또는 예방을 위한 약제(medicament) 제조를 위한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 레트로바이러스 입자, 세포 또는 약제학적 조성물의 용도가 제공된다. 상기 HIV 감염은 중복감염(superinfection)을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 레트로바이러스 입자, 세포 또는 약제학적 조성물을 동일한 유효량으로 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하는 HIV 감염 또는 이와 관련된 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 추가적인 측면에 따르면 본 발명의 벡터 또는 레트로바이러스 입자를 감염시키거나 형질도입시키는 것을 포함하는 HIV 감염 또는 이와 관련된 병태의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
일 구체예에서 상기 감염 또는 형질도입은 생체밖에서(ex vivo) 수행되며 환자로 도입된다.
도면에 대한 설명
도 1A는 Vif의 5개 아미노산 서열(HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호 K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449)에 의해 생성된 야생형(WT) 공통(consensus) 아미노산 서열을 보여준다. 상기 접근번호는 NCBI Genbank를 참조한 것이다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide).
도 1B는 Vif의 5개 아미노산 서열, 생성된 공통 서열 및 F12-Vif 서열의 배열을 도시한다.
도 1C는 NL4-3의 야생성 Vif 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 HIV1 F12로부터의 HIV F12-Vif 폴리펩티드 서열(NCBI 접근번호: Z11530)를 도시한다. 특유한 아미노산 치환이 굵은 글씨체로 표기되어 있다.
도 3A는 Chim1 폴리펩티드 서열을 도시한다. 굵은 글씨체로 표기된 아미노산은 야생형 Vif(NL4-3)와 대비하여 대체된 아미노산을 나타낸다.
도 3B는 F12-Vif(이탤릭) 및 야생형 Vif에 해당하는 Chim1 부분을 강조하여 도시하고 있다.
도 4A는 Chim2 폴리펩티드 서열을 도시한다. 굵은 글씨체로 표기된 아미노산은 야생형 Vif(NL4-3)와 대비하여 대체된 아미노산을 나타낸다.
도 4B는 F12-Vif(이탤릭) 및 야생형 Vif에 해당하는 Chim2 부분을 강조하여 도시하고 있다.
도 5A Chim3 폴리펩티드 서열을 도시한다. 굵은 글씨체로 표기된 아미노산은 야생형 Vif(NL4-3)와 대비하여 대체된 아미노산을 나타낸다.
도 5B는 F12-Vif(이탤릭) 및 야생형 Vif에 해당하는 Chim3 부분을 강조하여 도시하고 있다.
도 6은 HIV-1-기반 PΔN, WT-VifPΔN, F12-VifPΔN, Chim1-PΔN, Chim2-PΔN 및 Chim3-PΔN 레트로바이러스 벡터의 프로바이러스 형태에 대한 개략적 도시이다.
도 7은 웨스턴 블랏 분석에 의한 야생형(WT)- 및 F12-Vif 전장 단백질과 비교한 Chim1, Chim2 및 Chim3의 발현 분석을 도시한다.
도 8은 T 세포주에서의 키메릭(chimeric) 단백질의 항바이러스 활성을 도시한다. A. X4 분자 클론 HIV NL4-3을 0.1의 MOI로 NP CEM A3.01 목(mock)-형질도입(Mock) 및 F12-Vif- 및 Chim3PΔN-형질도입된 세포에 감염시켰다. RT 분석에 의한 감염 키네틱스(15일)의 최고점에서 측정된 3회반복(triplicate) 측정값의 평균이 제시되어 있다. B. X4 HIV-1 NL4-3을 0.1의 MOI로 감염시킨 증식허용 목-형질도입 CEMss 세포 및 LV-형질도입 CEMss 세포의 감염 키네틱스. C. X4 HIV-1 NL4-3을 0.1의 MOI로 감염시킨 증식허용성 SupT-1 목-형질도입 세포 및 LV-형질도입된 세포. D. R5 HIV-1 AD8을 0.1의 MOI로 증식불허용 목-형질도입 PM1 세포 및 Chim3PDN-형질도입된 PM1 세포에 감염시켰으며 RT 활성이 감염후 6일째에 측정되었다.
도 9는 CD4+ T 림파구에서의 Chim3의 항바이러스 활성을 도시한다. X4 HIV-1 NL4-3(A) 또는 R5 분자 클론 HIV-1 AD8 둘 중 어느 하나를 0.1의 MOI(B)로 목 형질도입 및 LV-형질도입된 제대혈에서 유래한 CD4+ T 임파구에 감염시켰다.
도 10은 표시된 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 다음 HIV-1NL4-3가 0.1의 MOI로 감염된 CEM A3.01 세포에서의 HIV-1 복제 키네틱스를 도시한다.
도 11은 Chim3가 CD4+ T 림프구에서 X4 및 R5 Δvif HIV-1의 복제를 회복시키지 못함을 보여준다. X4 Δvif-인체면역결함바이러스(A) 및 R5 HIV-1 AD- 1vif (B) 분자 클론을 0.1의 MOI로 목-형질도입 또는 LV-형질도입된 CD4+ T 림프구에 감염시켰다. HIV-1 생산은, 각각의 경우에 있어서, 39일 및 29일 동안 지속되었다.
도 12는 HIV-1 감염후에 목-형질도입 세포에 재차 F12-Vif- 및 Chim3-형질도입된 세포의 선택적인 이점을 보여준다. LV-형질도입 및 목-형질도입 CEM A3.01 세포를 50:50 비율로 섞고 배양한 다음 X4 HIV-1 NL4-3을 0.01의 MOI로 감염시켰다. 형질도입된 세포(NGFR+ 세포)의 증식율은 감염된 세포와 비감염된 세포 간에 일당 20 p.i.로 계산되었다.
도 13은 WT-Vif와 비교하여 Chim2 및 Chim3가 낮게 발현되며 Chim3가 증식허용 세포에서 보다 증식불허용 세포에서 더 효율적으로 프로테아좀에 의해 분해됨을 보여준다. A. 목 및 LV-형질도입된 증식불허용 CEM A3.01 또는 증식허용 SupT-1 세포 둘 중 어느 하나에서의 기저수준(basal level)의 Vif 및 hA3G 단백질에 대한 웨스턴 블롯 분석. B. 프로테아좀 억제자 MG132를 18시간 동안 처리한 감염되지 않은 증식허용(SupT-1) 또는 증식불허용(CEM A3.01) 세포 둘 중 어느 하나로부터 유래한 세포 추출물 전체에 대한 웨스턴 블롯 분석. 필터를 항-Vif, 항-hA3G(증식불허용 세포에서만) 및 항-액틴 항체(Abs)로 순차적으로 탐침(probing)하였다. C. MG132를 처리 또는 비처리한 밴드 강도를 측정함으로써 Vif 단백질의 증가배수(fold of increment)를 계산하였으며 액틴 밴드를 갖는 동일한 양의 단백질로 표준화(normalising)시켰다. 독립된 실험을 3회 반복하여 정량화하였다.
도 14는 증식불허용 세포에 시클로헥시미드(cycloheximide)를 처리하고 난 후 Chim3 mRNA의 축적을 보여준다. A. 증식불허용 CEM A3.01 세포로부터 세포 총 RNA(10mg)를 추출하고 난 다음, 분획화된 RNA를 NGFR 프로브와 혼성화시켰다. B. 8시간 동안 클로헥시미드(10 mg/ml)를 처리 또는 비처리한 증식불허용 CEM A3.01 세포로부터 총 RNA를 추출하고 난 다음 분획화된 RNA를 NGFR 프로브와 혼성화시켰다. C. Vif mRNA의 증가배수를 NGFR 밴드상에서 표준화된 상대적 밴드에 대한 포스포르이메이져(Phosphorimager) 정량화로 계산하였다.
도 15는 Chim3 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 16은 Chim2 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 17은 NL4-3의 야생형(WT) Vif 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 18은 F12-Vif 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 구체예들이 지금부터 비-제한적인 실시예를 통해 기술될 것이다.
본 발명의 실시에는, 특별히 달리 언급하지 아니하는 한, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자의 창작능력범위 이내인, 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 일반적인 기술들이 채용될 것이다. 상기 기술들은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, 제이. 샘브룩, 이. 에프. 프리치, 및 티. 마니아티스의 저서[Sambrook, E. F. Fritsch, 및 T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; 아우수벨, 에프. 엠과 그의 동료저자들의 저서[Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)]; 비. 로에, 제이. 크랩트리, 및 에이. 칸의 저서[B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons]; 제이. 엠. 폴락 및 제임스. 오'디. 맥지의 저서[J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press]; 엠. 제이. 게이트(에디터)의 저서[M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press]; 및 디. 엠. 제이. 릴리 및 제이. 이. 달버그의 저서[D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press]를 참조할 수 있다. 상기 각각의 일반적인 저서들은 본원의 참조로서 여기에 통합되어 있다.
표적 세포
본 발명의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 레트로바이러스 입자, 세포 또는 약제학적 조성물은 표적 세포로 전달될 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 면역체계의 세포, 예를 들어, T-세포이다. 바람직하게는 상기 세포는 인간 면역체계의 세포이다. 훨씬 더 바람직하게는 상기 세포는 HIV에 감염될 수 있는 세포, 즉 HIV 증식허용 세포(HIV permissive cell)이다. 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 입자가 도입될 수 있는 세포는 말초혈액 림프구, 단핵세포, 대식세포, 성상세포를 포함한다.
바이러스 감염 인자(Viral Infectivity Factor, Vif)
본원이 개시한 아미노산 위치는 도 1A의 공통 서열의 특정 위치에 '해당하는(corresponding)' 아미노산 위치들에 의해 확인된 것임을 주목하여야 한다. 이는 본 발명의 서열이 도 1A에 제시된 서열들을 반드시 포함해야만 한다는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 아니된다. 통상의 기술자는 Vif 서열이 다른 HIV 변종(strains)에서는 달라진다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 상기 도면은 단지 임의의 특별한 Vif 단백질내에서의 특정 아미노산 위치의 확인(identification)이 가능하도록 하는 참고사항으로 활용된다. 상기 아미노산 위치들은 서열 정렬 프로그램을 사용하여 일반적으로 확인될 수 있으며, 상기 프로그램의 사용법은 종래 기술분야에 잘 알려져 있다.
HIV-1과 같은 렌티바이러스는 모든 복제-가능(replication-competent) 레트로바이러스에 의해 발현되는 구조 유전자 gag, pol, 및 env와 더불어 수 많은 부속 유전자(accessory genes)를 엔코딩한다. 상기 부속 유전자들 중 하나인, vif(바이러스 감염 인자)는, 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus)를 제외한 공지된 모든 렌티바이러스에서 발현된다. Vif 단백질은 192개의 아미노산으로 이루어진 23-kDa 단백질로서, 염기성이 매우 강하다. HIV-1-감염-개체들로부터 획득한 바이러스에 대한 DNA 서열 분석은 Vif의 개방해독틀이 손상되지 않은 상태로 존재한다는 것을 밝혀내었다(Sova, et al., 1995; Wieland et al., 1994; Wieland et al., 1997). 비교적 천연 조건에서, Vif 단백질은 시험관내에서(in vitro) 이합체, 삼합체 또는 사합체를 포함하는, 다합체(multimers)를 형성한다. 또한 Vif 단백질은 세포내에서 서로 반응할 수 있다는 것이 입증되었다. 후속 연구는 Vif 자기-회합(self-association)에 영향을 미치는 도메인이 상기 단백질의 C-말단에 위치, 특히 프로린-풍부 지역 151-164에 위치함을 밝혀내었다(Yang et al., 2001).
vif 유전자의 결실은 짧은 꼬리 원숭이(macaques)에서의 원숭이 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus, SIV) 복제 및 SCID-hu 생쥐에서의 HIV 복제를 급격하게 감소시키며(Aldrovandi, G. M. & Zack, J. A., J. Virol. 70:1505-1511, 1996; Desrosiers, R. C., et al., J. Virol. 72:1431-1437, 1998), 이는 생체내에서의(in vivo) 렌티바이러스의 병원성 복제에 상기 유전자가 필수적임을 입증한다. 종래의 발견은 프로바이러스 DNA 통합에서의 Vif 역할을 뒷받침한다(Simon et al., 1996; von Schwedler et al., 1993; Sova et al., 2001). Vif는 또한 게놈 RNA(Zhang et al., 2000; Dettenhofer et al., 2000) 또는 캡시드 조립의 후기에 관여하는, 예컨대, HP-68-Gag 복합체와 같은, 바이러스 및 세포 단백질 둘 중 어느 하나와 상호작용한다는 것이 알려져 있다(Zimmerman et al., 2002).
Vif-증강된 감염성은 바이러스-생산 세포에서는 부여되나 표적 세포에서만은 부여되지 아니하는 것으로 입증되어 있다. 그러므로 vif - 프로바이러스는 바이러스-생산 세포에서는 트랜스(trans)로 컴플리멘트(compliment)될 수 있으나, 표적 세포에서는 그러하지 아니하다. 더욱이, Vif의 필요여부는 세포 유형-특이적이다. vif - 바이러스는 초기(primary) T-림프구에서 생산될 때, 최종적으로 대식세포, 또 는 일부 T-림프 세포주, 예컨대 H9로 분화될 때 음성 표현형을 나타낸다. 상기 세포들은 "증식불허용(nonpermissive)" 세포로 정의된다. 그러나, SupT1, C8166과 같은 몇몇 T-세포주, 및 HelaCD4 세포와 같은 다른 비-T-세포에서는, vif - HIV-1 바이러스의 생산적인 복제가 일어날 수 있다. 상기 세포주들은 "증식허용(permissive)" 세포로 정의된다(Gabuzda et al., 1992; von Schwedler et al., 1993; Gabuzda et al., 1994). 상기한 구비조건들은 증식불허용 세포에서 선택적으로 발현되며, HIV-1에 대한 자연면역(innate immunity)을 부여하는, 최근에 확인된 CEM15/APOBEC-3G 단백질의 활동을 상충시키는 Vif 활성에 의존한다(Sheehy et al., 2002). APOBEC-3G는 바이러스 생산이 일어나는 동안 vif 결함 비리온(virions)(Δvif HIV-1)에 통합되는 시티딘 디아미나아제 세포 단백질로서, 감염된 세포 내에서 역전사가 진행되는 동안 발생초기의 플러스 가닥 cDNA에서 대규모 G-에서-A로의 하이퍼 돌연변이를 유발하여 Δvif HIV-1 변종의 복제에 대한 강한 억제를 유도한다(Lecossier et al., 2003; Harris et al., 2003; Mariani et al., 2003; Goff et al., 2003). 초기에 발견된 유전자군의 구성원인, APOBEC는, RNA에 작용하고 그의 발현을 조절하기 위해 그의 표적 아포리포프로테인 B mRNA 내의 시토신 잔기 하나만을 탈아미노화시키는 반면(Teng et al., 1998), APOBEC-3G는 대신에 단일-가닥 DNA에 작용하고 훨씬 더 강력하다. 상기 유전자의 작동 결과, 바이러스 DNA의 모든 시토신 잔기들의 약 1% 내지 2%가 우라실로 전환된다. APOBEC-3G에 의한 공격후, 탈아미노화는 바이러스 증식이 불가능한 고도로 돌연변이된 DNA를 생성시키거나, 우라실-기반 절제 경로를 촉발시킴으로써, 표적 세포로의 cDNA의 축적을 방해한다. 또 달리, 마이너스 가닥에서 우라실 수의 증가는 플러스-가닥 합성 개시에 나쁜 영향을 미칠 수 있다.
Vif가 APOBEC-3G를 억제하는 활동 메카니즘은 아직까지 완전히 이해되지 못하고 있다. 그러나, Vif가 비리온에서 캡슐화(encapsulation)된 APOBEC-3G 단백질의 수준을 상당히 감소시킨다는 사실이 밝혀진 바 있다. 비리온으로부터 APOBEC-3G이 배제되도록 하기 위해, Vif는 조립되는 비리온과 상호작용하는 APOBEC-3G의 도메인을 차폐(mask)하거나; 바이러스가 조립되는 세포의 부위로부터 APOBEC-3G가 멀리 이격되도록 하거나; APOBEC-3G 분해를 유발할 수 있다. Vif의 주요한 역할이 APOBEC3G의 프로테아좀-의존성 분해를 유발시켜, 이로 인하여 HIV-1가 복제되도록 하는 것임을 제시하는 증거가 있다(Navarro et al., 2004; Trono, 2004). APOBEC-3G의 분해는 Vif에 의한 그의 유비퀴틴표지화(ubiquitination)에 대해 2차적이며, C-말단 SOCS 박스를 통한 APOBEC-3G 및 E3 유비퀴틴 리가제 복합체 간의 기능성 교량(functional bridge)을 형성한다(Addo et al., 2003, and Harris et al., 2003).
바이러스 단백질 및 핵산을 포함하는, 바이러스 구성인자의 발현은 증식불허용 세포로부터 생산된 비리온에서 변형되지 아니한다(Fouchier et al., 1996; Gabuzda et al., 1992; von Schwedler et al., 1993). 그러나, vif 유전자의 결실은, 결과적으로 비리온 형태의 변형을 초래한다(Borman et al., 1995; Bouyac et al 1997; Hoglund et al., 1994).
15개의 독특한 아미노산 치환을 내포하는, Vif의 천연 돌연변이체(F12-Vif) 는, F12 HIV-1 변종(Federico et al., 1989)에서 최초로 확인되었으며, 1차 HIV-1 분리체로 감염시킨 HUT 78 세포에서 클로닝된 논-프로듀서 프로바이러스는 항-HIV 활성을 나타낸다(D'Aloja et al., 1998).
본 발명자들은 HIV-1로 감염된 T 세포주에서 HIV-1의 시험관내 복제 억제에 매우 효과적인 신규한 vif 돌연변이체를 개발하였다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 HIV 감염으로부터 보호하기 위해 전장서열의 F12-Vif가 반드시 필요한 것은 아니라는 것을 밝혀내었다. 실제, 본 발명자들은, 야생형-Vif 서열(context)에 끼어든, 단지 6개의 독특한 아미노산 치환을 내포하는, F12-Vif의 45개 아미노산 지역(F12-Vif-Chim3)이 HIV-1 감염으로부터 인간 T-림프구를 보호한다는 것을 밝혀내었다.
본 발명의 다양한 측면에서, Vif 단백질은 F12-Vif 및 제2 Vif 단백질의 키메라(chimer)일 수 있으며, 상기 제2 Vif 단백질은 자연적으로 생성된 Vif 단백질인 것이 바람직하다. 예를 들어, 상기 제2 Vif 단백질은 HXB2 접근번호 K03455, BRU 접근번호 K02013, SF2 접근번호K02007, PV22 접근번호 K02083, MN 접근번호 M17449 또는 NL4-3 접근번호 M19921 Vif일 수 있다(도 1A, 1B 및 1C 참조). 일 구체예에서 상기 키메라(chimer) 단백질을 만들기 위해 사용된 상기 제2 Vif 단백질은 F12-Vif내에 존재하는 보존된 15개의 아미노산 치환(즉, 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째, 142번째, 185번째 및 186번째 위치에서의 치환) 중 어느 것도 지니지 아니한다. F12-Vif 특이적 치환이 요구되는 키메라(chimer) 부분은 F12-Vif 단백질로부 터 유래되는 것이 바람직하며, 나머지 부분은 제2 Vif 단백질에서 유래되는 것이 바람직하다. 예를 들어, F12-Vif 특이적 치환이 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째 및 142번째 위치(다시 말해, 상기 지점들에서의 아미노산들이 제각기 N, V, R, L, S 및 I임)에서는 요구되나, 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 185번째 및 186번째 위치에서는 불필요한 경우라면, 적어도 22번째 내지 186번째 아미노산을 포함하는 키메릭 부분이 F12-Vif로부터 유래될 수 있으며, 나머지 부분은 제2 Vif 단백질로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 다양한 측면에서, 본 발명의 Vif 단백질은 상기 요구되는 아미노산 위치에서 점 돌연변이를 일으킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, F12-Vif 특이적 치환이 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째 및 142번째 위치(다시 말해서, 상기 지점들의 아미노산이, 각각, N, V, R, L, S 및 I임)에서 요구되는 경우, 상기 위치-특이적 돌연변이[예컨대, PCR 중첩 기술(Taddeo et al., 1996)을 사용함]는 자연 생성 Vif(예컨대, NL4-3)의 상기 위치들에 도입될 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 Vif 단백질은 돌연변이된 Vif 단백질 또는 이의 단편이며, 상기 단백질이 표적 세포에서 발현될 때, HIV-1의 복제를 감소시키거나 억제한다. 본 발명의 돌연변이체 Vif는 표준 돌연변이유발 기술을 사용하여 돌연변이화될 수 있다. 본 발명자들은 상기 돌연변이유발에 결실 또는 치환도 또한 포함시킨다. 특히 바람직한 구체예에서, 위치-특이적 돌연변이가 PCR 중첩 기술을 사용하여 도입된다(Taddeo et al., 1996). HIV 감염에 대한 적어도 일부의 저항력 또는 월등한 저항력(super-resistance)을 함양(imparting)하는 돌연변이체 Vif의 능력은 바이러스 복제를 분석함으로써 결정될 수 있다. 이러한 분석은 종래 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 D'Aloja(2001)에 개시되어 있다. 또 달리 돌연변이체 HIV Vif는 야생형으로 되돌아 갈 수 잇으며 그 결과 생성된 생성물이 HIV-증식허용성 세포에 형질도입될 수 있다. 상기 방법은 유용한 추가적인 돌연변이를 확인할 수 있게 하며 이로써 본 발명에 유용한 돌연변이체의 추가적인 동정이 가능하게 할 것이다.
인체면역결핍바이러스(HIV)
본원에서 사용된 HIV는, 예컨대 HIV(예를 들어, HIV-1 및 HIV-2)와 HTLV(예를 들어, HTLV-III)와 같은, 후천성 면역결핍증후군(AIDS) 및 AIDS-관련 합병증(ARC)의 원인체(causative agents)로써의 연관성이 인정되어 그러한 바이러스들로 명명된 모든 것을 포괄한다. 2가지 중요한 HIV 유형(HIV-1 및 HIV-2)중, HIV-1은 전 세계적으로 우점종(predominant species)이다. 현재까지, HIV-1의 2개의 주요 그룹인, "M" 및 "O"가 규명되어 있다. HIV-1 감염의 거의 대부분을 유발시키는 바이러스는 M그룹에 속해 있다. 상기 O 그룹은 M 그룹으로부터 유전학적으로 상당히 떨어져 있다. M 그룹의 HIV-1 서브타입은 서브타입 A-J를 포함한다.
폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이들은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 이들은 또한 이들내에 합성 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 통상의 기술자는 유전자 코드 의 축퇴성으로 인해 다수의 상이한 폴리뉴클레오티드가 동일한 폴리펩티드를 엔코딩할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 통상의 기술자는, 폴리펩티드가 발현되는 임의의 특정 숙주 개체의 코돈 사용빈도(usage)를 반영하여 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드 서열에는 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 일반적인 기술을 사용하여 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 폴리뉴클레오티드는 종래기술 분야에서 이용할 수 있는 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 상기 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내(in vivo) 활성 또는 수명(life span)을 강화하기 위해 수행될 수 있다.
DNA 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드가 재조합적으로, 합성적으로, 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 이용할 수 있는 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드들은 또한 표준 기술에 의해 클로닝될 수 있다.
길이가 더 긴 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 재조합 수단, 예를 들어 PCR(중합효소 연쇄반응) 클로닝 기술을 이용하여 생산될 것이다. 상기 기술은 클로닝이 요망되는 DNA 표적 서열 지역에 플랭킹되어 있는 한 쌍의 프라이머(예를 들어, 약 15 내지 30개 뉴클레오티드로 구성된 프라이머)를 제조하는 단계, 상기 프라이머가 동물 또는 인간 세포로부터 획득된 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키는 단계, 요망되는 지역의 증폭이 야기되는 조건하에서 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계, 증폭된 단편을 분리하는 단계(예를 들어, 아가로스 겔 상에서 반응 혼합물을 정제함으로써) 및 증폭된 DNA를 회수하는 단계를 포함할 것이다. 상기 프라이머는 적 당한 제한 효소 인식 부위를 포함하도록 디자인될 것이며 이로 인해 증폭된 DNA가 적당한 클로닝 벡터에 클로닝될 수 있다.
단백질
본원에서 사용된, 용어 "단백질"은 용어 단일-사슬 폴리펩티드 분자뿐만 아니라 다중-폴리펩티드 복합체를 포함하는데, 여기서 개별적인 구성 폴리펩티드는 공유 또는 비공유 수단에 의해 결합된다. 본원에서 사용된, 용어 '폴리펩티드' 및 "펩티드"는 단량체(monomers)가 아미노산이고 펩티드 결합 또는 이황화 결합을 통해 서로 연결된 중합체로 정의된다. 용어 소단위체(subunit) 및 도메인(domain)은 또한 생물학적 기능을 갖는 폴리펩티드 및 펩티드로 정의될 수 있다.
변이체, 유도체, 유사체, 상동체 및 단편
본원에서 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드 이외에, 본 발명은 또한 변이체, 유도체, 유사체, 상동체 및 이의 단편를 포함한다.
본 발명의 전후문맥에서, 임의의 주어진 서열의 변이체는 특정 서열의 잔기(아미노산 또는 핵산 잔기)가 변형된 서열이며, 상기 변형은 문제된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 적어도 그의 내재적인 기능들(endogenous functions)중 하나를 유지하는 방식으로 행해진다. 변이체 서열은 자연적으로-생성되는 단백질내에 존재하는 하나 이상의 잔기의 부가, 결실, 치환, 변형, 대체 및/또는 변이에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여, 본원에서 사용된 용어 "유도체"는, 결과로서 획득된 단백질 또는 폴리펩티드가 그의 내재적인 기능들 중 적어 도 하나 이상을 유지하는 것을 전제조건으로 서열로부터 또는 상기 서열에서 하나(또는 그 이상)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변이, 변형, 대체, 결실 및/또는 부가를 포함한다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여, 본원에서 사용된 용어 "유사체"는, 임의의 모방체, 즉 상기 유사체가 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내재적인 기능들중 적어도 하나 이상을 보유하는 화학적 화합물을 포함한다.
일반적으로, 아미노산 치환은, 예를 들어, 1개, 2개 또는 3개로부터 10개 또는 20개 아미노산 까지 행해질 수 있으며, 이는 변형된 서열이 요망되는 활성 또는 능력을 보유한다는 것을 전제조건으로 한다. 아미노산 치환은 비-자연 생성 유사체의 용도를 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질들은 또한 침묵 돌연변이(silent change)를 생성시켜 결과적으로 기능적으로 동등한 단백질의 생성을 초래하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 운반 또는 조절기능이 그대로 유지되는 한, 계획적인 아미노산 치환이 잔기들의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양극성(amphipathic nature)에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하를 띠는 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되며; 양전하를 띠는 아미노산에는 리신 및 아르기닌이 포함되며; 유사한 친수성 값를 나타내는 전하를 띠지 않는 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산으로는 루신, 이소루신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 및 티로신이 포함된다.
예를 들어, 하기 표에 따라 보존적인 치환이 이루어질 수 있다. 2번째 컬럼의 동일 블록의 아미노산 및 바람직하게는 3번째 컬럼의 동일 행(line)의 아미노산들 상호간에 치환이 이루어질 수 있다:
지방족




 비-극성
 G A P
I L V
극성-비전하
 C S T M
N Q
극성-전하
 D E
K R
방향족 H F W Y
"단편"은 또한 변이체이며, 상기 용어는 일반적으로 기능적으로 또는 예를 들어, 분석적으로 관심의 대상이 되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 지역을 의미한다. 따라서, "단편"은 전장 길이 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열로 정의된다.
상기 변이체들은 위치-지정 돌연변이기법과 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 삽입 부위의 양쪽 측면의 자연적으로-생성된 서열에 해당하는 5´ 및 3´플랭킹 지역과 함께 삽입체를 엔코딩하는 합성 DNA가, 어느 곳에나 삽입될 수 있다. 상기 플랭킹 지역은 자연적으로-생성된 서열의 부분에 해당하는 편리한 제한효소부위를 포함할 것이므로, 따라서 상기 서열을 적당한 효소로 절단할 수 있으며 상기 합성 DNA는 절단체 내부로 라이게이션될 수 있다. 이후 상기 DNA는 본 발명에 따라 엔코딩된 단백질을 발현시키게 된다. 상기 방법은 단지 DNA 서열의 조작을 위한 수많은 표준 기술 중의 일예를 설명한 것에 지나지 아니하며 다른 공지된 기술들이 또한 사용될 수 있다.
바람직하게는 폴리뉴클레오티드 변이체들은 코돈 최적화된 서열을 포함할 것 이다. 코돈 최적화(Codon optimisation)는 RNA 안정도 강화 및 그로 인한 유전자 발현을 강화하기 위한 방법으로서 종래 기술분야에 알려져 있다. 유전자 코돈의 리던던시는 몇개의 상이한 코돈들이 동일한 아미노산을 엔코딩할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 루신, 아르기닌 및 세린은 여섯개의 상이한 코돈에 의해 각자 엔코딩된다. 상이한 개체들은 그들의 코돈 사용에 있어서 상이한 코돈 선호도를 보여준다. 예를 들어, HIV와 같은 바이러스들은, 아주 많은 수의 희귀 코돈을 사용한다. 희귀 코돈들을 그에 대응하는 공통적으로 사용되는 포유류의 코콘들로 대체하는 식으로 뉴클레오티드 서열을 변형함으로써, 표유류의 표적 세포에서의 서열의 증가된 발현이 획득될 수 있다. 포유류 세포이외에, 다양한 다른 개체들에 대한 코돈 사용빈도 표가 종래 기술 분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 서열의 적어도 일부분이 코돈 최적화된다. 훨씬 더 바람직하게는, 서열이 완전히 코돈 최적화된다.
벡터
종래 기술분야에 잘 알려져 있는 것과 같이, 벡터는 어떤 실체(entity)의 한 환경에서 다른 환경으로의 전달을 가능 또는 용이하게 하는 도구이다. 본 발명에 따라, 그리고 일예로서, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 몇 가지 벡터가, DNA 세그먼트(예컨대 이종유래(heterologous) DNA 세그먼트, 예컨대 이종유래 cDNA 세그먼트)와 같은, 실체를 숙주 및/또는 표적 세포로 전달되도록 하며, 상기 벡터는 본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터의 복제 및/또는 본 발명에 사용되는 단백질의 발현을 위한 목적으로 사용된다. 재조합 DNA 기술에서 사용 되는 벡터의 예로는 플라스미드, 염색체, 인공 염색체 또는 바이러스가 포함되나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 벡터에 통합된다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드가, 코딩 서열의 발현이 숙주세포에 의해서 제공될 수 있게 하는, 조절서열(control sequences)에 작동가능하게 연결되며, 즉 상기 벡터는 발현벡터이다. 상기 용어 "작동가능하게 연결된"은 기술된 구성요소들이 그들의 의도된 방식으로 작동이 가능하도록 하는 관계를 맺고 있다는 것을 의미한다. 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절서열(regulatory sequence)은 상기 코딩 서열의 발현이 상기 조절서열과 호환되는 조건하에서 수행되는 방식으로 라이게이션된다.
조절서열은, 예를 들어, 추가 전사 조절 엘리먼트의 부가에 의해 상기 조설서열에 의해 유도되는 전사 수준이 전사 모듈레이터(modulators)에 더 민감하게 반응하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 벡터는, 예를 들어, 복제 기점, 선택적으로 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 선택적으로 프로모터의 레귤레이터(regulators)를 구비한 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 하나 또는 그 이상의 선별 마커 유전자, 및/또는 GFP와 같은 추적 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 숙주세포로 트랜스펙션되거나 이를 형질전환시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질을 엔코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 조절서열은 프로모터/인헨서 및 다른 발현 조절 시그날을 포함한다. 상기 조절서열은 본원에서 사용되도록 디자인된 발현벡터를 위한 숙주세포와 호환되게 선택될 수 있다. 상기 용어 "프로모터"는 종래 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 크기 및 복잡성(complexity)면에서 최소 프로모터(minimal promoters)로부터 업스트림 엘리먼트 및 인헨서를 포함하는 프로모터까지의 핵산 지역을 포함한다.
원핵생물 프로모터 및 다른 진핵생물에서 기능적인 프로모터가 사용될 수 있지만, 상기 프로모터는 대체로 포유동물의 세포에서 기능적인 프로모터들에서 선택된다. 상기 프로모터는 대체로 바이러스 또는 진핵생물 유전자의 프로모터 서열로부터 유래된다. 예를 들어, 상기 프로모터는 발현이 일어나게 될 세포의 게놈로부터 유래된 프로모터일 수 있다. 진핵생물의 프로모터와 관련하여, 상기 프로모터들은 유비쿼터스 방식으로(예컨대 a-액틴, b-액틴, 튜불린) 또는, 대안적으로, 조직-특이적 방식으로(예컨대, 피루베이트 키나아제와 관련된 유전자들의 프로모터) 기능하는 프로모터일 수 있다. 바이러스 프로모터가 사용될 수 있으며, 상기 프로모터로는 몰로니 설치류 백혈병 바이러스 긴 말단 반복 서열(Moloney murine leukaemia virus long terminal repeat, MMLV LTR) 프로모터, 라우스 육종 바이러스(rous sarcoma virus, RSV) LTR 프로모터 또는 사람 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) IE 프로모터를 그 예로 들 수 있다.
상기 프로모터가 유도성이어서 이종유래 유전자의 발현 수준이 세포의 생존기간동안 조절될 수 있도록 하는 것이 유리할 수 있다. 유동성이라는 것은 프로모터를 사용하여 획득되는 발현 수준이 조절될 수 있다는 것을 의미한다.
또한, 상기 프로모터들 중 임의의 프로모터가, 예를 들어 인헨서 서열과 같은 추가의 조절 서열의 부가에 의해 변형될 수 있다. 키메릭 프로모터가 또한 사 용될 수 있으며, 상기 프로모터는 상기한 둘 또는 그 이상의 상이한 프로모터로부터 유래한 서열 엘리먼트들을 포함한다.
본 발명의 벡터는 바이러스가 표적 세포에 들어가면 감염성 있는 바이러스 자손 입자를 복제 및 생산할 수 없도록 유전공학적으로 조작된 레트로바이러스 기반 벡터일 수 있다.
레트로바이러스
수 많은 상이한 레트로바이러스가 확인되었다. 그 예로서 하기 바이러스들이 포함된다:설치류 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MLV), 인체면역결핍바이러스(human immunodeficiency, HIV), 원숭이면역결핍바이러스(simian immunodeficiency virus, SIV), 사람 T-세포 백혈병 바이러스(human T-cell leukemia virus, HTLV), 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anaemia virus, EIAV), 쥐 포유류 종양 바이러스(mouse mammary tumour virus, MMTV), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV), 후지나미 육종 바이러스(Fujinami sarcoma virus, FuSV), 몰로니 설치류 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, Mo-MLV), FBR 설치류 골육종 바이러스(FBR murine osteosarcoma virus, FBR MSV), 몰로니 설치류 육종 바이러스(Moloney murine sarcoma virus, Mo-MSV), 아벨손 설치류 백혈병 바이러스(Abelson murine leukemia virus, A-MLV), 조류 골수세포종증 바이러스-29(Avian myelocytomatosis virus-29, MC29), 및 조류 적아세포종 바이러스(Avian erythroblastosis virus, AEV). 레트로바이러스의 상세한 목록은 코핀과 그 동료 저자들의 논문을 참조할 수 있다(Coffin et al., 1997, "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763).
일부 레트로바이러스의 게놈 구조에 대한 자세한 내용은 당 분야의 종래 기술에서 찾아볼 수 있다. 일예로서, HIV 및 Mo-MLV에 관한 자세한 내용은 NCBI Genbank에서 찾아볼 수 있다(각각의 게놈 접근 번호 AF033819 및 AF033811).
레트로바이러스는 대체로 2개의 카테고리로 나뉘어 질 수 있다: 즉, "단순한(simple)" 것 및 "복잡한(complex)" 것. 레트로바이러스는 심지어 7개의 군으로 더 구분될 수 있다. 상기 군중 5개군은 종양발생 가능성을 갖는 레토로바이러스에 해당한다. 나머지 2개 군은 렌티바이러스와 스푸마바이러스(spumavirus)이다. 상기 레트로바이러스에 대한 리뷰는 코핀과 그 동료 저자들의 논문에 개시되어 있다(Coffin et al., 1997, 전게서).
각각의 레트로바이러스 게놈은 비리온 단백질 및 효소들을 엔코딩하는 gag, pol 및 env로 불리우는 유전자들을 포함한다. 프로바이러스에서, 상기 유전자들은 긴 말단 반복 서열(LTRs)로 불리우는 지역에 의해 양쪽 말단에서 플랭킹되어 있다. 상기 LTR은 프로바이러스의 삽입(integration), 및 전사에 관여한다. LTR은 또한 인헨서-프로모터 서열로서 역할을 하며 바이러스 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 레트로바이러스 RNA의 엔캡시데이션(encapsidation)이 바이러스 게놈의 5´말단에 위치하는 psi 서열의 도움으로 일어나게 된다.
LTR은 그 자체로는 U3, R 및 U5로 불리우는, 3개의 엘리멘트로 구분될 수 있는 서열들과 동일하다. U3는 상기 RNA의 3´ 말단에 존재하는 독특한 서열로부터 유래한다. R은 상기 RNA의 양쪽 말단에서 반복되는 서열로부터 유래하며 U5는 상기 RNA의 5´말단에 위치하는 독특한 서열로부터 유래한다. 상기 3개 엘리먼트의 크기는 다른 레트로바이러스들 사이에서 상당히 다를 수 있다.
감염성있는 레트로바이러스 RNA 게놈의 기본적인 분자 구조는 (5´) R-U5-gag, pol, env-U3-R (3´)이다. 결함있는 레트로바이러스 벡터 게놈에서, gag, pol 및 env 는 결실되거나 작동하지 아니할 수 있다. 상기 RNA의 양쪽 말단에 존재하는 R 지역은 반복된 서열을 갖는다. U5 및 U3는 각각이 상기 RNA 게놈의 5´ 및 3´ 말단에 위치하는 독특한 서열을 의미한다.
숙주 범위 및 조직 친화성(tropism)은 레트로바이러스들 간에 다양하다. 일부 경우에 있어서, 상기 특이성(specificity)은 재조합 레트로바이러스 벡터의 형질도입 잠재력을 제한할 수 있다. 이러한 이유로, 많은 유전자 요법 실험이 MLV를 사용하여 왔다. 4070A라고 불리우는 외막 단백질을 갖는 특별한 MLV는 양친화성(amphotropic) 바이러스로 알려져 있으며, 상기 바이러스는 또한 그의 막 단백질이 인간과 생쥐 간에 보존되어 있는 인산기 운반 단백질과 "결합(dock)"하기 때문에 인간 세포에 감염될 수 있다. 상기 운반자는 유비퀴터스하며 그래서 상기 바이러스들은 많은 유형의 세포들에 감염될 수 있다.
그러나 일부 경우에 있어서, 특히 안정성의 측면에서, 특별히 제한된 세포를 표적으로 삼는 것이 유리할 수 있다. env 유전자의 이종유래 env 유전자로의 대체는 특별히 확정된 유형의 세포를 표적으로 삼기 위해 사용되는 기술 또는 전략의 일예에 해당한다. 상기 기술은 슈도타이핑(pseudotyping)으로 불리운다.
용어 "재조합 레트로바이러스 벡터(RRV)"는, 패키징 구성요소의 존재시에, 표적 세포로 감염되는 능력을 갖춘 바이러스 입자로의 RNA 게놈의 패키징이 가능하도록 하는 충분한 레트로바이러스 유전 정보를 갖는 벡터를 의미한다. 표적 세포로의 감염은 역전사 및 표적 세포 게놈으로의 삽입을 포함한다. 일반적으로 사용되는 상기 RRV는 대체로 상기 벡터에 의해 표적 세포로 운반되는 비-바이러스 코딩 서열을 포함한다. RRV는 최종 표적 세포내에서 감염성있는 레트로바이러스 입자를 생산하기 위한 독자적인 복제를 할 수 없다. 본 발명의 상기 "재조합 레트로바이러스 벡터"는 렌티바이러스 벡터로부터 유래한다. 달리 말하자면, 본 발명의 상기 재조합 레트로바이러스 벡터는 "재조합 렌티바이러스 벡터"이다.
일반적인 유전자 치료용 재조합 레트로바이러스 벡터에 있어서, 복제에 필수적인 지역을 코딩하는 상기 gag, pol 및 env 단백질중 하나 또는 그 이상의 적어도 일부분이 상기 바이러스로부터 제거될 수 있다. 이는 상기 레트로바이러스 벡터의 복제의 결함을 조장한다. 이후 제거된 부분은 바이러스 게놈이 숙주 게놈으로 삽입될 수 있는 바이러스를 생산하기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 대체될 수 있으며, 여기서 상기 변형된 바이러스 게놈은 구조 단백질의 결실로 인해 그 자체로는 증식할 수 없다. 숙주 게놈으로 삽입되면, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 일어난다-그 결과로, 예를 들어, 치료 및/또는 진단 효과가 획득된다. 따라서, 폴리뉴클레오티드의 관심있는 부위로의 전이는 일반적으로 하기 단계에 의해 획득된다: 폴리뉴클레오티드를 재조합 바이러스 벡터에 삽입시키는 단계; 변형된 바이러스 벡터를 비리온 코트로 패키징하는 단계; 및 표적 세포로 형질도입시키는 단계.
복제-결함 레트로바이러스 벡터는 대체로, 예를 들어, 패키징 또는 헬퍼 세포주 및 재조합 벡터의 조합을 사용하여, 연이은 형질도입을 위한 레트로바이러스 벡터의 적당한 티터(titres)를 제공하기 위해 증식된다. 다시 말하면, 3가지 패키징 단백질이 트랜스(trans)로 제공될 수 있다.
"패키징 세포주"는 레트로바이러스 gag, pol 및 env 유전자들을 포함한다. 상기 패키징 세포주는 레트로바이러스 DNA의 패키징을 위해 필요한 단백질을 생산하나 psi 지역의 결실로 인해 엔캡시데이션을 초래할 수 없다. 그러나,폴리뉴클레오티드 및 psi 지역을 운반하는 재조합 벡터가 상기 패키징 세포주내로 도입될 경우, 헬퍼 단백질은 재조합 바이러스 스톡(stock)을 생산하기 위해 psi-양성 재조합 벡터를 패키징할 수 있다. 세포들이 형질도입하도록 상기 바이러스 스톡이 사용될 수 있으며 상기 스톡에 의해 폴리뉴클레오티드가 표적 세포의 게놈내로 도입된다.
바이러스 단백질을 만들기 위해 필요한 모든 유전자들이 결함된 게놈을 갖는 재조합 바이러스는 단 1회만 형질도입될 수 있으며 증식할 수 없다. 표적 세포로 단 1회(single round)만 형질도입될 수 있는 상기 바이러스 벡터는 복제 결합 벡터(replication defective vector)로 공지되어 있다. 그리하여, 잠재적으로 해로운 레트로바이러스의 생성없이 상기 폴리뉴클레오티드가 숙주/표적 세포 게놈내로 도입된다. 코핀과 그 동료 저자들은 가용한 패키징 라인에 대해 요약 제시하고 있다(Coffin et al., 1997, 전게서).
gag, pol 및 env 바이러스 코딩 지역이, 패키징 세포주로 독립적으로 트랜스펙션되는, 별개의 발현 플라스미드 상에서 운반되는 레트로바이러스 패키징 세포주 가 사용되는 것이 바람직하다. 때때로 3가지 플라스미드 트랜스펙션 기법으로 칭해지는(Soneoka et al., 1995), 상기 전략은, 3가지 재조합 사건이 야생형 바이러스 생산을 위해 요구되므로, 복제-능력있는(replication-competent) 바이러스의 생산의 가능성을 감소시킨다. 재조합은 상동성에 의해 상당히 용이해지므로, 벡터 및 헬퍼 게놈간의 상동성 감소 또는 제거가 또한 복제-능력있는 헬퍼 바이러스 생산 문제를 감소시키는데 이용될 수 있다.
안정하게 트랜스펙션되는 패키징 세포주에 대한 또 다른 대안은 일과성(transient) 트랜스펙션 세포주를 사용하는 것이다. 일과성 트랜스펙션은 벡터가 발현(development)될 때 벡터의 생산 수준을 측정하기 위해 유익하게 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 일과성 트랜스펙션은 안정한 벡터-생산 세포주를 생산하기 위해 필요한 더 긴 시간 소요를 회피하게 하며, 벡터 또는 레트로바이러스 패키징 구성요소가 세포에 유독한 경우에 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터를 생산하기 위해 일반적으로 사용되는 구성요소들은 gag/pol 단백질을 엔코딩하는 플라스미드, 단백질을 엔코딩하는 플라스미드 및 폴리뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드를 포함한다. 벡터 생산은 하나 또는 그 이상의 상기 구성요소를 그 밖의 다른 필요 구성요소를 함유하는 세포로의 일과성 트랜스펙션을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위한 한 가지 접근방법은 레트로바이러스 5´LTR을 사용하는 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 내부 이종유래 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 배열(arrangement)은 프로모터 선택에서의 유연성을 제공한다.
렌티바이러스 군은 "영장류(primate)" 및 "비-영장류" 군으로 구분할 수 있다. 영장류 렌티바이러스로 인체면역결핍바이러스(HIV), 인간 자가-면역결핍 증후군(auto-immunodeficiency syndrome, AIDS)의 원인체, 및 원숭이 면역결핍바이러스(SIV)를 예로 들 수 있다. 비-영장류 렌티바이러스 군은 원형 "슬로우 바이러스(slow virus)" 비스나/매디 바이러스(visna/maedi virus, VMV) 이외에, 관련된 산양 관절염-뇌염 바이러스(caprine arthritis-encephalitis virus, CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 및 아주 최근에 보고된 고양이 면역결함바이러스(feline immunodeficiency virus, FIV) 및 소 면역결함 바이러스(bovine immunodeficiency virus, BIV)를 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 상기 레트로바이러스 벡터는 HIV로부터 유래할 수 있다.
렌티바이러스 패밀리와 다른 유형의 레트로바이러스 간의 차이점은 렌티바이러스가 분열 및 비-분열 세포 둘 모두에 감염할 수 있는 능력을 갖는다는 데 있다. 대조적으로, 그밖의 다른 레트로바이러스-예컨대, MLV-는, 예를 들어, 근육, 뇌, 폐 및 간 조직을 구성하는 그러한 비-분열 세포에 감염될 수 없다.
비-분열 세포에 대한 감염이 렌티바이러스 벡터의 특이한 특성이기는 하지만, 특정 조건에서는 안정하고 효율적인 트랜스펙션이 모두 제공될 수 있다. 상기 조건은 HIV-1 Vpr의 발현(Subbramanian et al., 1998; Vodicka et al., 1998), HIV-1 pol 폴리퓨린 트랙트(PPT)로부터 유래한 서열의 존재(Follenzi et al., 2000), 및 단핵세포/대식세포 배양물의 활성 상태(Re and Luban, 1997)를 포함한다.
TNFa 자극에 대해 탈감작(desensitizing), 예를 들어, 벡터 HIV-1 LTR 프로모터내의 TNFa 반응 서열(즉, NF-kB 결합 부위)를 결실/돌열변이시킴으로써, 벡터의 본성적 발현이 상당히 감소될 수 있다.
벡터의 전사체가 Rev/RRE 상호작용의 부재시에 불분명한 정체(retention) 및 분해를 겪는 벡터를 디자인함으로써 HIV-1 발현에 대한 더 직접적인 종속관계가 확립될 수 있다(Emerman et al., 1989; Malim et al., 1989). 더욱이, 레트로바이러스 벡터와 관련하여 이미 개시된 바와 같이(Grignani et al., 1998), 숙주 게놈에 삽입되지 아니하고도 도입유전자를 발현할 수 있는 새로운 새대의 렌티바이러스 벡터의 사용이 생체안전성의 관점에서 값진 의의를 지닐 수 있다.
Tat 단백질은 렌티바이러스 유전자 발현 수준을 조절한다. 긴 말단 반복 서열(LTR)의 약한 기본 전사 활성으로 인하여, 프로바이러스의 발현은 처음에 Tat, Rev, 및 Nef 단백질을 코딩하는 다중으로 스플라이싱된 소량의 전사체를 생성시키게 된다. Tat는 발생초기의 RNA내의 스템-루프 구조(트랜스액티베이션 반응 엘리먼트[TAR])에 겹합함으로써 전사를 급격하게 증가시키며, 이로 인하여 폴리머라제 II 복합체에 의한 전사 연장을 촉진하는 사이클린-키나아제 복합체가 모집된다. 바람직하게는, 돌연변이체 Vif를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드가 HIV-1 LTR의 조절하에 놓이며, Tat에 의해 활성화고 그 결과 세포가 HIV-1에 의해 감염될 때만 발현된다. 그러므로 상기 벡터 디자인은 비-감염된 세포에서의 Vif 발현이 최소화되도록 하며, 그로 인하여 면역원성(immunogenicity)이 감소되도록 하고, 세포가 HIV-1 에 감염될 때만 매우 높은 수준으로 유도되도록 한다. 상기 벡터는 그 밖의 다른 벡터 시스템을 기준으로 한다면 더 나은 보호를 부여한다.
일 구체예에서, 본 발명의 상기 렌티바이러스 벡터는 선별 마커를 포함한다. 바람직하게는, 상기 선별 마커는 절단된 저 친화성 신경성장인자 수용체(truncated low affinity nerve growth factor receptor, ΔLNGFR). 공통적인 뉴트로핀 수용체인, 저 친화성 신경성장인자 수용체 유전자(LNGFR)(p75NTR로도 지칭됨)는 대다수의 인간 조혈세포상에서 발현되지 않으며, 그러므로 단일 세포 분해능(resolution)을 갖는, 면역형광에 의해 형질도입된 유전자 발현의 정량적 분석이 가능하게 된다. LNGFR 발현에 대한 형광 활성화 세포 분류기 분석은 유전자 발현을 연구하기 위해 형질도입된 세포에서 수행될 수 있다. 따라서 LNGFR은 본 발명에서 선별 마커로서 활용될 수 있다. LNGFR을 이용한 분석에 대한 더 자세한 내용은 마비리오의 논문에서 찾아볼 수 있다(Mavilio, 1994). 절단된 LNGFR인, ΔLNGFR에 대해서는 마비리오의 논문에 기술되어 있다(Mavilio, 1994).
선별 마커는 내부 프로모터에 작동가능하게 연결되거나 5´으로부터 발현될 수 있다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 단핵세포, 대식세포, 림프구 또는 조혈모세포와 같은 세포에 의해 운반될 수 있다. 특히, 세포-의존성 운반 시스템이 사용된다. 상기 시스템에서 렌티바이러스 벡터는 생체밖에서(ex vivo) 하나 또는 그 이상의 세포로 도입되며 이후 상기 세포는 환자에게로 도입된다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 단독으로 투여될 수 있으나 일반적으로 약제 학적 조성물로 투여될 것이다.
치료
본 발명은 HIV 감염 또는 관련 병태(conditions)의 치료와 관련이 있다. 치료에 관한 본원의 모든 레퍼런스들은 HIV와 관련된 질병의 치료적, 경감적 및 예방적 치료를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 포유동물의 치료가 특히 선호된다. 인간 및 수의 치료 둘 모두가 본 발명의 영역내에 속한다.
따라서, 본 발명은 감염으로부터 위험에 처한 개체에서 초기 HIV 감염을 예방,또는 적어도 실질적으로 억제하기 위한 세포간 면역화를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 AIDS 또는 ARC의 발병을 억제, 또는 적어도 감염의 전파를 지연시킴으로써, 그리고 상기 AIDS 또는 ARC의 발병을 예방 또는 적어도 지연시킴으로써 HIV 양성 환자의 치료학적 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, HIV 감염 또는 중복감염(superinfection)에 대한 저항력을 함양하는(imparting) 방법이 제공되며, 상기 방법은 HIV-증식허용성 세포를 환자로부터 제거하는 단계, HIV 돌연변이체 Vif 삽입을 달성하기 위해 상기 세포에 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 형질도입시키는 단계 및 상기 세포를 환자에 재도입하는 단계를 포함한다. 상기한 생체외(ex vivo) 방법은 페라리와 그 동료 저자들의 논문에 개시된 바 있다(Ferrari et al., (1991)). 대안적으로 상기 레트로바이러스 벡터는 시험관내에서(in vivo) 세포로 운반될 수 있다.
렌티바이러스 벡터의 세포 핵 게놈으로의 삽입은, 예를 들어, 시퀀싱 또는 서던(Southern) 혼성화와 함께 PCR을 사용하여 모니터될 수 있다.
약제학적 조성물
약제학적 조성물은 약제학적으로 활성이 있는 제제의 치료적으로 유효한 양으로 구성되거나 포함하는 조성물이다. 상기 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석물 또는 부형제(이의 조합물을 포함)를 포함한다. 치료적 용도로 허용되는 담체 또는 희석물은 약제학적 분야에서 공지되어 있고 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)]에서 설명되어 있다. 약제학적 담체, 부형제 또는 희석물의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약제 실무에 따라서 선택될 수 있다. 약제학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석물로서 또는 이에 추가하여 임의의 적합한 결합제, 윤할제, 현탁제, 코팅제, 용해제를 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체의 예는 예를 들어, 물, 염 용액, 알콜, 실리콘, 왁스, 바셀린(petroleum jelly), 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리포좀, 설탕, 겔라틴, 락토오스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 계면활성제, 실릭산, 점성 파라핀, 향 오일, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 페트로에트랄 지방산 에스테르, 히드록시메틸-셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.
적절한 경우, 약제학적 조성물은 하기중 임의의 하나 또는 그 이상으로 투여될 수 있다: 흡입, 좌약 또는 페서리의 형태로, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포 분말의 형태로 국소적으로, 피부 패치의 사용으로, 전분 또는 락토오스와 같은 부형제를 함유하는 정제의 형태로 경구투여로, 또는 단독으로 또는 부형제와 혼합된 캡슐 또는 소란(ovule)으로, 또는 착향제 또는 착색제를 함유하는 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태로, 또는 상기 약제학적 조성물은, 예를 들어, 해면체내, 정맥내, 근육내 또는 피하와 같이 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 조성물은 기타 물질, 예를 들어 혈액과 등장성인 용액을 제조하기에 충분한 염 또는 모노사카라이드를 함유할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 사용되는 것이 가장 좋을 수 있다. 구강 또는 설하 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenges)의 형태로 투여될 수 있다.
다양한 전달 시스템에 따라 조성물/제형화 구비요건이 상이할 수 있다. 일예로서, 본 발명의 약제학적 조성물은 미니-펌프를 이용하여, 또는 점막 경로, 예를 들어 흡입용 비내 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취가능한 용액으로, 또는 조성물이 예를 들어 정맥내, 근내 또는 피하 경로에 의한 전달을 위한 주사가능한 형태로 제형화되어 비경구적으로 전달되도록 하기 위해 제형화될 수 있다. 대안적으로, 상기 제형화는 두 경로 모두로 전달되도록 디자인될 수 있다.
바이러스 감염에 영향을 주기 위한 용도의 폴리펩티드 구성요소를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드/벡터는 비가공(naked) 핵산 컨스트럭트로서, 바람직하게는 숙주 세포 게놈과 상동성이 있는 플랭킹 서열을 더 포함하는 컨스트럭트로서 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드/벡터가 비가공 핵산으로 투여될 경우, 투여되는 핵산의 양은 일반적으로 1㎍ 내지 10㎎, 바람직하게는 100㎎ 내지 1㎎의 범위 이내일 것이다.
포유동물에 의한 비가공(naked) 핵산 컨스트럭트의 섭취는 몇몇의 공지된 트 랜스펙션 기술, 예를 들면 트랜스페션제의 사용을 포함하는 기술들에 의해 증강될 수 있다. 상기 제제들의 예는 양이온성 제제(예를 들면, 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란) 및 리포펙턴트[예를 들면, 리포펙탐(lipofectamTM) 및 트랜스펙탐(transfectamTM )]를 포함한다. 일반적으로, 핵산 컨스트럭트를 트랜스펙션 제제와 혼합하여 조성물을 제조한다.
본 발명의 조성물은 또한 그 밖의 항레트로바이러스 약물, 특히 예컨대 AZT 및 ddI와 같은 항-HIV 치료제와 함께 사용될 수 있다.
기술된 투여 경로 및 투여용량은 단지 지침으로서 의도된 것이며 통상의 기술자는 임의의 특정 환자 및 병태에 따라 최적 투여경로 및 투여요량을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 추가의 바람직한 특징 및 구체예는 이제 하기의 비제한적인 실시예 및 수반되는 도면을 참조로 하여 기술될 것이다.
실시예 1-실험재료 및 실험방법
세포
CEM A3.01은 HIV-1 세포병변(cytopathic) 영향에 매우 민감한, T-림프블라스토이드 CEM 세포주의 클론 유도체이다(Folks et al., 1985). 10% FCS(EuroClone Ltd, UK)가 보충된 RPMI 1640 및 페니실린 스트렙토마이신과 글루타민(PSG)의 조합물 내에서 상기 CEM A3.01, CEMss(Nara et al., 1988), Sup-T1(Smith et al., 1984) 및 PM1 세포(Lusso et al., 1995)를 배양하였다. 사람 신장 293T 세포를 10% FCS 및 PSG가 보충된 이스코브의 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM)에서 증식시켰다.
피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque) 구배(Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Norway)로 원심분리하여 제대혈로부터 사람 신생아 백혈구를 분리정제하였다. CD4+ T 세포 분리 키트 II(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, USA)를 사용한 네거티브 셀렉션에 의해 CD4+ T 세포를 동정하였다. 순도(> 95%) 및 나이브(naive) 표현형을 항-CD4, 항-CD45RA 및 항-CD45RO 항체(BD Pharmingen TM)를 각각 사용하는 유세포분석기(flow cytometry)로 확인하였다. 10% 사람 혈청, 50 U/ml의 IL-2(Chiron, Emeryville, CA), 25 U/ml의 IL-7 (ImmunoTools, Germany)를 포함하는 X-VIVO-15 (BioWhittaker, Cambrex Bio Science, Verviers, Belgium) 및 0.5 비드/세포의 비율로 다이나비드(Dynabeads) CD3/CD28 T 세포 익스팬더(Dynal Lake Success, NY, USA)존재하에 CD4+ T 림프구를 배양하였다.
플라스미드
렌티바이러스 벡터 pHR2(Dull et al., 1998)의 ClaI/SacII 부위내의, 포스포글리세로키나아제(phosphoglycerokinase, PGK) 프로모터 조절하에서 저 친화성 신경 성장 인자 수용체의 절단된 형태(ΔLNGFR)를 엔코딩하는 PGK-ΔLNGFR 카세트(Bonini et al., 1997)를 클로닝하여 렌티바이러스 벡터 PΔN을 생산하였다. PCR-증폭된, 611-염기쌍(bp) 길이의 F12-vif 또는 WT vif 서열 각각을 상기 PΔN 벡터의 ClaI 부위에 삽입하여 F12-VifPΔ 및 VifPΔ 벡터를 수득하였다. 야생형 HIV-1NL4-3 (접근번호 M19921), 및 F12-HIV-1 (접근번호 Z11530) DNA를 하기 프라이머를 이용하여 vif PCR 주형으로 사용하였다:
정방향: 5´-GCAAAGAATCGATGGGATTATGGAAAACAG-3´;
역방향: 5´-CTCCTCTAATCGATGCTAGTGTCCATTCATTG-3´(ClaI 서열은 굵은 글씨체로 표기됨). 모든 PCR-증폭 단편 및 클로닝 접합체(junctions)를 완전히 시퀀싱하였다. 본 발명자들은, 이전에 기술된 PΔN 렌티바이러스 벡터(Vallanti et al, 2005)로부터 출발하여, 키메릭 WT/F12 vif 유전자를 운반하는 3개의 벡터 Chim1PΔN, Chim2PΔN 및 Chim3PΔN을 생산하였다. Chim1PΔN 은 F12-vif의 첫번째 N-말단 87개 아미노산과 WT-vif의 나머지 106 개 아미노산을 엔코딩하며, Chim2PΔN은 Chim1PΔN와 비교하여 상기 2 도메인이 바뀐 키메릭 단백질을 엔코딩하며, 마지막으로 Chim3PΔN는 F12-Vif의 아미노산 지역 126-170이 야생형-Vif 골격에 삽입된 키메릭 단백질을 엔코딩한다. F12-HIV로부터 획득한 BSpMI-PflMI(259 bp) 및 PflMI-EcoRI(440 bp) 단편들이 각각 대체된 2개의 NL4-3 HIV-1 분자 클론 돌연변이체의 게놈을 PCR 주형으로 사용하여 상기 첫 번째 2개의 키메릭 유전자를 수득하였다. 프림(Primm) 에스. 알. 엘(Milano, Italy)에 의한 DNA 합성으로 상기 세 번째 벡터를 생산하였다. PΔN 공 벡터의 ClaI 부위로 상기 3개의 키메릭 유전자들을 클로닝하였다. 모든 PCR-증폭 단편 및 클로닝 접합체를 시퀀싱하여 확인하였다. 상기 F12-VifPΔN 및 WT-VifPΔN은 이전에 기술되었다. pCEM15:HA(Sheehy et al., 2002) 플라스미드를 엠. 마림(Malim)(King's College, London, UK)으로부터 기증받았다.
슈도-타이핑된 렌티바이러스 벡터의 생산
Gag, Pol, Tat 및 Rev를 발현하는, 전달(transfer) 벡터인, 제2세대 최소 패키징 컨스트럭트 pCMVΔR8.74, 및 수포성 구내염 외피 글리코단백질인, VSV-G을 엔코딩하는 pMD.G 플라스미드(Zufferey et al., 1997)를 이용하여 293T 세포를 일과성 코-트랜스펙션시켜 슈도-타이핑된 렌티바이러스 벡터 스톡을 생산하였다. FugeneTM6(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)로 상기 3개의 플라스미드를 2:1:3의 비율로 트랜스펙션하기 전에 0.4 x 106/ml 24 시간으로 세포를 파종하였다. 트랜스펙션 후 48-72시간 경과시점에 상등액을 회수하고, 저속 원심분리(1,500 rpm으로 10분)로 불순물을 제거하고, 공극-크기 0.45-㎛의 필터를 이용하여 여과하였다. 바이러스 스톡을 연속 희석하여 세포에 형질도입하여 바이러스 티터를 계산하였다. 표준화된 RT 분석 및 p24 항원(Ag) ELISA 절차(Coulter Corporation, Westbrook, ME)를 이용하여 바이러스 스톡 표준화(normalisation) 를 완수하였다.
세포에 대한 형질도입 및 ΔLNGFR 면역 선별.
바이러스 접종(spinoculation)에 의해 세포를 형질도입시켰다. 간략히 정리하면, 각각의 VSV-G 슈도-타이핑된 벡터의 RT 분석-표준화된 상등액을 1 x 106 세포와 함께 최종 부피 2㎖(MOI 0.5 내지 5)가 되도록 배양하였으며, 폴리브 렌(polybrene)(8㎍/㎖) 존재하에 2,00rpm으로 1시간 동안 원심분리하였다. 48시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 신선한 완전 배지를 부가하였다. 항-사람 p75-LNGFR 단일클론항체 20.4 (ATCC, Rockville, MD) 및 R-피코에리트린(RPE)-컨쥬게이션된 염소 항-생쥐 혈청(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)을 사용하여 ΔLNGFR 발현에 대한 유세포 분석기 분석(FACScan, Becton Dickinson, Mountain View, CA)을 통해 트랜스펙션 효율을 바이러스 접종후 1주일 이상 모니터링하였다. 제조업자의 사용지침에 따라 미니맥스(MiniMACS) 마이크로비드(Miltenyi Biotec Inc., Sunnyvale, CA)를 사용한 자기(magnetic) 세포 분류에 의해 면역 선별된 ΔLNGFR+ 세포를 수득하였다. FACS 염색에 의할 때, ΔLNGFR+ 세포 순도는 >92%였다. 변형된 바이러스 접종 프로토콜(폴리브렌 농도: 4 ㎍/㎖; 밤새 배양후 신선한 배지로 바이러스 상등액을 대체)에 의해 초기(primary) T 세포를 형질도입시켰다. 세포주와 관련하여 기술한 바와 같이 바이러스 접종 후 3일째에 ΔLNGFR+ T-림프구를 선별하였다.
웨스턴 블랏 분석
전-세포 단백질 추출물(40㎍)을 당 분야에 공지된 바에 따라 준비하고(Bovolenta et al., 2002), 12.5% SDS-PAGE로 크기별-분획화(size-fractionating)하고, 전자블랏팅(electroblotting)을 통해 하이본(Hybond) ECL 니트로셀룰로오스 막(Amersham, Little Chalfont, UK)으로 옮겼다. 상기 막을 실온에서 1시간 동안 5% 저-지방 우유로 블록킹하고 난 다음, 4℃에서 밤새도록 적당한 1차 항체와 함께 배양하였다. HIV- 1HXB2 Vif 래빗 항혈청(Goncalves et al., 1994)을 AIDS 리서치 및 레퍼런스 리에이젼트 프로그램(Division of AIDS, NIAID, NIH, Bethesda, MD)을 통해 데이나 가부즈다로부터 획득였으며, 1:1,000으로 희석하여 사용하였다. 사람 액틴에 대한 래빗 폴리클로날 항체(Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO)을 1:250으로 희석하여 사용하였다. 모든 주요 HIV-1 단백질을 인식하는, AIDS 환자로부터 수득한 혈청을, 1:2000으로 희석하여 사용하였다. 항체 결합을 시각화하였다. 강화된 화학발광 시스템(ECL, Amersham)으로써 1:10,000으로 희석시킨, 허스래디시 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 2차 항체, 항-래빗 및 항-인간 항체(Amersham, Little Chalfont, UK)를 사용하여 항체 결합을 시각화하였다.
노던 블랏 분석
CEM A3.01 세포를 시클로헥시미드(10㎍/㎖; Calbiochem?)를 비처리 또는 처리한 체 8 시간 동안 두었다. 전체 RNA를 추출하였다. 제조업자의 사용지침에 따라 트리졸(Trizol) 시약(Life TechnologiesTM Inc., Gaithersburg, MD)을 사용하여 추출하고, 0.8% 아가로즈-포름알데히드 겔상에서 런닝시키고, 모세관 이동으로 하이본드-N 막(Hybond-N, Amersham) 상으로 이동시키고, 퍼펙트하이브(PerfectHyb) 플러스(PLUS) 혼성화 버퍼(Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO)중에서 106 dpm/㎖의 32P-표지된 1-kb DLNGFR 단편으로 탐침화(probing)하고, -70℃에서 X-레이 필름에 노출시켰다(도. 14).
HIV-1 감염
세포를 하기 HIV-1 종으로 급속히 감염시켰다: 실험실용으로 개조된 X4 HIV-1 IIIB/LAI(ABI, Advanced Biotechnologies, Columbia, MD), 분자 클론 X4 HIV-1NL4-3 및 그의 Δvif 유도체(Gibbs, 1994), 분자 클론 R5 HIV-1 AD8(ABI, Advanced Biotechnologies, Columbia, MD) 및 케이. 페덴(K. Peden, FDA, NIH, Bethesda, MD)이 흔쾌히 기부해준 pAΔ1vif1 HIVdly. 바이러스들을(MOI 범위 0.01 내지 1) 37℃에서 2-5시간 동안 상기 세포에 흡착시키고 난 후, PBS로 2회 세척하였다. 세포를 최종적으로 완전 배지에 재현탁시키고, 96-웰 플레이트에 3회 반복하여(triplicate) 0.5-1 x 106 /㎖로 파종하였다. 배양물 상등액을 4일마다 회수하고 표준 절차에 따른 Mg2+-의존성 RT-활성 분석 또는 p24 ELISA를 위한 시험을 수행하기 전까지 -80℃에 저장하였다.
실시예 2 - 돌연변이체 Vif의 Tat 의존적 발현
본 발명자들은 상기 키메릭 단백질이 Vif 돌연변이체를 엔코딩하는 렌티바이러스 벡터 및 패키징 컨스트럭트(Tat의 공급원으로서)로 코-트랜스펙션시킨 293T세포에서 Tat-의존적 방식으로 발현된다는 것을 밝혀내었다(도. 7).
전-세포 추출물(Whole-cell extracts, WCE)을 당 분야에 공지된 바에 따라 준비하였다{Bovolenta, 2002 #205}. 단백질을 SDS-PAGE로 크기별-분획화하고, 전자블랏팅에 의해 하이본드 ECL 니크로셀룰로오스 막(Amersham, Little Chalfont, UK)으로 옮겼다. 상기 막을 5% 저-지방 우유로 블로킹하고 난 다음, 적당한 1차 항체화 함께 배양하였다. HIV- 1HXB2 Vif 래빗 항혈청(Goncalves, 1994 #241)을 AIDS 리서치 및 레퍼런스 리에이젼트 프로그램(Division of AIDS, NIAID, NIH, Bethesda, MD)을 통해 데이나 가부즈다로부터 획득였으며, 1:1,000으로 희석하여 사용하였다.
상기 단백질들은, F12-Vif(도. 2), Chim2(도. 4A, 4B) 및 Chim3(도. 5A, 5B)이 더 이상 나타나지 않는다는 점에서, 상이한 세포내 안정성을 가지는 반면, WT-Vif(도. 1C) 및 Chim1(도. 3A, 3B)는 여전히 72시간 경과시점에도 축적된다(도. 7).
실시예 3 - 돌연변이체 Vif 컨스트럭트는 T-세포에서의 HIV-1의 복제를 억제한다
본 발명자들은 처음에 0,1의 MOI로 X4 분자 클론 NL4-3를 목-형질도입 및 LV-형질도입된 CEMA3.01 세포를 감염시켜 상기 3가지 키메라의 잠재적인 항-바이러스 활성과 F12-Vif의 활성을 비교하였다. 도. 8A는, F12-Vif의 N-말단 지역을 포함하는, Chim1은 항바이러스 활성을 나타내지 아니하는 반면, Chim2 및 Chim3(F12-Vif의 C-말단 도메인을 발현시킴) 둘 모두는 F12-Vif의 억제활성과 비견될 수 있을 정도로 HIV-1 복제를 억제한다는 것을 보여준다. Chim3에서의 F12-Vif 서열 길이가 Chim2 에서의 길이보다 더 짧기는 하지만(6개의 독특한 아미노산 치환을 포함하는 45개 아미노산 대 9개의 독특한 치환을 포함하는 104개 아미노산), 상기 Chim3 의 항-바이러스 활성은 Chim2의 활성보다 조금 더 높다. 그러므로, 이후 부터, 본 발명자들은 Chim2의 효과는 Chim3의 효과와 항상 비슷한것으로 단순화시켜 생략함과 동시에, F12-Vif의 효과와 비교한 Chim 3의 효과에 대해서만 보고한다. 본 발명자들은 CEMss(도. 8B) 및 Sup-T1(도. 8C) 증식허용성 세포내의 Chim3의 HIV 억제 활성을 확인하였으며, 이 과정에서 상기 세포들을 0,1의 MOI로 X4 NL4-3 HIV-1로 감염시켰다. 두 가지 경우 모두에서 Chim3 F12-Vif만큼 효율적으로 HIV-1 복제를 억제한다. 마지막으로, R5 HIV-1 종에 대한 Chim3의 억제 활성을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 R5 HIV-1 종으로 감염될 수 있는 유일한 T 세포주로서 PM1 세포를 사용하였다(Lusso et al., 1995). 목-형질도입 및 Chim3PΔN-형질도입된 세포를 HIV-1 AD8 분자 클론을 가지고 0.1의 MOI로 감염시키고, 감염후 6일째에 바이러스 생산량을 분석하였다. 도. 8D에 도시된 바와 같이, Chim3를 발현시키는 세포는 목-형질도입 세포에 비해 4-배나 더 적은 바이러스 방출을 보여준다.
실시예 4 - Chim3는 제대혈 유래 CD4+ T 림프구에서의 X4 및 R5 HIV-1 종 둘 모두의 복제를 억제시킨다
렌티바이러스들(LVs)을 건강한 정상 공여자의 제대혈로부터 수득한 미리-활성화된 CD4+ T 림프구에 형질도입시키고, X4 HIV-1 NL4-3 종을 0.1의 MOI로 감염시켰다. 목-형질도입 세포와는 대조적으로, 삽입된 Chim3 유전자를 지니는 T 림프구는 실험전반에 걸쳐 HIV-1 감염 뿐만 아니라 F12-Vif를 조절한다(도. 9A). R5 분자 클론 HIV-1 AD8을 0,1의 MOI로 감염시킨 다른 공여자로부터 유래된 CD4+ T 림프구에서도 유사한 결과가 얻어졌다(도. 9B).
실시예 5 - Chim3는 제대혈(CB)-유래 CD4+ T 림프구내에서 Δ vif HIV-1의 복제를 회복시키지 아니한다
F12-Vif, Chim2 및 Chim3 억제 활성이 WT-Vif의 존재에 의존적인지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 Δvif HIV-1를 0.1의 MOI로 증식불허용 CEM A3.01 목- 및 벡터-형질도입 세포에 감염시켰다(도. 10). 예상한 대로, Δvif HIV-1는 목- 및 PΔN-형질도입 세포에서는 복제되지 아니하나, WT-Vif가 트랜스로 제공된 세포에서는 효율적으로 생성된다. 놀랍게도, Δvif HIV-1는 또한 F12-Vif- 및 Chim2-발현 세로로부터 방출되나, Chim3-발현 세포에서는 방출되지 않는데, 이는 환자내부에 조용히 잠복하고 있는 Δvif HIV-1 유사종과 조우시에 Chim2의 경우에서 보다는 Chim3 Vif가 더 안정하다는 것을 의미한다(도. 10).
추가 실험에서, 본 발명자들은 X4 또는 R5 친화성 둘 중 어느 하나와의 정황관계에서 생성된 vif-결함 바이러스를 0,1의 MOI로 CD4+ T 림프구 목-형질도입, F12-Vif- 및 Chim3-형질도입 세포에 감염시키고 연이어 각각, 39일(X4 Δvif HIV, 도 11A) 및 29일(R5 Δvif HIV, 도. 11B) 동안 감염 키네틱스를 실시하였다. F12-Vif와 관련하여 본 발명자들이 이전에 개시한 것(22)과는 달리 본원에서 확증된 바에 의하면, 약한 수준의 바이러스 복제가 R5-친화성 종(도. 11B)에서 관찰되기는 하지만, Chim3는 상기 vif-결함 바이러스 둘 모두의 복제를 회복시키지 못한다. 상기 결과들은 Chim3가 F12-Vif에 의해 달성되는 수준과 유사한 수준으로 HIV 복제를 억제할 뿐만 아니라, 훨씬 더 중요하게는 vif-결함 바이러스의 복제를 회복시키지 않는다는 것을 입증한다. 따라서 이러한 결과는 항-HIV 유전자 치료 접근방법 에 있어서 Chim3가 F12-Vif와 비교하여 더 나은 후보자가 되게 한다. 사실상 Chim3는 HIV-1 제한 인자 hHA3G에 대한 대항인자(counteracting factor)로서 Vif의 영향과 관련하여 진정(truly) 우성(dominant) 음성(negative) 표현형을 나타낸다.
실시예 6 - Chim3는 목 형질도입 HIV-1 감염 세포와 비교하여 도입된 세포의 생존에 기여한다
Chim3-형질도입 세포가 목 형질도입 대응체와 비교하여 선택적인 이점을 제공할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 동일한 비율(50:50)로 목-형질도입 세포와 LV-형질도입 CEMA3.01을 섞었다. 이후 세포들을 2개의 군으로 나누었으며, 하나는 감염시키지 아니한 상태로 두고 나머지 하나는 X4 HIV-1 NL4-3을 0,01의 MOI로 감염시켰다. 감염시키지 아니한 세포에 대한 감염된 세포의 NGFR+ 증가 퍼센트를 배양 20일째에 계산하였다. NGFR의 발현을 FACS 분석을 통해 모니터링하였다. 도. 12는, 모든 유형의 세포에서, HIV-1 감염후 NGFR+ 세포가 증가된다는 것을 보여준다. 그러나, Chim3- 및 F12-Vif-형질도입 세포의 증가도(enhancement)는 대조군 세포와 비교하여 2 내지 5배 더 높게 나타나는데, 이는 상기 2가지 치료 유전자들이 유전학적으로 변형된 세포에 훨씬 더 강한 선택적 이점을 제공한다는 것을 의미한다.
실시예 7 - Chim3는 비 증식허용성 세포내의 프로테아좀에 의해서만 우선적으로 분해되며 이의 수준은 세포 인자 사람 APOBEC3G(hA3G)의 수준과 역비례 관계에 있다
F12-Vif와는 대조적으로, Chim3가 진정 우성 음성 인자와 같이 행동한다는 상기 사실에 기초하여, 본 발명자들은 Chim3 형질도입 세포중에 hA3G의 수준이 얼마나 될 것인지에 대해 의문을 가졌다. 본 발명자들은 처음에 감염되지 않은 형질도입된 증식불허용 CEM A3.01 및 증식허용 Sup-T1 세포내에서의 상기 키메라 단백질의 기초 발현 수준을 분석하였다. 놀랍게도, Chim2 및 Chim3 발현 수준은 그 밖의 다른 Vif의 발현수준보다 훨씬 더 낮게 분석되었는데(도. 13A), 이는 상기 2가지 키메라 단백질이 상이한 안정성을 가지거나 상이하게 발현된다는 것을 시사한다.
Vif가 프로테아좀에 의해 증식불허용 HeLa 및 293T 세포내에서 분해되므로(Fujita et al., 2004), 다음으로 본 발명자들은 프로테아좀 억제자 MG132의 존재 또는 부재시의 증식허용 및 증식불허용 세포에서의 Vif 단백질의 수준을 조사하였다. 도 13B의 상단 판넬에 도시된 바와 같이, Chim2 및 Chim3 둘 모두의 발현은 Sup-T1 세포에서 역시 그 밖의 다른 Vif 단백질들에 비해 더 낮으며 및 MG132의 처리는 단지 상기 단백질들의 약한 축적을 유발시킬 뿐이다(도. 13C). 대조적으로, Chim3는 MG132 처리후에 그 밖의 다른 Vif 단백질들에 비해 약 3배 더 축적된다(도. 13B, 하단 판넬 및 도. 13C). 보다 더 중요한 사실은, hA3G가 Chim3 발현 세포에서 웨스턴 블랏 분석으로만 유일하게 검출될 수 있으며 그의 수준은 MG132 처리된 세포내의 Chim3 수준과 역비례 관계에 있다는 것이다(도. 13B, 중앙 판넬). 상기 결과들은 Chim3가 증식불허용 세포내에서 프로테아좀에 의해서만 유일하게 우선적으로 분해되며 그의 낮은 수준이 hA3G의 정상적 발현이 가능하게 한다는 것을 입증한다.
실시예 8 - Chim3는 본 발명의 벡터에 의해 정상적으로 발현되며 이의 mRNA는 시클로헥시미드 처리후 축적된다
Chim3의 낮은 발현이 또한 낮은 전사에 의존하는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 NGFR 프로브를 사용하여 LV-형질도입 비감염 CEM A3.01 세포로부터 획득한 전체 RNA에 대한 노던 블랏 분석을 수행하였다. LV는 3종의 상이한 RNA를 전사하며, 이들 RNA는 벡터의 5´LTR로 유도되는, 전장 RNA 와 스플라이싱된 RNA, 그리고 구조(constitutive) PGK-ΔLNGFR mRNA(Vallenti et al., 2005)이다. Tat 및 Rev가 결여되어 있는, 감염되지 아니한 세포에서, 상기 5´LTR은 실제로 작동하나- 상기 Vif 단백질이 축적됨 - 감염된 세포에서 보다는 약하게 작동한다. 그러므로, 검출된 유일한 2개의 밴드들은 Vif를 포함하는 상기 스플라이싱된 RNA 및 상기 구조 ΔLNGFR RNA에 해당한다. 놀랍게도, Chim2 및 Chim3 LV의 발현은 다른 LV 단백질들보다 더 강하게 발현되며(도. 14A) 합성된 단백질의 수준에 역비례한다. 이러한 명백한 모순을 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 단백질 합성을 블록킹하는 시클로헥시미드를 세포에 8시간 동안 처리하였다. Chim3 mRNA의 축적이 다른 Vif들 보다 더 높다는 사실에 주목할 필요가 있다(도. 14B 및 C). 상기 결과는 Chim3를 제외한, 분석된 Vif들이 음성 피드-백 메카니즘에 의해 그들 자신의 전사를 조절한다는 것을 제시하는 것이다. Chim3는 정상적으로 전사되며, 상기 단백질은 프로테아좀에 의해 쉽게 분해되기 때문에 그의 mRNA는 불충분하게 전사될 것이다.
실시예 9 - 면역원성
그 자체로, Vif는 HIV-1 단백질중 면역원성이 적은 단백질들에 속하는 단백질이다(Addo et al., 2003). 적어도 HLA-I 결합 펩티드를 예상하기 위한 BIMAS(http://bimas.cit.nih.gov/) 및 RANKPEP(http://www. mifoundation.org/Tools/rankpep.html) 알고리즘 둘 모두에 근거할 때, 상기 면역원성 측면에서 본 발명의 돌연변이체 Vif 폴리펩티드는 WT-Vif와 실질적으로 상이하지는 아니할 것으로 예상된다(데이터 미제시). 돌연변이체 Vif의 낮은 면역원성 및 Tat-의존성 발현이 시험관내에서(in vivo) 감염되지 않은 레트로바이러스-형질도입된 세포에 대한 면역반응을 회피 또는 적어도 최소화할 것이다. 이에 반해서, 야생형 HIV-1 LTR은, 트랜스-도미넌트 돌연변이체 단백질의 활성에 중요한 구비조건인, HIV-1 감염된 세포에서의 도입유전자의 매우 높은 발현 수준을 보장한다.
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<220> <223> Nucleotide encoding chimeric protein <400> 12 atcgatggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 60 aggattaaca catggaaaag attagtaaaa caccatatgt atatttcaag gaaagctaag 120 gactggtttt atagacatca ctatgaaagt actaatccaa aaataagttc agaagtacac 180 atcccactag gggatgctaa attagtaata acaacatatt ggggtctgca tacaggagaa 240 agagactggc atttgggtca gggagtctcc atagaatgga ggaaaaagag atatagcaca 300 caagtagacc ctgacctagc agaccaacta attcatctgc actattttga ttgtttttca 360 gaatctgcta taagaaatac catattagga aatgtagtta gacttagttg tgaatatcaa 420 gcaggacata acaagatagg atctctacaa tacttggcac tagcagcatt aataacacca 480 aaaaagataa agccaccttt gcctagtgtt acgaaactga cagaggacag atggaacaag 540 ccccagaaga ccaagggcca cagagggagc catacaatga atggacacta gcatcgat 598 <210> 13 <211> 599 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide encoding chimeric protein <400> 13 tatcgatggg attatggaaa acagatggca ggtgatgatt gtgtggcaag tagacaggat 60 gaggattaac acatggaaaa gattagtaaa acaccatatg tatatttcaa ggaaagctaa 120 ggactggttt tatagacatc actatgaaag tactaatcca aaaataagtt cagaagtaca 180 catcccacta ggggatgcta aattagtaat aacaacatat tggggtctgc atacaggaga 240 aagagactgg catttgggtc agggagtctc catagaatgg aggaaaaaga gatatagcac 300 acaagtagac cctggcctag cagaccaact aattcatcgg tattattttg attgtttttc 360 agaatctgct ataagaaatg ccatactagg aaatgtagtt agacttagtt gtgaatatca 420 agcaggacat aacaagatag gatctctaca atacttggca ctagcagcat taataacacc 480 aaaaaagata aagccacctt tgcctagtgt tacgaaactg acagaggata gatggaacaa 540 gccccagaag accaagggcc acagaaggaa ccatacaatg aatggacact agatcgata 599 <210> 14 <211> 598 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide encoding chimeric protein <400> 14 atcgatggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 60 aggattaaca catggaaaag attagtaaaa caccatatgt atatttcaag gaaagctaag 120 gactggtttt atagacatca ctatgaaagt actaatccaa aaataagttc agaagtacac 180 atcccactag gggatgctaa attagtaata acaacatatt ggggtctgca tacaggagaa 240 agagactggc atttgggtca gggagtctcc atagaatgga ggaaaaagag atatagcaca 300 caagtagacc ctggcctagc agaccaacta attcatcggt attattttga ttgtttttca 360 gaatctgcta taagaaatgc catactagga aatgtagtta gacttagttg tgaatatcaa 420 gcaggacata acaagatagg atctctacaa tacttggcac tagcagcatt aataacacca 480 aaaaagataa agccaccttt gcctagtgtt acgaaactga cagaggatag atggaacaag 540 ccccagaaga ccaagggcca cagaaggaac catacaatga atggacacta gatcgata 598 <210> 15 <211> 598 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 15 atcgatggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 60 aggattaaca catggaaaag attagtaaaa caccatatgt atatttcaag gaaagctaag 120 gactggtttt atagacatca ctatgaaagt actaatccaa aaataagttc agaagtacac 180 atcccactag gggatgctaa attagtaata acaacatatt ggggtctgca tacaggagaa 240 agagactggc atttgggtca gggagtctcc atagaatgga ggaaaaagag atatagcaca 300 caagtagacc ctgacctagc agaccaacta attcatctgc actattttga ttgtttttca 360 gaatctgcta taagaaatac catattagga cgtatagtta gtcctaggtg tgaatatcaa 420 gcaggacata acaaggtagg atctctacag tacttggcac tagcagcatt aataaaacca 480 aaacagataa agccaccttt gcctagtgtt aggaaactga cagaggacag atggaacaag 540 ccccagaaga ccaagggcca cagagggagc catacaatga atggacacta gcatcgat 598 <210> 16 <211> 591 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 16 atcgatggga ttatggaaaa cagatggcag gtgatgattg tgtggcaagt agacaggatg 60 aggattagaa catggataag tttagtaaaa caccatatat atatttcaaa gaaagctaag 120 ggatggtttt ataaacatca ctatgaaagc actaatccaa gaataagttc agaagtacac 180 atcccactag gggatgctag attggtagta acaacatatt ggggtctgca tacaggagaa 240 agagactgga atttaggcca gggagtctcc atagaatgga ggaaaaagag atatagcaca 300 caagtagacc ctggcctagc agaccaacta attcatcggt attattttga ttgtttttca 360 gaatctgcta taagaaatgc catactagga aatgtagtta gacttagttg tgaatatcaa 420 gcaggacata acaagatagg atctctacaa tacttggcac tagcagcatt aataacacca 480 aaaaagataa agccaccttt gcctagtgtt acgaaactga cagaggatag atggaacaag 540 ccccagaaga ccaagggcca cagaaggaac catacaatga atggacacta g 591 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 17 gcaaagaatc gatgggatta tggaaaacag 30 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 18 ctcctctaat cgatgctagt gtccattcat tg 32 <210> 19 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant Vif sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (48)..(48) <223> May be Asn <220> <221> MUTAGEN <222> (127)..(127) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (128)..(128) <223> May be any amino acid except Ile <220> <221> MUTAGEN <222> (130)..(130) <223> May be any amino acid except Ser <220> <221> MUTAGEN <222> (131)..(131) <223> May be any amino acid except Pro <220> <221> MUTAGEN <222> (132)..(132) <223> May be any amino acid except Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (142)..(142) <223> May be any amino acid except Val <400> 19 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Met Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pro His 35 40 45 Pro Arg Ile Ser 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(80)..(80) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (109)..(109) <223> May be any amino acid except Leu <220> <221> MUTAGEN <222> (127)..(127) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (128)..(128) <223> May be any amino acid except Ile <220> <221> MUTAGEN <222> (130)..(130) <223> May be any amino acid except Ser <220> <221> MUTAGEN <222> (131)..(131) <223> May be any amino acid except Pro <220> <221> MUTAGEN <222> (132)..(132) <223> May be any amino acid except Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (142)..(142) <223> May be any amino acid except Val <220> <221> MUTAGEN <222> (185)..(185) <223> May be any amino acid except Gly <220> <221> MUTAGEN <222> (186)..(186) <223> May be any amino acid except Ser <400> 27 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Met Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pro His 35 40 45 Pro Arg Ile Ser Ser Glu Val His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60 Val Ile Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp Xaa 65 70 75 80 Leu Gly Gln Gly Val Ser Ile Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gln Val Asp Pro Glu Leu Ala Asp Gln Leu Ile His Xaa His Tyr Phe 100 105 110 Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Leu Leu Gly Xaa Xaa 115 120 125 Val Xaa Xaa Xaa Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys Xaa Gly Ser 130 135 140 Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175 Pro Gln Lys Thr Lys Gly His Arg Xaa Xaa His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 28 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant Vif sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (48)..(48) <223> May be Asn <400> 28 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Met Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pro His 35 40 45 Pro Arg Ile Ser Ser Glu Val His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60 Val Ile Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp Asn 65 70 75 80 Leu Gly Gln Gly Val Ser Ile Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gln Val Asp Pro Glu Leu Ala Asp Gln Leu Ile His Arg His Tyr Phe 100 105 110 Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Leu Leu Gly Asn Val 115 120 125 Val Arg Leu Ser Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys Ile Gly Ser 130 135 140 Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175 Pro Gln Lys Thr Lys Gly His Arg Arg Asn His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 29 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant Vif sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (48)..(48) <223> May be Asn <220> <221> MUTAGEN <222> (66)..(66) <223> May be any amino acid except Ile <220> <221> MUTAGEN <222> (80)..(80) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (109)..(109) <223> May be any amino acid except Leu <220> <221> MUTAGEN <222> (127)..(127) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (128)..(128) <223> May be any amino acid except Ile <220> <221> MUTAGEN <222> (130)..(130) <223> May be any amino acid except Ser <220> <221> MUTAGEN <222> (131)..(131) <223> May be any amino acid except Pro <220> <221> MUTAGEN <222> (132)..(132) <223> May be any amino acid except Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (142)..(142) <223> May be any amino acid except Val <220> <221> MUTAGEN <222> (185)..(185) <223> May be any amino acid except Gly <220> <221> MUTAGEN <222> (186)..(186) <223> May be any amino acid except Ser <400> 29 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Met Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pro His 35 40 45 Pro Arg Ile Ser Ser Glu Val His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60 Val Xaa Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp Xaa 65 70 75 80 Leu Gly Gln Gly Val Ser Ile Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gln Val Asp Pro Glu Leu Ala Asp Gln Leu Ile His Xaa His Tyr Phe 100 105 110 Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Leu Leu Gly Xaa Xaa 115 120 125 Val Xaa Xaa Xaa Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys Xaa Gly Ser 130 135 140 Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175 Pro Gln Lys Thr Lys Gly His Arg Xaa Xaa His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 30 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant Vif sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (48)..(48) <223> May be Asn <400> 30 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Met Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pro His 35 40 45 Pro Arg Ile Ser Ser Glu Val His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60 Val Val Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp Asn 65 70 75 80 Leu Gly Gln Gly Val Ser Ile Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gln Val Asp Pro Glu Leu Ala Asp Gln Leu Ile His Arg His Tyr Phe 100 105 110 Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Leu Leu Gly Asn Val 115 120 125 Val Arg Leu Ser Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys Ile Gly Ser 130 135 140 Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175 Pro Gln Lys Thr Lys Gly His Arg Arg Asn His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 31 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant Vif sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (48)..(48) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (66)..(66) <223> May be any amino acid except Ile <220> <221> MUTAGEN <222> (80)..(80) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (109)..(109) <223> May be any amino acid except Leu <220> <221> MUTAGEN <222> (127)..(127) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (128)..(128) <223> May be any amino acid except Ile <220> <221> MUTAGEN <222> (130)..(130) <223> May be any amino acid except Ser <220> <221> MUTAGEN <222> (131)..(131) <223> May be any amino acid except Pro <220> <221> MUTAGEN <222> (132)..(132) <223> May be any amino acid except Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (142)..(142) <223> May be any amino acid except Val <220> <221> MUTAGEN <222> (185)..(185) <223> May be any amino acid except Gly <220> <221> MUTAGEN <222> (186)..(186) <223> May be any amino acid except Ser <400> 31 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Met Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pro Xaa 35 40 45 Pro Arg Ile Ser Ser Glu Val His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60 Val Xaa Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp Xaa 65 70 75 80 Leu Gly Gln Gly Val Ser Ile Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gln Val Asp Pro Glu Leu Ala Asp Gln Leu Ile His Xaa His Tyr Phe 100 105 110 Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Leu Leu Gly Xaa Xaa 115 120 125 Val Xaa Xaa Xaa Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys Xaa Gly Ser 130 135 140 Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175 Pro Gln Lys Thr Lys Gly His Arg Xaa Xaa His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 32 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant Vif sequence <400> 32 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Met Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Arg His His Tyr Glu Ser Pro Asn 35 40 45 Pro Arg Ile Ser Ser Glu Val His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60 Val Val Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp Asn 65 70 75 80 Leu Gly Gln Gly Val Ser Ile Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gln Val Asp Pro Glu Leu Ala Asp Gln Leu Ile His Arg His Tyr Phe 100 105 110 Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Leu Leu Gly Asn Val 115 120 125 Val Arg Leu Ser Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys Ile Gly Ser 130 135 140 Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175 Pro Gln Lys Thr Lys Gly His Arg Arg Asn His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 33 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant Vif sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (41)..(41) <223> May be any amino acid except Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (48)..(48) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (66)..(66) <223> May be any amino acid except Ile <220> <221> MUTAGEN <222> (80)..(80) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (109)..(109) <223> May be any amino acid except Leu <220> <221> MUTAGEN <222> (127)..(127) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (128)..(128) <223> May be any amino acid except Ile <220> <221> MUTAGEN <222> (130)..(130) <223> May be any amino acid except Ser <220> <221> MUTAGEN <222> (131)..(131) <223> May be any amino acid except Pro <220> <221> MUTAGEN <222> (132)..(132) <223> May be any amino acid except Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (142)..(142) <223> May be any amino acid except Val <220> <221> MUTAGEN <222> (185)..(185) <223> May be any amino acid except Gly <220> <221> MUTAGEN <222> (186)..(186) <223> May be any amino acid except Ser <400> 33 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Met Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Xaa His His Tyr Glu Ser Pro Xaa 35 40 45 Pro Arg Ile Ser Ser Glu Val His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60 Val Xaa Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp Xaa 65 70 75 80 Leu Gly Gln Gly Val Ser Ile Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gln Val Asp Pro Glu Leu Ala Asp Gln Leu Ile His Xaa His Tyr Phe 100 105 110 Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Leu Leu Gly Xaa Xaa 115 120 125 Val Xaa Xaa Xaa Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys Xaa Gly Ser 130 135 140 Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175 Pro Gln Lys Thr Lys Gly His Arg Xaa Xaa His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 34 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant Vif sequence <400> 34 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Met Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Lys His His Tyr Glu Ser Pro Asn 35 40 45 Pro Arg Ile Ser Ser Glu Val His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60 Val Val Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp Asn 65 70 75 80 Leu Gly Gln Gly Val Ser Ile Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gln Val Asp Pro Glu Leu Ala Asp Gln Leu Ile His Arg His Tyr Phe 100 105 110 Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Leu Leu Gly Asn Val 115 120 125 Val Arg Leu Ser Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys Ile Gly Ser 130 135 140 Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175 Pro Gln Lys Thr Lys Gly His Arg Arg Asn His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 35 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant Vif sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (29)..(29) <223> May be any amino acid except Met <220> <221> MUTAGEN <222> (41)..(41) <223> May be any amino acid except Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (48)..(48) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (66)..(66) <223> May be any amino acid except Ile <220> <221> MUTAGEN <222> (80)..(80) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (109)..(109) <223> May be any amino acid except Leu <220> <221> MUTAGEN <222> (127)..(127) <223> May be any amino acid except His <220> <221> MUTAGEN <222> (128)..(128) <223> May be any amino acid except Ile <220> <221> MUTAGEN <222> (130)..(130) <223> May be any amino acid except Ser <220> <221> MUTAGEN <222> (131)..(131) <223> May be any amino acid except Pro <220> <221> MUTAGEN <222> (132)..(132) <223> May be any amino acid except Arg <220> <221> MUTAGEN <222> (142)..(142) <223> May be any amino acid except Val <220> <221> MUTAGEN <222> (185)..(185) <223> May be any amino acid except Gly <220> <221> MUTAGEN <222> (186)..(186) <223> May be any amino acid except Ser <400> 35 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Xaa Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Xaa His His Tyr Glu Ser Pro Xaa 35 40 45 Pro Arg Ile Ser Ser Glu Val His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60 Val Xaa Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp Xaa 65 70 75 80 Leu Gly Gln Gly Val Ser Ile Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gln Val Asp Pro Glu Leu Ala Asp Gln Leu Ile His Xaa His Tyr Phe 100 105 110 Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Leu Leu Gly Xaa Xaa 115 120 125 Val Xaa Xaa Xaa Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys Xaa Gly Ser 130 135 140 Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175 Pro Gln Lys Thr Lys Gly His Arg Xaa Xaa His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 36 <211> 192 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant Vif sequence <400> 36 Met Glu Asn Arg Trp Gln Val Met Ile Val Trp Gln Val Asp Arg Met 1 5 10 15 Arg Ile Arg Thr Trp Lys Ser Leu Val Lys His His Ile Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Lys Ala Arg Gly Trp Phe Tyr Lys His His Tyr Glu Ser Pro Asn 35 40 45 Pro Arg Ile Ser Ser Glu Val His Ile Pro Leu Gly Asp Ala Arg Leu 50 55 60 Val Val Thr Thr Tyr Trp Gly Leu His Thr Gly Glu Arg Asp Trp Asn 65 70 75 80 Leu Gly Gln Gly Val Ser Ile Glu Trp Arg Lys Lys Arg Tyr Ser Thr 85 90 95 Gln Val Asp Pro Glu Leu Ala Asp Gln Leu Ile His Arg His Tyr Phe 100 105 110 Asp Cys Phe Ser Glu Ser Ala Ile Arg Lys Ala Leu Leu Gly Asn Val 115 120 125 Val Arg Leu Ser Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys Ile Gly Ser 130 135 140 Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys Lys Ile Lys 145 150 155 160 Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr Glu Asp Arg Trp Asn Lys 165 170 175 Pro Gln Lys Thr Lys Gly His Arg Arg Asn His Thr Met Asn Gly His 180 185 190 <210> 37 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Region of F12-Vif (Chim3) <400> 37 Gly Asn Val Val Arg Leu Ser Cys Glu Tyr Gln Ala Gly His Asn Lys 1 5 10 15 Ile Gly Ser Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ile Thr Pro Lys 20 25 30 Lys Ile Lys Pro Pro Leu Pro Ser Val Thr Lys Leu Thr 35 40 45

Claims (98)

  1. SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열의 127번째, 128번째, 130번째, 131번째, 132번째 및 142번째 위치에 해당하는 아미노산 각각이 N, V, R, L, S 및 I로 대체되고,
    22번째, 29번째, 41번째, 66번째, 80번째, 109번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 모든 아미노산이, 각각, I, I, K, V, N, R, R 및 N이 아닌, Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서, 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 모든 아미노산이, 각각, I, I, K, N, V, N, R, R 및 N이 아님을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 48번째 위치에 해당하는 아미노산이 N임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 22번째, 29번째, 41번째, 48번째, 66번째, 80번째, 109번째, 185번째 및 186번째 위치에 해당하는 아미노산이 자연 생성(naturally occurring) Vif에 존재하는 아미노산임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 22번째 위치에 해당하는 아미노산은 K이고, 29번째 위치에 해당하는 아미노산은 M이고, 41번째 위치에 해당하는 아미노산은 R이고, 48번째 위치에 해당하는 아미노산은 N 또는 H이고, 66번째 위치에 해당하는 아미노산은 I이고, 80번째 위치에 해당하는 아미노산은 H이고, 109번째 위치에 해당하는 아미노산은 L이고, 185번째 위치에 해당하는 아미노산은 G이고, 186번째 위치에 해당하는 아미노산은 S임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 자연 생성 Vif 서열에 삽입(embedment)된 SEQ ID NO. 7의 F12-Vif 서열의 126번째 내지 170번째 아미노산을 포함하는 키메릭(chmeric) Vif를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 자연 생성 Vif 서열은 F12-Vif가 아닌 것인 폴리뉴클레오티드.
  7. SEQ ID NO. 11에 제시된 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  8. SEQ ID NO. 12 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 1항, 제2항, 제3항, 제6항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항의 Vif 단편을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 단편이 SEQ ID NO. 7에 제시된 서열의 적어도 126번째 내지 170번째에 해당하는 아미노산을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제 1항, 제2항, 제3항, 제6항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 Vif 폴리펩티드.
  11. SEQ ID NO. 11에 제시된 아미노산을 갖는 Vif 폴리펩티드.
  12. 제 1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 인체면역결핍바이러스(HIV)로부터 유래될 수 있음을 특징으로 하는 벡터.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 바이러스의 긴 말단 반복서열(long terminal repeat, LTR)에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 벡터.
  16. 제 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 tat 의존성임을 특징으로 하는 벡터.
  17. 제 13항에 있어서, tat 유전자가 결여(lack)된 벡터.
  18. 제 13항에 있어서, 상기 Vif의 발현이 HIV-1 유도성 조절을 받는 것을 특징으로 하는 벡터.
  19. 제 13항에 있어서, gag, pol 및 env 유전자 중 어느 하나 이상, 또는 전부가 결여된, 벡터.
  20. 제 13항에 있어서, 선별 마커 유전자(selectable marker gene)를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  21. 제 13항에 있어서, p75 저 친화성 신경성장인자 수용체(low affinity nerve growth factor receptor, LNGFR)의 적어도 일부분을 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 벡터.
  22. 제 13항에 있어서, 통합(integration)된 프로바이러스(provirus) 형태인 벡터.
  23. 제 13항의 벡터로부터 획득할 수 있는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 입자.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 입자가 슈도타이핑(pseudotyping)된 것임을 특징으로 하는 입자.
  25. (i) 제 13항의 벡터, (ii) 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 gag-pol 및 (iii) 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 env 또는 비레트로바이러스 또는 비렌티바이러스의 env를 포함하는, 제23항의 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 입자를 생산하기 위한 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 생산 시스템.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 레트로바이러스 또는 렌티바이러스의 gag-pol, 및 env가 서로 다른 벡터에 존재함을 특징으로 하는 생산 시스템.
  27. 제 25항에 있어서, 상기 env가 RD114-TR, VSV-G, GALV 또는 4070A 중에서 선택됨을 특징으로 하는 생산 시스템.
  28. 제 1항, 제2항, 제3항, 제6항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  29. 제 13항의 벡터로 감염 또는 형질도입된 세포.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 세포가 단핵세포(monocyte), 대식세포(macrophage) 또는 림프구(lymphocyte)인 세포.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 세포가 CD34+ 조혈전구세포(hematopoietic precursor cell) 또는 조혈세포인 세포.
  32. 제 29항에 있어서, 상기 돌연변이체 Vif가 HIV-1 유도성 조절하에 있음을 특징으로 하는 세포.
  33. 제 1항, 제2항, 제3항, 제6항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, HIV 감염의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  34. 제1항, 제2항, 제3항, 제6항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서, HIV 감염 또는 관련 병태(condition)의 치료 또는 예방을 위한 것인, 폴리뉴클레오티드.
  35. 제 33항에 있어서, 상기 HIV 감염이 중복감염(superinfection)을 나타냄을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  36. 제 9항에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 엔코딩되는 Vif 단편.
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