KR102458904B1 - 신규의 bmpr2 유전자 기능획득 돌연변이체 및 이의 용도 - Google Patents

신규의 bmpr2 유전자 기능획득 돌연변이체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102458904B1
KR102458904B1 KR1020200075323A KR20200075323A KR102458904B1 KR 102458904 B1 KR102458904 B1 KR 102458904B1 KR 1020200075323 A KR1020200075323 A KR 1020200075323A KR 20200075323 A KR20200075323 A KR 20200075323A KR 102458904 B1 KR102458904 B1 KR 102458904B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bmpr2
cells
ser
mutation
leu
Prior art date
Application number
KR1020200075323A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210157252A (ko
Inventor
김용환
김명진
조태준
Original Assignee
숙명여자대학교산학협력단
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 숙명여자대학교산학협력단, 서울대학교산학협력단 filed Critical 숙명여자대학교산학협력단
Priority to KR1020200075323A priority Critical patent/KR102458904B1/ko
Priority to US18/011,365 priority patent/US20230235001A1/en
Priority to PCT/KR2020/019261 priority patent/WO2021256646A1/ko
Publication of KR20210157252A publication Critical patent/KR20210157252A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102458904B1 publication Critical patent/KR102458904B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

FOP의 원인으로 알려진 기존 ACVR1-R206H 돌연변이 외에 FOP 유사 표현형의 신규 사례로서 특정 유전자의 돌연변이를 발굴하고 이를 골 형성 분화를 통한 골 질환 치료에 활용 가능한 기술이 개시된다. 본 발명은 BMPR2(bone morphogenetic protein type 2 receptor)를 코딩하는 BMPR2 유전자의 376번째 자리의 아미노산이 글루탐산(E)으로부터 라이신(K)으로 돌연변이된 BMPR2-E376K 돌연변이체를 제공한다.

Description

신규의 BMPR2 유전자 기능획득 돌연변이체 및 이의 용도{A Novel Gain-of-Function Mutation in the BMPR2 Gene and Uses Thereof}
본 발명은 신규 돌연변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 진행성 골화성 섬유이형성증(Fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP) 환자 유래의 BMPR2 유전자 기능획득 돌연변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
진행성 골화성 섬유이형성증(Fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP)(MIM #135100)은 결합 조직에서 점진적 이소성 골 형성으로 특징되는 흔치 않은 상염색체 우성 유전 골 질환이다(비특허문헌 1 및 2 참조). FOP 환자의 전형적인 특징은 엄지 발가락의 선천적 기형이다(비특허문헌 3 참조). FOP 환자의 약 70%는 이소성 골화에 앞서 플레어-업(flare-ups)으로 알려진 간헐적 전골화 염증성 연조직 종창(episodic pre-osseous inflammatory soft tissue swelling)을 경험한다(비특허문헌 4 참조).
FOP의 분자적 기초에 대한 이해는 원인이 되는 ACVR1(BMP(bone morphogenetic protein) 신호전달을 책임지는 1형 TGF-베타 수용체) 코딩 유전자의 기능획득 돌연변이의 발굴(identification) 과정에서 촉발되었다(비특허문헌 5 참조). FOP 사례의 95%가 ACVR1-R206H 돌연변이로부터 기인된 것이기는 하나 지금까지 다수의 ACVR1 변이가 알려졌다(비특허문헌 6 및 7 참조).
축적된 증거는 ACVR1의 기능획득 돌연변이가 BMP 리간드가 없는 경우에도 BMP 신호전달을 항시적으로 자극하여 이소성 골화에 이르게 한다는 아이디어를 뒷받침한다(비특허문헌 8 내지 10 참조). 흥미롭게도 야생형 ACVR1 환경에서 BMP 신호전달을 억제하는 사이토카인인 액티빈 A(activin A)는 특히 ACVR1-R206H 돌연변이를 갖는 세포에서 BMP 신호전달을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(비특허문헌 11 및 12 참조). FOP에서 액티빈 A가 관여한다는 것은 액티빈 A에 대한 항체 처리로 이소성 골 형성이 감소됨을 보인 FOP 마우스 모델에서 검증되었다(비특허문헌 11 참조). 액티빈 A가 어떻게 ACVR1 돌연변이-의존 BMP 신호전달 과활성에 영향을 주는지에 대한 정확한 분자적 기초는 알려지지 않았다. 또한 FOP의 유전적 원인에 대한 제한된 양의 정보는 질병의 병리생리학에 대한 이해를 방해한다.
[비특허문헌]
1. Shore EM, Kaplan FS. Inherited human diseases of heterotopic bone formation. Nat Rev Rheumatol 2010;6:518-27.
2. Kaplan FS, Le Merrer M, Glaser DL, et al. Fibrodysplasia ossificans progressiva. Best Pract Res Clin Rheumatol 2008;22:191-205.
3. Towler OW, Shore EM, Xu M, et al. The congenital great toe malformation of fibrodysplasia ossificans progressiva? - A close call. Eur J Med Genet 2017;60:399-402.
4. Pignolo RJ, Bedford-Gay C, Liljesthrom M, et al. The Natural History of Flare-Ups in Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP): A Comprehensive Global Assessment. J Bone Miner Res 2016;31:650-6.
5. Shore EM, Xu M, Feldman GJ, et al. A recurrent mutation in the BMP type I receptor ACVR1 causes inherited and sporadic fibrodysplasia ossificans progressiva. Nat Genet 2006;38:525-7.
6. Pignolo RJ, Baujat G, Brown MA, et al. Natural history of fibrodysplasia ossificans progressiva: cross-sectional analysis of annotated baseline phenotypes. Orphanet J Rare Dis 2019;14:98.
7. Haupt J, Xu M, Shore EM. Variable signaling activity by FOP ACVR1 mutations. Bone 2018;109:232-40.
8. Yu PB, Deng DY, Lai CS, et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med 2008;14:1363-9.
9. Chakkalakal SA, Zhang D, Culbert AL, et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res 2012;27:1746-56.
10. Culbert AL, Chakkalakal SA, Theosmy EG, Brennan TA, Kaplan FS, Shore EM. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells 2014;32:1289-300.
11. Hatsell SJ, Idone V, Wolken DM, et al. ACVR1R206H receptor mutation causes fibrodysplasia ossificans progressiva by imparting responsiveness to activin A. Sci Transl Med 2015;7:303ra137.
12. Hino K, Ikeya M, Horigome K, et al. Neofunction of ACVR1 in fibrodysplasia ossificans progressiva. Proc Natl Acad Sci U S A 2015;112:15438-43.
13. Machado RD, Southgate L, Eichstaedt CA, et al. Pulmonary Arterial Hypertension: A Current Perspective on Established and Emerging Molecular Genetic Defects. Hum Mutat 2015;36:1113-27.
14. Wang Y, Wu MH, Cheung MPL, et al. Reprogramming of Dermal Fibroblasts into Osteo-Chondrogenic Cells with Elevated Osteogenic Potency by Defined Transcription Factors. Stem Cell Reports 2017;8:1587-99.
15. Wright V, Peng H, Usas A, et al. BMP4-expressing muscle-derived stem cells differentiate into osteogenic lineage and improve bone healing in immunocompetent mice. Mol Ther 2002;6:169-78.
16. Yamamoto K, Kishida T, Sato Y, et al. Direct conversion of human fibroblasts into functional osteoblasts by defined factors. Proc Natl Acad Sci U S A 2015;112:6152-7.
17. Takacs R, Matta C, Somogyi C, Juhasz T, Zakany R. Comparative analysis of osteogenic/chondrogenic differentiation potential in primary limb bud-derived and C3H10T1/2 cell line-based mouse micromass cultures. Int J Mol Sci 2013;14:16141-67.
18. Pauklin S, Vallier L. Activin/Nodal signalling in stem cells. Development 2015;142:607-19.
19. Namwanje M, Brown CW. Activins and Inhibins: Roles in Development, Physiology, and Disease. Cold Spring Harb Perspect Biol 2016;8.
20. Anderson GJ, Darshan D. Small-molecule dissection of BMP signaling. Nat Chem Biol 2008;4:15-6.
21. Zhang L, Zhou F, ten Dijke P. Signaling interplay between transforming growth factor-beta receptor and PI3K/AKT pathways in cancer. Trends Biochem Sci 2013;38:612-20.
22. Southgate L, Machado RD, Graf S, Morrell NW. Molecular genetic framework underlying pulmonary arterial hypertension. Nat Rev Cardiol 2019.
23. Kim MJ, Park SY, Chang HR, et al. Clinical significance linked to functional defects in bone morphogenetic protein type 2 receptor, BMPR2. BMB Rep 2017;50:308-17.
24. Hopper RK, Moonen JR, Diebold I, et al. In Pulmonary Arterial Hypertension, Reduced BMPR2 Promotes Endothelial-to-Mesenchymal Transition via HMGA1 and Its Target Slug. Circulation 2016;133:1783-94.
25. Wang X, Li F, Xie L, et al. Inhibition of overactive TGF-beta attenuates progression of heterotopic ossification in mice. Nat Commun 2018;9:551.
26. Chang HR, Cho SY, Lee JH, et al. Hypomorphic Mutations in TONSL Cause SPONASTRIME Dysplasia. Am J Hum Genet 2019;104:439-53.
27. Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 2009;25:1754-60.
28. Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics 2009;25:2078-9.
29. McKenna A, Hanna M, Banks E, et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res 2010;20:1297-303.
30. Wang K, Li M, Hakonarson H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Res 2010;38:e164.
31. Richards S, Aziz N, Bale S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med 2015;17:405-24.
본 발명은 FOP의 원인으로 알려진 기존 ACVR1-R206H 돌연변이 외에 FOP 유사 표현형의 신규 사례로서 특정 유전자의 돌연변이를 발굴하고 이를 골 형성 분화를 통한 골 질환 치료에 활용 가능한 기술을 제시하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 제1 양태로서 본 발명은, BMPR2(bone morphogenetic protein type 2 receptor)를 코딩하는 BMPR2 유전자의 376번째 자리의 아미노산이 글루탐산(E)으로부터 라이신(K)으로 돌연변이된 BMPR2-E376K 돌연변이체를 제공한다.
또한 상기 돌연변이체는 1126번 뉴클레오티드에서 구아닌(G)이 아데닌(A)으로 치환된 점 돌연변이인 것을 특징으로 하는 BMPR2-E376K 돌연변이체를 제공한다.
또한 상기 돌연변이체는 진행성 골화성 섬유이형성증(Fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP) 표현형을 유발하는 것을 특징으로 하는 BMPR2-E376K 돌연변이체를 제공한다.
또한 상기 돌연변이체는 골 형성 분화를 통한 골 질환 치료를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 BMPR2-E376K 돌연변이체를 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 제2 양태로서 본 발명은, 상기 돌연변이체를 포함하는 세포주를 제공한다.
본 발명은 FOP 유사 표현형의 신규 사례에 관한 것이다. 환자는 전신에 걸쳐 플레어-업(flare-ups)과 이소성 골 형성이 나타났고, 이는 ACVR1 돌연변이의 표현형과 유사하다. 그러나, 그 환자는 엄지 발가락 이상이나 ACVR1 유전자에 어떠한 돌연변이도 나타나지 않았다. 본 발명에서는 전장 엑솜 시퀀싱을 통해 BMP 신호전달 캐스케이드에서 Ⅱ형 TGF-베타 수용체를 코딩하는 BMPR2 유전자에서 원인이 되는 기능획득 돌연변이를 발굴 및 검증하였다. 이는 BMPR2 기능획득 돌연변이와 그 결과로 인한 FOP 유사 표현형에 관한 최초 보고이다. FOP 유사 표현형을 나타내도록 하는 추가적인 유전적 변이의 발굴은 골 형성 분화를 통한 골 질환 치료에 활용 가능할 뿐 아니라, 전반적으로 질병의 분자적 기초 및 TGF/BMP 신호전달 생물학에 대해 유용한 정보를 제공할 것이다.
도 1a 내지 1h는 FOP 환자의 신규 변이 발굴에 관련된 사진 및 그래프이다.
도 1a는 16세 환자의 방사선 사진이다. 화살표는 골격근에서의 이소성 골 형성을 나타낸다. 전형적인 FOP 환자와 달리, 엄지 발가락 이상이 없다.
도 1b는 환자 가족의 BMPR2 변이에 관한 가계도이다. 화살표는 환자를 나타낸다.
도 1c는 BMPR2 유전자의 이형접합 신규 과오 돌연변이(heterozygous de novo missense mutation)가 검출된 전장 엑솜 시퀀싱을 나타내고 있다. 환자는 1126번 뉴클레오티드에서 구아닌(G)이 아데닌(A)으로 치환된 점 돌연변이를 가지고 있다.
도 1d는 BMPR2 단백질에서 기능적 영역 및 돌연변이 위치를 나타낸 개략도이다. 돌연변이는 BMPR2의 키나아제 영역(KD)에서 엑손 8 내에 위치한다. 'TM'은 transmembrane이고, 'ECD'는 extracellular domain이고, 'CTD'는 C-terminal domain이다.
도 1e는 BMPR2의 키나아제 영역에서 종간 상동관계를 나타내고 있다. 보존 서열은 회색 음영으로, E376K 변이는 빨간색으로 표시되었다.
도 1f는 웨스턴 블로팅으로 정상(BJ fibroblast) 및 FOP 환자 세포에서 SMAD 신호전달(p-SMAD1/5/9, SMAD5, p-SMAD2, SMAD2), 이의 하위 표적 유전자(ID1, ID3) 및 골 형성 마커(osteocalcin, ALP, RUNX2)의 발현을 분석한 결과를 나타내고 있다. 정상 및 환자 세포는 골 형성 분화 유도를 위해 완전 배지(15% 혈청) 또는 저혈청 배지(2% 말 혈청)에서 배양되었다
도 1g는 BMP2 또는 BMP4(50 ng/ml)로 2일간 분화 유도 후 정상 및 환자 섬유아세포의 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP) 염색 결과(좌측 패널)를 나타내고 있다. ALP는 보라색으로 검출되었다. ALP 활성(우측 패널)은 405 nm 흡광도 측정을 통해 평가되었고, 총 단백질은 단백질 분석 키트(Micro-BCA protein assay kit)를 이용하여 560 nm에서 측정되었다. ALP 활성은 시료의 단백질 함량으로 정규화되었다.
도 1h는 세포내 칼슘 축적을 보여주는 알리자린 레드 S 염색(alizarin red S staining) 결과를 나타내고 있다.
도 2a 내지 2g는 BMPR2-E376K 변이의 병원성의 기능적 검증에 관련된 사진 및 그래프이다.
도 2a는 인간 BMPR2 유전자를 나타낸 개략도로서, 엑손 8(빨간색 별 및 글자 표시)에 G1126A 돌연변이를 보여준다. 구아닌(G)에서 아데닌(A)으로 치환은 단백질 서열에서 글루탐산(파란색)에서 라이신(빨간색)으로의 돌연변이를 유발한다. CRISPR-Cas9으로 수정된 클론에서 녹-아웃(knock-out) #3은 1:1 비율로 대립유전자를 가지고, 1122번 뉴클레오티드에 1개의 염기쌍이 결실되었다. 이는 정지 신호를 초래하였다. 녹-아웃(knock-out) #5은 뉴클레오티드 A(노란색)의 1개 염기쌍의 삽입으로 정지 코돈 돌연변이를 유발하였다. 마지막으로 녹-인(knock-in) #203은 1126번에 정상 뉴클레오티드 구아닌과 HDR 도너 주형(HDR donor template)으로부터 CTC 서열을 함유하였고, 야생형 아미노산 서열이 보존되었다.
도 2b는 환자 유래 피부 섬유아세포에서 CRISPR-Cas9으로편집된 녹-아웃(#3 및 #5) 및 녹-인(#203) 클론의 용해물을 면역블로팅(immunoblotting)하여 확인된 단백질 발현 결과를 나타내고 있다.
도 2c는 HEK293T 세포에서 BMPR2-E376K 변이에 의한 BMP 신호전달의 변화를 검증하기 위한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내고 있다. HEK293T 세포는 공 벡터(EV), 야생형(WT)과, BMPR2(E376K) 및 ACVR1(R206H)의 돌연변이(mut) 형태를 발현한 구조물로 일시적으로 형질주입시켰고, 세포 용해물에서 단백질 발현을 면역블로팅하여 검출하였다.
도 2d는 프로모터 리포터 분석 결과로서, 야생형(WT) 및 돌연변이(mut)의 BMPR2 및 ACVR1를 가지는 플라스미드로 형질주입된 HEK293T 세포에서 루시페라제 발현이 BMP-반응성 요소(BMP-responsive elements)에 의해 조절되는 것을 나타내고 있다.
도 2e는 C3H10T1/2 세포를 공 벡터(EV), HA-표지된 야생형(WT) 또는 돌연변이 BMPR2로 형질주입시키고, 이들의 용해물에 대해 웨스턴 블롯 분석을 통한 SMAD1/5/9의 강화된 인산화 및 하위 작동자 ID1, ID3 및 SOX9의 발현 결과를 나타내고 있다. 별 표시는 교차반응 산물을 나타낸다.
도 2f는 BMP2를 3주간 처리하여 BMPR2-WT 또는 BMPR2-E376K를 발현하는 C3H10T1/2 세포에서 연골형성능을 검출하기 위해 알시안 블루 염색(Alcian blue staining) 결과를 나타내고 있다. 염색 정량은 600 nm에서 흡광도 측정을 통해 결정되었다.
도 2g는 공 벡터(EV), BMPR2-WT 또는 BMPR2-E376K를 발현하는 C3H10T1/2 세포로부터 얻어진 Col2a1, 아그레칸(Aggrecan) 및 Col10a1에 대한 실시간 PCR(real-time PCR)로 분석된 mRNA 발현 결과를 나타내고 있다.
도 3a 내지 3g는 BMPR2-E376K의 우성-음성 작용(dominant-negative functions)의 분자적 기초에 관련된 사진이다.
도 3a는 HA-표지된 BMPR2-E376K를 야생형(WT) V5-표지된 ACVR1로 공동면역침전(co-immunoprecipitation) 결과를 나타내고 있다.
도 3b는 p-SMAD1/5/9, p-SMAD2, ID1 및 ID3에 대한 웨스턴 블로팅으로 평가된, BMP 신호전달 강화에 있어 ACVR1-R206H 및 BMPR2-E376K의 상가효과를 나타내고 있다.
도 3c는 공 벡터(EV), V5-표지된 야생형(WT) 또는 BMPR2돌연변이(mut)를 발현하는 HEK293T 세포에서 액티빈 A(50 ng/ml) 처리로 SMAD1/5/9 및 SMAD2의 인산화가 증가된 결과를 나타내고 있다.
도 3d는 V5-표지된 야생형(WT) 또는 ACVR1 또는 BMPR2돌연변이(mut)를 발현하는 HEK293T 세포에서 SMAD2의 인산화에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내고 있다.
도 3e는 환자 유래 피부 섬유아세포에서 I형 수용체, ALK2 또는 ALK5에 대한 siRNA 존재하에 SMAD의 발현 및 인산화 결과를 나타내고 있다.
도 3f 및 3g는 BMP4, 도르소모르핀(DM) 또는 SB431542(SB)로 처리 및 미처리 시 HA-표지된 야생형(WT) 또는 BMPR2 돌연변이(mut)를 안정적으로 과발현하는 C2C12 세포주의 염색 결과를 나타내고 있다.
도 4a 내지 4c는 환자 유래 섬유아세포에서 CRISPR-Cas9으로 유도된 유전체 DNA 편집의 개략도이다. G에서 A로 과오 돌연변이(missense mutation) 자리에 일치하는 구역에서 BMPR2 exon 8을 표적하는 양성 가닥 sgRNA(single-guide RNA, 밝은 파란색 박스) 서열은 PAM(Protospacer Adjacent Motif, 어두운 파란색 박스)에 인접하여 설계되었다. RNA-guided Cas9에 의한 PAM으로부터 3번째 뉴클레오티드(빨간색 화살표 머리)의 정확한 절단은 BMPR2 돌연변이 대립유전자에서 이중 가닥 절단(double-strand breaks, DSB)을 유도한다. DSB는 두 개의 일반 수선 경로 중 하나에 의해 수선된다: 상동 인도 수선(homology directed repair, HDR) 및 비-상동 말단 결합(non-homologous end joining, NHEJ).
도 4a는 HDR이 녹인(knockin) 도너 주형(120 mer)을 이용하여 유사 돌연변이(CTC, 녹색 글자) 및 야생형 G 뉴클레오티드(파란색 글자)와 함께 특이적 단일 뉴클레오티드 변형을 생성함을 나타낸다.
도 4b는 NHEJ-매개 DSB 수선이 BMPR2 돌연변이 대립유전자의 DSB 자리에서 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 자주 유도하고, 아미노산 삽입, 결실 또는 구조이동 돌연변이(frameshift mutation)의 원인이 되어 BMPR2 유전자의 개방형 해독틀(open reading frame)에서 조기 정지 코돈에 이르게 함을 나타낸다.
도 4c는 BMPR2 돌연변이 대립유전자의 sgRNA로 유도된 딥 시퀀싱 리드(deep sequencing reads)의 패턴을 나타낸다. 딥 시퀀싱 리드의 풀(pool)로부터 HDR의 효율은 약 1.63%이었다. 총 리드의 Indels은 약 53.6%이었다.
도 5a 및 5b는 골 형성 분화 검출을 위한 염색 결과를 나타낸 사진이다. 정상, 환자 유래 세포 및 CRISPR-변형 세포(knock-out#3, #5 및 knock-in#203)의 중복 시료(#1, 2)를 2% 저혈청 배지에서 37℃, 5% CO2 및 3% O2 조건으로 5일간 배양하고, 조기 골 형성 분화에서 발현되는 알칼리성 포스파타아제 검출을 위한 ALP 염색을 수행하였고(도 5a), 정상, 환자 유래 세포 및 CRISPR-변형 세포를 BMP2 또는 BMP4(50 ng/ml) 없이 또는 함께 2% 저혈청 배지에 21일간 유지시키고, 지연 골 형성 분화에서 칼슘 침전을 감지하기 위해 알리자린 레드 S 염색을 수행하였다(도 5b).
도 6a 및 6b는 TGF-β 신호전달 표적 유전자의 mRNA 수준을 나타낸 그래프이다. FOP의 원인이 되는 변이에 의해 조절되는 TGF-β 신호전달의 mRNA 발현 패턴 분석을 위해, 공 벡터(EV), BMPR2 야생형 또는 BMPR2 E376K(이상 도 6a), EV, ACVR1 야생형 또는 ACVR1 R206H(이상 도 6b) 구조물을 일시적으로 HEK293T 세포에 형질도입시켰다. PAI-1, PDGFB 및 THBS-1를 포함한 TGF-β 표적 유전자의 발현 수준을 RT-qPCR로 측정하였다.
도 7a 및 7b는 BMPR2 E376K 변이에서 I형 또는 II형 TGF-β 수용체의 결실은 SMAD 활성 억제를 보이는 것을 나타낸 사진이다.
도 7a에서는 공 벡터, HA-BMPR2 야생형 또는 렌티바이러스 형질도입으로 확립된 HA-BMPR2 돌연변이를 안정적으로 발현하는 HeLa 및 U2OS 세포를 역방향 또는 정방향 형질주입 방법을 이용하여 BMPR2에 대한 siRNA로 처리하였다. 세포 용해물로부터 SMAD1/5/9 인산화의 단백질 발현을 웨스턴 블로팅으로 측정하였다. 별 표시는 교차-반응 밴드를 나타낸다.
도 7B에서는 BMPR2 E376K 변이를 발현하는 HeLa 및 HEK293T 세포를 I형 수용체인 ACVR1(ALK2) 또는 TGFBR1(ALK5)에 대한 siRNA로 형질주입시키고, SMAD1/5/9 및 SMAD2의 인산화를 웨스턴 블로팅으로 검출하였다.
도 8a 및 8b는 C2C12 세포에서 BMPR2 E376K에 의해 신호 과활성된 BMP/SMAD의 골 형성 분화능을 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 8a에서는 공 벡터, HA-BMPR2 야생형 또는 렌티바이러스 형질도입에 의한 HA-BMPR2 구조물을 안정적으로 발현하는 C2C12 세포로서, 웨스턴 블로팅을 이용하여 SMAD1/5/9 및 SMAD2의 인산화에 대한 단백질 발현이 관찰되고, 도 8b에서는 C2C12 세포로부터 골아세포(osteoblasts)를 구분하기 위해 37℃ 및 5% CO2 조건으로 BMP2 또는 BMP4(50 ng/ml) 없이 또는 함께 세포를 배양하고, 5일 후 ALP 염색을 수행하였다. ALP 활성 정량을 위해 골 형성 분화세포로부터 용해물(lysates)을 0.67 M pNPP 용액에서 37℃에서 30분간 배양하고, 반응 후 405 nm 흡광도에서 분석하였다.
도 9는 FOP의 원인이 되는 돌연변이 세포에서 액티빈 A에 의한 SMAD 인산화의 단백질 수준을 나타낸 사진이다. 공 벡터, V5-ACVR1 야생형 또는 V5-ACVR1 R206H를 과발현하는 HEK293T 세포를 액티빈 A(50 ng/ml)로 5분간 처리하고, 웨스턴 블로팅을 통해 SMAD1/5/9 및 SMAD2의 인산화를 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
진행성 골화성 섬유이형성증(Fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP)은 연한 결합 조직에서의 점진적 이소성 골화(progressive heterotopic ossification)가 특징인 흔치 않은 상염색체 우성 유전 골 질환(autosomal dominant skeletal disorder)이다. 지금까지 FOP 임상 특징을 나타내는 모든 환자는 ACVR1(activin A type I receptor) 유전자에 이형접합 기능획득 돌연변이(heterozygous gain-of-function mutations)를 가지는 것으로 확인되었다.
이에 대하여 본 발명에서는 FOP 유사 표현형을 갖는 환자에서 BMPR2(bone morphogenetic protein type 2 receptor)를 코딩하는 BMPR2 유전자에서의 기능획득 돌연변이를 제시한다.
한 16세 남성은 3세 때 두피에 피하 유주성 결절(subcutaneous migrating nodules)이 있었고, 6세 때부터 시작하여 목과 등으로부터 사지에 이르기까지 일련의 플레어-업(flare-ups)이 나타나 연조직 골화로 이어졌다. 전장 엑솜 시퀀싱(Whole exome sequencing)을 통해 BMPR2의 이형접합 신규 돌연변이(heterozygous de novo mutation)(c.1126G>A, p.E376K)로 밝혀졌고, 이는 BMPR2의 고도로 보존된 키나아제 영역에 위치하였다. BMP 신호전달의 항시적(Constitutive) 활성화는 환자 유래 피부 섬유아세포에서 검출되었고, 이는 CRISPR/Cas9 매개 BMPR2 침묵화(silencing)로 억제되었다. 일관하여 다른 세포주에서의 BMPR2-E376K 돌연변이 이소성 발현은 BMP 리간드가 없음에도 SMAD1/5/9 인산화(phosphorylation)를 유도한다. 세포학적 레벨에서 환자 유래 세포는 알칼리성 포스파타아제 발현 및 칼슘 축적에 양성이고, 두 가지 모두 BMP 신호전달 억제제인 도르소모르핀(dorsomorphin) 처리로 억제되었다. 이는 항시적으로 활성화된 ACVR1 돌연변이와 같이, BMPR2-E376K 돌연변이가 점진적 이소성 골화의 표현형을 유발한 것을 나타낸다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
FOP 사례
한 16세 남자가 충치 치료 후 좌측 가슴 부위의 플레어-업(flare-ups)을 보여주었다. 그 환자는 건강한 한국 부부 사이에 정상적인 임신 만기로 출생하였다. 출생 시 체중은 2.98 kg이었고, 어떠한 출산 전후의 문제도 없었다. 운동과 인지 발달은 정상 범위에 있었다. 2세 때 두피에, 4세 때 목 뒤에 피하 유주성 결절(subcutaneous migrating nodules)이 나타났다. 6세 때부터는 목과 등에 플레어-업(flare-ups)과 경직(stiffness)이 나타났고, 그 이후 사지에 나타났다. 신체검사를 통해 목, 등 및 우측 어깨가 완전 경직된 것으로 드러났다. 좌측 상체 및 우측 하체는 관절 운동의 기능적 범위를 유지하였다. 다리와 발가락은 정상으로 나타났다.
22세 때 환자는 키 145 cm(z < -4), 체중은 57 kg이었다. 목과 등 전체, 양쪽 어깨, 엉덩이와 좌측 무릎은 완전 고정(fixed)되었다. 양쪽 팔꿈치는 10 내지 30˚로 유지되어 굴신운동이 가능하였고, 우측 무릎은 80˚의 운동을 유지하였다. 방사선 검사에서 등 근육, 견갑골 주위 근육, 신우 주위 및 넓적다리 근육에 이소성 골화를 보였다(도 1a 참조). 상부경추(upper cervical vertebrae) 후주(posterior column)의 관절경직(ankylosis) 또한 주목되었다. 발가락에 이상이 없는 것은 주목할 만하였다(도 1a 참조). 환자는 유년기에 유문협착 개복술로(laparotomy for pyloric stenosis)부터 무사히 회복되었다. 19세 때 환자는 심한 현기증을 보였다. 뇌 MRI를 통해 안상 부위(suprasellar　area), 투명중격(septum pellucidum) 및 숨뇌(medulla oblongata)에 관련된 다초점 가돌리늄-강화 종양(multifocal gadolinium-enhanced tumors)이 드러났다. 혈청 베타-hCG 레벨이 서서히 증가하였기 때문에 임상-방사선학적으로 배아세포종(germ cell tumors)으로 진단되었다. 방사선 치료 후 종양이 사라졌고 환자는 후유증으로 요붕증(diabetes insipidus)을 가지고 3년간 완치 상태를 유지하였다.
실험 방법
서면동의 후 환자, 형제 및 그 부모로부터 유전체 DNA를, 환자로부터 피부 섬유아세포를 얻었다. 서울대학교 병원(서울, 한국)의 임상시험심사위원회에서 이 연구를 승인하였다.
(1) 세포 배양, DNA 제작, 돌연변이 유발 및 FOP 세포주 확립
환자 유래 피부 섬유아세포 및 BJ(정상) 세포는 15% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS, GIBCO), 글루타맥스(GlutamaxTM, GIBCO, Cat#35050-061), 비-필수 아미노산(non-essential amino acid, GIBCO, Cat#11140-050), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin, GIBCO, 15140-122)으로 보충된 고-글루코오스(high-glucose) 및 글루타민 비함유(no-glutamine) DMEM(GIBCO, Cat#10313)에서 생장되었다. 섬유아세포는 37℃에서 5% CO2 및 3% O2 조건으로 배양되었다. BJ 포피 섬유아세포는 ATCC로부터 얻었다. HEK293T, HeLa 및 U2OS 세포는 10% FBS(GIBCO), 1X 페니실린 및 스트렙토마이신(GIBCO, Cat#15140-122)으로 보충된 고-글루코오스 DMEM(GIBCO, Cat#11965)에서 생장되었고, 37℃에서 5% CO2 조건으로 배양되었다. C2C12 근원세포는 15% FBS, 1X 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 고-글루코오스, 글루타민 및 피루브산 나트륨 DMEM(GIBCO, Cat#11995)으로 37℃에서 5% CO2의 습한 분위기에서 배양되었다. 미분화 C2C12 세포는 세포 접촉에 의한 근발생 방지를 위해 폴리스티렌 세포 배양 디쉬에서 성기게 유지되었다. C3H10T1/2 섬유아세포는 10% FBS, 1X 페니실린 및 스트렙토마이신으로 보충된 고-글루코오스, 글루타민 및 피루브산 나트륨 DMEM(GIBCO, Cat#11995)으로 37℃에서 5% CO2 조건으로 배양되었다. 주요 환자 유래 섬유아세포 및 BJ 세포는 렌티바이러스 형질도입을 통해 인간 텔로머라아제(human telomerase, hTERT)의 촉매소단위(catalytic subunit) 발현으로 불멸화되었고, 레트로바이러스 형질도입(retroviral transduction)을 통해 인간 유두종(papilloma) 바이러스 E6 및 E7 단백질에 의해 형질전환되었다. BMPR2 cDNA는 addgene으로부터 얻었다. BMPR2 cDNA는 In-Fusion HD Cloning kits(Takara, Cat#638920)를 이용하여 pcDNA6/V5-HisABC 벡터에서, Gateway cloning system(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 pDONR223 BP 벡터 및 이후 pHAGE-HA-FLAG LR 벡터에서 EcoRI 제한 자리로 클론되었다. C.1126G>A BMPR2 돌연변이는 하기 프라이머 세트를 이용하여 QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Genomics)에 의해 생성되었다; BMPR2-F(서열번호 1) : 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGACTTCCTCGCTGCAGCGGC-3', BMPR2-R(서열번호 2) : 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACAGACAGTTCATTCC-3'. BMPR2 또는 BMPR2 돌연변이를 안정적으로 발현하는 세포주는 이전에 기술된 렌티바이러스 형질도입(비특허문헌 26 참조)에 의해 생성되었다.
(2) 골 형성 분화(Osteogenic differentiation)
BJ 및 환자 유래 피부 섬유아세포(8x104 cells/well)를 24-웰 세포 배양 플레이트에 분주하고, 15% FBS, 1% 글루타맥스, 1% 비-필수 아미노산 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 DMEM에서 37℃에서 5% CO2 및 3% O2 조건으로 배양하였다. 분화 유도를 위해 세포 밀집도가 80 내지 90%에 이르게 한 후, 생장 배지를 2% 말혈청(GIBCO, Cat#16050)으로 보충된 DMEM으로 대체하였다. 세포를 재조합 인간 BMP2 또는 BMP4(R&D SYSTEMS) 없이 또는 함께 유지시키고, 2 내지 21일간 2 내지 3일 주기로 신선한 배지로 대체하였다. C2C12 세포를 4x104 cells/well 농도로 24-웰 세포 배양 플레이트에 분주하였다. 세포는 15% FBS로 보충된 DMEM(GIBCO, Cat#11995)으로 37℃에서 5% CO2 조건으로 생장되었다. 밀집도가 80 내지 90%인 세포는 2% 말혈청으로 보충되고, 100 nM 덱사메타손(dexamethasone), 10 mM β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) 및 50 μM 아스코르브산-2-인산염(ascorbic acid-2-phosphate)(이상 Sigma)을 함유한 골 형성 분화 DMEM(GIBCO, Cat#11995)으로 대체되었다. C2C12를 BMP2, BMP4, 도르소모르핀(Sigma) 또는 SB431542(Sigma)로 처리하고, 2 내지 21일간 2 내지 3일 주기로 신선한 배지로 대체하여 유지시켰다.
(3) 연골세포 분화(Chondrogenic differentiation)
연골 형성을 위해 C3H10T1/2 세포를 마이크로매스 기술(micromass technique)인 고농도 도트 배양(high density dot culture)으로 배양하였다. 먼저 세포를 10% FBS 및 1X 페니실린으로 보충된 DMEM에서107 cells/ml 농도로 재부유시키고, 12-웰 세포 배양 플레이트의 웰 중앙에 세포 부유액을 10 μl 적하하고, 37℃에서 5% CO2 조건으로 배양하였다. 2시간 후, 1% FBS, 1% 인슐린-트랜스페린-셀레니움(Insulin-Transferrin-Selenium, GIBCO), 0.1 μM 덱사메타손, 0.17 mM 아스코르브산-2-인산염, 0.35 mM 프롤린(proline, Sigma) 및 0.15% 글루코오스(Sigma)로 구성된 연골세포 분화 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포를 인간 재조합 BMP2 없이 또는 함께 유지시켰다.
(4) 전장 엑솜 시퀀싱 및 DNA 분석
환자로부터 서면동의를 받고, 서울대학교 병원(서울, 한국)의 임상시험심사위원회에서 이 연구를 승인하였다. 유전체 DNAs를 혈액에서 추출하였고, Twist modular library preparation kits를 이용하여 라이브러리 시퀀싱을 준비하였다. 모든 엑손 영역을 포함하는 SureSelect Human All Exon V5 baits(Agilent, Santa Clara, CA)를 이용하였다. 표적 시퀀싱은 101 base pair (bp) paired-end reads on an Illumina HiSeq2500 platform(Illumina, San Diego, CA)으로 수행되었다. 시퀀싱된 리드(reads)는 MEM 알고리즘(Maximum Entropy Method algorithm)이 적용된 BWA(Burrows-Wheeler Aligner version 0.7.5a)를 이용하여 인간 게놈 참조 서열(hg19)에 대해 정렬되었다. 동시에 30 초과의 프레드 스코어(phred quality score)로 선별된 정렬된 리드는 BAM(binary alignment map) 포맷으로 전환되어 SAMTOOLS(version 1.2)를 이용하여 게놈 위치(genomic position)로 정렬하였다. 고성능의 정확한 변이를 추출하기 위해, i) PCR 중복 리드는 MarkDuplicates of Picard tools(version 1.127, http://broadinstitute.github.io/picard/)를 이용하여 표지되었고, ii) 삽입 및 결실(Indel) 재정렬은 GATK(Genome Analysis Tool Kit, version 3.1-1)의 RealignerTargetCreator 및 IndelRealigner를 이용하여 알려진 Indels(Mills)로 수행되었다. iii) 염기 스코어(base quality score)는 GATK의 BaseRecalibrator 및 PrinReads에 의해, 알려진 SNPs(single nucleotide polymorphisms) 및 Indels(dbSNP138, Mills and 1000 Genome Project phase I)로 모델링된 머신 러닝 모델을 이용하여 재보정되었다. 처리된 BAMs는 동시에 추출되어 SNVs(single nucleotide variants)로 유전형 분석(genotyped)되었고, GATK UnifiedGenotyper에 의한 Indels는 Bayesian genotype likelihood model을 사용한다. 변이는 GATK VariantRecalibrator 및 ApplyRecalibration를 사용하는 dbSNP138, Mills Indels, HapMap 및 Omni와 같은 참조 변이로 재보정되었다. 변이는 다음의 ANNOVAR를 사용하여 다양한 정보를 표시하였다: i) 1000 genome phase III, ExAC 및 KRGDB와 같은 인구 데이터베이스(population database)(http://coda.nih.go.kr/coda/KRGDB/), ii) OMIM 과 같은 질병 데이터베이스, RefSeqGene과 같은 시퀀싱 데이터베이스, iii) ACMG 가이드라인에 따른 변이의 설명 및 분류를 위한 FATHMM, MutationAssessor, MutationTaster, SIFT, Polyphen, GERP 및 Phylop와 같은 인 실리코(in silico) 예측 알고리즘. 분류된 병원성 또는 유사 병원성 변이는 생어 시퀀싱으로 확인되었다. CNVs(Copy number variants)는 자체 상대 비교 방법으로 표적 영역에 정렬된 리드 수를 사용하여 계산되었다. 검출 및 분류된 병원성 CNVs는 array CGH(array comparative genomic hybridization)로 재확인되었다(비특허문헌 27 내지 31 참조).
(5) CRISPR-Cas9 매개 유전자 수정
10 μM의 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN) 도너 주형과 함께, 4 μg의 S.pyogenes Cas9(SpCas9) 단백질 및 FOP 환자의 돌연변이 대립유전자를 선택적으로 표적하는 1 μg의 가이드 RNA를 RNP 복합체(ribonucleoprotein complex)로 준비하고, 전기천공기(Neon electroporator, Invitrogen)로 환자로부터 얻은 섬유아세포로 전달하였다. CRISPR-Cas9에 대한 표적 서열(서열번호 3)은 다음과 같다; 5'-agataatgcagccataagcaagg-3'(PAM sequence:밑줄). 야생형과 수정된 대립유전자를 구분하고, 반복 분열을 방지하기 위해 도너 주형(서열번호 4)을 다음과 같이 설계하였다; 5'- ccatgaggctgactggaaatagactggtgcgcccaggggaggaagataatgcagccatCTCc g aggtgagtgtatacaaaaggtatcacactgatgtactttgaaatgataatttaatta (대문자 밑줄: codon matched sense mutation, 이탤릭체 밑줄: corrected base). 전기천공 1주일 후, 혼주된(pooled) 섬유아세포로부터 적절히 수정된 대립유전자 빈도를 표적 딥 시퀀싱(targeted deep sequencing)으로 분석하였다. 빈도에 기초하여 세포를 분리하고, 단일 세포 콜로니를 얻기 위해 웰 당 1/3 세포 농도로 96-웰 플레이트에 재분주하였다. 단일 세포 콜로니 분리 후 각 클론의 gDNAs를 수집하고 표적 딥 시퀀싱으로 분석하였고, 이후 실험에 사용할 적절한 콜로니를 선택하였다.
(6) 표적 딥 시퀀싱(Targeted deep sequencing)
CRISPR-Cas9 처리 후 Indel 비율 정량 및 서열 분석을 위해 표적 영역을 네스티드 PCR(nested PCR)에 의해 표적 증폭물 서열(target amplicon sequences)을 일루미나 바코드 서열(illumina barcode sequences)로 하이브리드화한 PCR 프라이머로 증폭하였다. PCR 산물을 정제, NaOH로 변성 및 Illumina MiSeq로 2x250 페어드-엔드 시퀀싱(paired-end sequencing)되었다. MiSeq로부터의 페어드-엔드 리드는 Cas-Analyzer로 분석되었다(http://www.rgenome.com). 실험에 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같다; hBMPR2 E7 F1(서열번호 5) : 5'- gcctccttttacagccctat-3', hBMPR2 E7 R1(서열번호 6) : 5'- aactttacccttgcctcaaa-3', hBMPR2 E7 dF1(서열번호 7) : 5'- ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTacagcagaaatgtcctag, hBMPR2 E7 dR1(서열번호 8) : 5'- GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTctctttaccttaggtgat.
(7) 짧은 간섭 RNA(Small interfering RNA, siRNA)
siRNAs를 세포에 2회 형질주입시켰다. Lipofectamine RNAiMAX reagent(Invitrogen)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 먼저 역방향 형질주입(reverse transfection)을 하고 24시간 후 정방향 형질주입을 하였다. ACVR1(ID#s974, s976), TGFBR1(ID#s14071, s14073) 및 BMPR2(ID#s2044, s2045, s2046) siRNAs를 Thermo Fisher Scientific으로부터 구입하였다. 2 내지 3개의 siRNAs 풀로서 최종 25 nM 농도의 siRNA가 사용되었다.
(8) 루시페라제 리포터 분석(Luciferase reporter assay)
293T 세포를 플레이트(Falcon® 96-well white flat bottom tissue culture-treated microtest assay microplate(CORNING))에 분주하였다. 각 웰에서 100 μl의 10% DMEM 배지에 5,000 세포가 분주되었다. 분주 24시간 후 형질주입 키트(calcium phosphate transfection Kit(Invitrogen))를 이용하여 분석을 위해 세포를 pcDNA-공 벡터, pcDNA6/V5-HisA-야생형 BMPR2 또는 -돌연변이 BMPR2, pGL3-BMP 반응성 요소-루시페라제(responsive elements-luciferase(이하 'pGL3-BRE-luc'라 함, addgene(plasmid #45126)으로부터 제공) 및 pNL1.1.TK 내부 대조군 벡터(internal control vector)로 형질주입시켰다. Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay Kit(Promega)에서 야생형 또는 돌연변이 BMPR2, pGL3-BRE-luc 및 pNL1.1의 양은 Clontech Laboratories의 칼슘 포스페이트 형질주입(calcium phosphate transfection) 프로토콜에 따라 측정되었다; 50ng의 야생형 BMPR2 또는 돌연변이 BMPR2, pGL3-BRE-luc 및 5ng의 pNL1.1.TK를 사용하고, 2M 칼슘 용액 및 멸균수를 각 DNA 튜브에 첨가하였다. 동량의 2X HBS(HEPES-Buffered Saline)를 칼슘-DNA 혼합물에 떨어뜨려 상온에서 배양하였다. 15분 후 형질주입 용액을 배양 플레이트 배지에 첨가하여 37℃의 CO2 배양기에서 유지시켰다. 익일 칼슘 포스페이트 함유 배지를 세포로부터 제거하고 신선한 완전 생장 배지로 대체하였다. 각 웰에 배양 배지 부피와 동일한 양으로 분석 시약(One-GloTM EX Luciferase assay Reagent)을 첨가하고, 3분간 300 rpm의 회전 진탕기(orbital shaker)에 두었다. GloMax® Discover System(Promega)으로 1초의 노출 시간(integration times)으로 발광을 측정하였다. NanoLuc® 루시페라제 활성 측정에 있어, 원래의 배양 배지 부피와 동량의 NanoDLRTM Stop & Glo® Reagent를 각 웰에 첨가하고 발광을 분석하였다. BRE 리포터 발광은 NanoLuc® 루시페라제 활성으로 정규화되었다.
(9) 웨스턴 블로팅 및 면역침강반응(Western blotting and Immunoprecipitation)
세포를 70% 밀집도로 60 mm 또는 100 mm 플레이트에 분주하였다. 익일 플라스미드 DNA를 Lipofectamine 2000으로 HEK293T 세포에 형질주입시켰다. 4시간 후 세포를 무혈청 배지로 대체하고, 익일 인간 재조합 액티빈 A(R&D SYSTEMS)를 처리하였다. 세포를 수집하고 프로테아제 저해 혼합물(protease inhibitor cocktail, Roche)을 함유한 완충액(lysis buffer, 50 mM Tris-HCl pH7.5, 150 mM NaCl 및 0.5% Nonidet P-40)으로 용해시키고, Protein Assay Dye Reagent Concentrate(Bio-Rad) 및 NanoDrop(Thermo Fisher Scientific)으로 정량하였다. 단백질을 8~15% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하고, 겔을 0.45 μm 공극 크기의 PVDF(polyvinylidene difluoride) 트랜스퍼 멤브레인(Merck Millipore)에 블로팅하였다. 블롯을 5% DifcoTM Skim Milk(BD)를 함유한 0.1% Tween-20(Sigma)이 첨가된 1X PBS으로 상온에서 1시간 블로킹하고, anti-V5-Tag(Invitrogen, #R960-25), anti-phospho-SMAD1/5/9(Cell Signaling Technology, #13820), anti-SMAD1(CST, #6944), anti-SMAD5(CST, #12534), anti-phospho-SMAD2(CST, #3108), anti-SMAD2(CST, #5339), anti-SMAD4(CST, #9515), anti-ID1(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, sc-488), anti-ID3(SCBT, sc-490), anti-HA(Covance, MMS-101R), anti-SOX9(CST, #82630), anti-BMPR2(CST, #6979), anti-Osteocalcin(Merck Millipore, AB10911), anti-Alkaline Phosphatase(abcam, ab108337), anti-RUNX2(SCBT, sc-10758) 및 anti-GAPDH(SCBT, sc-25778)로 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 블롯을 상온에서 1시간 1X PBST에서 4회 세척 후, 항-마우스 2차(anti-mouse secondary, Jackson ImmunoResearch, 115-035-003) 또는 항-래빗 2차(anti-rabbit secondary, Jackson ImmunoResearch, 111-035-003)를 1:2500으로 상온에서 2시간 사용하였고, ChemiDoc System(Bio-Rad)을 이용하여 강화 화학발광 용액(enhanced chemiluminescence solution, Bio-Rad)으로 밴드를 검출하였다. 밴드 이미지는 Image LabTM Software(Version 5.2.1, Bio-Rad)로 분석되었다.
면역침강반응을 위해 일시적으로 형질주입된 HEK293T 세포를 4℃ 완충액에서 용해 및 음파처리(sonicated) 하였다. 조 용해물을 4℃에서 20분간 15,000 rpm으로 원심분리하여 투명하게 하였다. 상등액을 Monoclonal Anti-HA-Agarose antibody(Sigma)로 4℃에서 2시간 배양하였다. 면역복합체(Immunocomplex)를 완충액으로 5회 세척하고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 수행하였다.
(10) 실시간 정량 역전사 PCR(Real-time quantitative reverse transcription PCR)
세포의 총 RNA를 RNeasy Mini Kit 및 QIAshredder(QIAGEN)를 이용하여 추출하고, NanoDrop 기기를 이용하여 정량하였다. 1 μg의 총 RNA를 SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen)을 이용하여 cDNA 합성에 사용하였다. 유전자 발현은LightCycler® 96(Roche)에서 수행되어 2X qPCRBIO SyGreen Blue Mix Lo-ROX(PCRBIOSYSTEMS)로 정량되었다. 시료의 Cq(Quantification cycle) 값은 LightCycler® 96 Application Software(Version 1.1)로 분석되었다. 유전자 특이적 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.
sample Sequence 5' → 3' 비고
mCol2a1 sense CCTCCGTCTACTGTCCACTGA 서열번호 9
antisense ATTGGAGCCCTGGATGAGCA 서열번호 10
mCol10a1 sense AACAGGTATGCCCGTGTCTG 서열번호 11
antisense TCATCAAATGGGATGGGGGC 서열번호 12
mAggrecan sense TGGCTTCTGGAGACAGGACT 서열번호 13
antisense TTCTGCTGTCTGGGTCTCCT 서열번호 14
mGapdh sense CATGTTCCAGTATGACTCCACTC 서열번호 15
antisense GGCCTCACCCCATTTGATGT 서열번호 16
hPAI-1 sense TCCTGGTTCTGCCCAAGTT 서열번호 17
antisense CCAGGTTCTCTAGGGGCTTC 서열번호 18
hPDGFB sense CTGGCATGCAAGTGTGAGAC 서열번호 19
antisense CGAATGGTCACCCGAGTTT 서열번호 20
hTHBS-1 sense CAATGCCACAGTTCCTGATG 서열번호 21
antisense TGGAGACCAGCCATCGTC 서열번호 22
hGAPDH sense AGCCACATCGCTCAGACAC 서열번호 23
antisense GCCCAATACGACCAAATCC 서열번호 24
(11) 알리자린 S 염색(Alizarin S staining, Mineralization assay)
광화(mineralization)는 골 형성 분화 21일 후 알리자린 레드 S 염색으로 결정되었다. 용액 준비를 위해 2 g의 Alizarin Red S(Sigma)를 100 ml 증류수에 용해시키고, HCl 또는 NH4OH로 pH4.3으로 조절하였다. 분화된 세포를 PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, Sigma)로 고정하였다. 30분 후 세포를 증류수로 세척하고 준비된 염색 용액을 암실 상온에서 45분간 세포에 첨가하였다. 세포를 증류수로 4회 세척하고 흡입시켰다. 분화된 세포는 칼슘 침전물로 더 붉게 염색된다. 디지털 카메라(Nikon)를 사용하여 촬영 후 염색된 세포를 10 mM 인산나트륨 완충액(1 M NaH2PO4 monobasic 및 1 M Na2HPO4 dibasic, pH7.0)에 용해된 10% cetylpyridinium chloride(sigma)로 용해시키고, GloMax® Discover System을 이용하여 560 nm에서 정량되었다.
(12) 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP) 염색 및 활성
알칼리성 포스파타아제 검출을 위해 세포를 먼저 2일 또는 3일간 골 형성 분화 배지로 배양시켰다. 세포를 PBS로 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 1분 후 세포를 세척 완충액(Washing Buffer, 0.05% Tween 20 in PBS)으로 헹구고, 이어서 10 ml 증류수에 1개의 BCIP/NBT 정제(Sigma)가 녹여진 기질 용액으로 처리하였다. 염색을 위해 세포를 상온 암실에서 2 내지 3분 주기로 모니터링하면서 10분간 배양시켰다. 기질 용액을 흡입하고 세포를 세척 완충액으로 헹구었다. 알칼리성 포스파타아제가 높을수록 어두운 블루-바이올렛이 심해진다. ALP 활성을 위해 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 차가운 알칼리성 포스파타아제 반응 완충액(1 M Diethanolamine 및 0.5 mM Magnesium Chloride, pH9.8, Sigma)으로 용해시켰다. 용해물을 0.67 M pNPP(p-Nitrophenyl Phosphate) 용액(Sigma)에서 37℃에서 30분간 배양하고, 반응을 계속하면서 405 nm에서 흡광도를 모니터링하였다. Micro-BCA protein assay kit(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 총 단백질을 측정하고 GloMax® 기기를 이용하여 560 nm에서 측정하였다. 효소적 ALP 활성은 시료의 단백질 함량으로 정규화되었다.
(13) 알시안 블루 염색(Alcian blue staining)
연골형성능을 시각화하기 위해 염색 용액(pH 1.0)을 0.1 M HCl 100 ml에 1 g의 Alcian blue 8GX(Sigma)으로 준비하였다. 세포를 PBS에 4% 파라포름알데히드로 상온에서 20분간 고정하고, PBS로 3회 헹구었다. 염색을 위해 상온 암실에서 알시안 블루 용액이 사용되었다. 익일 세포를 0.1 M HCl로 1회 및 PBS로 2회 세척하였다. 사진 촬영 후 염료를 상온에서 2시간 Guanidine-HCl(Sigma)로 추출하고, GloMax® 기기를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험 결과
환자의 임상적 특징은 엄지 발가락 이상이 없는 것을 제외하고는 FOP와 일치하였다(도 1a 참조). 환자의 ACVR1(MIM #102576) 코딩 영역에 대한 전체 시퀀싱 결과 두 개의 침묵 서열 변이(silent sequence variations)를 보였고, 이 둘 모두 이전의 normal population에서 c.270C>T(NCBI dbSNP rs2227861) 및 c.690G>A(rs1146031)로 보고되었다. 이후 유전체 DNA에 대하여 전장 엑솜 시퀀싱을 수행하였고, BMPR2(MIM #600799)에서 이형접합 변이, c.1126G>A(p.E376K)를 발굴하였다. 생어 시퀀싱(Sanger sequencing)과 제한 효소 절단(restriction enzyme digestion)으로 환자의 시퀀스 변이와, 부모 및 형제 유전체에서의 변이 부재를 확인하였다(도 1b 내지 1c 참조). BMPR2-E376K 돌연변이는 키나아제 영역에 위치하였고(도 1d 참조)(비특허문헌 13 참조), 그 서열은 종 사이에 고도로 보존되었다(도 1e 참조). BMPR2 서열 변이는 1000개 유전체의 일반인(general populations of the 1000 genome), ExAC, dbSNP 또는 Exome Sequencing Project 데이터베이스에서는 발견되지 않았다.
질병 표현형의 분자적 기초를 이해하기 위해 환자와 정상군의 피부 섬유아세포로부터 준비된 용해물을 면역블로팅(immunoblotting)하여 BMPR2 단백질 변화를 확인하였다. 도 1f에 나타낸 바와 같이, 환자 유래 세포의 용해물은 SMAD1/5/9의 항시적 인산화를 보였고, 그 결과 ID1 및 ID3 발현을 증가시켰으나, 정상 BJ 대조 세포(normal BJ control cells)로부터 준비된 용해물에서는 그렇지 않았다. 흥미롭게도 SMAD2 또한 이들 세포에서 인산화되었다. 또한 분별 배지(differentiation media)에서 배양된 환자 유래 세포는 BMP 처리가 없음에도 오스테오칼신(osteocalcin, OCN), 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase, ALP) 및 RUNX2(Runt-related transcription factor 2)를 포함하는 골 성장의 원인이 되는 한 그룹의 단백질(비특허문헌 14 참조)을 발현하였다(도 1f 우측 패널 참조). 이러한 분자적 변화는 세포 수준에서 반영되었다. ALP 발현은 골 성장의 분자 마커로 알려져 있다(비특허문헌 15 참조). 예상한대로 환자 유래 세포는 ALP 염색과 ALP 활성에 양성을 나타낸 반면, 정상 대조 세포는 ALP가 거의 발현되지 않았다(도 1g 참조). 더욱이 환자 유래 세포 배양에서 칼슘이 축적된 것을 알았으며, 이는 배양 21일 후 알리자린 레드 S 염색(alizarin red S staining)으로부터 확인되었다(도 1h 참조)(비특허문헌 16 참조). 종합하면 이러한 결과로부터 BMPR2-E376K 변이는 BMP 처리가 없음에도 항시적으로 BMP 신호전달을 활성화시킨다는 점을 강하게 시사한다.
잠재적 원인이 되는 돌연변이의 병원성(pathogenicity)에 대한 기능적 검증은 매우 중요하다. DNA 서열 분석을 통해 BMPR2-E376K 변이가 기능적으로 우성임을 제시하였고, 따라서 돌연변이 BMPR2 대립유전자를 제거하면 과활성화된 BMP 신호전달이 정상화될 것이라 가설을 세웠다. 이 때문에 먼저 환자 유래 세포에서 CRISPR-Cas9을 이용하여 돌연변이 BMPR2 대립유전자를 제거하였다. 이와 동시에 CRISPR-Cas9 녹-인(knock-in) 방법을 이용하여 c.1126G>A 변이를 야생형 서열로 되돌렸다. 다수의 단일 클론을 분리하고, MiSeq 시스템을 이용하여 각 클론에서 BMPR2 유전자 서열을 확인하였다(도 2a 및 도 4 참조). 녹-아웃 및 녹-인 클론 모두 SMAD1/5/9 인산화(도 2b 참조), ALP 염색 및 칼슘 퇴적(도 5 참조)이 상실된 것을 알았고, 이는 BMPR2-E376K 변이가 항시적 BMP 활성화 및 그에 따른 결과에 원인이 됨을 보여준다.
다음으로, 본 발명자들은 다른 종류의 세포에서 BMPR2-E376K 변이의 이소성 발현으로 기능적으로 우성인 유전체 변이의 발현에 의해 분자 및 세포 변화가 재현될 것이라 판단하였다. 이를 평가하기 위해 HEK293T 세포에서 공 벡터, 야생형 BMPR2 또는 BMPR2-E376K를 각각 발현하였고(도 2c 참조), BMPR2-E376K 발현만이 SMAD1/5/9 과인산화와 ID1 및 ID3 발현으로 이어지는 것을 확인하였다. 또한 BMPR2-E376K 발현으로 인한 강화된 BMP 신호전달이 BMP 응답 유전자 발현(response gene expression)으로 이어지는 것인지 평가하기 위해 루시페라제(luciferase) 발현이 BMP-반응성 요소(BMP-responsive elements)에 의해 조절되는 전사 리포터 분석 시스템(transcriptional reporter assay system)을 확립하였다(비특허문헌 7 참조). 예상한대로 HEK293T 세포에서 BMPR2-E376K 발현으로 루시페라제 활성이 상당히 증가된 것을 확인하였다(도 2d 참조). 동일한 실험 설계에서, HEK293T 세포에서 알려진 원인이 되는 ACVR1-R206H 돌연변이 발현 시 유사한 결과를 얻었다(도 2c 내지 2d, 우측 패널 참조). 종합하면 이러한 결과로부터 BMPR2-E376K 돌연변이에 우성의 기능획득 특징이 있음을 시사한다.
FOP 병변에서 연골내 이소성 골화는 강화된 BMP 신호전달로 인해 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)로부터 연골 분화(chondrogenic differentiation)를 수반하고, 이후 성숙한 골 조직으로 변하게 된다(비특허문헌 14 참조). BMPR2-E376K 돌연변이가 BMP 리간드 없이도 BMP 신호를 자극함에 따라, BMPR2-E376K 변이가 MSCs를 연골세포(chondrocytes)가 되도록 하는 것이라는 가설을 세웠다. 이 가설을 평가하기 위해 마우스 세포주 C3H10T1/2에서 공 벡터, 야생형 BMPR2 또는 BMPR2-E376K를 각각 발현하였다. 도 2e에 나타낸 바와 같이, BMPR2-E376K의 시간적 발현(temporal expression)이 SMAD1/5/9의 인산화와, ID1, ID3 및 SOX9을 포함한 그 하위 작동자(downstream effector)의 발현으로 이어지는 것을 확인하였다. 또한 알시안 블루 염색(Alcian blue staining)에 기초하여 BMPR2-E376K를 발현하는 C3H10T1/2 세포가 연골세포로 되는 것을 확인하였다(도 2f 참조). 실제, BMPR2-E376K 돌연변이의 발현이 COL2A1, COL10A1 및 아그레칸(Aggrecan)의 발현 증가를 보였고, 이들 모두 골아세포(osteoblasts)에서 고발현되었다(도 2g 참조)(비특허문헌 17 참조). 전적으로 이러한 결과는 BMPR2-E376K가 FOP 표현형에 원인이 되고, 전형적인 기능획득 돌연변이임을 시사한다.
BMP 신호전달은 BMP 리간드 존재하에 활성화되고, I형 및 II형 수용체를 참여하게 한다. 다른 세포 수용체 시스템에서도 마찬가지이고, 다른 수용체에서의 기능획득 돌연변이는 수용체 파트너의 강제적 연관을 유발하여 항시적 신호 전달을 초래하는 것으로 보고되었다. 기능획득 BMPR2-E376K 돌연변이의 분자적 결과를 이해하고자 BMPR2-E376K 돌연변이가 BMP 리간드 없이 ACVR1과 관련되는지 평가하였다. 이를 위해 야생형 또는 돌연변이 HA-표지된 BMPR2 각각과 함께 V5-표지된 ACVR1을 일시적으로 발현하였다. 놀랍게도 ACVR1이 BMPR2-E376K과 공동면역침전(co-immunoprecipitated)되고, 반면 야생형 BMPR2는 BMP 리간드 없이 ACVR1과 관련되지 않은 것을 확인하였고(도 3a 참조), 이는 BMPR2-E376K 돌연변이에 의한 BMP 신호전달의 항시적 활성에 대한 분자적 기초를 시사한다. 또한 ACVR1-R206H 및 BMPR2-E376K 변이의 결합 발현은 SMAD1/5/9 인산화의 상가효과(additive effects)를 보였고(도 3b 참조), 이는 BMPR2-E376K 변이가 ACVR1-R206H에 비해 BMP 신호 활성에 있어 다른 분자 기구(molecular mechanism)를 갖는 것을 가리킨다. 그러나, ACVR1-R206H 돌연변이 사례와 유사하게(도 9 참조)(비특허문헌 11 및 12 참조), SMAD2/3 인산화(비특허문헌 11, 18 및 19 참조)를 자극하는 TGF-베타 수퍼패밀리(TGF-beta superfamily)의 비골형성(nonosteogenic) 일원인 액티빈 A 처리로 BMPR2-E376K를 발현하는 세포에서 SMAD1/5/9 인산화를 강화하나, 공 벡터 또는 야생형 BMPR2에서는 그렇지 않다는 것을 확인하였다(도 3c 참조). 액티빈 A가 FOP 표현형에 대한 절대 인자(obligatory factor)인 사실을 고려하면 이러한 결과는 그 분자 기구는 알려지지 않았지만 BMPR2-E376K 돌연변이가 FOP에 대한 원인이 된다는 아이디어를 더욱 뒷받침한다.
ACVR1-R206H와 달리, 환자 유래 세포에서 강화된 SMAD2 인산화가 관찰되었고(도 1f 참조), 또한 HEK293T 세포에서 BMPR2-E376K이 발현되었으며, 이는 ACVR1-R206H 변이를 발현하는 세포에서는 나타나지 않았다(도 3d 참조). 정량적 mRNA 검출을 통해 하위 유전자의 발현이 증가함을 확인하였고(도 6 참조), BMPR2-E376K 변이 때문에 SMAD2 인산화가 실제 기능적임을 암시한다. BMPR2-E376K 환경에서 I형 TGF-베타 수용체가 SMAD2 활성화의 원인임을 설명하기 위해, 환자 유래 세포에서 각 I형 수용체를 대폭 감소시켰고, TGFBR1의 감소가 환자 유래 세포에서 SMAD2 인산화의 폐기로 이어지고(도 3e 참조), 다른 세포들은 BMPR2-E376K 돌연변이를 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다(도 7 참조). BMPR2-E376K를 발현하는 세포의 FOP 병변에서 SMAD2 활성화의 기능적 역할을 이해하기 위해 FOP가 발병된 표적 조직에서 유래된 마우스 근원세포(myogenic cells) C2C12를 이용하였다. 렌티바이러스 형질도입(lentiviral transduction)을 통해 공 벡터, 야생형 인간 BMPR2 또는 BMPR2-E376K 변이를 안정적으로 발현하는 C2C12 세포주를 확립하였다. 예상한대로 SMAD1/5/9 인산화 및 이의 하위 표적(downstream target) ID1은 BMPR2-E376K를 발현하는 세포에서만 검출되었다(도 8 참조). 일관하여 BMPR2-E376K를 발현하는 세포는 ALP 염색에 양성이었다(도 3f 참조). BMP2 또는 BMP4의 처리로 BMPR2 야생형 및 BMPR2-E376K 환경에서 모두 ALP 발현이 증가되었고, BMPR2-E376K 세포가 BMPR2 야생형 세포보다 ALP를 고발현하는 것은 명확하다(도 8 참조). 이 설계에서 BMP 신호전달의 잠재 억제자인 도르소모르핀(dorsomorphin)뿐 아니라(비특허문헌 20 참조), TGF 신호전달의 잠재 억제자인 SB431542(비특허문헌 21 참조)의 처리로 ALP 염색을 감소시키는 것을 확인하였고(도 3f 내지 3g 참조), 이는 BMP 및 TGF 신호전달 활성 모두 본 FOP 사례의 이소성 골화 표현형에 중요함을 시사한다.
BMPR2 유전자의 기능획득 돌연변이가 유전적 골이형성증으로서, 연조직이 성장해야 할 부위에 이소성 골 형성으로 특징되는 FOP의 원인임을 보고한다. 지금까지 ACVR1만이 FOP의 원인이 되는 유전자이고, FOP 환자의 95% 이상이 ACVR1 유전자에 특이적 R206H 돌연변이를 보유한 것으로 알려져 왔다(비특허문헌 6 및 7 참조). 그러나, FOP 환자에서 확인되는 유전적 원인이 제한적인 관계로, 아직까지 ACVR1-R206H가 어떻게 BMP 신호의 항시적 활성화를 유도하는지, 일반적으로 FOP의 병리생리학은 어떠한지 명확하지 않다. 본 발명에서는 엄지 발가락 이상을 제외하고 전형적인 FOP 표현형을 나타내는 한 환자를 다루었다. 유전적 시퀀싱 분석으로부터 그 환자는 ACVR1에 돌연변이를 보유하지는 않았으나, BMPR2 유전자에 새로운 기능획득 돌연변이를 보유한 것을 확인하였다. 다중 기능적 분석을 통해 BMPR2-E376K 돌연변이의 병원성(pathogenicity)을 검증하였고, BMPR2-E376K 돌연변이의 여러 가지 흥미로운 양상을 확인하였으며, 이는 FOP의 발병뿐 아니라 TGF/BMP 신호전달 캐스케이드의 속성을 이해하는 데에 유용한 정보를 제공할 것이다.
BMPR2-E376K 변이는 일관되게 I형 수용체 ACVR1와 관련되어 있고, BMP 리간드가 없음에도 I형 및 II형 TGF-베타 수용체 사이의 근접성이 증가함을 확인하였다(도 3a 참조). ACVR1-R206H 돌연변이의 분자적 결과는 알려지지 않았다. 흥미롭게도 ACVR1-R206H와 BMPR2-E376K의 결합 발현은 BMP 신호 유도에 상가효과를 보인 것을 확인하였고(도 3b 참조), 이는 ACVR1-R206H가 BMP 신호전달 캐스케이드의 활성에 다른 분자 기구를 가지고 있다는 것을 암시한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따른 결과는 ACVR1-R206H 돌연변이로부터 발생하는 FOP의 정확한 병리생리학을 이해하는 데에 유익한 정보를 제공할 뿐 아니라, 강화된 BMP 신호전달을 억제하는 약물 개발에 유용하여, 다른 질병과 함께 FOP에 적용될 수 있을 것이다.
ACVR1-R206H 돌연변이가 있는 경우 액티빈 A의 처리로 SMAD1/5/9 인산화를 더욱 자극시키는 것으로 보고되었다(비특허문헌 11 및 12 참조). 지금까지 액티빈 A가 보통 TGF-베타 신호전달을 유도하는 것으로 알려졌음에도, ACVR1-R206H 환경에서 BMP 신호의 활성화에 관해서는 설명되지 않고 있다. 본 발명에서는 BMPR2-E376K 돌연변이와 ACVR1-R206H 돌연변이가 BMP 신호에 대해 다른 분자 기구를 가지고 있음을 실증하였다. 그러나, ACVR1-R206H와 유사하게 BMPR2-E376K 역시 액티빈 A 처리로 BMP 신호를 더욱 유도함을 확인하였다(도 3c 참조). 이러한 결과는 FOP에서 액티빈 A에 대한 응답에 있어 강화된 BMP 신호전달의 분자 기구가 특이적 분자 환경에 의존하는 것보다 더 일반적일 수 있음을 시사한다. 앞으로 후속 연구가 필요할 것이나, 본 발명에 따른 결과는 FOP에서 액티빈 A의 기능적 역할을 이해하는 데에 유용한 정보를 제공할 것이다.
BMPR2의 기능상실 돌연변이는 폐동맥 고혈압(pulmonary artery hypertension, PAH)에서 잘 설명되어 있다(비특허문헌 22 및 23 참조). PAH의 정확한 분자 기전은 알려지지 않았으나, BMPR2 기능의 상실로 TGF-베타 신호전달 캐스케이드가 강화되어, 혈관내 평활근 세포의 과증식으로 이어진다는 제안이 있었다(비특허문헌 24 참조). 본 발명에서는 최초로 기능획득 BMPR2 돌연변이와 인간 질병에서 이의 잠재적 원인이 되는 역할을 제시한다. 본 발명에 따른 결과는 BMPR2의 항시적 활성이 BMP 신호전달을 강화하여 이소성 골 형성 표현형에 이르게 함을 명확히 입증하였다. BMPR2의 생리학적 기능의 이해는 또한 PAH의 병리생리학적 이해와 새로운 치료 옵션 개발을 위한 장을 마련하는 데에 기여할 것이다.
ACVR1-R206H 돌연변이와 달리, BMPR2-E376K 발현 세포는 SMAD2 인산화와 하위 표적 유전자 발현을 보였다. 추가 연구에서 SMAD2 인산화의 원인인 I형 수용체가 TGFBR1임을 밝혔고, 이는 경우에 따라서는 BMP 및 TGF 신호전달 사이에 상호작용(crosstalk)의 가능성을 시사한다. 또한 활성화된 SMAD2 의존 신호전달 이소성 골화 과정에 부분적으로 관여하는 것을 확인하였고, 이는 TGF-베타 신호전달이 FOP 표현형에 있어 중요함을 보인 다른 연구를 통해 뒷받침된다(비특허문헌 25 참조). TGF-베타 신호전달 억제에 초점을 맞추어 FOP에 새로운 치료적 접근을 시도하는 것도 가치 있을 것이다.
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
<110> Sookmyung Women's university industry-academic cooperation foundation <120> A Novel Gain-of-Function Mutation in BMPR2 and uses thereof <130> NP20-02007 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMPR2-F Primer <400> 1 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt aatgacttcc tcgctgcagc ggc 53 <210> 2 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMPR2-R Primer <400> 2 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcacagacag ttcattcc 48 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence for CRISPR-Cas9 <400> 3 agataatgca gccataagca agg 23 <210> 4 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> donor template <400> 4 ccatgaggct gactggaaat agactggtgc gcccagggga ggaagataat gcagccatct 60 ccgaggtgag tgtatacaaa aggtatcaca ctgatgtact ttgaaatgat aatttaatta 120 120 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hBMPR2 E7 F1 <400> 5 gcctcctttt acagccctat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hBMPR2 E7 R1 <400> 6 aactttaccc ttgcctcaaa 20 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hBMPR2 E7 dF1 <400> 7 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctacagcag aaatgtccta g 51 <210> 8 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hBMPR2 E7 dR1 <400> 8 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctctcttt accttaggtg at 52 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCol2a1 sense primer <400> 9 cctccgtcta ctgtccactg a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCol2a1 antisense primer <400> 10 attggagccc tggatgagca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCol0a1 sense primer <400> 11 aacaggtatg cccgtgtctg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCol0a1 antisense primer <400> 12 tcatcaaatg ggatgggggc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAggrecan sense primer <400> 13 tggcttctgg agacaggact 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAggrecan antisense primer <400> 14 ttctgctgtc tgggtctcct 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGapdh sense primer <400> 15 catgttccag tatgactcca ctc 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGapdh antisense primer <400> 16 ggcctcaccc catttgatgt 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPAl-1 sense primer <400> 17 tcctggttct gcccaagtt 19 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPAl-1 antisense primer <400> 18 ccaggttctc taggggcttc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPDGFB sense primer <400> 19 ctggcatgca agtgtgagac 20 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPDGFB antisense primer <400> 20 cgaatggtca cccgagttt 19 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTHBS-1 sense primer <400> 21 caatgccaca gttcctgatg 20 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTHBS-1 antisense primer <400> 22 tggagaccag ccatcgtc 18 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH sense primer <400> 23 agccacatcg ctcagacac 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGAPDH antisense primer <400> 24 gcccaatacg accaaatcc 19 <210> 25 <211> 1038 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human BMPR2 <400> 25 Met Thr Ser Ser Leu Gln Arg Pro Trp Arg Val Pro Trp Leu Pro Trp 1 5 10 15 Thr Ile Leu Leu Val Ser Thr Ala Ala Ala Ser Gln Asn Gln Glu Arg 20 25 30 Leu Cys Ala Phe Lys Asp Pro Tyr Gln Gln Asp Leu Gly Ile Gly Glu 35 40 45 Ser Arg Ile Ser His Glu Asn Gly Thr Ile Leu Cys Ser Lys Gly Ser 50 55 60 Thr Cys Tyr Gly Leu Trp Glu Lys Ser Lys Gly Asp Ile Asn Leu Val 65 70 75 80 Lys Gln Gly Cys Trp Ser His Ile Gly Asp Pro Gln Glu Cys His Tyr 85 90 95 Glu Glu Cys Val Val Thr Thr Thr Pro Pro Ser Ile Gln Asn Gly Thr 100 105 110 Tyr Arg Phe Cys Cys Cys Ser Thr Asp Leu Cys Asn Val Asn Phe Thr 115 120 125 Glu Asn Phe Pro Pro Pro Asp Thr Thr Pro Leu Ser Pro Pro His Ser 130 135 140 Phe Asn Arg Asp Glu Thr Ile Ile Ile Ala Leu Ala Ser Val Ser Val 145 150 155 160 Leu Ala Val Leu Ile Val Ala Leu Cys Phe Gly Tyr Arg Met Leu Thr 165 170 175 Gly Asp Arg Lys Gln Gly Leu His Ser Met Asn Met Met Glu Ala Ala 180 185 190 Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asp Leu Asp Asn Leu Lys Leu Leu Glu Leu 195 200 205 Ile Gly Arg Gly Arg Tyr Gly Ala Val Tyr Lys Gly Ser Leu Asp Glu 210 215 220 Arg Pro Val Ala Val Lys Val Phe Ser Phe Ala Asn Arg Gln Asn Phe 225 230 235 240 Ile Asn Glu Lys Asn Ile Tyr Arg Val Pro Leu Met Glu His Asp Asn 245 250 255 Ile Ala Arg Phe Ile Val Gly Asp Glu Arg Val Thr Ala Asp Gly Arg 260 265 270 Met Glu Tyr Leu Leu Val Met Glu Tyr Tyr Pro Asn Gly Ser Leu Cys 275 280 285 Lys Tyr Leu Ser Leu His Thr Ser Asp Trp Val Ser Ser Cys Arg Leu 290 295 300 Ala His Ser Val Thr Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His Thr Glu Leu Pro 305 310 315 320 Arg Gly Asp His Tyr Lys Pro Ala Ile Ser His Arg Asp Leu Asn Ser 325 330 335 Arg Asn Val Leu Val Lys Asn Asp Gly Thr Cys Val Ile Ser Asp Phe 340 345 350 Gly Leu Ser Met Arg Leu Thr Gly Asn Arg Leu Val Arg Pro Gly Glu 355 360 365 Glu Asp Asn Ala Ala Ile Ser Glu Val Gly Thr Ile Arg Tyr Met Ala 370 375 380 Pro Glu Val Leu Glu Gly Ala Val Asn Leu Arg Asp Cys Glu Ser Ala 385 390 395 400 Leu Lys Gln Val Asp Met Tyr Ala Leu Gly Leu Ile Tyr Trp Glu Ile 405 410 415 Phe Met Arg Cys Thr Asp Leu Phe Pro Gly Glu Ser Val Pro Glu Tyr 420 425 430 Gln Met Ala Phe Gln Thr Glu Val Gly Asn His Pro Thr Phe Glu Asp 435 440 445 Met Gln Val Leu Val Ser Arg Glu Lys Gln Arg Pro Lys Phe Pro Glu 450 455 460 Ala Trp Lys Glu Asn Ser Leu Ala Val Arg Ser Leu Lys Glu Thr Ile 465 470 475 480 Glu Asp Cys Trp Asp Gln Asp Ala Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gln Cys 485 490 495 Ala Glu Glu Arg Met Ala Glu Leu Met Met Ile Trp Glu Arg Asn Lys 500 505 510 Ser Val Ser Pro Thr Val Asn Pro Met Ser Thr Ala Met Gln Asn Glu 515 520 525 Arg Asn Leu Ser His Asn Arg Arg Val Pro Lys Ile Gly Pro Tyr Pro 530 535 540 Asp Tyr Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Asp Ser Ile His His Thr Asp 545 550 555 560 Ser Ile Val Lys Asn Ile Ser Ser Glu His Ser Met Ser Ser Thr Pro 565 570 575 Leu Thr Ile Gly Glu Lys Asn Arg Asn Ser Ile Asn Tyr Glu Arg Gln 580 585 590 Gln Ala Gln Ala Arg Ile Pro Ser Pro Glu Thr Ser Val Thr Ser Leu 595 600 605 Ser Thr Asn Thr Thr Thr Thr Asn Thr Thr Gly Leu Thr Pro Ser Thr 610 615 620 Gly Met Thr Thr Ile Ser Glu Met Pro Tyr Pro Asp Glu Thr Asn Leu 625 630 635 640 His Thr Thr Asn Val Ala Gln Ser Ile Gly Pro Thr Pro Val Cys Leu 645 650 655 Gln Leu Thr Glu Glu Asp Leu Glu Thr Asn Lys Leu Asp Pro Lys Glu 660 665 670 Val Asp Lys Asn Leu Lys Glu Ser Ser Asp Glu Asn Leu Met Glu His 675 680 685 Ser Leu Lys Gln Phe Ser Gly Pro Asp Pro Leu Ser Ser Thr Ser Ser 690 695 700 Ser Leu Leu Tyr Pro Leu Ile Lys Leu Ala Val Glu Ala Thr Gly Gln 705 710 715 720 Gln Asp Phe Thr Gln Thr Ala Asn Gly Gln Ala Cys Leu Ile Pro Asp 725 730 735 Val Leu Pro Thr Gln Ile Tyr Pro Leu Pro Lys Gln Gln Asn Leu Pro 740 745 750 Lys Arg Pro Thr Ser Leu Pro Leu Asn Thr Lys Asn Ser Thr Lys Glu 755 760 765 Pro Arg Leu Lys Phe Gly Ser Lys His Lys Ser Asn Leu Lys Gln Val 770 775 780 Glu Thr Gly Val Ala Lys Met Asn Thr Ile Asn Ala Ala Glu Pro His 785 790 795 800 Val Val Thr Val Thr Met Asn Gly Val Ala Gly Arg Asn His Ser Val 805 810 815 Asn Ser His Ala Ala Thr Thr Gln Tyr Ala Asn Gly Thr Val Leu Ser 820 825 830 Gly Gln Thr Thr Asn Ile Val Thr His Arg Ala Gln Glu Met Leu Gln 835 840 845 Asn Gln Phe Ile Gly Glu Asp Thr Arg Leu Asn Ile Asn Ser Ser Pro 850 855 860 Asp Glu His Glu Pro Leu Leu Arg Arg Glu Gln Gln Ala Gly His Asp 865 870 875 880 Glu Gly Val Leu Asp Arg Leu Val Asp Arg Arg Glu Arg Pro Leu Glu 885 890 895 Gly Gly Arg Thr Asn Ser Asn Asn Asn Asn Ser Asn Pro Cys Ser Glu 900 905 910 Gln Asp Val Leu Ala Gln Gly Val Pro Ser Thr Ala Ala Asp Pro Gly 915 920 925 Pro Ser Lys Pro Arg Arg Ala Gln Arg Pro Asn Ser Leu Asp Leu Ser 930 935 940 Ala Thr Asn Val Leu Asp Gly Ser Ser Ile Gln Ile Gly Glu Ser Thr 945 950 955 960 Gln Asp Gly Lys Ser Gly Ser Gly Glu Lys Ile Lys Lys Arg Val Lys 965 970 975 Thr Pro Tyr Ser Leu Lys Arg Trp Arg Pro Ser Thr Trp Val Ile Ser 980 985 990 Thr Glu Ser Leu Asp Cys Glu Val Asn Asn Asn Gly Ser Asn Arg Ala 995 1000 1005 Val His Ser Lys Ser Ser Thr Ala Val Tyr Leu Ala Glu Gly Gly Thr 1010 1015 1020 Ala Thr Thr Met Val Ser Lys Asp Ile Gly Met Asn Cys Leu 1025 1030 1035 <210> 26 <211> 3117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human BMPR2 <400> 26 atgacttcct cgctgcagcg gccctggcgg gtgccctggc taccatggac catcctgctg 60 gtcagcactg cggctgcttc gcagaatcaa gaacggctat gtgcgtttaa agatccgtat 120 cagcaagacc ttgggatagg tgagagtaga atctctcatg aaaatgggac aatattatgc 180 tcgaaaggta gcacctgcta tggcctttgg gagaaatcaa aaggggacat aaatcttgta 240 aaacaaggat gttggtctca cattggagat ccccaagagt gtcactatga agaatgtgta 300 gtaactacca ctcctccctc aattcagaat ggaacatacc gtttctgctg ttgtagcaca 360 gatttatgta atgtcaactt tactgagaat tttccacctc ctgacacaac accactcagt 420 ccacctcatt catttaaccg agatgagaca ataatcattg ctttggcatc agtctctgta 480 ttagctgttt tgatagttgc cttatgcttt ggatacagaa tgttgacagg agaccgtaaa 540 caaggtcttc acagtatgaa catgatggag gcagcagcat ccgaaccctc tcttgatcta 600 gataatctga aactgttgga gctgattggc cgaggtcgat atggagcagt atataaaggc 660 tccttggatg agcgtccagt tgctgtaaaa gtgttttcct ttgcaaaccg tcagaatttt 720 atcaacgaaa agaacattta cagagtgcct ttgatggaac atgacaacat tgcccgcttt 780 atagttggag atgagagagt cactgcagat ggacgcatgg aatatttgct tgtgatggag 840 tactatccca atggatcttt atgcaagtat ttaagtctcc acacaagtga ctgggtaagc 900 tcttgccgtc ttgctcattc tgttactaga ggactggctt atcttcacac agaattacca 960 cgaggagatc attataaacc tgcaatttcc catcgagatt taaacagcag aaatgtccta 1020 gtgaaaaatg atggaacctg tgttattagt gactttggac tgtccatgag gctgactgga 1080 aatagactgg tgcgcccagg ggaggaagat aatgcagcca taagcgaggt tggcactatc 1140 agatatatgg caccagaagt gctagaagga gctgtgaact tgagggactg tgaatcagct 1200 ttgaaacaag tagacatgta tgctcttgga ctaatctatt gggagatatt tatgagatgt 1260 acagacctct tcccagggga atccgtacca gagtaccaga tggcttttca gacagaggtt 1320 ggaaaccatc ccacttttga ggatatgcag gttctcgtgt ctagggaaaa acagagaccc 1380 aagttcccag aagcctggaa agaaaatagc ctggcagtga ggtcactcaa ggagacaatc 1440 gaagactgtt gggaccagga tgcagaggct cggcttactg cacagtgtgc tgaggaaagg 1500 atggctgaac ttatgatgat ttgggaaaga aacaaatctg tgagcccaac agtcaatcca 1560 atgtctactg ctatgcagaa tgaacgcaac ctgtcacata ataggcgtgt gccaaaaatt 1620 ggtccttatc cagattattc ttcctcctca tacattgaag actctatcca tcatactgac 1680 agcatcgtga agaatatttc ctctgagcat tctatgtcca gcacaccttt gactataggg 1740 gaaaaaaacc gaaattcaat taactatgaa cgacagcaag cacaagctcg aatccccagc 1800 cctgaaacaa gtgtcaccag cctctccacc aacacaacaa ccacaaacac cacaggactc 1860 acgccaagta ctggcatgac tactatatct gagatgccat acccagatga aacaaatctg 1920 cataccacaa atgttgcaca gtcaattggg ccaacccctg tctgcttaca gctgacagaa 1980 gaagacttgg aaaccaacaa gctagaccca aaagaagttg ataagaacct caaggaaagc 2040 tctgatgaga atctcatgga gcactctctt aaacagttca gtggcccaga cccactgagc 2100 agtactagtt ctagcttgct ttacccactc ataaaacttg cagtagaagc aactggacag 2160 caggacttca cacagactgc aaatggccaa gcatgtttga ttcctgatgt tctgcctact 2220 cagatctatc ctctccccaa gcagcagaac cttcccaaga gacctactag tttgcctttg 2280 aacaccaaaa attcaacaaa agagccccgg ctaaaatttg gcagcaagca caaatcaaac 2340 ttgaaacaag tcgaaactgg agttgccaag atgaatacaa tcaatgcagc agaacctcat 2400 gtggtgacag tcaccatgaa tggtgtggca ggtagaaacc acagtgttaa ctcccatgct 2460 gccacaaccc aatatgccaa tgggacagta ctatctggcc aaacaaccaa catagtgaca 2520 catagggccc aagaaatgtt gcagaatcag tttattggtg aggacacccg gctgaatatt 2580 aattccagtc ctgatgagca tgagccttta ctgagacgag agcaacaagc tggccatgat 2640 gaaggtgttc tggatcgtct tgtggacagg agggaacggc cactagaagg tggccgaact 2700 aattccaata acaacaacag caatccatgt tcagaacaag atgttcttgc acagggtgtt 2760 ccaagcacag cagcagatcc tgggccatca aagcccagaa gagcacagag gcctaattct 2820 ctggatcttt cagccacaaa tgtcctggat ggcagcagta tacagatagg tgagtcaaca 2880 caagatggca aatcaggatc aggtgaaaag atcaagaaac gtgtgaaaac tccctattct 2940 cttaagcggt ggcgcccctc cacctgggtc atctccactg aatcgctgga ctgtgaagtc 3000 aacaataatg gcagtaacag ggcagttcat tccaaatcca gcactgctgt ttaccttgca 3060 gaaggaggca ctgctacaac catggtgtct aaagatatag gaatgaactg tctgtga 3117

Claims (5)

  1. 서열번호 25로 표시되는 인간 BMPR2(bone morphogenetic protein type 2 receptor)의 376번째 자리의 아미노산이 글루탐산(E)으로부터 라이신(K)으로 돌연변이된 BMPR2-E376K 돌연변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 돌연변이체는 이를 암호화하는 서열번호 26으로 표시되는 폴리뉴클레오티드의 1126번 뉴클레오티드에서 구아닌(G)이 아데닌(A)으로 치환된 점 돌연변이인 것을 특징으로 하는 BMPR2-E376K 돌연변이체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 돌연변이체는 진행성 골화성 섬유이형성증(Fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP) 표현형을 유발하는 것을 특징으로 하는 BMPR2-E376K 돌연변이체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 돌연변이체는 골 형성 분화를 통한 골 질환 치료를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 BMPR2-E376K 돌연변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 돌연변이체를 포함하는 세포주.
KR1020200075323A 2020-06-19 2020-06-19 신규의 bmpr2 유전자 기능획득 돌연변이체 및 이의 용도 KR102458904B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200075323A KR102458904B1 (ko) 2020-06-19 2020-06-19 신규의 bmpr2 유전자 기능획득 돌연변이체 및 이의 용도
US18/011,365 US20230235001A1 (en) 2020-06-19 2020-12-29 Novel gain-of-function mutant of bmpr2 gene and use thereof
PCT/KR2020/019261 WO2021256646A1 (ko) 2020-06-19 2020-12-29 신규의 bmpr2 유전자 기능획득 돌연변이체 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200075323A KR102458904B1 (ko) 2020-06-19 2020-06-19 신규의 bmpr2 유전자 기능획득 돌연변이체 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210157252A KR20210157252A (ko) 2021-12-28
KR102458904B1 true KR102458904B1 (ko) 2022-11-01

Family

ID=79178301

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200075323A KR102458904B1 (ko) 2020-06-19 2020-06-19 신규의 bmpr2 유전자 기능획득 돌연변이체 및 이의 용도

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230235001A1 (ko)
KR (1) KR102458904B1 (ko)
WO (1) WO2021256646A1 (ko)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060121497A1 (en) * 2004-08-30 2006-06-08 Jane Morse BMPR2 mutations in pulmonary arterial hypertension related to congenital heart disease
US8912152B2 (en) * 2005-03-08 2014-12-16 Molmed Spa HIV vif mutants
US20090029371A1 (en) * 2005-12-05 2009-01-29 Ihc Intellectual Asset Management, Llc Method for determining vasoreactivity
KR101978399B1 (ko) * 2017-09-21 2019-05-16 순천향대학교 산학협력단 자궁내막증에 대한 진단 마커로서의 돌연변이 유전자 및 이의 용도
CN109266679A (zh) * 2018-10-12 2019-01-25 中国医学科学院阜外医院 一种bmpr2基因突变大鼠的制备方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
희귀난치성 골격계 발달장애 질환 유발 유전자의 생물학적 기능 연구를 통한 발병기전 규명, 숙명여자대학교 산학협력단(2018.03.15.) 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021256646A1 (ko) 2021-12-23
US20230235001A1 (en) 2023-07-27
KR20210157252A (ko) 2021-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kizawa et al. An aspartic acid repeat polymorphism in asporin inhibits chondrogenesis and increases susceptibility to osteoarthritis
Mohapatra et al. Mutations in the muscle LIM protein and α-actinin-2 genes in dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis
Schubert The genomic basis of the Williams–Beuren syndrome
Callier et al. Loss of function mutation in the palmitoyl-transferase HHAT leads to syndromic 46, XY disorder of sex development by impeding Hedgehog protein palmitoylation and signaling
Brosh Jr et al. Roles of the Werner syndrome protein in pathways required for maintenance of genome stability
CA2283299A1 (en) 186 human secreted proteins
Koptides et al. Autosomal dominant polycystic kidney disease: molecular genetics and molecular pathogenesis
KR20100037592A (ko) 낙설 증후군 및 녹내장의 진단, 예후 및 치료용 마커인 염색체 １５ｑ２４ 상의 유전적 변이
Rotin WW (WWP) domains: from structure to function
Umair et al. Biallelic variant in DACH1, encoding Dachshund Homolog 1, defines a novel candidate locus for recessive postaxial polydactyly type A
Naessens et al. The N‐terminal p.(Ser38Cys) TIMP3 mutation underlying Sorsby fundus dystrophy is a founder mutation disrupting an intramolecular disulfide bond
KR102476822B1 (ko) 신규의 bmpr2 유전자 기능획득 돌연변이체 유래 유도만능줄기세포, 중간엽줄기세포 및 이의 용도
KR102458904B1 (ko) 신규의 bmpr2 유전자 기능획득 돌연변이체 및 이의 용도
KR102587871B1 (ko) Bmpr2 유전자 기능획득 돌연변이체를 포함하는 돌연변이 복합체 및 이의 용도
de Zwart-Storm et al. A novel missense mutation in the second extracellular domain of GJB2, p. Ser183Phe, causes a syndrome of focal palmoplantar keratoderma with deafness
Rajapakse et al. Amelotin is expressed in retinal pigment epithelium and localizes to hydroxyapatite deposits in dry age-related macular degeneration
US20230242605A1 (en) Mutation complex including gain-of-function mutant of bmpr2 gene, induced pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells derived from mutant, and use thereof
KR20040028601A (ko) 파골세포-관련 수용체
Tsai et al. Lack of modulatory function of coding nucleotide polymorphism S100A2_185G> A in oral squamous cell carcinoma
CN108949998B (zh) 预测乳腺癌患者对抗her2治疗药物反应性的基因突变位点及其应用
JP2006514821A (ja) 新規なｋｃｎｑポリペプチド、それらのモジュレータ及び精神障害の治療におけるそれらの使用
Mavillard et al. Ablation of the carboxy-terminal end of MAMDC2 causes a distinct muscular dystrophy
KR102352161B1 (ko) Tonsl 유전자를 이용한 스포나스트림 이형성증의 진단 마커
Braddock et al. 35th annual david w smith workshop on malformations and morphogenesis: Abstracts of the 2014 annual meeting
Amor Barris et al. In-depth characterization of HINT1 pathogenic variants

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right