CN101137666B - HIV Vif突变体 - Google Patents

Abstract

一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的127、128、130、131、132和142位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代，并且其中核苷酸序列不编码图2中的氨基酸序列。

Description

HIV Vif突变体

发明领域 

本发明涉及慢病毒载体，及其用于对包括HIV重复感染在内的HIV感染赋予抗性的方法。 

发明背景 

在发展中国家，AIDS是导致死亡的一个主要因素，它的蔓延呈全国性爆发趋势。可是，距根除HIV-1仍很遥远。目前，高效抗逆转录病毒治疗(HAART)是唯一有效降低AIDS散播及蔓延的疗法，尽管其长期使用会带来诸如要遵守复杂的给药方案、副作用毒性以及花费增加这样的缺点及局限(Richman et al，2001)。HIV-1由于其基因组的超突变率、以及缺乏顺从性所导致的亚型内及亚型间很大程度的遗传与抗原的变异，是其对HAART药物产生抗性、以及开发基于多类群的预防性疫苗出现多次失败的原因(Ho et al，2002)。基于此，有必要发展出针对AIDS的替代和/或附加治疗策略。 

多年的临床前研究已经表明，可以在很多水平上干扰HIV-1的生命周期，并至少在概念上证实了抗HIV基因疗法(Buchschacher et al，2001)。可用——譬如，直接针对病毒与细胞内基因的编码核酶的基因、诱饵、反义及小干扰RNA(SiRNA)分子(Buchschacher et al，2001；Jacqueet al，2002；Novina et al，2002；Lee et al，2002；Coburn et al，2002；Qin et al，2003)，或者诸如细胞内趋化因子、毒素及单链抗体这样的蛋白对造血干细胞(HSCs)、T细胞前体或者T淋巴细胞进行遗传改造。然而，用表达病毒蛋白反式显性突变体或者抗HIV-1核酶的载体所转导的T淋巴细胞的早期临床实验令人沮丧(Woffendin et al，1996；Ranga et al，1998；Wong-Staal et al，1998)——这主要是由于基因转移效率低下、结合不充分以及经遗传改造后的T细胞在体内存活时间短造成的。迄今为止所进行的绝大多数临床前及临床研究，都是基于使用来源于莫洛尼小鼠白血病病毒(MLV)的逆转录病毒载体来转导HSCs或者T细胞的。然而，来源于MLV的载体在临床应用上表现出明显的局限，譬如转导未分裂的HSCs及T细胞的效率低、潜在的治疗用抗HIV产物的表达不充分、 以及有通过对癌基因的插入激活而诱发瘤形成的倾向(Baum et al，2003)。 

病毒感染因子(vif)基因的产物是抗HIV基因疗法的可能靶标。vif是HIV-1四个附属基因之一，在病毒复制晚期以Rev依赖的方式表达(Cullen et al，1998；Frankel et al，1998)。Vif蛋白对在被称为“非允许细胞(non-permissive cell)”的包括HIV-1的天然靶点(T细胞和巨噬细胞)以及某些T细胞系，例如CEM、H9和HUT 78中进行高度病毒感染而言是必需的。这种需求依赖于Vif抵消最近鉴定的CEM15/APOBEC-3G蛋白(Sheehy et al，2002)的功能的能力，所述的CEM15/APOBEC-3G蛋白提供针对HIV-1的先天免疫力。因此，Vif功能的丧失或者受阻，可以提供一种不同的抗HIV-1治疗途径。 

F12-vif是vif的一个天然突变体，其具有15个特有的氨基酸替代，最初在HIV-1的F12非生产突变体中发现(Federico et al，1989；Carlini etal，1992；Carlini et al，1996)。F12非生产HIV在重复感染HIV的复制中引发了阻碍，并且F12-Vif在降低该生产系的感染方面发挥作用。然而，需要进一步提供具有抗HIV活性的vif突变体，并提供有效递送这些突变体的系统。本发明用以攻克这些问题。 

发明概要 

我们已经开发出vif的新突变体，于体外在感染了HIV-1的T细胞系中可以高效抑制HIV-1的复制。特别地，我们发现在与野生型序列中127、128、130、131、132和142位相对应的氨基酸处含有替代氨基酸的Vif蛋白，可针对HIV充分发挥出抗病毒作用。此外，我们表明，F12-Vif的一个嵌合在WT-Vif内、仅具有6个特有的氨基酸替代的45个氨基酸的区域(Chim3)，可保护人T淋巴细胞免受HIV-1感染。而且，我们证明了同F12-Vif相比，Chim3不能在非允许细胞中恢复Vif缺陷病毒体(Δvif HIV-1)的复制，这使得以沉默方式携带有Δvif HIV-1准种的病人在使用该突变体时更加安全。 

与本发明的一个优选实施方案相关的优势是突变Vif转基因处于Tat依赖的野生型HIV-1 LTR的转录控制之下，其仅在感染了HIV-1的细胞中被激活，这样避免了外源抗原在转导HSCs及其子代中的不必要表达，也就是说，HIV-1的表达在HIV-1的诱导控制之下。 

发明综述 

根据本发明的第一个方面，提供了一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的127、128、130、131、132和142位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代(即，氨基酸分别不是H、I、S、P、R和V)，并且其中核苷酸序列不编码图2中的氨基酸序列。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的127、128、130、131、132和142位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代，并且其中一个或多个与22、29、41、48、66、80、109、185和186位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、N、V、N、R、R和N。 

优选地，所有与22、29、41、48、66、80、109、185和186位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、N、V、N、R、R和N。 

在一个实施方案中，与图1A中序列的127、128、130、131、132和142位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代，并且所有与22、29、41、66、80、109、185和186位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、V、N、R、R和N。 

优选地，所有与127、128、130、131、132和142位相对应的氨基酸，分别被N、V、R、L、S和I替代。 

在一个实施方案中，与48位相对应的氨基酸是N。 

优选地，与22、29、41、48、66、80、109、185和186位相对应的氨基酸，是存在于天然状态的Vif中的那些氨基酸，例如但并不局限于，HXB2 acc.#K03455、BRU acc.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22acc.#K02083、MN acc.#M17449和NL4-3 acc.#M19921(参见图1A，1B和1C)。适合这些位置的氨基酸如但并不局限于，22(K)、29(M)、41(R)、48(N或H)、66(I)、80(H)、109(L)、185(G)、186(S)。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的127、128、130、131、132、142和185位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代(即，这些氨基酸分别不是H、I、S、P、R、V和G)，并且其中一个或多个与22、29、41、48、66、80、109和186位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、N、V、 N、R和N。 

优选地，所有与22、29、41、48、66、80、109和186位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、N、V、N、R和N。 

在一个实施方案中，与图1A中序列的127、128、130、131、132、142和185位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代，并且所有与22、29、41、66、80、109和186位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、V、N、R和N。 

优选地，与127、128、130、131、132、142和185位相对应的氨基酸，分别被N、V、R、L、S、I和R替代。 

在一个实施方案中，与48位相对应的氨基酸是N。 

优选地，与22、29、41、48、66、80、109和186位相对应的氨基酸，是存在于天然状态的Vif中的那些氨基酸，例如但并不局限于，HXB2acc.#K03455、BRU acc.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22 acc.#K02083、MN acc.#M17449和NL4-3 acc.#M19921(参见图1A，1B和1C)。适合这些位置的氨基酸如但并不局限于，22(K)、29(M)、41(R)、48(N或H)、66(I)、80(H)、109(L)、186(S)。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代(即，这些氨基酸分别不是H、I、S、P、R、V、G或S)，并且其中一个或多个与22、29、41、48、66、80和109位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、N、V、N和R。 

优选地，所有与22、29、41、48、66、80和109位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、N、V、N和R。 

在一个实施方案中，与图1A中序列的127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代，并且所有与22、29、41、66、80和109位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、V、N和R。 

优选地，与127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的氨基酸，分别被N、V、R、L、S、I、R和N替代。 

在一个实施方案中，与48位相对应的氨基酸是N。 

优选地，与22、29、41、48、66、80、109位相对应的氨基酸，是 存在于天然状态的Vif中的那些氨基酸，例如但并不局限于，HXB2 acc.#K03455、BRU acc.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22 acc.#K02083、MN acc.#M17449和NL4-3 acc.#M19921(参见图1A，1B和1C)。适合这些位置的氨基酸如但并不局限于，22(K)、29(M)、41(R)、48(N或H)、66(I)、80(H)、109(L)。。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代(即，这些氨基酸分别不是L、H、I、S、P、R、V、G和S)，并且其中一个或多个与22、29、41、48、66和80位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、N、V和N。 

优选地，所有与22、29、41、48、66和80位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、N、V和N。 

在一个实施方案中，与图1A中序列的109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代，并且所有与22、29、41、66和80位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、V和N。 

优选地，与109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的氨基酸，分别被R、N、V、R、L、S、I、R和N替代。 

在一个实施方案中，与48位相对应的氨基酸是N。 

优选地，与22、29、41、48、66、80位相对应的氨基酸，是存在于天然状态的Vif中的那些氨基酸，例如但并不局限于，HXB2 acc.#K03455、BRU acc.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22 acc.#K02083、MN acc.#M17449和NL4-3 acc.#M19921(参见图1A，1B和1C)。适合这些位置的氨基酸如但并不局限于，22(K)、29(M)、41(R)、48(N或H)、66(I)、80(H)。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代(即，这些氨基酸分别不是H、L、H、I、S、P、R、V、G和S)，并且其中一个或多个与22、29、41、48和66位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、N和V。 

优选地，所有与22、29、41、48和66位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K、N和V。 

在一个实施方案中，与图1A中序列的80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代，并且所有与22、29、41和66位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K和V。 

优选地，与80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的氨基酸，分别被N、R、N、V、R、L、S、I、R和N替代。 

在一个实施方案中，与48位相对应的氨基酸是N。 

优选地，与22、29、41、48和66位相对应的氨基酸，是存在于天然状态的Vif中的那些氨基酸，例如但并不局限于，HXB2 acc.#K03455、BRU acc.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22 acc.#K02083、MN acc.#M17449和NL4-3acc.#M19921(参见图1A，1B和1C)。适合这些位置的氨基酸如但并不局限于，22(K)、29(M)、41(R)、48(N或H)、66(I)。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的66、80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代(即，这些氨基酸分别不是I、H、L、H、I、S、P、R、V、G和S)，并且其中一个或多个与22、29、41和48位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K和N。 

优选地，所有与22、29、41和48位相对应的氨基酸，分别不是I、I、K和N。 

在一个实施方案中，与图1A中序列的66、80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代，并且所有与22、29和41位相对应的氨基酸，分别不是I、I和K。 

优选地，与66、80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的氨基酸，分别被V、N、R、N、V、R、L、S、I、R和N替代。 

在一个实施方案中，与48位相对应的氨基酸是N。 

优选地，与22、29、41和48位相对应的氨基酸，是存在于天然状 态的Vif中的那些氨基酸，例如但并不局限于，HXB2 acc.#K03455、BRUacc.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22 acc.#K02083、MN acc.#M17449和NL4-3 acc.#M19921(参见图1A，1B和1C)。适合这些位置的氨基酸如但并不局限于，22(K)、29(M)、41(R)、48(N，H)。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的48、66、80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代(即，这些氨基酸分别不是H、I、H、L、H、I、S、P、R、V、G和S)，并且其中一个或多个与22、29和41位相对应的氨基酸，分别不是I、I和K。 

优选地，所有与22、29和41位相对应的氨基酸，分别不是I、I和K。 

优选地，与48、66、80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的氨基酸，分别被N、V、N、R、N、V、R、L、S、I、R和N替代。 

优选地，与22、29和41位相对应的氨基酸，是存在于天然状态的Vif中的那些氨基酸，例如但并不局限于，HXB2 acc.#K03455、BRU acc.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22 acc.#K02083、MN acc.#M17449和NL4-3 acc.#M19921(参见图1A，1B和1C)。适合这些位置的氨基酸如但并不局限于，22(K)、29(M)、41(R)。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的41、48、66、80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代(即，这些氨基酸分别不是R、H、I、H、L、H、I、S、P、R、V、G和S)，并且其中至少一个与22和29位相对应的氨基酸不是I。 

优选地，与41、48、66、80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的氨基酸，分别被K、N、V、N、R、N、V、R、L、S、I、R和N替代。 

优选地，与22和29位相对应的氨基酸，是存在于天然状态的Vif中的那些氨基酸，例如但并不局限于，HXB2 acc.#K03455、BRU acc.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22 acc.#K02083、MN acc.#M17449和NL4-3 acc.#M19921(参见图1A，1B和1C)。适合这些位置的氨基酸 如但并不局限于，22(K)、29(M)。 

优选地，与22和29位相对应的两个氨基酸均不是I。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码Vif的核苷酸序列的多核苷酸，其中与图1A中序列的29、41、48、66、80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的每个氨基酸均被另一种氨基酸替代(即，这些氨基酸分别不是M、R、H、I、H、L、H、I、S、P、R、V、G和S)，并且与22位相对应的氨基酸不是I。 

优选地，与29、41、48、66、80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位相对应的氨基酸，分别被I、K、N、V、N、R、N、V、R、L、S、I、R和N替代。 

优选地，与22位相对应的氨基酸是存在于天然状态的Vif中的那个氨基酸，例如但并不局限于，HXB2 acc.#K03455、BRU acc.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22 acc.#K02083、MN acc.#M17449和NL4-3 acc.#M19921(参见图1A，1B和1C)。适合这个位置的氨基酸如但并不局限于K(赖氨酸)。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码镶嵌在天然状态的Vif序列中的嵌合Vif蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，，例如但并不局限于，HXB2 acc.#K03455、BRU acc.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22acc.#K02083、MN acc.#M17449和NL4-3 acc.#M19921(参见图1A，1B和1C)，所述嵌合蛋白含有图2中F12-Vif序列的126到170位的氨基酸。在此种情况下，天然状态的Vif序列不是F12-Vif。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码上述Vif多肽片段的核苷酸序列的多核苷酸，其中该片段至少包含与图2中序列的126到170位相对应的氨基酸。 

优选地，该片段至少包含图2中序列的126到170位氨基酸。 

在一个实施方案中，该片段由图2中序列的126到170位氨基酸组成。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码Vif多肽片段的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述片段在与图1A中野生型序列的127、128、130、131、132和142位相对应的氨基酸处含有替代氨基酸。 

在一个实施方案中，由多核苷酸编码的片段进一步在与图1A中野生型序列的185位相对应的氨基酸处含有替代氨基酸。 

在另一个实施方案中，由多核苷酸编码的片段进一步在与图1A中野生型序列的186位相对应的氨基酸处含有替代氨基酸。 

在另一个实施方案中，由多核苷酸编码的片段进一步在与图1A中野生型序列的109位相对应的氨基酸处含有替代氨基酸。 

在另一个实施方案中，由多核苷酸编码的片段进一步在与图1A中野生型序列的80位相对应的氨基酸处含有替代氨基酸。 

在另一个实施方案中，由多核苷酸编码的片段进一步在与图1A中野生型序列的66位相对应的氨基酸处含有替代氨基酸。 

在另一个实施方案中，由多核苷酸编码的片段进一步在与图1A中野生型序列的48位相对应的氨基酸处含有替代氨基酸。 

在另一个实施方案中，由多核苷酸编码的片段进一步在与图1A中野生型序列的41位相对应的氨基酸处含有替代氨基酸。 

在另一个实施方案中，由多核苷酸编码的片段进一步在与图1A中野生型序列的29位相对应的氨基酸处含有替代氨基酸。 

优选地，图1A中野生型序列22位的氨基酸被改变为I。 

优选地，图1A中野生型序列29位的氨基酸被改变为I。 

优选地，图1A中野生型序列41位的氨基酸被改变为K。 

优选地，图1A中野生型序列48位的氨基酸被改变为N。 

优选地，图1A中野生型序列66位的氨基酸被改变为V。 

优选地，图1A中野生型序列80位的氨基酸被改变为N。 

优选地，图1A中野生型序列109位的氨基酸被改变为R。 

优选地，图1A中野生型序列127位的氨基酸被改变为N。 

优选地，图1A中野生型序列128位的氨基酸被改变为V。 

优选地，图1A中野生型序列130位的氨基酸被改变为R。 

优选地，图1A中野生型序列131位的氨基酸被改变为L。 

优选地，图1A中野生型序列132位的氨基酸被改变为S。 

优选地，图1A中野生型序列142位的氨基酸被改变为I。 

优选地，图1A中野生型序列185位的氨基酸被改变为R。 

优选地，图1A中野生型序列186位的氨基酸被改变为N。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码图4A中所示的氨基酸序列的核苷酸序列或者由其所组成的多核苷酸。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含编码图5A中所示的氨 基酸序列的核苷酸序列或者由其所组成的多核苷酸。 

根据本发明的另一个方面，提供了一种包含图15或16中所示的核苷酸序列或者由其所组成的多核苷酸。 

根据本发明的另一个方面，提供了由本发明的多核苷酸所编码的Vif多肽及Vif多肽片段。 

根据本发明的另一个方面，提供了包含图4A或4B中所示的氨基酸序列或者由其所组成的多肽。 

根据本发明的另一个方面，提供了包含本发明的多核苷酸的载体。 

优选地，该载体是重组慢病毒载体。 

优选地，该慢病毒载体可来源于HIV。 

优选地，该载体编码可操作连接到病毒LTR上的本发明中的多核苷酸。 

优选地，多核苷酸的表达是tat及rev依赖的。 

优选地，本发明的载体不含有tat及rev基因。 

优选地，本发明的载体能够在HIV-1诱导控制下表达突变Vif或者突变Vif片段。 

优选地，本发明的载体缺少gag、pol和env基因。 

在一个实施方案中，本发明的载体进一步包含编码选择标记基因的多核苷酸序列。 

优选地，本发明的载体进一步包含编码低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)最低限度部分的多核苷酸序列。 

在另一个实施方案中，本发明的载体以整合的前病毒形式存在。 

根据本发明的另一个方面，提供了可从本发明载体获得的逆转录病毒颗粒。 

优选地，该逆转录病毒颗粒是假型的。 

优选地，编码突变Vif的多核苷酸可操作连接到病毒长末端重复序列(LTR)上。 

根据本发明的另一个方面，提供了用于产生本发明逆转录病毒颗粒的逆转录病毒生产体系，包含本发明中的载体，及逆转录病毒的gag-pol，以及逆转录病毒或者非逆转录病毒的env。特别地，假型包装的概念在本技术领域是众所周知的，可用在本发明中。 

优选地，逆转录病毒的gag-pol及env在不同的载体上。 

优选地，包膜蛋白选自RD1 14-TR、VSV-G、GALV及4070A。 

根据本发明的另一个方面，提供了含有本发明中多核苷酸的细胞。 

根据本发明的另一个方面，提供了用本发明中的载体或逆转录病毒颗粒感染或者转导的细胞。 

优选地，该细胞是T细胞。 

优选地，该细胞是单核细胞、巨噬细胞或者淋巴细胞。 

优选地，该细胞是造血CD34+前体细胞或者造血细胞。 

优选地，本发明中的细胞在HIV-1的诱导控制之下表达突变Vif。 

根据本发明的另一个方面，提供了本发明中的多核苷酸、多肽、载体、逆转录病毒颗粒或者细胞在药品中的用途。 

根据本发明的另一个方面，提供了包含本发明中的多核苷酸、多肽、载体、逆转录病毒颗粒或者细胞的药物组合物，以及药学上可接受的载体、稀释液或者赋形剂。 

根据本发明的另一个方面，提供了使用本发明中的多核苷酸、多肽、载体、逆转录病毒颗粒、细胞或者药物组分在制备用于治疗或者预防HIV感染或相关疾病的药物中的应用。HIV感染可以是重复感染。 

因此，本发明提供了治疗或者预防HIV感染或相关疾病的方法，包括对有需要的患者给药有效剂量的本发明中的多核苷酸、多肽、载体、逆转录病毒颗粒、细胞或者药物组合物 

根据本发明进一步的方面，提供了治疗或者预防HIV感染或相关疾病的方法，包括用本发明中的载体或者逆转录病毒颗粒感染或者转导细胞。 

在一个实施方案中，感染和转导是离体进行的，然后将细胞导入患者体内。 

附图简述 

图1所示的是由5个氨基酸序列(HXB2 acc.#K03455、BRU acc.#K02013，SF2 acc.#K02007，PV22 acc.#K02083，MN acc.#M17449)所生成的共有WT氨基酸序列，登录号可参见NCBI Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？CMD＝search&DB＝nucleotide)。 

图1B所示的是5个Vif氨基酸序列的比对、生成的共有序列以及F12-Vif序列。 

图1C所示的是NL4-3 WT Vif氨基酸序列。 

图2所示的是来自HIV1 F12的HIV F12-Vif多肽序列(NCBI序列号：Z11530)。特有的氨基酸替代以粗体表示。 

图3A所示的是Chim1多肽序列。粗体部分的氨基酸表示相对于野生型Vif(NL4-3)的替代氨基酸。 

图3B突出表示了与F12-Vif(斜体)及野生型Vif相对应的Chim1部分。 

图4A所示的是Chim2多肽序列。粗体部分的氨基酸表示相对于野生型Vif(NL4-3)的替代氨基酸。 

图4B突出表示了与F12-Vif(斜体)及野生型Vif相对应的Chim2部分。 

图5A所示的是Chim3多肽序列。粗体部分的氨基酸表示相对于野生型Vif(NL4-3)的替代氨基酸。 

图5B突出表示了与F12-Vif(斜体)及野生型Vif相对应的Chim3部分。 

图6所示的是基于HIV-1、以前病毒形式存在的PΔN，WT-VifPΔN，F12-VifPΔN，Chim1-PΔN，Chim2-PΔN和Chim3-PΔN慢病毒载体的示意图。 

图7所示的是通过western blot实验分析，同WT及F12-Vif全长蛋白相比，Chim1、Chim2和Chim3的表达。 

图8所示的是T细胞系中嵌合蛋白的抗病毒活性。A.在MOI为0.1时用X4分子克隆HIV-1 NL4-3感染NP CEM A3.01模拟转导(Mock)及F12-Vif和Chim3 PΔN转导的细胞。给出了在感染动力学峰值时(15天)通过RT实验测量的三个值的平均值。B.在MOI为0.1时用X4 HIV-1NL4-3感染允许模拟转导及LV转导的CEMss细胞的感染动力学。C.在MOI为0.1时用X4 HIV-1 NL4-3感染允许SupT-1模拟转导及LV转导的细胞。D.MOI为0.1时用R5 HIV-1 AD8在感染非允许模拟转导及Chim3PΔN转导的PM1细胞，以及在感染后6天时测量的RT活性。 

图9所示的是CD4+T淋巴细胞中Chim3的抗病毒活性。在MOI为0.1时用X4 HIV-1 NL4-3(A)或者R5分子克隆的HIV-1 AD8(B)感染来自脐带血的模拟转导及LVs转导的CD4+T淋巴细胞。 

图10所示的是在用所示慢病毒载体转导后、然后在MOI为0.1时 用HIV-1NL4-3感染的CEM A3.01细胞内HIV-1复制的动力学。 

图11所示的是Chim3没有在CD4+T淋巴细胞中恢复X4和R5ΔvifHIV-1的复制。在MOI为0.1时用X4Δvif-HIV(A)和R5 HIV-1AD-lvif(B)分子克隆感染模拟转导或者LVs转导的CD4+T淋巴细胞。接下来HIV-1分别生长39和29天。 

图12所示的是在HIV-1感染后，F12-Vif和Chim3转导优于模拟转导的选择优势。混合LVs转导和模拟转导的CEM A3.01细胞，以50∶50的比例培养，然后在MOI为0.01时用X4 HIV-1 NL4-3感染。在接种后20天时在感染和非感染细胞间计算转导细胞(NGFR+细胞)增加的百分比。 

图13所示的是同WT-Vif相比Chim2和Chim3的表达较低，及Chim3在非允许细胞中比在允许细胞中可更有效地被蛋白酶体所降解。A.在模拟转导及LV转导的非允许CEM A3.01细胞或者允许SupT-1细胞中，Vif与hA3G蛋白基础水平的western blot分析。B.来自未感染的允许(SupT-1)或者非允许(CEM A3.01)细胞的全细胞提取物用蛋白酶体抑制剂MG132处理18小时后的western印迹分析。滤纸继续用抗Vif、抗hA3G(仅存在于非允许细胞中)和抗肌动蛋白抗体检测。C.通过测量用或没用MG132处理的条带的密度、统一化成等量的肌动蛋白条带的蛋白来计算Vif蛋白增加的倍数。 

图14所示的是在非允许细胞中用放线菌酮处理后Chim3 mRNA的累积。A.从非允许CEM A3.01细胞中提取总RNA(10μg)，然后将不同片段长度的RNA用NGFR探针进行杂交。B.从使用或者未使用放线菌酮(10μg/ml)处理8小时的非允许CEM A3.01细胞中提取总RNA，然后将不同片段长度的RNA用NGFR探针进行杂交。C.通过按NGFR条带进行统一化的相关条带的Phosphorimager定量来计算VifmRNA增加的倍数。 

图15所示的是Chim3多核苷酸序列。 

图16所示的是Chim2多核苷酸序列。 

图17所示的是NL4-3WT Vif多核苷酸序列。 

图18所示的是F12-Vif多核苷酸序列。 

发明详述 

现在将通过非限定实施例的方式来描述本发明的多个优选特征及实施方案。 

除非另有说明，实施本发明本发明将会应用到化学、分子生物学、微生物学、重组DNA及免疫学方面的常规技术，这些均在本领域普通技术人员的能力之内。这些技术在文献中均有说明。参见，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：ALaboratoryManual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.et al.(1995及定期补充材料；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles andPractice；Oxford University Press；M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesis：APractical Approach，Irl Press；and，D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure PartA：Synthesis and PhysicalAnalysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press。这些常用文献均作为参考引入本文中。 

靶细胞

本发明中的多肽、多核苷酸、载体、逆转录病毒颗粒、细胞或者药物组合物可以递送到靶细胞中。优选地，该细胞是免疫系统的细胞，即T细胞。优选地，该细胞是人类免疫系统的细胞。更优选地，该细胞是能够被HIV感染的细胞，即HIV允许细胞。可导入本发明重组慢病毒载体或颗粒的细胞包括外周血淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、星型细胞。 

病毒感染因子(Vif)

应注意到在本申请中，氨基酸的位置是通过与图1A共有序列中的特定位置“相对应”来确定的。但不应理解为这意味着本发明中的序列一定包含图1A中列出的序列。技术人员很容易理解Vif序列在不同的HIV株之间有所变化。参考该图只是可以用来确定任意特定Vif蛋白中特定氨基酸的位置。这些氨基酸的位置可使用序列比对程序来进行常规确定，其使用方法在本领域是众所周知的。 

诸如HIV-1之类的慢病毒除编码在所有的可复制逆转录病毒中均有 表达的结构基因gag、pol及env之外，还编码许多辅助基因。除马传染性贫血病毒外的所有已知慢病毒均表达其中一个辅助基因——vif(病毒感染因子)。Vif蛋白是由192个氨基酸组成的高碱性、23-kDa的蛋白。来自HIV-1感染个体的病毒DNA序列分析已经表明Vif的开放阅读框保持完整(Sova，et al，1995；Wieland et al，1994；Wieland et al，1997)。在相对天然的条件下，Vif蛋白在体外形成包括二聚体、三聚体或四聚体在内的多聚体。还揭示了Vif蛋白在细胞内可以彼此相互作用。进一步的研究表明影响Vif自缔合的结构域位于该蛋白的C-末端，尤其是富含脯氨酸的151-164区域(Yang et al，2001)。 

缺失vif基因可显著降低猕猴中的猴免疫缺陷病毒(SIV)，以及SCID-hu小鼠中HIV-1的复制(Aldrovandi，G.M.&Zack，J.A.，J.Virol.70：1505-1511，1996；Desrosiers，R.C，et al，J.Virol.72：1431-1437，1998)，由此表明它是体内慢病毒致病复制所必须的。先前的发现支持Vif在前病毒DNA整合中的作用(Simon et al，1996；von Schwedler et al，1993；Sova et al，2001)。还表明Vif可与基因组RNA(Zhang et al，2000；Dettenhofer et al，2000)、或参与末期衣壳组装的HP-68-Gag复合物之类的病毒及细胞内蛋白(Zimmerman et al，2002)相作用。 

在病毒产生细胞中可提供给Vif增强的感染性，但在靶细胞中显示出来。因此，vif前病毒在病毒产生细胞中是反式互补的，但在靶细胞中不是。此外，对Vif的需求是细胞类型特异性的。当在原始T淋巴细胞、末期分化的巨噬细胞或者诸如H9这样的一些T淋巴细胞系中产生时，vif病毒表现出阴性表型。这些细胞被称为“非允许”细胞。然而，在诸如SupT1、C8166这样的T细胞系、以及诸如HelaCD4细胞这样的其它非T细胞中，可实现vif HIV-1病毒的高产复制。这些细胞系被称为“允许”细胞(Gabuzda et al，1992；von Schwedler et al，1993；Gabuzda et ah，1994)。这种条件依赖于Vif抵消最近鉴定的CEM15/APOBEC-3G蛋白(Sheehy et al，2002)活性的能力，这提供了针对HIV-1的先天免疫，所述的CEM15/APOBEC-3G蛋白选择性地在非允许细胞中表达。APOBEC-3G是一种胞苷脱氨酶细胞蛋白，在病毒产生期间整合到vif缺陷的病毒体(Δvif HIV-1)中，这会在缺陷细胞的反转录期间，在新生的正链cDNA中诱发大量的G到A超突变，导致强烈抑制Δvif HIV-1变异体的复制(Lecossier et al.，2003；Harris et al.，2003；Mariani et al.， 2003；Goffet al.5 2003)。与基因家族中最初发现的成员APOBEC3作用在RNA上、并在它的靶，即载脂蛋白B mRNA上仅使一个胞嘧啶残基脱去氨基从而调节其表达(Teng et al.，1998)不同，APOBEC-3G改为作用在单链DNA上并且具有更强效力。作为其活性的结果，所有病毒DNA的胞嘧啶残基中，大约1％到2％被转换成尿嘧啶。被APOBEC-3G攻击后，脱氨作用或者产生无法扩充病毒的超突变DNA，或者通过触发基于尿嘧啶的切除途径，阻止了cDNA在靶细胞中的累积。或者，在负链中尿嘧啶数目的增加会削弱正链合成的起始。 

Vif阻断APOBEC-3G的作用机制目前仍未完全清楚。不过，已表明Vif可显著降低包装进病毒体的APOBEC-3G蛋白的水平。为了将APOBEC-3G排除在病毒体之外，Vif可以屏蔽APOBEC-3G与组装中的病毒体相作用的结构域、可以指导APOBEC-3G离开细胞中病毒组装的位点、或者可以诱导APOBEC-3G降解。有证据表明Vif的主要功能是诱导APOBEC-3G蛋白酶体依赖的降解，从而允许HIV-1复制(Navarroet al，2004；Trono，2004)。其次通过Vif所致的泛素化会导致APOBEC-3G的降解，这在APOBEC-3G和E3泛素连接酶复合物之间通过C-末端SOCS盒形成一个具有功能的桥(Addo et al.，2003，and Harris et al.，2003)。 

包括病毒蛋白及核酸在内的病毒组分的表达，在非允许细胞产生的病毒体内没有变化(Fouchier et al.，1996；Gabuzda et al.，1992；vonSchwedler et al，1993)。然而，缺失vif基因会导致病毒体形态上出现改变(Borman et al，1995；Bouyac et al 1997；Hoglund et al，1994)。 

一种带有15个特有氨基酸替代的天然Vif的突变体(F12-Vif)表现出抗HIV-1活性(D′Aloja et al，1998)，其最初是在F12 HIV-1变异体，即用原始HIV-1分离株感染的HUT78细胞中克隆的非生产型前病毒中鉴定的(Federico et al，1989)。 

我们已经开发了一种新颖的vif突变体，可于体外在感染了HIV-1的T细胞系中高效抑制HIV-1的复制。更具体地，我们已经发现F12-Vif的全长序列对保护防止HIV感染并非必需。实际上，我们已经表明F12-Vif的一个嵌合在WT-Vif之内、仅带有6个特有氨基酸替代的45个氨基酸的区域(F12-Vif-Chim3)，可保护人类T淋巴细胞免受HIV-1的感染。 

在本发明的各方面，Vif蛋白可以是F12-Vif与另一个Vif蛋白的嵌合体，另一个Vif蛋白优选地是天然存在的Vif蛋白。譬如，另一个Vif蛋白可以是HXB2 acc.#K03455、BRU ace.#K02013、SF2 acc.#K02007、PV22 acc.#K02083、MN acc.#M17449或者NL4-3 acc.#M19921 Vif(参见图1A、1B和1C)。在一个实施方案中，用于产生嵌合体的另一种Vif蛋白不具有F12-Vif蛋白中保守的15个氨基酸替代(即，22、29、41、48、66、80、109、127、128、130、131、132、142、185和186位)。优选地，需要有F12-Vif特异替代的嵌合体部分来源于F12-Vif蛋白，剩余的来自另一种Vif蛋白。例如，如果在127、128、130、131、132和142位需要F12-Vif特异替代(也就是说，在这些位点的氨基酸分别是N、V、R、L、S和I)，而在22、29、41、48、66、80、109、185和186位不需要，那么至少含有22到186位的嵌合体组分是来自F12-Vif，剩余的来自另一种Vif蛋白。 

在本发明的多个方面，本发明中的Vif蛋白可以通过在所需要的氨基酸位点产生点突变的方式来产生。例如，如果需要在F12-Vif蛋白的127、128、130、131、132和142位有特异的替代(也就是说，在这些位点的氨基酸分别是N、V、R、L、S和I)，那么可以在天然状态的Vif(例如，NL4-3)中的这些位置引入这些位点特异性的突变(例如，使用重叠PCR技术(Taddeo et al，1996))。 

优选地，本发明中的Vif蛋白是突变的Vif蛋白或其片段，当在靶细胞中表达时，会降低或者抑制HIV-1的复制。可以使用常规的诱变技术来对本发明中的突变Vif进行突变。对于诱变，我们也包括缺失或者替代。在一个特别优选的实施方案中，使用重叠PCR技术来引入位点特异的突变(Taddeo et ah，1996)。可以通过分析病毒复制来确定突变的Vif对HIV感染给予了至少某些抗性或者超抗性的能力。这些检验对于本领域的技术人员而言是已知的，在D′Aloja 2001中有描述。或者突变的HIV Vif可以回复成野生型，得到的产物可转染到可允许HIV的细胞中。这种方法能够鉴定其他有用的突变，因此能够鉴定本发明中其他有用的突变。 

HIV

在本文用法中，HIV包含那些被视为获得性免疫缺陷综合症 (AIDS)以及AIDS相关综合症的成因的，诸如HIV、譬如HIV-1和HIV-2，HTLV，譬如HTLV-III的所有名称。在两个主要的HIV类型--HIV-1和HIV-2中，HIV-1在全世界是优势种。迄今为止，主要存在两组HIV-1，“M”和“O”。导致HIV-1感染的大部分病毒属于M组。O组分离株与M组在遗传上相距甚远。M组中的HIV亚型包括亚型A-J。 

多核苷酸

本发明中的多核苷酸可包含DNA或RNA。它们可以是单链或者双链的。技术人员知道许多不同的多核苷酸由于遗传密码的简并性可以编码相同的多肽。此外，应该知道技术人员可以使用常规技术来产生不影响本发明中所用的多核苷酸所编码的多肽序列的核苷酸替代，以反映任何待表达多肽的特定宿主生物中密码子的使用率。可通过本领域中已有的任何方法来改造多核苷酸。可进行这类改造，以增强本发明中的多核苷酸的体外活性或者寿命。 

诸如DNA多核苷酸这样的多核苷酸可以通过重组、合成或者任何本领域技术人员已知的方法来产生。它们也可通过标准技术来克隆。 

一般通过重组方法来产生更长的多核苷酸，例如，使用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这涉及制备一对位于想要克隆的DNA靶序列区域两侧的引物(例如，约15-30个核苷酸)，将引物与从动物或人类细胞中获得的mRNA或cDNA接触，在可扩增所需区域的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增片段(例如，通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。可以将引物设计成含有合适的内切酶识别位点，这样可以将扩增的DNA克隆到合适的载体中。 

蛋白质

在本文用法中，术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多肽复合物，其中单个组分的多肽通过共价或非共价方式连接在一起。在本文用法中，术语“多肽”和“肽”是指其中单体为氨基酸并且通过肽键或二硫键连接在一起的多聚物。术语亚单位和结构域也可以指具有生物学功能的多肽及肽。 

变异体、衍生物、类似物、同源物和片段

除了本文提到的特定的蛋白质及核酸，本发明还包含其变异体、衍生物、类似物、同源物和片段。 

在本发明内容中，任意给定序列的变异体是指其中特定的残基(无论是氨基酸或者核酸残基)序列按照至少保留所讨论的多肽或者多核苷酸一种内源功能的这样一种方式而被改造的序列。可通过对于天然存在的蛋白质中的至少一个残基进行添加、缺失、替代、修饰替换和/或变化来改造成变异体序列。 

本文所用的涉及本发明中蛋白质或者多肽的术语“衍生物”，包括对序列中的一个(或多个)氨基酸残基的任意替代、变异、修饰、替换、缺失和/添加，所获得的蛋白质或者多肽至少保留一种内源功能。 

本文所用的涉及本发明中蛋白质或者多肽的术语“类似物”，包括任何类似的化学化合物，也就是说，它至少具有一种所模仿的多肽或者多核苷酸的内源功能。 

典型地，可以生成譬如从1或3到10或20个替代的氨基酸替代，只要改造后的序列保留所需活性或能力即可。氨基酸替代可包括使用非天然存在的类似物。 

本发明中的蛋白也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或者替代，其可产生沉默改变并生成功能上等价的蛋白。可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性特征来进行有目的的氨基酸替代，只要仍保留输送和调控功能即可。例如，阴性电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；阳性电荷氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及有着相似亲水值的具有不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸。 

例如，可以根据下表生成保守的替代。在第二列相同板块中的氨基酸、以及优选地，在第三列中相同行中的氨基酸，可以彼此替代。 

“片段”也是变异体，并且该术语典型地是用来指感兴趣——或者是功能上，或者，譬如，是实验中——的多肽或者多核苷酸中选定的区域。因此“片段’’是指作为全长多肽或者多核苷酸一部分的氨基酸或者核酸序列。这类变异体可使用诸如定点突变这样的标准重组DNA技术来制备。生成插入片段，即合成的DNA，它编码插入片段及与天然存在的序列上插入位点每一侧相对应的5’和3’侧翼区域。侧翼区域会含有合适的、与天然存在的序列中的位点相对应的限制性位点，以便可以用适当的酶来切开序列并将合成的DNA连接到切口处。然后将DNA依照发明进行表达，产生所编码的蛋白。这些方法仅仅是本领域多种DNA序列操作标准技术的示例，也可使用其它已知技术。 

优选地，多核苷酸变异体含有密码子优化的序列。在本领域中，密码子优化是作为增强RNA稳定性及因之的基因表达的方法而为人所知的。遗传密码的简并性意味着几个不同的密码子可以编码相同的氨基酸。例如，亮氨酸、精氨酸和丝氨酸每个均由6个不同的密码子编码。不同的生物表现出它们有使用不同密码子的偏爱性。例如，诸如HIV这样的病毒，使用大量的稀有密码子。通过改变核苷酸序列——将稀有密码子用相应的通常所用的哺乳动物密码子来代替，可在哺乳动物靶细胞中提高序列的表达。在哺乳动物细胞以及多种其它生物中的密码子使用表在本领域是已知的。优选地，至少部分序列是密码子优化的。甚至更优选地，整个序列都是密码子优化的。 

载体

如本领域所众所周知的那样，载体是允许或者帮助一个实体从一个 环境转移到另一个中的工具。依照本发明，并且通过实施例，某些用于重组DNA技术的载体允许诸如DNA片段(譬如异源DNA片段、譬如异源cDNA片段)这样的实体转移到宿主和/或靶细胞中，其目的是复制包含本发明中的核苷酸序列的载体和/或表达本发明中所用的蛋白。在重组DNA技术中所用载体的实施例包括但不限定于质粒、染色体、人工染色体或病毒。 

优选地，本发明中的多核苷酸整合在载体中。优选地，多核苷酸可操作地连接到控制序列上，其可帮助编码序列在宿主细胞中的表达，也就是说，载体是一个表达载体。术语“可操作连接”是指所述组分处于允许它们以其预期的方式来发挥功能的关系中。与编码序列“可操作连接”的调控序列，是以可使编码序列在与控制序列相容的条件下进行表达这样的方式进行连接的。 

控制序列可以被修饰，例如，通过添加进一步的转录调控元件来使得受控制序列指导的转录水平对转录调节物更加敏感。 

本发明中的载体可以是的质粒或者病毒载体，其可具有复制起点、可选择地带有用于多核苷酸表达的启动子、及可选择地带有启动子的调控物。载体可以包含一个或者多个选择标记基因，和/或诸如GFP这样的追踪标记。载体可以用于，例如，转染或者转化宿主细胞。 

可操作地连接到本发明中编码蛋白的序列上的控制序列包括启动子/增强子以及其它表达调控信号。可选择与有待在其中使用表达载体的宿主细胞相容的控制序列。术语“启动子”在本领域是众所周知的，包含大小不一的核酸区域以及从最低限度的启动子到包含上游元件及增强子在内的启动子的复合物。 

典型地，启动子从可在哺乳动物细胞中发挥作用的启动子中选择——尽管也可使用原核启动子以及在其它真核细胞中具有功能的启动子。典型地，启动子来源于病毒或者真核基因的启动子序列。例如，可以是来源于要在其中进行表达的细胞的基因组中的启动子。关于真核启动子，它们可以是以普遍存在的方式(诸如a-肌动蛋白、b-肌动蛋白、微管蛋白的启动子)、或者，以组织特异性方式(诸如丙酮酸激酶基因的启动子)发挥作用的启动子。也可使用病毒启动子，例如，莫罗尼小鼠白血病病毒长末端重复序列(MMLV LTR)启动子，劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子或者人巨细胞病毒(CMV)IE启动子。 

使用诱导型启动子也具有优势，因为这样可以在细胞生命周期中可调节异源基因的表达水平。诱导意味着使用启动子获得的表达水平可以被调节。 

此外，任何这些启动子均可通过添加进一步的调控序列，例如增强子序列来进行修饰。也可使用包含来自上述2个或多个不同启动子的序列元件的嵌合启动子。 

本发明中的载体可以是基于下述载体的逆转录病毒，所述载体已进行遗传改造以在病毒进入靶细胞时不能复制并且不会产生感染性病毒颗粒的子代。 

逆转录病毒

已鉴定了大量不同的逆转录病毒。实施例包括：小鼠白血病病毒(MLV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫罗尼小鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR小鼠骨肉瘤病毒(FBR-MSV)、莫罗尼小鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson小鼠白血病病毒(A-MLV)、禽骨髓细胞瘤病毒29(MC29)、以及禽红细胞增多症病毒(AEV)。可在Coffin et al.，1997，″Retroviruses″，Cold Spring Harbour LaboratoryPress Eds：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp 758-763中找到反转录病毒的详细清单。 

在本领域中已经确定了某些逆转录病毒的具体基因组结构。作为例子，HIV及Mo-MLV的细节可从NCBI Genbank获得(基因组序列号分别为Nos.AF033819和AF033811)。 

逆转录病毒可以广泛地分为两类：即“简单的”和“复合的”。逆转录病毒可以进一步分为7个组。其中5个组表示逆转录具有致癌潜力。剩余2组是慢病毒和泡沫病毒。在Coffin et al.，1997(同上)中有一份关于这些逆转录病毒的综述。 

每个逆转录病毒基因组包含称为gag、pol和env的基因，它们编码病毒蛋白和酶。在前病毒中，这些的两侧是被称为长末端重复序列(LTRs)的区域。LTRs负责前病毒的整合和转录。LTRs也可作为增强子-启动子序列，能够控制病毒基因的表达。通过位于病毒基因组5’末 端的psi序列的作用将逆转录病毒RNAs包装入衣壳。 

LTRs自身是一样的序列，每个可以分为称作U3、R和U5的三个元件。U3来源于RNA 3’末端的特有序列。R来源于RNA两个末端的重复序列，U5来源于RNA 5’末端的特有序列。这三个元件的大小在不同逆转录病毒之间变化很大。 

感染性逆转录病毒RNA基因组的基本分子构成是(5′)R-U5-gag，pol，env-U3-R(3′)。在缺陷的逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以缺失或者没有功能。在RNA两端的R区域是重复序列。U5和U3分别表示RNA基因组5’和3’末端的特有序列。 

不同逆转录病毒的宿主范畴及组织嗜性差异很大。在某些例子中，这种特异性可以限制重组逆转录病毒的转导潜力。因此，很多基因疗法实验使用MLV。已知一种具有被称为4070A包膜蛋白的特殊的MLV是双嗜性病毒，它也可以感染人类细胞——因为它的包膜蛋白与人和小鼠中保守的磷酸盐转运蛋白“泊定”在一起。该转运物是普遍存在的，因此这些病毒能够感染许多细胞类型。 

然而在某些例子中，尤其是从安全的角度来看，作用于专门限定的细胞会有好处。用异源的env基因取代env基因，是用来作用于特定某种细胞类型的技术或者策略的一个示例。该技术被称为假型包装。 

术语“重组逆转录病毒载体”(RRV)是指具有足够的逆转录病毒遗传信息、可允许RNA基因组在存在包装组分时包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中的载体。靶细胞的感染包括反转录以及整合到靶细胞的基因组中。典型地，所用的RRV带有将由载体递送到靶细胞中去的非病毒编码序列。在最终靶细胞内，RRV不能独立复制以产生具有感染性的逆转录病毒颗粒。本发明中的“重组逆转录病毒载体”来源于慢病毒载体。即，本发明中的重组逆转录病毒载体是一种“重组慢病毒载体”。 

在一个用于基因疗法的典型的重组逆转录病毒载体中，复制所必需的gag、pol和env蛋白编码区域中的一个或者多个的至少一部分从病毒中移除了。这使得逆转录病毒载体是复制缺陷的。然后可以用本发明中的多核苷酸替换被移除的部分，生成能够将其基因组整合到宿主基因组中的病毒，但改造后的病毒基因组由于缺少结构蛋白而不能散播。当整合到宿主基因组时，多核苷酸开始进行表达会导致，例如，治疗和/或诊断效果。这样，典型地，可通过：将多核苷酸整合到重组病毒载体中、 将修饰后的病毒载体包装到病毒体衣壳中、然后转导靶细胞的方式来实现将多核苷酸转运到感兴趣的位点。 

典型地，复制缺陷的逆转录病毒载体可通过联合使用包装或辅助细胞系以及重组载体来散播，例如，可制备合适滴度的逆转录病毒载体用于后续转导。也就是说，可以反式方式提供三种包装蛋白。 

“包装细胞系”含有逆转录病毒gag、pol和env中的一个或多个。包装细胞系产生包装逆转录病毒DNA所需的蛋白，但它由于缺少psi区域不能发生衣壳化。不过，当携带多核苷酸以及psi区域的重组载体导入包装细胞系时，辅助蛋白可包装重组载体以产生重组病毒母液。使用该病毒母液转导细胞，将多核苷酸导入靶细胞基因组中。 

基因组中缺少全部生成病毒蛋白所需的基因的重组病毒，仅能转导一次并且不能繁殖。这些仅能转导一轮靶细胞的病毒载体被叫做复制缺陷载体。因此，多核苷酸转入宿主/靶细胞基因组中后不会产生潜在有害的逆转录病毒。在Coffin et al，1997(同上)中有可使用的包装细胞系的概要。 

优选地，使用在不同的表达质粒上携带gag、pol和env病毒编码区域的逆转录病毒包装细胞系，所述质粒独立转染到上述包装细胞系。这种策略，有时候也称为三质粒共转染方法(Soneoka et ah，1995)，可降低产生可复制的病毒的可能性，这是因为要产生野生型病毒需要有三个重组事件。由于同源可以极大促进重组发生，降低或者消除载体与辅助子基因组之间的同源性也可用来减少生成可复制的辅助病毒的问题。 

另一种用来稳定转染包装细胞系的方法是使用瞬时转染细胞系。当进行载体展示时，瞬时转染可方便地用于测量载体生成水平。在这点上，瞬时转染避免了生成稳定的载体产生细胞系所需的比较久的时间，并且在载体或者逆转录病毒包装组分对细胞有毒性时也可使用。典型地，用于生成逆转录病毒的组分包括编码gag/pol蛋白的质粒、编码env蛋白的质粒、以及含有多核苷酸的质粒。载体生成涉及一个或多个这些组分进入到含有其它所需组分的细胞中的瞬时转染。 

控制本发明中多肽表达的一个方法是使用逆转录病毒的5’LTR。将多核苷酸序列可操作地连接到内部异源启动子上。这种排列在启动子选择方面具有灵活性。 

慢病毒类群可以分为“灵长类的”和“非灵长类的”。灵长类慢病 毒的实施例包括人免疫缺陷病毒(HIV)、人自发免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体、猴免疫缺陷病毒(SrV)。非灵长类慢病毒类群包括“慢病毒”原型——维斯纳/梅迪病毒(VMV)，及相关的山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)以及近来描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。优选地，本发明中的逆转录病毒载体可来源于HIV。 

慢病毒家族与其它类型的逆转录病毒之间的一个差别是慢病毒有能力感染分裂中以及未分裂的细胞。相反，其它逆转录病毒，譬如MLV不能感染诸如那些构成例如肌肉、脑、肺和肝脏组织这样的非分裂的细胞。 

尽管感染非分裂的细胞是慢病毒载体一个特殊的特征，但需要提供特定的条件进行稳定且有效的转导。这些条件包括HIV-1 Vpr的表达(Subbramanian et al.，1998；Vodicka et al，1998)、存在来自HIV-1 pol的多聚嘌呤通道(PPT)序列(Follenzi et al，2000)、以及单核细胞/巨噬细胞培养物的活化状态(Re and Luban，1997)。 

通过使载体对TNFα的刺激脱敏，例如通过缺失/突变TNFα在载体HIV-1 LTR启动子中的应答序列(即，NF-kB结合位点)，可显著降低载体的组成型表达。 

通过设计一种载体，其转录在缺少Rev/RRE相互作用时经历了核存留和降解，也可实现对HIV-1表达更为直接的依赖(Emerman et al，1989；Malim et al，1989)。而且，如同已对逆转录病毒载体所作的描述那样(Grignani et al，1998)，从生物安全角度看，使用新一代能够表达不整合到宿主基因组中的转基因的慢病毒载体具有很大的重要性。 

Tat蛋白调控慢病毒基因表达的水平。由于长末端重复序列(LTR)较弱的基础转录活性，前病毒的表达最初会导致只有少量的Tat、Rev和Nef蛋白的多拼接转录物。Tat通过结合到新生RNA中的茎环结构(反式激活应答元件[TAR])上可强烈提高转录，从而补充了细胞周期蛋白激酶复合物，其可刺激通过聚合酶II复合物的转录延伸。优选地，编码突变Vif的多核苷酸位于HIV-1 LTR的控制之下，由Tat激活，因此仅在细胞被HIV-1感染时才表达。因此将该载体设计为在非感染细胞中只有Vif的最小表达，从而降低了免疫原性，并且当细胞被HIV-1感染时可诱导到非常高的水平。这对于其它载体系统提供了更好的保护。 

在一个实施方案中，本发明中的慢病毒载体含有一个选择标记。优选地，选择标记是截短的神经生长因子受体(ΔLNGFR)。通常的神经营养素受体、低亲和力神经生长因子受体基因(LNGFR)(也称为p75NTR)在多数人类造血细胞中不表达，这样可以通过免疫荧光技术及单细胞解析度对转导基因表达进行定量分析。可在转导细胞中对LNGFR的表达进行荧光活化细胞分选分析，以研究基因表达。这样LNGFR可用作本发明中的选择标记。可在Mavilio 1994描述的Mavilio1994.A truncated LNGFR5 ΔLNGFR中找到使用LNGFR进行分析的进一步的细节。 

选择标记可以可操作地连接到内部启动子上或者从5′LTR表达。 

本发明中的慢病毒载体可以通过诸如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞或者造血干细胞这样的细胞来递送。特别地，使用了一种细胞依赖的递送系统。在该系统中，在体外将慢病毒载体导入一个或多个细胞中，然后将细胞导入患者体内。 

本发明中的慢病毒载体可以单独给药，但通常是作为药物组合物来给药的。 

治疗

本发明涉及对HIV感染或者相关疾病的治疗。应该意识到本文中用于治疗的所有文献包括了对HIV相关疾病的药物、缓和及预防治疗。哺乳动物的治疗是特别优选的。人类和兽医治疗也在本发明的范畴内。 

因此，本发明可以用来影响细胞内免疫，在受到HIV感染威胁的病人体内预防、或者至少是充分抑制最初感染。它也可通过阻断、或者至少是减缓感染扩散，并且预防或者至少是延缓AIDS或ARC的发病，用于HIV阳性患者的治愈性治疗中。 

在本发明一个优选的技术方案中，提供了一种对HIV感染或者重复感染提供抗性的方法，包括从患者体内取出HIV允许细胞、用本发明中的慢病毒载体转导细胞以实现HIV突变的Vif的整合，并再次将细胞转入患者体内。在Ferrari et al.，(1991)中描述了这种体外方法。或者，逆转录病毒载体可以在体内递送到细胞中。 

可以用，譬如用PCR并结合测序或者Southern杂交，来监测慢病毒载体整合到细胞核基因组中。 

药物组合物

药物组合物是包含治疗学上有效剂量的药学活性试剂或者由其所组成的组合物。优选地，它包括药学上可接受的载体、稀释液或者赋形剂(包括其组合物)。治疗用的可接受的载体或者稀释液在药学领域是众所周知的，并且在譬如Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中有所描述。对于药学载体、赋形剂或者稀释液的选取，可以根据制定的给药途径及标准的药学实践来选择。药物组合物可包含作为载体、赋形剂或者稀释液的，或者除此之外的任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂。 

药学上可接受的载体的实施例包括，例如，水、盐溶液、酒精、硅酮、蜡、凡士林油、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香水油、脂肪酸一酯和二酯、石油醚脂肪酸酯(petroethral fatty acidesters)、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮及其它类似物。 

如果合适，可以通过以下任何一种或多种途径来给药药物组合物：吸入剂，以栓剂或者药托的形式，典型地，以洗剂、溶液、乳膏、软膏或者爽身粉的形式，使用皮肤贴片，以含有诸如淀粉或者乳糖这样的赋形剂的片剂的形式口服，或者单独或与赋形剂一起混合在胶囊或胚珠中，或者以含有调味料或染色剂的酏剂、溶液或悬浮液的形式，或者它们可通过肠胃外注射的方式，例如海绵体、静脉、肌肉或皮下来给药。对于肠胃外注射给药，组合物最好以无菌水溶液的形式来使用，其中可含有其它物质，譬如足够的盐和单糖以使得溶液与血液等压。对于含服或者舌下给药，组合物可以以按照传统方式配制片剂或者锭剂的形式给药。 

根据不同的递送系统，对组分/配方会有不同的需求。作为实施例，本发明中的药物组合物可以配制成使用微型泵或者通过黏膜通道来递送，例如作为用于吸入或摄入溶液的鼻喷雾或者气雾剂，或者通过将组分配制成可注射的形式以肠胃外注射方式进行递送，例如通过静脉、肌肉内或皮下途径。或者，可以将配方设计成可以通过两种途径来递送。 

编码用于影响病毒感染的多肽组分的多核苷酸/载体可以以裸核酸构建体、优选地进一步包含与宿主细胞同源的侧翼序列的方式来直接给 药。当多核苷酸/载体以裸核酸方式给药时，给药的核酸的量典型地在1μg到10mg的范围内，优选地为100μg到1mg。 

可通过几种已知的转染技术，例如那些包括使用转染试剂的技术来增强哺乳动物细胞对裸核酸构建体的摄入。这些试剂的实施例包括阳离子试剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)及脂质体(例如lipofectam^TM和transfectam^TM)。典型地，将核酸构建体与转染试剂混合以生成组合物。 

本发明中的组合物也可与其它抗逆转录病毒药物，尤其是诸如AZT及ddl这样的抗HIV药物联合使用。 

所述的给药途径和药量只起指导作用，熟练的从业人员能够针对任何特定患者及条件轻易确定出最优的给药途径和剂量。 

现在将通过非限制实施例的方式来描述本发明中进一步优选的特征与技术方案。 

实施例1材料和方法

细胞 

CEM A3.01是T淋巴母细胞系CEM的一种衍生克隆，对HIV-1的细胞病变效果高度敏感(Folks et al.，1985)。在补充了10％FCS(EuroClone Ltd，UK)以及青霉素、链霉素和谷氨酰胺(PSG)混合物的RPMI 1640上培养CEM A3.01、CEMss(Nara et al.，1988)、Sup-T1(Smith et al.，1984)及PM1细胞(Lusso et al..1995)。在补充了10％FCS及PSG的Iscove′s Modified Dulbecco′s培养基(IMDM)上繁殖人肾293T细胞。 

通过在Ficoll-Hypaque梯度离心机(Lymphoprep，Nycomed PharmaAS，Norway)上离心，从脐带血中纯化人新生白细胞。使用CD4+T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec，Sunnyvale，CA，USA)通过阴性选择分离CD4+T细胞。分别使用抗CD4、抗CD45RA和抗CD45RO抗体(BDPharmingen^TM)通过流式细胞仪来确认其纯度(＞95％)与天然表型。将CD4+T淋巴细胞在含有10％人血清、50 U/mlIL-2(Chiron，Emeryville，CA)、25 U/mlIL-7(Immuno Tools，Germany)并以0.5磁珠/细胞的比例存在Dynabeads CD3/CD28 T细胞扩增仪(Dynal Lake Success，NY，USA)的X-VIVO-15(BioWhittaker，Cambrex Bio Science，Venders，Belgium)中培养3天。 

质粒 

通过将位于磷酸甘油酯激酶(PGK)启动子控制下的编码截短形式的低亲和力神经生长因子受体(ΔLNGFR)的PGK-ΔLNGFR盒(Boniniet al.，1997)克隆到慢病毒载体pHR2(Dull et al.，1998)中的ClaI/SacII位点，从而产生慢病毒载体PΔN。通过在PΔN载体的ClaI位点分别插入PCR扩增的、611bp长的F12-vif或者野生型(WT)vif序列获得了F12-VifPΔN和VifPΔN载体。WT HIV-W3(ace.#M19921)和F12-HIV-1(ace.#Z1 1530)DNA用作vifPCR的模板，引物如下：正向：5′-GCAAAGAATCGATGGGATTATGGAAAACAG-3′；反向：5′-CTCCTCTAATCGATGCTAGTGTCCATTCATTG-3′(ClaI序列用粗体表示)。所有的PCR扩增片段和克隆接头均完整测序。我们从前述PΔN慢病毒载体(Vallanti et al，2005)出发，生成了三个携带嵌合WT/F12 vif基因的载体——Chim1PΔN、Chim2PΔN和Chim3PΔN。Chim1PΔN编码F12-vif N末端最初的87个氨基酸以及剩余的WT-vif中的106个氨基酸，Chim2PΔN编码一种嵌合蛋白，其中的两个结构域与Chim1PΔN中的互换了一下，最后，Chim3PΔN编码一种嵌合蛋白，其中F12-vif的126-170氨基酸区域插入到WT-Vif骨架中。前两个嵌合基因是使用两个NL4-3 HIV-1分子克隆突变体为PCR模板获得的，其中来自F12-HIV基因组的BSpMI-PflMI(259 bp)和PflMI-EcoRI(440 bp)片段分别被替换了。第三个载体是由Primm s.r.l(Milano，Italy)通过DNA合成来产生的。三个嵌合基因克隆到PΔN空载体的ClaI位点上。所有的PCR扩增片段和克隆接头均通过测序进行检验。F12-VifPΔN和WT-VifPΔN已在前面描述过。pCEM15：HA质粒(Sheehy et al.，2002)由M.Malim(King′sCollege，London，UK)惠赠。 

产生假型慢病毒载体 

通过用转运载体、第二代最小包装构建体pCMVΔR8.74，其表达Gag、Pol、Tat和Rev、以及编码水疱性口炎病毒包膜糖蛋白VSV-G(Zufferey et al.，1997)的pMD.G质粒的瞬时共转染293T细胞，来产生假型慢病毒载体母液。在转染前24小时用三种质粒按2∶1∶3的比例通过Fugene^TM6(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)接种0.4× 10⁶/ml的细胞。转染后48-72小时收取上清，通过低速离心使其澄清(1500rpm 10分钟)，并通过0.45-μm孔径大小的滤膜进行过滤。通过用病毒母液的一系列稀释溶液转导细胞来计算病毒滴度。使用标准RT检验和p24 Ag ELISA步骤(Coulter Corporation，Westbrook，ME)可对病毒母液进行统一化。 

细胞的转导与ΔLNGFR免疫筛选 

通过离心方法转导细胞。简要地，将每种VSV-G假型载体的RT检验统一化的上清与1×10⁶个细胞温育，终体积为2ml(MOI为0.5到5)，在存在凝聚胺(8μg/ml)的条件下于2200rpm离心1小时。48小时后，用PBS洗涤细胞，并加入新鲜的完全培养基。在离心方法后，使用抗人p75-LNGFR单克隆抗体20.4(ATCC，Rockville，MD)和R-藻红蛋白(RPE)连接的羊抗鼠血清(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)通过流式细胞仪分析ΔLNGFR表达(FACScan，BectonDickinson，Mountain View，CA)，对转导效率至少监测一个星期。用MiniMACS微珠(Miltenyi Biotec Inc.，Sunnyvale，CA)根据制造商说明书通过磁性细胞分选来获得ΔLNGFR⁺细胞的免疫选择。经FACS染色，ΔLNGFR⁺纯度为＞92％。通过改进后的离心方法(凝聚胺浓度：4μg/ml；病毒上清用过夜温育后的新鲜培养基来代替)来转导原代T细胞。在离心方法后3天按对细胞系所进行的描述来选择ΔLNGFR⁺T淋巴细胞。 

Western印迹分析 

如前所述(Bovolenta et al.，2002)制备大小不一的全细胞蛋白提取物(40μg)，用12.5％SDS-PAGE按大小进行分离，然后通过电印迹转移到Hybond ECL硝酸纤维素膜(Amersham，Little Chalfont，UK)上。于室温下在5％的低脂干牛奶中将膜封闭1小时，然后于4℃与合适的一抗温育过夜。通过AIDS研究及参考试剂计划(Division of AIDS，NIAID，NIH，Bethesda，MD)从Dana Gabuzda处获得了HIV-1HXB2 Vif兔抗血清(Goncalves et al.，1994)，以1∶1000的稀释度使用。兔抗人肌动蛋白的多克隆抗体(Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO)以1∶250的稀释度使用。从一个AIDS患者身上获得的可识别所有主要HIV-1蛋白的血清，以1∶2000的稀释度使用。利用增强的化学发光系统(ECL，Amersham)， 通过以1∶10000稀释度的辣根过氧化物酶连接的二抗、抗兔及抗人抗体(Amersham，Little Chalfont，UK)可观察到抗体结合。 

Northern印迹分析 

CEM A3.01不经处理，或者用放线菌酮(10μg/ml；Calbiochem

)处理8小时。利用Trizol试剂(Life Technologies^TM Inc.，Gaithersburg，MD)根据制造商说明书来提取总RNA，于0.8％的琼脂糖甲醛凝胶上电泳，通过毛细管转移转到Hybond-N膜(Hybond-N，Amersham)上，在PerfectHyb PLUS杂交缓冲液(Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO)中用10⁶ dpm/ml的³²P标记的1-kbΔLNGFR片段作为探针进行检测，于-70℃置于X-射线底片上(图14)。 

HIV-1感染 

用下述菌株对细胞进行急性感染：实验室驯化的X4 HIV-1 IIIB/LAI(ABI，Advanced Biotechnologies，Columbia，MD)、分子克隆X4 HIV-1_NL4-3及其Δvif衍生物(Gibbs，1994)、分子克隆R5 HIV-1 AD8(ABI，Advanced Biotechnologies，Columbia，MD)和K.Peden友情捐赠的pAD1vifl HIV(FDA，NIH，Bethesda，MD)。病毒(MOI范围是0.01到1)于37℃吸附到细胞上2-5小时，然后用PBS洗涤两次。最后将细胞重悬在完全培养基中，以0.5-1×10⁶/ml一式三份接种到96孔板中。每4天收集培养物上清，储存在-80℃，直到根据标准程序对Mg²⁺依赖的RT活性检验或者p24 ELISA进行检测为止。 

实施例2突变Vif的Tat依赖表达

我们已表明用编码Vif突变体的慢病毒载体和包装构建体(作为Tat来源)共转染的293T细胞中，嵌合蛋白以Tat依赖的方式进行表达(图7)。 

按先前所述(Bovolenta，2002#205)制备全细胞提取物(WCE)。通过SDS-PAGE根据大小分离蛋白，通过电印迹转移到Hybond ECL硝酸纤维素膜(Amersham，Little Chalfont，UK)上。在5％的低脂干牛奶中将膜封闭，然后与合适的一抗温育。通过AIDS研究及参考试剂计划(Division of AIDS，NIAID，NIH，Bethesda，MD)从Dana Gabuzda处获得 了HIV-1_HXB2 Vif兔抗血清(Goncalves et al.，1994)，以1∶1000的稀释度使用。 

蛋白具有不同的细胞内稳定性，其中F12-Vif(图2)、Chim2(图4A5B)和Chim3(图5A5B)不再存在，而WT-Vif(图1C)和Chiml(图3A5B)在72小时时仍有累积。 

实施例3  突变Vif构建体在T细胞中抑制HIV-1的复制

我们最初通过用X4分子克隆NL4-3，在MOI为0，1时感染模拟转导及LV转导的CEMA3.01细胞来比较F12-Vif三种嵌合体潜在的抗病毒活性。图8A所示的是含有F12-Vif N末端区域的Chim1没有抗病毒活性，而Chim2和Chim3(表达F12-Vif的C末端结构域)以与F12-Vif相当的方式来抑制HIV-1的复制。尽管在Chim3中的F12-Vif序列要短于Chim2中的(在45对104个氨基酸中分别为含有6对9个特有的氨基酸替代)，但它的抗病毒活性比Chim2略高。因此，此后我们仅报道Chim3与F12-Vif相比较的效果，为了简化略去了Chim2的效果总是与Chim3的效果平行。我们在CEMss(图8B)和Sup-T1(图8C)允许细胞中通过用X4 NL4-3 HIV-1在MOI为0.1时感染它们来确认Chim3的HIV抑制活性。在两个例子中，Chim3抑制HIV-1复制与F12-Vif同样有效。最后，为了检验Chim3对R5 HIV-1株的抑制活性，我们使用PM1细胞作为唯一的被R5 HIV-1株感染的T细胞(Lusso et al.，1995)。用HIV-1 AD8分子克隆在MOI为0.1时感染模拟转导和Chim3PΔN转导的细胞，在感染后6天分析病毒复制。如图8D所示，5个表达Chim3的细胞与模拟转导细胞相比，病毒的释放降低4倍。 

实施例4  在来源于脐带血的CD4+T淋巴细胞中抑制X4和R5HIV-1株的复制

用不同的LVs转导来源于健康正常供体脐带血中的活化前CD4+T淋巴细胞，并用X4 HIV-1 NL4-3株在MOI为0.1时进行感染。同模拟转导的细胞相比，带有整合了Chim3基因的T淋巴细胞在整个实验过程中同F12-Vif一样控制了HIV-1感染(图9A)。在用来源于不同的供体并且用R5分子克隆HIV-1 AD 8在MOI为0.1时进行感染的CD4+T淋巴细胞中也获得了类似结果(图9B)。 

实施例5 Chim3在CB来源的CD4+T淋巴细胞中不恢复Δvif HIV-1的复制

为了研究是否F12-Vif、Chim2和Chim3的抑制活性依赖于存在WT-Vif，我们用Δvif/HIV-1在MOI为1时感染模拟转导的以及用载体转导的非允许CEM A3.01细胞(图10)。如预期所料，Δvif HIV-1在模拟转导和PΔN转导的细胞中均没有复制，但它可在提供反式WT-Vif的细胞中有效生长。引入注意的是，Δvif HIV-1也从表达F12-Vif和Chim2的细胞中释放了，但没有从表达Chim3的细胞中释放，表明一旦遇上以潜伏状态携带有Δvif HIV-1准种的病人时，Chim3比Chim2更安全(图10)。 

在一个进一步的实验中，我们用在X4或者R5嗜性环境中生成的vif缺陷病毒在MOI为0.1时感染模拟转导的、F12-Vif和Chim3转导的CD4+T淋巴细胞，并分别观察感染动力学39天(X4Δvif HIV，图11A)和29天(R5 Δvif HIV，Fig.11B)。同我们先前所描述的相反(22)，在这里确认了F12-Vif、Chim3不恢复两种vif缺陷病毒的复制，尽管用R5-向性株(tropic strain)观察到微弱水平的病毒复制(图11B)。所有这些结果表明Chim3不仅在与F12-Vif所能达到的类似水平上抑制HIV复制，而且更重要地，它不会救助vif缺陷病毒的复制。因此，这使得Chim3与F12-Vif相比，是用于抗HIV基因治疗途径的更好的候选者。就Vif作为HIV-1限制因子hHA3G的中和因子的效果而言，Chim3表现出了实际上真正显性的阴性表型。 

实施例6  同模拟转导HIV-1感染细胞相比，Chim3给予了转导感染细胞生存优势

为了研究是否Chim3转导细胞比其模拟转导副本表现出选择优势，我们将CEM A3.01 LVs转导细胞与模拟转导细胞以等比例(50∶50)进行混合。然后将细胞分为两个群体，一个不感染，另一个用X4 HIV-1 NL4-3在MOI为0.01时进行感染。在培养20天时计算NGFR+感染细胞超过非感染细胞的百分比。通过FACS分析监测NGFR的表达。图12表明在所有的细胞类型中，在HIV-1感染后NGFR+细胞均有增加。然而，Chim3和F12-Vif转导细胞的增量比对照细胞高2到5倍，说明这 两个治疗基因均对遗传改造细胞提供了更强的选择优势。 

实施例7 Chim3仅在非允许细胞的蛋白酶体中优选降解，其水平与细胞因子——人APOBEC3G(hA3G)负相关

基于Chim3与F12-Vif相反这个事实，其行为类似真正显性的阴性因子，我们想知道在Chim3转导的细胞中hA3G的水平如何。我们首先分析在非感染的转导非允许细胞CEM A3.01和允许细胞Sup-T1中嵌合体表达的基础水平。令人吃惊的是，Chim2和Chim3的表达远低于其它Vif(图13A)，表明这两个嵌合体具有不一样的稳定性或者表达。 

由于Vif在非允许细胞HeLa和293T中被蛋白酶体降解(Fujita et al.，2004)，我们接下来想知道在存在或者缺失蛋白酶体抑制物MG132时在允许及非允许细胞中Vif蛋白的水平。如图13B中上图所示，Chim2和Chim3的表达在Sup-T1细胞中也低于其它Vif，用MG132处理只诱导了蛋白的微弱累积(图13C)。相反，Chim3在MG132处理后比其它Vif的累积高约3倍(图13B中下图和图13C)。更重要的是，仅在表达Chim3的细胞中通过western印迹分析检测到hA3G，其水平与MG132处理细胞中Chim3的水平负相关(图13B，中图)。这些结果表明Chim3仅在非允许细胞的蛋白酶体中优选降解，并且它的低水平允许hA3G正常表达。 

实施例8 Chim3通常由载体表达，经放线菌酮处理后其mRNA会累积

为了确定是否Chim3的低表达也是由于低转录所致，我们使用NGFR探针对从LV转导的未感染的CEM A3.01细胞中获得的总RNA进行Northern印迹分析。LV转录三种不同的RNA——由载体5′LTR所驱动的全长的和拼接的RNA，以及组成型的PGK-ΔLNGFR mRNA(VaIlenti et al.，2005)。在缺少Tat和Rev的未感染的细胞中，5′LTR确实发挥了功能，Vif蛋白累积了，但比感染的细胞要弱。因此，仅仅检测到的两条条带，对应于含有Vif的拼接RNA及组成型ΔLNGFR RNA。令人惊奇的是，Chim2和Chim3 LV的表达要强于其它LV(图14A)，并与合成的蛋白水平负相关。为了进一步研究这种明显的矛盾的成因，我们用可封闭蛋白合成的放线菌酮处理细胞8小时。值得注意的是，Chim3 mRNA的累积高于其它Vif(图14B and C)。这些结果表明是所分析的Vif，而非Chim3，通过负反馈机制调节它们自己的转录。Chim3被正常转录了，它所转录出的mRNA很稀少，可能是由于蛋白很容易会被蛋白酶体降解的缘故。 

实施例9  免疫原性

单独存在时，Vif是HIV-1蛋白中免疫原性较低的一个(Addo et al.，2003)。并不期望本发明中的突变Vif多肽会与WT-Vif在这方面有显著差别，至少在预测HLA-I结合多肽时基于BIMAS(http://bimas.cit.nih.gov/)和RANKPEP(http://www.mifoundation.org/Tools/rankpep.html)的算法是如此(数据没有列出)。突变Vif的低免疫原性以及Tat依赖的表达，可避免或者至少最小化在体内针对未感染的逆转录病毒转导细胞的免疫应答。在另一方面，野生型HIV-1LTR保证了转基因在HIV-1感染细胞中的非常高的表达水平，这是反式显性突变蛋白具有活性的至关重要的必要条件。 

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Claims (31)

1.一种由编码Vif的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中位于图1A中序列的127、128、130、131、132和142位的每个氨基酸分别为N、V、R、L、S和I，并且其中位于22位的氨基酸是K、位于29位的氨基酸是M、位于41位的氨基酸是R、位于48位的氨基酸是N或H、位于66位的氨基酸是I、位于80位的氨基酸是H、位于109位的氨基酸是L、位于185位的氨基酸是G，且位于186位的氨基酸是S。

2.如权利要求1所述的由编码Vif的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中位于48位的氨基酸是N。

3.一种多核苷酸，其由编码图5A中所示的氨基酸序列的核苷酸序列组成。

4.一种多核苷酸，其由图15中所示的核苷酸序列组成。

5.由前述任一项权利要求所述的多核苷酸所编码的Vif多肽。

6.由图5A中所示的氨基酸序列组成的Vif多肽。

7.一种载体，其包含在权利要求1到4中任一项所述的多核苷酸。

8.如权利要求7所述的载体，其中该载体是逆转录病毒或者慢病毒载体。

9.如权利要求8所述的载体，其中慢病毒载体来源于HIV。

10.如权利要求8或9所述的载体，其中所述多核苷酸可操作地连接到病毒LTR上。

11.如权利要求8到10中的任一项所述的载体，其中所述多核苷酸的表达是tat依赖的。

12.如权利要求8到11中任一项所述的载体，其缺少tat基因。

13.如权利要求8到12中的任一项所述的载体，其中所述多肽的表达处于HIV-1的诱导控制之下。

14.如权利要求8到13中任一项所述的载体，其缺少gag、pol和env基因中的任意一个或者多个、或者全部。

15.如权利要求7到14中任一项所述的载体，其进一步包含编码选择标记基因的多核苷酸序列。

16.如权利要求7到15中任一项所述的载体，其进一步包含编码p75低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)最低限度部分的多核苷酸序列。

17.如权利要求7到16中任一项所述的载体，以整合的前病毒的形式存在。

18.可从权利要求7到17中任一项所述的载体获得的逆转录病毒或者慢病毒颗粒。

19.如权利要求18所述的逆转录病毒或者慢病毒颗粒，其中颗粒是假型病毒。

20.用于产生权利要求18或19中逆转录病毒或者慢病毒颗粒的逆转录病毒或者慢病毒生产体系，其包含权利要求7到17任一项所述的载体，及逆转录病毒或者慢病毒的gag-pol，以及逆转录病毒或者慢病毒的env，或者是非逆转录病毒或者非慢病毒的env。

21.如权利要求20所述的逆转录病毒或者慢病毒生产体系，其中逆转录病毒或者慢病毒的gag-pol及env在不同的载体上。

22.如权利要求20或21所述的逆转录病毒或者慢病毒生产体系，其中env选自RD114-TR、VSV-G、GALV或4070A。

23.一种细胞，其包含权利要求1到4任一项所述的多核苷酸。

24.一种由权利要求7到17任一项所述的载体或者权利要求18或19所述的逆转录病毒颗粒感染或转导的细胞。

25.如权利要求23或24所述的细胞，其中所述的细胞是单核细胞、巨噬细胞或者淋巴细胞。

26.如权利要求25所述的细胞，其是造血CD34+前体细胞或者造血细胞。

27.如权利要求23到26中任一项所述的细胞，其中突变的Vif处于HIV-1的诱导控制之下。

28.一种药物组合物，其包含权利要求1到4任一项中的多核苷酸、权利要求5或6任一项中的多肽、权利要求7到17任一项中的载体、权利要求18或19中的逆转录病毒颗粒、或者权利要求23到27任一项中的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释液或者赋形剂。

29.权利要求1到4任一项中的多核苷酸、权利要求5或6任一项所述的多肽、权利要求7到17任一项所述的载体、权利要求18或19所述的逆转录病毒颗粒、或者权利要求23到27任一项所述的细胞，或如权利要求28所述的药物组合物在制备药物中的用途。

30.使用权利要求1到4任一项所述的多核苷酸、权利要求5或6任一项所述的多肽、权利要求7到17任一项所述的载体、权利要求18或19所述的逆转录病毒颗粒、或者权利要求23到27任一项所述的细胞，或如权利要求28所述的药物组合物在制备用于治疗或者预防HIV感染的药物中的用途。

31.如权利要求30的用途，其中所述的HIV感染是指重复感染。

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