KR101383567B1 - 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브 및 이의 제조방법 - Google Patents

마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 내 DNA의 추출능력이 우수한 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브 및 이의 제조방법을 개시한다. 이를 위하여, 본 발명은 아민 그룹으로 치환된 탄소나노튜브를 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액에 첨가하고 교반하여 1차 생성물을 생성하는 단계와, 상기 1차 생성물을 1.5M NaOH 수용액에 적가하여 2차 생성물을 생성하는 단계, 및 상기 2차 생성물을 원심분리한 후 침전물을 회수하여 건조시키는 단계를 포함하는 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 전통적인 유기용매 추출방법과 달리 페놀을 이용하지 않기 때문에 인체에 해롭지 않고, 환경오염 등의 문제가 최소화되며, 목적 DNA에 대한 결합성 및 DNA의 수득률이 높아 단위 시간당 필요한 시료 DNA를 다량으로 확보할 수 있다.

Description

마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브 및 이의 제조방법{CARBON NANOTUBES COATING MAGNETITE PARTICLES AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포 내 DNA의 추출능력이 우수한 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
나노기술은 원자 또는 분자들을 적절히 결합시킴으로써 기존 물질의 특성 개선은 물론 신물질, 신소자 창출에 더욱 적합하여 그 응용분야가 전자, 재료, 통신, 기계, 의약, 농업, 에너지, 환경 등 매우 다양하다.
이상과 같이 나노기술은 다양하게 발전하고 있으며 크게 세 가지 분야로 분류되어 있다.
첫째, 나노 소재로 미세한 크기의 새로운 물질과 재료를 합성하는 기술에 관한 것이다. 둘째, 나노소자인데 나노 크기의 재료들을 조합하거나 배열하여 일정한 기능을 발휘하는 장치를 제조하는 기술에 관한 것이다. 셋째, 나노-바이오라 불리는 나노기술을 생명공학에 응용하는 기술에 관한 것이다.
특히, 나노-바이오 분야에서 나노입자들은 암세포 특이적 살상, 면역반응의 부스팅(boosting), 세포 융합, 유전자 또는 약물 전달, 진단 등에 이용되고 있다. 이러한 나노입자들이 전술한 용도에 이용되기 위해서는 상응하는 활성성분을 부착할 수 있는 부분을 구비해야할 뿐만 아니라 생체 내 즉, 수용성 환경에서 운반 및 분산되어야 한다. 이러한 조건을 만족시키기 위하여 현재까지 다양한 기술들이 개발되어져 왔다.
예를 들면, 대한민국 등록특허 제10-0538767호는 γ-Fe2O3 및 테트라에톡시실란[TEOS; Si(OC2H4)4]을 사용하여 제조되는 실리카가 코팅된 성질자성 나노입자의 제조방법을 개시하고 있다. 그러나, 이러한 발명은 DNA를 선택적으로 분리하기 위한 기술이 아니라 단백질을 분리 정제하기 위한 것이다.
또한, 미국특허공보 US 6,638,494호는 산화철과 같은 금속을 포함한 자성 나노입자에 관한 것으로 상기 나노입자의 표면에 특정한 카르복실산을 부착하여 중력 또는 자기장에서 나노입자가 응집 및 침전되는 것을 방지하는 방법을 개시하고 있다. 이때, 특정한 카르복실산으로는 말레산, 타르타르산, 글루카르산과 같은 지방족 디카르복실산 또는 시트르산, 시클로헥산,트리카르복실산과 같은 지방족 폴리디카르복실산이 이용되었다.
그러나 상기 방법은 나노입자를 수용액에서 합성하는데 이 경우 나노입자의 크기 조절이 어렵고, 합성된 나노입자가 크기가 불균일하다는 문제점이 있다. 또한, 상기 나노입자의 표면은 단분자 계면안정제로 코팅되어 있어 나노입자와의 결합력이 크지 않기 때문에 수용액에서 안정성이 떨어진다는 문제점이 있다.
이에 따라, DNA, RNA 등을 선택적으로 분리할 수 있으며 고순도 정제가 가능한 기술의 개발이 요구되고 있다.
대한민국 공개특허 제10-2012-0107543호(2012.10.04 공개) 대한민국 등록특허 제10-0652251호(2006.12.01 공고) 대한민국 등록특허 제10-0538767호(2005.12.26 공고) 미국 등록특허 US 6,638,494호(2003.10.28 등록)
따라서 본 발명의 제 1 목적은 세포 내의 DNA를 고순도 및 고용량으로 분리하여 정제할 수 있으며, 세포 내의 DNA를 추출하는 과정에서 원심분리 공정이 불필요한 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 제 2 목적은 상기 탄소나노튜브의 제조방법을 통해 제조된 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브를 제공하는데 있다.
상술한 본 발명의 제 1 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아민 그룹으로 치환된 탄소나노튜브를 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액에 첨가하고 교반하여 1차 생성물을 생성하는 단계와, 상기 1차 생성물을 1.5M NaOH 수용액에 적가하여 2차 생성물을 생성하는 단계, 및 상기 2차 생성물을 원심분리한 후 침전물을 회수하여 건조시키는 단계를 포함하는 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법을 제공한다.
그리고 본 발명의 제 2 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전술한 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법에 의해 제조되는 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브를 제공한다.
본 발명에 따른 탄소나노튜브를 사용하면, 전통적인 유기용매 추출방법과 달리 페놀을 이용하지 않기 때문에 인체에 해롭지 않고, 환경오염 등의 문제가 최소화되며, 목적 DNA에 대한 결합성 및 DNA의 수득률이 높아 단위 시간당 필요한 시료 DNA를 다량으로 확보할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 탄소나노튜브를 DNA 추출에 사용하면, 원심분리 공정을 이용하지 않고도 원심분리 공정을 이용하는 경우에 근접한 DNA 추출 수율을 확보할 수 있다
도 1은 본 발명의 마그네타이트가 코팅된 탄소나노튜브에 대한 투사전자현미경의 이미지이다.
도 2는 양전하로 치환된 CNT와 본 발명의 Fe3O4@CNT에 대한 XRD 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 첨부도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예들에 의한 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브(이하, '핵산 추출용 탄소나노튜브'라고 약칭함)와 이의 제조방법을 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브(Carbon NanoTube : CNT)의 제조방법은 CNT를 자성입자 수용액에 첨가하고 교반하여 1차 생성물을 생성하는 제 1 단계와, 상기 1차 생성물을 수산화나트륨(NaOH) 수용액에 적가하여 2차 생성물을 생성하는 제 2 단계, 및 상기 2차 생성물을 원심분리한 후 침전물을 회수하여 건조시키는 제 3 단계를 포함한다.
먼저, 본 발명에 따른 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법은 제 1 단계 이전에 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액의 생성단계를 더 포함할 수 있다.
상기 마그네타이트 입자는 입자 자체가 자기장을 가지고 있지는 않지만 자기장에 노출되었을 때는 자기쌍극자를 형성하는 물질이다.
이러한 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액은 염화수소(HCl)에 염화제일철 사수화물(FeCl2·4H2O) 및 염화제이철 육수화물(FeCl3·6H2O)의 혼합물을 첨가하여 생성한다. 이때, HCl로는 0.5 내지 2 M, 바람직하게는 1M의 HCl 수용액을 사용할 수 있다.
보다 구체적으로, 먼저 상온에서 Fe2+와 Fe3+의 몰비(Fe2+/Fe3+)가 1/2 내지 1, 바람직하게는 1/2이 되도록 염화제일철 사수화물과 염화제이철 육수화물을 혼합한 후 초음파 파쇄기로 교반시켜 새로운 강자성체 철산화물인 Fe3O4(또는 FeOFe2O3) (이하, '강자성체 철산화물'이라 약칭함)을 생성한다. 이때, 상기 초음파 파쇄기는 마그네타이트 나노입자(약 10 ㎚)의 생성을 유도하고, 생성된 마그네타이트 나노입자를 분산시키는 역할을 수행한다.
여기서, Fe2+와 Fe3+의 몰비가 1/2 미만이거나 Fe2+와 Fe3+의 몰비가 1을 초과하면 강자성체 철산화물 생성 효율이 떨어지며 염화제일철 사수화물과 염화제이철 육수화물등과 같은 반응물이 불순물로 남아 있게 된다.
보다 구체적으로, 본 단계에서는 1M HCl 수용액 100 ㎖를 기준으로 HCl 수용액에 11 내지 21㎎, 바람직하게는 15.9 ㎎의 염화제일철 사수화물과 34 내지 54㎎, 바람직하게는 43.8 ㎎의 염화제이철 육수화물을 첨가하고, 이를 혼합하여 마그네타이트 자성입자 제조를 위한 전처리 수용액을 생성한다.
그리고 본 발명에 따른 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법은 제 1 단계를 포함한다.
본 발명의 제 1 단계는 아민 그룹으로 치환된 CNT를 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액(또는 마그네타이트 자성입자 제조를 위한 전처리 수용액)에 첨가하고 교반하여 1차 생성물을 생성하는 단계로서, 자성입자 수용액에 포함된 자성나노입자(또는 자성입자 전처리 수용액에서 생성된 자성나노입자)가 CNT의 표면에 균일하게 분산 고정화시키는 과정을 수행한다. 이때, CNT 표면에 분산되는 마그네타이트 자성입자는 세포 내의 DNA를 선택적으로 추출하는 역할을 수행한다.
또한, 상기 아민 그룹은 세포 내 DNA를 CNT에 결합시키기 위한 것으로, 아민 그룹의 양전하가 세포 내 DNA의 음전하와 이온 결합됨으로써 CNT-DNA 복합체가 형성된다.
예컨대, DNA를 포함한 시료에 아민 그룹으로 치환된 CNT를 첨가하여 반응시키면, 상기 반응을 통해 CNT의 표면에 DNA를 결합시킴으로써 상기 시료의 DNA가 추출된다. 다시 말해, 양전하를 띤 CNT는 핵산과 양전하-음전하의 결합이 진행되므로, 핵산과의 결합력이 강화되어 음전하를 띤 CNT나 비극성 CNT와 비교하여 시료로부터 DNA 회수률이 증가된다.
또한, 기존 비극성 CNT와 DNA의 결합 원리는 CNT 표면과 DNA의 염기와의 π-π 결합으로써, CNT와 DNA를 결합시키기 위하여 수 시간의 반응 시간이 필요하였다. 하지만, 아민 그룹으로 치환된 CNT의 경우는 CNT의 표면에 양전하를 도입함으로써 약 5분 이내에 CNT와 DNA의 결합이 가능하다.
아울러, 음전하를 띤 CNT는 핵산과의 원활한 결합을 위해 NaCl, MgCl2, KCl, CaCl2이 포함된 염 용액 등의 다양한 시약이 필요하지만, 아민 그룹으로 치환된 CNT를 사용하면 염 용액 등의 시약 없이도 DNA와 원활하게 결합될 수 있다.
그리고 아민 그룹으로 치환된 CNT는 가루형태로 첨가하여도 무방하지만, 정확한 사용량을 용이하게 측정할 수 있도록 가루형태의 CNT를 용액과 혼합하여 분산액 상태로 첨가할 수 있다. 이때, 상기 용액으로는 주로 물을 사용할 수 있으며, 계면활성제를 추가로 더 첨가할 수 있다.
한편, 상기 아민 그룹으로 치환된 CNT로는 표면이 아미노기로 개질된 CNT를 사용할 수도 있다.
표면이 아미노기로 개질된 CNT는 비극성 CNT에 황산(H2SO4) 및 질산(HNO3)으로 형성된 혼합산을 첨가하여 카르복실기로 치환된 CNT를 생성하는 제 1 단계, 및 상기 카르복실기로 치환된 CNT에 다이아민류 및 용매를 첨가하여 아미노기로 치환된 CNT를 생성하는 제 2 단계를 통해 제조할 수 있다. 이때, 황산은 촉매역할을 수행하고, 질산이 산화제로 작용한다.
보다 구체적으로, 상기 제 1 단계는 비극성의 CNT 2g과 97% 황산 50㎖ 및 70% 질산 50㎖를 환류장치에 투입하는 과정과, 상기 환류장치의 혼합물을 80℃에서 지속적으로 교반해주면서 48시간 동안 반응시키는 과정과, 용매로서 증류수를 상기 환류장치에 넣어 반응을 종결시킨 후 상기 혼합물을 필터로 걸러주는 과정, 및 상기 혼합물의 pH가 중성이 될 때까지 필터로 거른 후 건조시켜 카르복실기로 치환된 CNT(CNT-COOH)를 생성하는 과정을 포함한다.
그리고 상기 제 2 단계는 상기 카르복실기로 치환된 CNT(CNT-COOH) 300mg과 다이아민류로 사용되는 헥사메틸렌다이아민(1,6-Hexanediamine) 1㎖ 및 용매로 사용되는 증류수 150㎖를 둥근 플라스크에 넣어 준 후 고무마개로 입구를 막은 다음 주사기를 이용하여 1N HCL을 떨어뜨려 pH가 5가 되도록 조정하는 과정과, 카르복실기로 치환된 CNT와 헥사메틸렌다이아민 및 증류수의 혼합물을 6시간 동안 교반해주는 과정, 및 상기 혼합물을 필터링 및 세척을 통해 pH를 중성으로 맞춰준 후 건조시켜 아미노기로 치환된 CNT(CNT-NH2)를 생성하는 과정을 포함한다.
아울러, 아민 그룹으로 치환된 CNT로는
Figure 112012089568317-pat00001
,
Figure 112012089568317-pat00002
,
Figure 112012089568317-pat00003
,
Figure 112012089568317-pat00004
,
Figure 112012089568317-pat00005
중 어느 하나를 사용할 수도 있다.
이어서 본 발명에 따른 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법은 제 2 단계를 포함한다.
본 발명의 제 2 단계는 제 1 단계를 통해 CNT의 표면에 균일하게 분산된 마그네타이트 입자를 CNT의 표면에 부착시키기 위한 단계로서, 이를 위해 제 1 단계를 통해 생성된 1차 생성물을 NaOH 수용액에 한 방울씩 적가하는 과정을 수행한다.
이때, 상기 NaOH 수용액은 0.1 내지 5M, 바람직하게는 1.5M의 NaOH 수용액을 사용할 수 있다. 여기서, NaOH 수용액의 농도가 0.1 M 미만이면 시간이 오래 걸리는 문제가 발생될 수 있고, NaOH 수용액의 농도가 5M을 초과하면 자성체 입자가 커지는 문제가 발생될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 단계에서는 1.5 M NaOH 수용액 100 ㎖를 기준으로 상기 NaOH 수용액에 80 내지 120 ㎖, 바람직하게는 100 ㎖의 1차 생성물을 한 방울씩 적가한다. 이를 위해, NaOH 수용액이 먼저 교반기에 투입되며, 상기 1차 생성물은 한 방울 씩 교반기에 투입되면서 NaOH 수용액과 1차 생성물이 교반되어 최종적으로 2차 생성물이 생성된다.
그 다음, 본 발명에 따른 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법은 제 3 단계를 포함한다.
본 발명의 제 3 단계는 제 2 단계를 통해 생성된 2차 생성물을 원심분리한 후 침전물을 회수하고, 회수된 침전물을 건조시키는 단계로서, 상기 원심분리는 7,000 내지 9,000 rpm으로 수행하고, 상기 침전물의 건조는 약 40℃에서 약 24시간 동안 수행할 수 있다.
필요에 따라, 본 단계에서는 원심분리를 통해 회수한 침전물을 에탄올 등을 이용하여 세척한 후 건조시킬 수도 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 추출용 탄소나노튜브는 상기 제 1 단계 내지 제 3 단계를 통해 제조되며, 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액과, 아민 그룹으로 치환된 탄소나노튜브, 및 NaOH 수용액이 사용된다.
이하의 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 이들만으로 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브 제조
삼각플라스크(250 ㎖)에 염화제일철 사수화물 15.9 ㎎과 염화제이철 육수화물 43.8 ㎎을 투입하고, 이를 혼합하여 강자성체 철산화물 생성하였다.
이어서, 상기 강자성체 철산화물에 1M HCl 100 ㎖를 혼합하여 염화철 혼합용액을 만들어 전처리 수용액을 생성하였다.
그 다음, 30 mg의 아미노기로 개질된 CNT를 혼합한 후, 이를 1시간 동안 초음파 파쇄기로 혼합하여 1차 생성물을 생성하였다.
이 후, 1.5M NaOH 수용액 100 ㎖에 상기 1차 생성물 100 ㎖를 한 방울씩 적가하면서 NaOH 수용액과 1차 생성물의 혼합물을 교반시켜 2차 생성물을 생성하였다.
마지막으로, 상기 2차 생성물을 30분 동안 상온에서 보관한 후 8,000 rpm으로 원심분리하고, 상기 원심분리를 통해 침전된 침전물을 수득하여 40℃에서 24시간 동안 건조시켜 마그네타이트 입자가 코팅된 탄소나노튜브(이하, 'Fe3O4@CNT'라고 약칭함)를 제조하였다.
이때, 전술한 모든 과정은 산소를 제거한 질소 조건하에서 시행되었다.
이와 같이 제조된 Fe3O4@CNT는 투사전자현미경을 이용하여 그 이미지를 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 살펴보면, 마그네타이트 나노입자는 명확하게 CNT의 외부 표면에서 관찰되었다. 특히, 마그네타이트 나노입자의 대부분은 무작위로 CNT의 외부 표면에 부착된 것으로 관찰되었다. 또한, 마그네타이트 나노입자의 평균 크기는 10 ㎚로 추정되었으며, 마그네타이트 나노입자의 분포는 불균일한 것으로 관찰되었다.
[실시예 2]
상기 실시예 1을 통해 제조한 Fe3O4@CNT 10㎎과 10㎖의 증류수를 초음파 파쇄기에 넣고 상기 초음파 파쇄기를 구동시켜 Fe3O4@CNT가 분산된 Fe3O4@CNT 분산액을 제조하였다.
이어서, Fe3O4@CNT 분산액을 3가지로 분리한 후 각각 pH 4, pH 5, pH 6으로 조절하였다.
[비교예 1]
상기 Fe3O4@CNT의 DNA 결합 정도를 평가하기 위하여 양전하로 치환된 CNT(이하, 'CNTs'로 약칭함)를 0.25% 분산액에 넣고 CNTs 분산액을 제조하였다.
[비교예 1]
상기 Fe3O4@CNT의 DNA 결합 정도를 평가하기 위하여 양전하로 치환된 CNT를 0.25% 분산액에 넣고 CNTs 분산액을 제조하였다.
[실험예 1]
비교예 1의 CNTs와 실시예 1의 Fe3O4@CNT의 결정 구조를 확인하기 위해 X-선 회절(XRD) 분석을 실시하였다. 도 2는 CNTs와 본 발명의 Fe3O4@CNT에 대한 XRD 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2를 참조하면, CNTs의 회절 패턴은 2θ = 25.99와 42.94 및 53.628에서 각각 관찰되었으며, Fe3O4@CNT의 회절 패턴은 2θ = 30.5, 36.5, 43 등등에서 각각 관찰되었다.
이와 같이 관찰된 회절 패턴은 Fe3O4(JCPDS NO. 019-0629)의 표준 스펙트럼과 일치하여 Fe3O4가 합성되었음을 반증하고 있다.
또한, Scherrer의 방정식에 따라 마그네타이트 입자의 평균 직경을 계산하기 위해 가장 큰 피크(311)를 선택하면, 마그네타이트 입자의 평균 크기는 약 10.6ㅁ 1.31 ㎚인 것으로 분석되었다.
[실험예 2]
1. 1.7㎕ Effendorf tube에 동물 조직(쇠고기) 10㎎에 용해 버퍼(lysis buffer) 200㎕와 Protenase K(10mg/㎖) 10㎕를 넣은 후 60℃에서 1시간 방치하여 세포 파쇄물(lysate)을 수득하였다.
2. 상기 세포 파쇄물에 1% Fe3O4@CNT 분산액 800㎕를 추가한 후 vortex로 10초간 섞어준 다음, 세포 파쇄물과 Fe3O4@CNT 분산액의 혼합물에 자석을 넣어 Fe3O4@CNT 입자를 상기 혼합물에서 분리하였다. 이때, 상기 Fe3O4@CNT 입자는 육안 분별이 되지 않는 Fe3O4@CNT와 DNA의 결합체를 의미한다.
3. 자석에 붙어있는 Fe3O4@CNT 입자를 50㎕의 DNA elution buffer가 들어있는 1.7ml Effendorf tube에 담근 후 5분간 방치하였다.
4. 자석에 붙어있는 Fe3O4@CNT 입자를 Effendorf tube에서 빼낸 후 tube 내에 남아있는 용액의 DNA 농도를 나노드롭(Nano Drop)으로 정량하였다.
5. 전술한 과정을 10회 반복 시행하여 세포내 DNA 추출 능력을 비교하였다. 그 결과는 표 1로 나타내었다.
[비교실험예 1]
실험예 2와 동일한 조건에서 실험을 실시하되, Fe3O4@CNT 분산액 800㎕ 대신 CNTs 분산액 200㎕을 사용하였다. 그 결과는 표 1로 나타내었다.
이때, CNT와 DNA 결합 정도를 평가하기 위하여 CNTs의 분산액 농도는 Fe3O4@CNT의 TGA 분석을 통하여 Fe3O4나노입자를 제외한 CNT의 질량을 계산하여 정하였다.
[비교실험예 2]
1. 1.7㎕ Effendorf tube에 동물 조직(쇠고기) 10㎎에 용해 버퍼(lysis buffer) 200㎕와 Protenase K(10mg/㎖) 10㎕를 넣은 후 60℃에서 1시간 방치하여 세포 파쇄물(lysate)을 수득하였다.
2. 상기 세포 파쇄물에 1% Fe3O4@CNT 분산액 800㎕를 추가한 후 vortex로 10초간 섞어주었다. 상기 세포 파쇄물과 Fe3O4@CNT 분산액의 혼합물을 셀룰로스 스핀 칼럼(cell㎕ose spin column)으로 옮긴 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리한 다음 1차 용출액을 배출시켰다.
3. 상기 1차 용출액이 배출된 셀룰로스 스핀 칼럼을 새로운 검체 용기(collection tube)로 옮긴 후 DNA elution buffer 50㎕를 넣었다.
4. 12,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 2차 용출액을 취득하였다.
5. 취득한 2차 용출액의 DNA 농도를 나노드롭(Nano Drop)으로 정량하였다.
6. 전술한 과정을 10회 반복 시행하여 각 pH에 따른 Fe3O4@CNT의 세포내 DNA 추출 능력을 평가한다. 그 결과는 표 1로 나타내었다.
[비교실험예 3]
비교실험예 2와 동일한 조건에서 실험을 실시하되, Fe3O4@CNT 분산액 800㎕ 대신 CNTs 분산액 200㎕을 사용하였다. 그 결과는 표 1로 나타내었다.
이때, CNT와 DNA 결합 정도를 평가하기 위하여 CNTs의 분산액 농도는 Fe3O4@CNT의 TGA 분석을 통하여 Fe3O4나노입자를 제외한 CNT의 질량을 계산하여 정하였다.
[표 1]
Figure 112012089568317-pat00006

[비교실험예 4]
1. Fe3O4@CNT 분산액 800㎕에 plasmid DNA(50ng/㎕) 50㎕를 넣은 후에 상온에서 10분간 방치하였다.
2. 상기 용액을 셀룰로스 스핀 칼럼(cell㎕ose spin column)으로 옮긴 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리한 후 외부로 액상 물질을 외부로 배출시켜 1차 용출액을 취득하였다.
3. 상기 1차 용출액이 배출된 셀룰로스 스핀 칼럼을 새로운 검체 용기(collection tube)로 옮긴 후 DNA elution buffer 50㎕를 투입하였다.
4. 12,000 rpm으로 2분간 원심분리하여 2차 용출액을 취득하였다. 이때, 취득한 1차 용출액과 2차 용출액의 DNA 농도를 나노드롭(Nano Drop)으로 정량하였다.
5. 전술한 과정을 10회 반복 시행하여 각 pH에 따른 Fe3O4@CNT의 DNA 결합 능력을 평가하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112012089568317-pat00007
표 2를 살펴보면, 버려지는 1차 용출액의 DNA는 plasmid DNA(50ng/㎕) 50㎕를 기준으로 8%, 11%, 20.4%인 것으로 관찰되었다. 특히, pH가 4와 5인 경우 Fe3O4@CNT와 결합되지 않는 DNA는 11%이하인 것으로 파악되었다.
아울러, 2차 용출액으로부터 수득되는 DNA는 82%, 77.2%, 54.6%인 것으로 관찰되었다. 특히, pH가 4와 5인 경우 Fe3O4@CNT를 통해 수득되는 DNA는 75% 이상인 것을 확인할 수 있었다.
[비교실험예 5]
비교실험예 4와 동일한 조건에서 실험을 실시하되, Fe3O4@CNT 분산액 800㎕ 대신 CNTs 분산액 200㎕을 사용하였다. 그 결과는 표 3으로 나타내었다.
[표 3]
Figure 112012089568317-pat00008

전술한 실험예 1은 본 발명에 따른 핵산 추출방법을 나타내는 실험이고, 비교실험예 1, 3은 특허출원 제10-2011-0025042호에 개시된 핵산 추출법을 나타내는 실험이며, 비교실험예 2는 Fe3O4@CNT 분산액을 기존의 핵산 추출법에 사용한 결과를 확인하기 위한 실험이다.
이러한 실험 결과, 기존에 개시된 핵산 추출법에서는 원심분리가 반드시 필요한 과정이었으나, 본 발명에서는 원심분리 과정을 거치지 않고 자석을 사용함으로써 핵산을 정제할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명에 따른 핵산 추출방법은 원심분리를 이용하지 않고도 원심분리를 이용하는 경우에 근접한 핵산 추출 수율을 확보할 수 있다는 것을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (7)

  1. (ⅰ) 아민 그룹으로 치환된 탄소나노튜브를 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액에 첨가하고 교반하여 1차 생성물을 생성하는 단계;
    (ⅱ) 상기 1차 생성물을 1.5M NaOH 수용액에 적가하여 2차 생성물을 생성하는 단계; 및
    (ⅲ) 상기 2차 생성물을 원심분리한 후 침전물을 회수하여 건조시키는 단계를 포함하는 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 (ⅰ) 단계 이전에는
    1M HCl에 염화제일철 사수화물 및 염화제이철 육수화물의 혼합물을 첨가하여 마그네타이트 입자가 포함된 자성입자 수용액을 생성하는 자성입자 수용액 생성단계가 더 포함된 것을 특징으로 하는 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 염화제일철 사수화물 및 염화제이철 육수화물의 혼합물은 Fe2+와 Fe3+ 의 몰비(Fe2+/Fe3+)가 1/2 내지 1이 되도록 염화제일철 사수화물과 염화제이철 육수화물이 혼합된 것을 특징으로 하는 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 (ⅲ) 단계는
    상기 원심분리는 7,000 내지 9,000 rpm으로 수행하는 것을 특징으로 하는 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 아민 그룹으로 개질된 탄소나노튜브는
    Figure 112012089568317-pat00009
    ,
    Figure 112012089568317-pat00010
    ,
    Figure 112012089568317-pat00011
    ,
    Figure 112012089568317-pat00012
    , 또는
    Figure 112012089568317-pat00013
    인 것을 특징으로 하는 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 1.5M NaOH 수용액 100㎖를 기준으로
    상기 1차 생성물은 80 내지 120㎖가 사용된 것을 특징으로 하는 마그네타이트 입자가 코팅된 핵산 추출용 탄소나노튜브의 제조방법.
  7. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20070051979A (ko) * 2005-11-16 2007-05-21 한국과학기술원 탄소나노튜브 분산액을 이용한 고순도 탄소나노튜브 필름의 제조방법
KR100947832B1 (ko) * 2009-06-05 2010-03-18 한국과학기술원 마그네타이트 나노입자와 카본나이트라이드 나노튜브의 혼성체의 제조방법

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