KR101376889B1

KR101376889B1 - 냉장 온도 안정성 인플루엔자 백신 조성물

Info

Publication number: KR101376889B1
Application number: KR1020137010888A
Authority: KR
Inventors: 조지 켐블; 조지 트래저; 리차드 슈워츠
Original assignee: 메디뮨 엘엘씨
Priority date: 2004-10-06
Filing date: 2005-10-04
Publication date: 2014-03-25
Also published as: JP2014193877A; KR20070083964A; JP2013035861A; CN101060859B; EP1796719B1; EP1796719A4; JP2008515894A; AU2005294528A1; ES2633471T3; JP5147405B2; EP1796719A1; KR20130048280A; HK1102047A1; CA2583698A1; CN102302773B; AU2005294528B2; JP5818940B2; CN102302773A; WO2006041819A1; KR20120123729A

Abstract

냉장 온도 안정성 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 조성물을 최적화 및 제조하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 냉장 온도 안정성 바이러스 조성물을 포함하는 제제 및 면역원성 조성물도 제공된다.

Description

냉장 온도 안정성 인플루엔자 백신 조성물{REFRIGERATOR-TEMPERATURE STABLE INFLUENZA VACCINE COMPOSITIONS}

다양하면서도 진화된 인플루엔자 균주에 대한 백신은, 매년 수많은 개체가 상이한 균주 및 유형의 인플루엔자 바이러스로 감염되기 때문에 공중 건강면에서 뿐 아니라 상업적으로도 중요하다. 유아, 중년, 건강을 적절히 돌보지 않는 사람 및 면역이 손상된 사람들은 상기 감염으로부터 특히 사망할 위험이 있다. 인플루엔자 감염의 문제가 큰 것은 새로운 인플루엔자 균주가 쉽사리 진화함에 따라 새로운 백신을 연속적으로 제조하는 것이 필요하게 된다는 것이다.

이와 같은 상이한 인플루엔자 바이러스에 특이적인 보호적 면역 반응을 생성할 수 있는 다수의 백신이 50여년에 걸쳐 제조되어 왔으며, 예컨대, 전 바이러스 백신, 분리 바이러스 백신, 표면 항원 백신 및 생 약독화 바이러스 백신을 포함한다. 이들 임의 백신 유형의 적절한 제제가 전신 면역 반응을 생성할 수 있지만, 생 약독화 바이러스 백신은 기도에서 국소 점막 면역성을 자극할 수 있다는 이점을 가진다. 따라서, 경제적으로 신속히 제조할 수 있으며 저장/운송이 용이할 수 있는 생 약독화 바이러스를 포함하는 백신이 매우 요망되고 있는 실정이다. 냉장 온도(예: 약 2-8℃)에서 저장/운송될 수 있는 상기 백신이 보다 요망된다.

지금까지, 미국에서 상업적으로 구입할 수 있는 모든 인플루엔자 백신은 닭의 발육난(embryonated egg)에서 보급되었다. 인플루엔자 바이러스는 계란에서 충분히 성장하지만, 백신 제조는 이러한 계란의 이용성에 좌우된다. 계란의 공급이 조직화되어 있고, 백신 제조용 균주는 다음 인플루엔자 시즌에 몇달 앞서 선택되기 때문에, 이러한 접근의 융통성은 제한적일 수 밖에 없으며, 제조 및 배급이 지연되거나 부족한 일이 허다하다. 따라서, 제조된 백신의 안정성(예: 냉장 온도에서)을 증가시키는 방법은 백신 원료의 질 저하를 방지할 수 있고 그렇치 않으면 새로운 제조를 요하는 등의 문제가 있기 때문에, 백신의 안정성을 증가시키는 방법이 절실히 요구된다.

세포 배양시 인플루엔자 바이러스를 제조하기 위한 시스템이 또한 최근에 개발중에 있으며(참조예: Furminger. Vaccine Production, in Nicholson et al. (eds.) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of Influenza virus in cell cultures for Vaccine preparation, in Cohen & Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151); 따라서, 이들 시스템에서 백신 조성물의 안정성(예: 냉장 온도에서 저장/운송)을 증가시키는 임의 방법이 또한 강력히 요구된다.

백신을 제조하기 위한 인플루엔자 바이러스를 제조하는데 있어서 상당한 작업이 본 발명자들 및 공동 연구원들에 의해 수행되었다; 예를 들어, 2002년 4월 26일 출원된 USSN 60/375,675호, 2003년 4월 25일 출원된 PCT/US03/12728호, 2003년 4월 25일 출원된 USSN 10/423,828 및 2005년 5월 20일 출원된 PCT/US05/017734호를 참조하기 바람.

본 발명은 예를 들어, 냉장 온도(예: 4℃)에서 안정한 백신 조성물 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 측면은 종래의 계란 및 신규 세포 배양 백신 제조방법 (및 또한 조합 시스템)에 적용이 가능하며 이하 내용을 검토함으로써 자명할 다수의 다른 이점을 포함한다.

본 발명은 4 내지 8℃ 범위의 온도에서 실질적으로 안정한 액체 백신 제제를 제공한다. 본 발명의 특정 구체예인 이들 및 다른 액체 제제는 본원에서 예를 들어, "본 발명의 백신 제제", "냉장 안정성 백신 제제", "본 발명의 액체 제제", "본 발명의 제제", "본 발명의 냉장 온도 안정성(RTS) 제제" 또는 간단히 "본 발명의 조성물" 또는 "본 발명의 바이러스 조성물"로 언급된다.

본 발명은 4 내지 8℃ 범위의 온도에서 실질적으로 안정한 액체 백신 제제를 제공한다. 본 발명의 특정 일례로, 본 발명의 액체 백신 제제는 2 내지 8℃ 범위의 온도 또는 4℃에서 3개월, 또는 4개월, 또는 5개월, 또는 6개월, 또는 9개월, 또는 12개월, 또는 18개월, 또는 24개월, 또는 36개월, 또는 48개월 기간 경과후, 예를 들어 0.5-1.0 log, 또는 0.5 log 미만, 또는 1.0 log 미만의 효능 손실에 따라 효능 손실(예: 인플루엔자 바이러스 효능 손실)이 허용 수준에 있다는 점에서 상기 기간 동안 실질적으로 안정하다.

일 구체예로, 생 인플루엔자 바이러스를 포함하는 본 발명의 냉장 안정성 백신 제제가 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 제제는 하기 바이러스중 하나 이상을 포함할 수 있다: 약독화 인플루엔자 바이러스, 한랭 적응 인플루엔자 바이러스, 온도 민감성 인플루엔자 바이러스, 한랭 적응(cold adapted) 온도 민감성 약독화 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스. 일례로, 본 발명의 액체 백신 제제는 두개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주를 포함한다.

또한, 본 발명의 제제는 다른 생 바이러스, 예컨대 파라믹소바이러스(예: RSV, 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 센다이 바이러스, 뉴캣슬병 바이러스) 및 파라인플루엔자 바이러스도 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 제제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 제제 및 면역원성 조성물을 포함하는 백신(예: 인플루엔자 백신)도 제공한다.

본 발명은 또한 상기 액체 백신 제제의 제조방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 일례로, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 액체 제제의 제조방법이 본원에 제공된다. 특정 일례로, 본 발명의 액체 제제를 제조하는 방법은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다: 1) 다수의 벡터[하나 이상에 인플루엔자 바이러스 게놈 부분이 도입(또는 코딩)됨]를 숙주 난(host egg) 집단 또는 숙주 세포 집단에 도입하는 단계(여기에서 숙주 난 또는 숙주 세포 집단은 인플루엔자 바이러스의 복제를 지지할 수 있다); 2) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단을 적절한 온도에서 배양하는 단계; 3) 인플루엔자 바이러스를 바이러스 수확물로 회수하는 단계; 4) 안정제(예: 본원에 개시된 바와 같은 수크로스 및 글루타메이트 함유 용액)를 첨가하는 단계; 5) 바이러스 수확물을 정제하여(예: 심층 또는 막 여과에 의해) 정제된 바이러스 수확물을 제공하는 단계; 6) 바이러스 수확물을 원심분리 단계(예: 연속 띠원심분리(continuous zonal centrifugation), 연속 유동 원심분리)에 적용하는 단계; 7) 멸균 여과 단계(예: 0.2, 또는 0.2-0.5 미크론 필터의 사용)(여과 중에 가열을 수행하거나 수행하지 않음); 및 8) -60℃에서 저장하는 단계.

다른 특정 구체예로, 본 발명의 액체 제제의 제조방법은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다: 1) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단에 인플루엔자 바이러스를 감염시키는 단계; 2) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단을 적절한 온도에서 배양하는 단계; 3) 인플루엔자 바이러스를 바이러스 수확물로 회수하는 단계; 4) 안정제를 첨가하는 단계; 5) 바이러스 수확물을 정제하여(예: 심층 여과 및/또는 0.2-0.8 미크론, 또는 0.8 또는 1.5 미크론에 이어 0.2 미크론 범위의 하나 이상의 필터에 통과) 정제된 바이러스 수확물을 제공하는 단계; 6) 바이러스 수확물을 원심분리 단계(예: 연속 띠원심분리, 연속 유동 원심분리)에 적용하는 단계; 7) 멸균 여과 단계(예: 0.2, 또는 0.2-0.5 미크론 필터의 사용)(여과 중에 가열을 수행하거나 수행하지 않음); 및 8) -60℃에서 저장하는 단계.

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 조성물의 제조방법은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다: 1) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단에 인플루엔자 바이러스를 감염시키는 단계; 2) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단을 적절한 온도에서 배양하는 단계; 3) 인플루엔자 바이러스를 바이러스 수확물로 회수하는 단계; 4) 바이러스 수확물을 여과에 의해 정제하여 정제된 바이러스 수확물을 제공하는 단계; 5) 정제된 바이러스 수확물을 원심분리 단계(예: 연속 유동 원심분리)에 적용하여 추가로 정제된 바이러스 수확물을 제공하는 단계; 6) 안정제(예: 6-8% 수크로스; 1-2% 아르기닌 모노하이드로클로라이드; 0.05-0.1% 글루탐산일나트륨, 일수화물; 및 0.5-2% 젤라틴 가수분해물중 하나 이상)를 첨가하는 단계; 및 7) 상기 추가로 정제된 바이러스 수확물을 여과에 의해 멸균하는 단계.

그밖의 다른 특정 구체예로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 조성물의 제조방법은 하기 모든 단계를 포함한다: 1) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단에 인플루엔자 바이러스를 감염시키는 단계; 2) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단을 적절한 온도에서 배양하는 단계; 3) 인플루엔자 바이러스를 바이러스 수확물로 회수하는 단계; 4) 바이러스 수확물을 여과에 의해 정제하여 정제된 바이러스 수확물을 제공하는 단계; 5) 정제된 바이러스 수확물을 원심분리(예: 연속 유동 원심분리)에 적용하여 추가로 정제된 바이러스 수확물을 제공하는 단계; 및 6) 상기 추가로 정제된 바이러스 수확물을 여과에 의해 멸균하는 단계.

다른 그밖의 특정 구체예로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 조성물의 제조방법은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다: 1) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단에 인플루엔자 바이러스를 감염시키는 단계; 2) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단을 적절한 온도에서 배양하는 단계; 3) 인플루엔자 바이러스를 바이러스 수확물로 회수하는 단계; 4) 바이러스 수확물을 정제하는 단계; 5) 정제된 바이러스 수확물을 원심분리(예: 연속 유동 원심분리)에 적용하여 추가로 정제된 바이러스 수확물을 제공하는 단계; 및 6) 상기 추가로 정제된 바이러스 수확물을 여과에 의해 멸균하는 단계.

또 다른 그밖의 특정 구체예로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 조성물의 제조방법은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다: 1) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단에 인플루엔자 바이러스를 감염시키는 단계; 2) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단을 적절한 온도에서 배양하는 단계; 3) 인플루엔자 바이러스를 바이러스 수확물로 회수하는 단계; 4) 바이러스 수확물을 정제하는 단계; 및 5) 정제된 바이러스 수확물을 정용여과(diafiltration)에 적용하는 단계.

그외 또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 조성물의 제조방법은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다: 1) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단에 인플루엔자 바이러스를 감염시키는 단계; 2) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단을 적절한 온도에서 배양하는 단계; 3) 인플루엔자 바이러스를 바이러스 수확물로 회수하는 단계; 4) 바이러스 수확물을 정제하는 단계; 5) 정제된 바이러스 수확물을 정용여과에 적용하는 단계; 및 6) 안정제(예: 6-8% 수크로스; 1-2% 아르기닌 모노하이드로클로라이드; 0.05-0.1% 글루탐산일나트륨, 일수화물; 및 0.5-2% 젤라틴 가수분해물중 하나 이상)를 첨가하는 단계.

본 발명의 상기 및 다른 목적 및 특징은 첨부된 도면과 함께 이하 상세한 설명을 살펴본 후 보다 자명해질 것이다.

도 1은 CTM 공정 흐름도이다.
도 2는 CTM 공정 흐름도이다.
도 3은 원심분리 로딩 및 온도 조사 표이다.
도 4는 QC 시험 데이터를 요약한 표이다.
도 5는 다수의 인플루엔자 균주에 대한 평균 수율을 나타내는 표이다.
도 6은 1가 벌크 방출 어세이 결과에 대한 QC 시험 데이터를 요약한 표이다.

본 발명은 4 내지 8℃ 범위의 온도에서 실질적으로 안정한 액체 백신 제제를 제공한다. 본 발명의 특정 일례로, 본 발명의 액체 백신 제제는 2 내지 8℃ 범위의 온도 또는 4℃에서 적어도 1개월, 또는 적어도 2개월, 또는 적어도 3개월, 또는 적어도 4개월, 또는 적어도 5개월, 또는 적어도 6개월, 또는 적어도 9개월, 또는 적어도 12개월, 또는 적어도 18개월, 또는 적어도 24개월, 또는 적어도 36개월, 또는 적어도 48개월 기간 경과후 예를 들어 0.5-1.0 log(예를 들어 TCID₅₀ 또는 형광 포커스 분석(Fluorescent Focus Assay; FFA)에 의해 측정된 경우)의 효능 손실에 따라 효능 손실(예: 인플루엔자 바이러스 효능 손실)이 허용 수준에 있다는 점에서 상기 기간 동안 실질적으로 안정하다.

본 발명은 4 내지 8℃ 범위의 온도에서 실질적으로 안정한 액체 백신 제제를 제공한다. 본 발명의 특정 일례로, 본 발명의 액체 백신 제제는 2 내지 8℃ 범위의 온도 또는 4℃에서 적어도 1개월, 또는 적어도 2개월, 또는 적어도 3개월, 또는 적어도 4개월, 또는 적어도 5개월, 또는 적어도 6개월, 또는 적어도 9개월, 또는 적어도 12개월, 또는 적어도 18개월, 또는 적어도 24개월, 또는 적어도 36개월, 또는 적어도 48개월 기간 경과후 예를 들어 10% 미만, 또는 20% 미만, 또는 30% 미만, 또는 40% 미만, 또는 50% 미만, 또는 60% 미만, 또는 70% 미만, 또는 80% 미만, 또는 90% 미만의 효능 손실에 따라 효능 손실(예: 인플루엔자 바이러스 효능 손실)이 허용 수준에 있다는 점에서 상기 기간 동안 실질적으로 안정하다.

일 구체예로, 생 인플루엔자 바이러스를 포함하는 본 발명의 액체 백신 제제가 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 제제는 하기 바이러스중 하나 이상을 포함할 수 있다: 약독화 인플루엔자 바이러스, 한랭 적응 인플루엔자 바이러스, 온도 민감성 인플루엔자 바이러스, 한랭 적응 온도 민감성 약독화 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스. 일례로, 본 발명의 액체 백신 제제는 두개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주를 포함한다.

또한, 본 발명의 제제는 다른 생 바이러스, 예컨대 파라믹소바이러스(예: RSV, 홍역 바이러스, 멈프스 바이러스, 센다이 바이러스, 뉴캣슬병 바이러스)도 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 액체 백신 제제의 제조방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 일례로, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 액체 제제의 제조방법이 본원에 제공된다. 특정 일례로, 본 발명의 액체 제제를 제조하는 방법은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다: 1) 다수의 벡터[하나 이상에 인플루엔자 바이러스 게놈 부분이 도입(또는 코딩)됨]를 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단에 도입하는 단계(여기에서 숙주 난 또는 숙주 세포 집단은 인플루엔자 바이러스의 복제를 지지할 수 있다); 2) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단을 적절한 온도에서 배양하는 단계; 3) 인플루엔자 바이러스를 바이러스 수확물로 회수하는 단계; 4) 안정제(예: 본원에 개시된 바와 같은 수크로스 및 글루타메이트 함유 용액)를 첨가하는 단계; 5) 바이러스 수확물을 정제하여(예: 심층 또는 막 여과에 의해) 정제된 바이러스 수확물을 제공하는 단계; 6) 바이러스 수확물을 원심분리 단계(예: 연속 띠원심분리, 연속 유동 원심분리)에 적용하는 단계; 7) 멸균 여과 단계(예: 0.2, 또는 0.2-0.5 미크론 필터의 사용)(여과 중에 가열을 수행하거나 수행하지 않음); 및 8) -60℃에서 저장하는 단계.

또 다른 그밖의 특정 구체예로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 조성물의 제조방법은 하나 이상의 하기 단계를 포함한다: 1) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단에 인플루엔자 바이러스를 감염시키는 단계; 2) 숙주 난 집단 또는 숙주 세포 집단을 적절한 온도에서 배양하는 단계; 3) 인플루엔자 바이러스를 바이러스 수확물로 회수하는 단계; 4) 바이러스 수확물을 정제하는 단계; 및 5) 정제된 바이러스 수확물을 정용여과에 적용하는 단계.

일 구체예로, 본 발명의 액체 제제의 제조방법은 상기 제제의 동결 단계를 포함할 수도 있다. 동결 단계는, 예를 들어, 최종 안전성 테스트 및 배급전 및/또는 냉장 온도(예: 4-8℃)로 저장 전에 실시될 수 있다. 냉장 온도로 저장하기 전에 백신 제제의 동결은 본 발명의 백신 제제의 안정성을 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 80% 까지 증가시킬 수 있다.

본 발명은 추가로 인플루엔자 바이러스 수확물을 여과하여 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이때 바이러스 수확물은 여과 중에 가열된다. 이들 특정 구체예에서는 조성물을 0.2 마이크로미터 내지 약 0.45 마이크로미터 기공 크기의 마이크로필터에 통과시키는 여과 단계를 포함한다. 또한, 여러 구체예의 경우, 이들 구체예에서 가열 온도는 임의로 약 28 내지 약 40℃ 또는 그 이상을 포함하며, 일부 구체예에서는 31℃ 또는 약 30 내지 약 32℃의 온도를 포함한다. 이러한 구체예에서 가열은 임의로 여과 전 또는 여과 중에 또는 여과 전 및 중에 수행되며, 임의로 약 50 분 내지 약 100 분, 약 60 분 내지 약 90 분, 또는 약 60 분을 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 방법으로 제조된 인플루엔자 바이러스 조성물도 제공한다(여기에서 조성물은 백신 조성물이다).

안정제 및 완충제

본 발명의 안정제는, 예를 들어 하나 이상의 하기 성분들을 포함한다: 아르기닌(예: 0.5-1%, 1-2%; 1%; 1.2%; 1.5%, 0.75-2%); 폴록사머; 수크로스(예: 2-8%; 2%; 6-8%; 3%; 4%; 5%; 6%; 7%, 또는 8%); 가수분해된 젤라틴(예: 1%; 0.5-2%; 1.5%; 0.5%; 0.75%); 및 글루타메이트(예: 0.05-0.1%, 0.02-0.15%, 0.03%, 0.04%, 0.06%, 0.02-0.3%, 또는 0.094%).

본 발명의 완충제는, 예를 들어 하나 이상의 하기 성분들을 포함한다: 포스페이트 완충제(일 또는 이염기성 또는 이 둘 모두)(예: 10-20O mM, pH 7-7.5; 100 mM, pH 7.2; 100 mM, pH 7-7.3); 및 히스티딘 완충제(예: 25-50 mM 히스티딘, pH 7-7.5, 50-10O mM 히스티딘, pH 7-7.5).

공정 수율

일 구체예로, 본 발명의 액체 제제의 제조방법에 따른 실제 또는 평균 공정 수율은(바이러스 수확물(VH)로부터 최종 제제에 이르기까지) 10% 미만, 16% 미만, 20% 미만, 30% 미만, 40% 미만, 50% 미만, 60% 미만, 70% 미만, 80% 미만, 90% 미만, 93% 미만 또는 95% 미만이다.

본원에 개시된 방법의 다수의 단계를 동일한 제조 시리즈로 수행하는 것이 필요치 않거나 존재할 필요가 없다는 것을 당업자들은 알 것이다. 따라서, 일부 바람직한 구체예에서 본원의 모든 단계 및/또는 조성물이 수행되거나 존재할지라도, 다른 구체예에서는 하나 이상의 단계가 임의로, 예를 들어 생략, 변화(범위, 순서, 위치 등) 되기도 한다.

당업자들은 또한 전형적인 구체예가 당업계에 공지된 단계/방법/조성물, 예를 들어 바이러스 함유 난의 투시 검란(candling), 난의 바이러스 접종 등을 포함함을 인지할 것이다. 따라서, 당업자들은 2-8℃에서 실질적으로 안정한 적합한 바이러스, 바이러스 용액, 조성물 등을 제조하기 위해 공지된 상기 단계에 적절한 조건, 부차 단계, 단계 세부내용 등을 용이하게 결정할 수 있다. 개별 단계는 이후 상세히 기술될 것이다.

추가로, 본 발명은 상기 액체 백신 제제의 제조방법을 제공한다. 예를 들어, 백신 제제는 바이러스 감염, 예를 들어 인플루엔자 감염 효과를 방지하거나 감소시키기 위하여 인간에 투여될 수도 있다. 일 구체예로, 본 발명의 제제는 인플루엔자 바이러스 감염 효과를 방지하거나 감소시키기 위하여 면역원성 조성물로서 투여된다.

냉장 안정성 CAIV 제제

본 발명의 발명자 및 공동 연구원들에 의한 선행 기술은 비강 분무에 의해 투여되는 3가의 한랭 적응 생 인플루엔자 백신(CAIV-T, FluMist^®, 도처에 FluMist로 언급되어 있으나, FluMist^®로 이해하여야 한다)을 개발하였다. 본 발명은 냉장 온도에서 안정성 프로파일이 개선된 CAIV-T 제제의 개발을 포함한다. 이러한 개선된 제제의 제조방법이 본원에 제공되며, 하나 이상의 하기 단계를 포함할 수 있다: 오염의 위험성을 감소시키기 위한 멸균 여과 단계, 초원심분리(예: 속도 침강 원심분리) 및 정용여과. 또한, 본원에는 본 발명의 액체 FluMist 및 다른 냉장 온도 안정성(RTS) 제제를 제조하는 다수의 방법도 포함된다.

1960년대에 미시간 대학의 존 마삽 박사(Dr. John Maassab)가 PCK 세포에서 인플루엔자 A 및 B 균주를 생성 균주가 재현성있게 한랭 적응(바이러스가 야생형 바이러스에 비해 감소된 온도에서 잘 증식한다), 온도 민감성(바이러스가 시험관내에서 상승된 온도에서는 잘 증식하지 않는다) 및 약독화(바이러스 복제가 흰족제비에서 제한된다) 표현형 성질을 보일 때까지 온도를 감소시키면서 계대배양한 결과, CAIV 균주 개발에 일조하게 되었다. 예를 들어, 본 발명자들 및 공동 연구원들에 의한 개발에서, 상기 성질은 6:2 유전자 재배열 과정을 통해 특정 해에 대한 CDC-지정 백신 균주를 반영한 년간 3가 백신의 개발을 위한 기초로 이용되었다. 예를 들어, 6:2 CAIV 균주는 관심의 대상이 되는 순환 인플루엔자 균주로 관련 A 또는 B 균주 마스터 도너 바이러스(Master Donor Virus; MDV)를 시험관내에서 공감염시키고, 항체에 의해 매개된 적절한 재배열체(reassortant)의 선택에 의해 생산된다. 표적 6:2 재배열체는 순환 균주로부터의 HA 및 NA 유전자, 및 한랭 적응된 마스터 도너 바이러스(MDV)로부터의 나머지 유전자를 포함한다. 재배열체는 상술한 바와 같은 한랭 적응 표현형 성질을 보유한다. 본 발명자들 및 공동 연구원들에 의해 CAIV에 대한 추가 개발이 행해지고 있다. FluMist는 안전한 프로파일을 가지는 것으로 입증되었고, 바이러스 공격에 대한 효능을 보였으며, 많은 상황에서 상용화 약제학적 용도로 승인되었다.

FluMist의 원형 제제는 선택한 균주의 제조자 가공 바이러스 시드(manufacturer's working virus seed; MWVS)로 특이적 병원균을 갖지 않는 계란을 감염시킨 후, 2 내지 3 일간 배양하고, 감염된 요막액을 수거하여 얻은 바이러스 수확물(VH)을 함유하고 있다. 1/10 부피의 1OX 수크로스 포스페이트 글루타메이트(SPG) 용액을 첨가하여 VH를 안정화시켰다. 3가 FluMist는 주어진 년간 백신내 세 각 균주로부터의 VH를 안정한 정상 요막액(NAF)과 각 균주의 7.3 log₁₀TCID₅₀/mL 표적 농도로 배합하여 제조되었다. 이어서, 생성된 블렌드가 FluMist 백신이 비강내로 전달되도록 스프레이 팁이 장착된 분무기에 충전되었다. 이러한 제품 포맷은 동결 형태로 저장되는 "동결 FluMist"로 사용된다. MWVS 바이러스가 또한 예를 들어 플라스미드 재배열에 의해 선택적으로 제조될 수도 있다. 예를 들어, 2002년 4월 26일 출원된 USSN 60/375,675호, 2003년 4월 25일 출원된 PCT/US03/12728호, 2003년 4월 25일 출원된 10/423,828호, 2005년 5월 20일 출원된 PCT/US05/017734호 및 US20050186563호를 참조하기 바람.

동결 FluMist는 제조후 동결되고 사용시까지 동결 상태로 유지되면 표지 백신으로 제공될 수 있기는 하나, 저장 온도에서 운송/저장에 안정한 형태의 FluMist가 절실히 요망된다. 이러한 "냉장 온도 안정성"(또는 RTS) 형태는 하나 이상의(각 구체예의 모든 경우에서 필수적인 것은 아니다) 하기 성질로 특성화된다: 냉장 액체로 배급되는 경우 안정성 유지; 멸균 제품의 보장을 위해 멸균 필터(예: 0.2 미크론) 통과; 난 단백질 함량 감소(예: 실질적으로 NAF 없음); NAF 희석제의 제조 불필요; 용량 부피 감소; 및 부형제(예: 안정제)로서 아르기닌 및 젤라틴중 어느 하나 또는 둘 모두 포함. 본원에서 특정 측면으로, 하나 이상의 상기 특성을 가지는 제제는 다른 CAIV-T 백신 변형체, 예컨대 동결체와 구분하기 위하여 "액체 FluMist" 또는 RTS 또는 다양한 유사 용어로 지칭된다. 본 발명은 상기 및 다른 측면을 제공한다.

본 발명의 액체 RTS 바이러스 조성물을 제조/시험하는데 있어서, 다수의 개발 배치가 이용되었다. 개발 배치는 로트당 2,000 내지 20,000개의 난인 반면, GMP 배치는 각각 약 10,000개의 난이다. MWVS 바이러스(예: 재배열체) 제조를 위해 여러 실시예 및 프로토콜이 본원에 개시되었으나, 바이러스는 상이한 구체예에서 상이한 수단을 이용하여 선택적으로 제조될 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 본원의 바이러스는 임의로 본원에 예시된 프로토콜로 제조되며, 다른 구체예에서, MWVS 바이러스는 임의로, 예를 들어 플라스미드 재배열 또는 "플라스미드 구조" 기법으로 제조된다. 예를 들어, 전체를 각각 본원에서 참고로 포함하는 2002년 4월 26일 출원된 USSN 60/375,675호, 2003년 4월 25일 출원된 PCT/US03/12728호, 2003년 4월 25일 출원된 10/423,828호, 2004년 2월 25일 출원된 10/788,236호, 2005년 5월 20일 출원된 PCT/US05/017734호 및 US20050186563호를 참조하기 바람. 따라서, 본원에서 사용되는 "숙주 세포 집단의 감염"은 생성된 바이러스에 의해 또는 플라스미드 재배열 중에 감염된 숙주 세포를 포괄한다.

다양한 구체예에서, 본 발명은 실질적으로 안정한, 예를 들어 목적 온도(예: 전형적으로 4℃, 5℃, 8℃, 약 2 내지 약 8℃ 또는 2℃ 초과, 또는 2 내지 4℃, 또는 2 내지 8℃)에서 선택한 기간(전형적으로 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 13개월, 적어도 14개월, 적어도 15개월, 적어도 16개월, 적어도 17개월, 적어도 18개월, 적어도 19개월, 적어도 20개월, 적어도 21개월, 적어도 22개월, 적어도 23개월, 또는 적어도 24개월, 또는 24개월 초과 등등) 동안 효능 손실이 0.5-1.0 log, 또는 0.5 log 미만, 또는 1.0 log 미만임에 따라 허용되지 않는 효능 손실을 보이지 않는 바이러스 및 백신 조성물을 제공한다.

본원에서는 본 발명의 다수의 측면이 FluMist를 예로 들어 예시되거나 설명되지만, 본 발명에 의해 구체화된 원리는 다른 바이러스/백신 조성물에도 적용될 수 있고 본원에 예시된 특정 균주/바이러스로만 한정되지 않는다. 따라서, 다른 생 약독화 인플루엔자 바이러스 및 백신 및 조성물도 또한 본 발명의 범위내에 포함되며, 예를 들어 사람의 개입 등에 따라서 적절한 방법으로 제조된다. 또한, 다른 인플루엔자 균주 등, 예컨대 인플루엔자 A 균주, 인플루엔자 B 균주, 약독화 및 비약독화 인플루엔자 균주, 한랭 적응 및 한랭 비적응 인플루엔자 균주, 온도 민감성 및 온도 비민감성 인플루엔자 균주 등의 다른 바이러스가 경우에 따라 모두 본 발명의 구체예에 포함된다. 이와 같은 다른 바이러스 및 백신은, 예를 들어 인간 또는 동물 등에서 신규 백신 및/또는 다른 백신을 시험하기 위한 대조군으로 사용될 수 있다. 또한, 특히 닭 세포 또는 난에서 증식시킨 생 바이러스(예: 홍역 바이러스)를 포함하는 다른 생 바이러스 백신 조성물이 본 발명의 구체예이다. 또한, 본 발명에 의해 구체화된 원리는 포유동물 세포에서 증식시킨 생 바이러스를 포함하는 바이러스 및 백신 조성물에도 광범하게 적용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,244,354호; 6,146,873호; 및 6,656,720호를 참조하기 바람.

벌크 바이러스 수확물 생산

조성물의 실질적인 제제 및 한랭 적응 인플루엔자 바이러스(또는 다른 유사 바이러스) 정제는 RTS 또는 액체 바이러스 조성물의 일면이다. 요막액으로부터 인플루엔자 바이러스의 분리를 불활성화 백신을 제조하기 위한 상용화 과정의 일부로 수행하였다. 이러한 불활성화 백신을 선별하는 방법은 초원심분리이다. 상업적 스케일의 연속 유동 초원심분리가 1969년부터 이용되었으며, 불활성화 인플루엔자 백신 제조에 즉각 응용되었다. 생 인플루엔자 바이러스의 크로마토그래피 정제가 유용한 대안이나, 아직 확고한 대규모 공정을 이용하지 못하고 있다. 이는 인플루엔자 바이러스 입자의 막 코팅 및 다형성 특성때문일 것으로 생각된다.

초원심분리에 의해 정제된 생 바이러스(불활성화 바이러스에 반대)의 회수가 본 발명자들 및 공동 연구원들에 의해 수행되었으며, 본 발명의 일례이다. 초원심분리전에 스윙잉-버켓(swinging-bucket) 원심분리에 대한 상업적 실행가능 대안 및 0.2 미크론 필터를 통한 여과후 생 바이러스의 허용가능한 회수로서 심층 여과 성능을 증명하는 추가의 연구를 실시하였으며, 이는 본 발명의 일 구체예를 이룬다.

특정 일례로, 본 발명의 방법에 있어서 VH 정제 단계에 대한 중간 공정 수율은 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%이다.

다른 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 있어서 초원심분리(예: 띠원심분리) 단계에 대한 중간 공정 수율은 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 있어서 피크 희석 및 멸균 여과 단계에 대한 중간 공정 수율은 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%이다.

초원심분리 단계는 CAIV 농축의 이점을 제공한다. 이는 더 작은 부피로 전달될 수 있음을 입증한다(예를 들어 동결 FluMist를 위해 사용될 수 있는 콧구멍당 0.25 mL가 아닌 콧구멍당 0.1 mL). 이러한 부피 감소는 비강 투여되는 제품에 보다 일반적이며, 소비자의 수락성을 증가시킬 수 있고, 코로부터 백신이 떨어져 나오거나 팽창하는 것으로 인한 제품 손실을 줄인다. CAIV에 대한 감염된 요막액 수확물 역가는 전형적으로 동결 FluMist에 대한 표적 제품 농도(용량당 7.3 log₁₀TCID₅₀/mL, 또는 7.0 log₁₀TCID₅₀) 보다 한자리 큰 8.3 내지 9.5 log₁₀TCID₅₀/mL이다. 매우 낮은 역가의 균주가 년간 백신 추천 목록에 포함되는 경우, 액체 또는 RTS FluMist는 동결 FluMist에 비해 최종 생성물내 바이러스 농도가 증가하였음에도 완전한 강도의 3가 백신의 제조 가능성을 향상시킨다. 액체 또는 RTS FluMist는 임의로 7.7 log₁₀TCID₅₀/mL의 최종 농도로 제제화되어 투여마다 동결 FluMist와 동일량의 생 바이러스를 전달한다.

특정 일례로, 바이러스 역가가 7.3 log₁₀TCID₅₀/mL 미만, 또는 7.0 log₁₀TCID₅₀/mL 미만 또는 6.0 log₁₀TCID₅₀/mL 미만, 또는 5.0 log₁₀TCID₅₀/mL 미만, 또는 4.0 log₁₀TCID₅₀/mL 미만, 또는 3.0 log₁₀TCID₅₀/mL 미만, 또는 2.0 log₁₀TCID₅₀/mL 미만인 낮은 역가의 인플루엔자 백신 조성물이 제공된다. 이러한 낮은 역가의 인플루엔자 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 어쥬번트(adjuvant), 예를 들어 E. coli 열-불안정성 독소(또는 그의 단편), 백일해 독소, 알루미늄을 추가로 포함할 수 있다. 다른 어쥬번트로는 인산알루미늄, 수산화알루미늄, MPL.TM.(3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., 몬타나 해밀턴 소재, 현재는 Corixa), 합성 리피드 A 유사체, 예컨대 529(Corixa), Stimulon.TM. QS-21(Aquila Biopharmaceuticals, 매사추세츠 프라밍검 소재), IL-12(Genetics Institute, 매사추세츠 캠브리지 소재), 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 CpG 모티브 함유 올리고뉴클레오티드(미국 특허 6,207,646호 (28)), 및 콜레라 독소(야생형 또는 돌연변이형으로, 예를 들어 아미노산의 29 위치에 글루탐산이 다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘으로 대체되었음, 국제 공개 특허출원 WO 00/18434호)가 포함되나 이들에만 한정되지 않는다.

특정 일례로, 정용여과가 본 발명의 바이러스 조성물 제조에 이용될 수 있다. 예를 들어, 정용여과는 제제화 전에 바이러스를 농축하기 위해 사용될 수 있다. 정용여과는 초원심분리와 함께, 또는 그 대신 사용될 수도 있다.

본원에서 이하에 개시되는 초기 단계 후에, cGMP 생산이 로트당 10,000개의 난 스케일로 개시된다. 후속 임상 실험을 위해 A/베이징/262/95(H1N1), A/시드니/05/97(H3N2) 및 B/앤아버/1/94(B/하얼빈/7/94-류) 1가 정제 CAIV 벌크를 제조하였다. B/앤아버 균주는 이후 B/하얼빈/7/94-류로 언급될 것이다. 편의상, 균주 표기는 종종 약어(예: A/베이징)로 지칭된다. 본 출원은 액체 FluMist에 특정적인 공정 단계에 대해 가장 중점적으로 기술할 것이지만, 액체 및 동결 FluMist에 관련된 단계도 또한 본원에 기술될 것이다.

본 발명의 다양한 구체예에서 액체 FluMist에 대한 난의 관리방법 및 신선한 바이러스 수확물의 제조방법은 동결 FluMist와 실질적으로 동일(자동 접종 및 수확은 제외)하며, 당업자들은 본 발명과 함께 이용할 수 있는 유사 또는 등가의 단계를 알 것이다. 본 발명에서, 초원심분리는 Hitachi CP40Y 띠원심분리기 및 RP40CT 타입 D 연속 유동식 로토(로토 부피 = 3.2L)를 이용하여 수행되었다. 바이러스 수확물을 먼저 풀링하고(pooling), 여과를 촉진하기 위해 수크로스 포스페이트 글루타메이트(SPG)로 안정화시킨 후, 5 미크론 폴리프로필렌 필터에 통과시켰다. 이어서, 여액을 10 내지 60% 수크로스 구배로 로딩하고, 40,000 rpm에서 1시간 밴딩한 다음, 100 mL 분획으로 용출시켰다.

고 수준의 적혈구 응집소(HA) 함유 분획을 풀링하여 0.2M 수크로스 농도로 희석시키고, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 0.2 미크론 필터를 사용하여 멸균 여과하였다. 얻은 정제된 1가 벌크 CAIV를 IL 병에서 -60℃ 이하로 동결시키고, 추가 처리를 위해 보관하였다.

제제 및 충전

초기 제제 선별로 냉장 온도에서 정제된 CAIV의 액체상 안정성이 년간 백신으로 적합하지를 결정하였다. CTM-1 전략으로부터 적어도 안정한 균주 및 로트가 6.9개월에 걸쳐 1 로그의 손실을 나타냄에 따라, 동결 FluMist 안정제 SPG에 첨가된 가수분해된 동물 젤라틴이 가장 뛰어난 안정성 결과를 보여 주었다. 추가의 제제 개발 연구는 제조직후 동결 저장하고 최종 배급 전에 해동시킴으로써 액체 FluMist의 안정성이 더 향상될 수 있음을 입증하였다. 아르기닌을 첨가함으로써 최악의 경우에 대한 균주 안정성이 또한 향상되었다. 동물 젤라틴은 전염성 해면상 뇌병증(transmissible spongiform encephalopathies; TSE)과 관련한 문제를 제기할 수 있지만, 이용가능한 무젤라틴 제제는 모든 구체예에서 필요한 안정성을 제공하지 못했다. 따라서, 액체 FluMist 제제의 일부 구체예에서는 안정성 및 돼지에서 TSE 발병이 보고되지 않은 사실을 이유로 돼지 젤라틴을 선택하였다. 콜라겐 가수분해에 이용된 엄격한 화학 공정 단계는 또한 프리온-크기의 단백질 불활성화를 야기할 것으로 생각된다.

액체 FluMist의 임상 실험을 위해 정제된 동결 1가 벌크 CAIV를 적재하여 3가 백신을 cGMP하에 제조하였다. 총 6회 충전이 실시되었다. 4L 유리 아스피레이터 플라스크를 이용하여 소규모로 블렌딩을 행하고, INOVA 자동 필러/스토퍼 및 조합 장비를 이용하여 0.5 mL Becton Dickinson(BD) Hypack SCF(즉석 충전할 수 있는 멸균 청정) 유리 분무기를 충전하였다. 충전된 3가 액체 FluMist의 제조에 대해 이하 좀 더 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 특정 제제 구체예

일 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 최종 제제에 하나 이상의 하기 성분들을 포함한다: 수크로스 6-8 중량/부피(w/v)%; 아르기닌 모노하이드로클로라이드 1-2w/v%; 글루탐산일나트륨, 일수화물 0.05-0.1w/v%; 젤라틴 가수분해물, 돼지 A형(또는 다른 공급원) 0.5-2w/v%; 제2인산칼륨 1-2%; 및 제1인산칼륨 0.25-1w/v%.

특정 구체예로, 백신 제제는 하나 이상의 하기 성분들을 포함한다: 수크로스 6.84 중량/부피(w/v)%; 아르기닌 모노하이드로클로라이드 1.21w/v%; 글루탐산일나트륨, 일수화물 0.094w/v%; 젤라틴 가수분해물, 돼지 A형(또는 다른 공급원) 1w/v%; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48w/v%. 또 다른 특정 구체예로, 백신 제제는 하기 성분들을 모두 포함한다: 수크로스 6.84 중량/부피(w/v)%; 아르기닌 모노하이드로클로라이드 1.21w/v%; 글루탐산일나트륨, 일수화물 0.094w/v%; 젤라틴 가수분해물, 돼지 A형(또는 다른 공급원) 1w/v%; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48w/v%.

또 다른 특정 구체예로, 백신 제제는 하기 성분들을 모두 포함한다(하나 이상의 성분을 10% 변동이내로): 수크로스 6.84 중량/부피(w/v)%; 아르기닌 모노하이드로클로라이드 1.21w/v%; 글루탐산일나트륨, 일수화물 0.094w/v%; 젤라틴 가수분해물, 돼지 A형(또는 다른 공급원) 1w/v%; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48w/v%.

또 다른 특정 구체예로, 백신 제제는 하기 성분들을 모두 포함한다(하나 이상의 성분을 10% 변동이내로): 수크로스 6.84 중량/부피(w/v)%; 아르기닌 모노하이드로클로라이드 1.21w/v%; 젤라틴 가수분해물, 돼지 A형(또는 다른 공급원) 1w/v%. 이러한 구체예에서, 제제는 완충제(예: 인산칼륨 완충제(pH 7.0-7.2))중에 존재한다.

또 다른 특정 구체예로, 백신 제제는 하기 성분들을 모두 포함한다(하나 이상의 성분을 20% 변동이내로): 수크로스 6.84 중량/부피(w/v)%; 아르기닌 모노하이드로클로라이드 1.21w/v%; 글루탐산일나트륨, 일수화물 0.094w/v%; 젤라틴 가수분해물, 돼지 A형(또는 다른 공급원) 1w/v%; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48w/v%.

또 다른 특정 구체예로, 백신 제제는 하기 성분들을 모두 포함한다(하나 이상의 성분을 30% 변동이내로): 수크로스 6.84 중량/부피(w/v)%; 아르기닌 모노하이드로클로라이드 1.21w/v%; 글루탐산일나트륨, 일수화물 0.094w/v%; 젤라틴 가수분해물, 돼지 A형(또는 다른 공급원) 1w/v%; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48w/v%.

또 다른 특정 구체예로, 백신 제제는 하기 성분들을 모두 포함한다(하나 이상의 성분을 40% 변동이내로): 수크로스 6.84 중량/부피(w/v)%; 아르기닌 모노하이드로클로라이드 1.21w/v%; 글루탐산일나트륨, 일수화물 0.094w/v%; 젤라틴 가수분해물, 돼지 A형(또는 다른 공급원) 1w/v%; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48w/v%.

또 다른 특정 구체예로, 백신 제제는 하기 성분들을 모두 포함한다(하나 이상의 성분을 1% 변동이내로): 수크로스 6.84 중량/부피(w/v)%; 아르기닌 모노하이드로클로라이드 1.21w/v%; 글루탐산일나트륨, 일수화물 0.094w/v%; 젤라틴 가수분해물, 돼지 A형(또는 다른 공급원) 1w/v%; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48w/v%.

또 다른 특정 구체예로, 백신 제제는 하기 성분들을 모두 포함한다(하나 이상의 성분을 3% 변동이내로): 수크로스 6.84 중량/부피(w/v)%; 아르기닌 모노하이드로클로라이드 1.21w/v%; 글루탐산일나트륨, 일수화물 0.094w/v%; 젤라틴 가수분해물, 돼지 A형(또는 다른 공급원) 1w/v%; 제2인산칼륨 1.13%; 및 제1인산칼륨 0.48w/v%.

특정 구체예로, 본 발명의 제제는 완충제로서 예를 들어 인산칼륨(예: 적어도 50 mM, 또는 적어도 10O mM, 또는 적어도 20O mM, 또는 적어도 25O mM) 또는 대안적으로 히스티딘(예: 적어도 50 mM, 또는 적어도 10O mM, 또는 적어도 20O mM, 또는 적어도 25O mM)을 포함한다.

본 발명의 다른 특정 구체예, 예컨대 투여, 효능

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제를 비강내로 투여하는 방법이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 백신 제제는 0.5 mL/용량; 0.75 mL/용량; 0.1 mL/용량; 0.15 mL/용량; 0.2 mL/용량; 0.25 mL/용량; 0.5-0.1 mL/용량; 0.5 mL-2 mL/용량; 또는 0.5-2.5 mL/용량의 최종 용량으로 비강내로 투여될 수 있다.

일 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 약 10⁷ 형광 포커스 단위((fluorescent focus unit: FFU) 또는 10⁷ TCID₅₀의 3종의 각 상이한 인플루엔자 재배열체 균주를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 백신 제제는 각 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 효능이 7.0(±0.5) log10 FFU/용량(또는 TCID₅₀/용량)이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 백신 제제는 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 효능이 7.0(±0.5) log10 FFU/용량(또는 TCID₅₀/용량)이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 백신 제제는 효능이 적어도(또는 =) 6.0 log10 FFU/용량, 6.5 log10 FFU/용량, 6.7 log10 FFU/용량 6.7 log10 FFU/용량, 6.8 log10 FFU/용량, 6.9 log10 FFU/용량, 7.0 log10 FFU/용량, 7.1 log10 FFU/용량, 7.2 log10 FFU/용량, 7.3 log10 FFU/용량, 7.4 log10 FFU/용량, 7.5 log10 FFU/용량, 7.6 log10 FFU/용량, 7.7 log10 FFU/용량, 7.8 log10 FFU/용량, 7.9 log10 FFU/용량, 8.1 log10 FFU/용량, 8.5 log10 FFU/용량 또는 8.8 log1O FFU/용량이다.

본 발명의 각 구체예에서 효능은 FFU 대신 TCID₅₀으로도 측정될 수 있다. 형광 포커스 어세이(FFA)는 MDCK 또는 다른 세포에서 증식 복제력을 측정하는 직접적인 척도이다.

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 효능이 용량당(예: 0.2 mL 용량당) 6.5-7.5 log10 FFU이다.

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 효능이 용량당 적어도(또는 =) 7.0 log10 TCID₅₀, 또는 용량당 적어도 6-8 TCID₅₀, 또는 용량당 적어도 6.4 TCID₅₀, 또는 용량당 적어도 6.6 log10 TCID₅₀이다.

일 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 pH가 6.7-7.7, 또는 6.6, 또는 6.7, 또는 6.8, 또는 6.9, 또는 7.0, 또는 7.1, 또는 7.2, 또는 7.3, 또는 7.4, 또는 7.5, 또는 7.6, 또는 7.7이다.

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 내독소가 60 EU/mL 이하, 또는 200 EU/mL 이하이다. 예를 들어, 본 발명의 백신 제제는 내독소가 5 EU/mL 이하이다. 또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 1.0 EU/7.0 log10 FFU 이하를 가진다.

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 하나 이상의(또는 전부) 하기 성분들을 가지지 않는다: 미코플라즈마, 레트로바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 및 미코박테륨(예: M. tuberculosis). 이러한 본 발명의 제제의 제조방법은 이들 불순물의 조사 단계(들)를 포함할 수도 있다.

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 FluMist에서와 같이 3종의 상이한 바이러스로부터의 HA 및 NA 유전자를 가지는 인플루엔자 바이러스를 함유할 수도 있다.

한 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 용량당(예: 0.2 mL 용량당) 하나 이상의(또는 전부) 하기 성분들을 포함한다: 수크로스(13.68 mg), 제2인산칼륨(2.26 mg), 제1인산칼륨(0.96 mg), 젤라틴 가수분해물(2.0 mg), 아르기닌 하이드로클로라이드(2.42 mg) 및 글루탐산일나트륨(0.188 mg).

특정 일례로, 본 발명의 제제는 용량당(예: 0.2 mL 용량당) 하나 이상의(또는 전부) 하기 성분들을 포함한다: 수크로스(13.68 mg), 인산칼륨(10O mM), 젤라틴 가수분해물(2.0 mg), 아르기닌 하이드로클로라이드(2.42 mg) 및 글루탐산일나트륨(0.188 mg).

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 제제는 용량당 하나 이상의(또는 전부) 하기 성분들을 포함한다(± 10%, 또는 20% 또는 30% 또는 40%): 수크로스(13.68 mg), 제2인산칼륨(2.26 mg), 제1인산칼륨(0.96 mg), 젤라틴 가수분해물(2.0 mg), 아르기닌 하이드로클로라이드(2.42 mg) 및 글루탐산일나트륨(0.188 mg).

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 용량당 하나 이상의(또는 전부) 하기 성분들을 포함한다(± 10%, 또는 20% 또는 30% 또는 40%): 수크로스(13.68 mg), 인산칼륨(10O mM), 젤라틴 가수분해물(2.0 mg), 아르기닌 하이드로클로라이드(2.42 mg) 및 글루탐산일나트륨(0.188 mg).

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 제제는 하나 이상의 하기 인플루엔자 바이러스의 유전자 골격(genetic backbone)을 가지는 인플루엔자 바이러스를 포함한다: A/앤아버(Ann Arbor)/6/60(A/AA/6/60) B/앤아버/1/66 바이러스, FluMist MDV-A(ca A/앤아버/6/60), FluMist MDV-B(ca B/앤아버/1/66), A/레닌그라드/17 도너 균주 골격 및 PR8.

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 하나 이상의 하기 성분들로부터의 HA 및 NA 폴리펩티드 서열(또는 이 서열과 적어도 90% 상동 또는 적어도 95% 상동)을 가지는 인플루엔자 바이러스를 포함한다: B/야마나시; A/뉴 칼레도니아; A/시드니; A/파나마; B/요하네스버그; B/빅토리아; B/홍콩; A/산둥/9/93; A/요하네스버그/33/94; A/무한/395/95; A/시드니/05/97; A/파나마/2007/99; A/와이오밍/03/2003; A/텍사스/36/91; A/선전/227/95; A/베이징/262/95; A/뉴 칼레도니아/20/99; B/앤아버/1/94; B/야마나시/166/98; B_요하네스버그_5_99; B/빅토리아/504/2000; B/홍콩/330/01; B_브리즈번_32_2002; B/지린/20/03; H1N1 인플루엔자 A 바이러스, H3N2 인플루엔자 A 바이러스, H9N2 인플루엔자 A 바이러스, H5N1 인플루엔자 A 바이러스; 인플루엔자 B 바이러스; 및 범유행성 인플루엔자 균주(WHO에 의해 지정되었거나 인간 집단에서 비순환). [참조예: US 20050042229].

또 다른 특정 구체예로, 본 발명의 백신 제제는 무균성이다.

백신 생산에 있어서 대표적인 단계에 대한 설명

논의 및 설명의 편의상, 백신 조성물 제조의 다양한 단계들은 일반적으로 크게 네개의 광범위 그룹(전술한 예시와 대략적으로 유사)을 포함하거나 또는 네 그룹에 속하는 것으로 고려될 수 있다. 제 1 그룹은 공-감염, 재배열, 재배열체 선택 및 재배열체의 클로닝과 같은 측면들을 포함한다. 제 2 그룹은 재배열체의 정제 및 팽창과 같은 측면을 포함한다. 제 3 그룹은 난에서 재배열체의 추가의 팽창 및 이렇게 수확한 바이러스 용액의 수확, 정제를 포함한다. 제 4 그룹은 수확한 바이러스 용액의 안정화 및 바이러스 용액의 효능/무균성 분석을 포함한다. 그러나, 본 발명의 측면을 상기 네개의 일반 범주로 분류하는 것은 단지 설명/구성의 목적만을 위한 것이고, 단계들의 상호의존성을 내포하는 것은 아닌 것으로 이해하여야 한다. 다른 단계(유사 및 상이한 것 모두)가 임의로 본 발명의 방법 및 조성물(예: RTS 백신 조성물에 대한 방법 및 조성물)과 함께 이용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

상기 언급한 바와 같이, 논의 및 설명을 용이하게 하기 위해서, 백신 생산의 다양한 단계들이 네개의 광범위한 그룹을 포함하는 것으로 생각할 수 있다. 제 1 그룹은 공-감염, 재배열, 재배열체 선택 및 재배열체의 클로닝과 같은 측면들을 포함한다.

그룹 1

본원에서 그룹 1에 속하는 것으로서 광범위하게 분류되는 백신 조성물의 생산 측면은, 예컨대 특별히 목적하는 재배열 바이러스를 생성하기 위해서 하나 이상의 야생형 바이러스와 마스터 도너 바이러스로 세포 배양주의 공감염을 최적화하고; 적절한 재배열 바이러스를 선별하고; 선별된 재배열 바이러스를 클로닝하는 것과 관련된 방법 및 조성물을 포함한다. 인플루엔자 바이러스 균주의 재배열은 당업자들에게 공지되었다. 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스 재배열체를 세포 배양물 및 난 모두에 이용하여 재배열 바이러스 균주를 생성하였다. 예를 들어, [Tannock et al., Preparation and characterisation of attenuated cold-adapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/134/17/57 donor strain, Vaccine (2002) 20:2082-2090]을 참조하기 바람. 플라스미드 작제물을 이용하여 인플루엔자 균주의 재배열체가 확인된 바 있다. 예를 들어, 2002년 4월 26일 출원된 USSN 60/375,675호, 2003년 4월 25일 출원된 PCT/US03/12728호, 2003년 4월 25일 출원된 USSN 10/423,828호, 2005년 5월 20일 출원된 PCT/US05/017734호 및 US20050186563호를 참조하기 바람.

간단히 요약하면, 재배열은 일반적으로 상이한 바이러스로부터의 유전자 세그먼트의(예: 난 또는 세포 배양물에서의) 혼합을 포함한다. 예를 들면, 인플루엔자 B 바이러스 균주의 전형적인 8 세그먼트가, 예컨대 관심 에피토프를 갖는 야생형 균주와 예컨대 한랭 적응 균주를 포함하는 "도너" 균주 간에 혼합될 수 있다. 2종 바이러스 간의 재배열은, 특히 한 세그먼트에 대해서는 야생형 에피토프 균주를 포함하고 다른 세그먼트에 대해서는 한랭 적응 균주를 포함하는 바이러스를 생성할 수도 있다. 유감스럽게도, 목적하는 재배열체를 얻기 위해서, 다수의 재배열을 실시해야 하는 경우가 흔히 있다. 재배열 후에, (예컨대, 목적하는 재배열체를 찾기 위해서) 바이러스를 선별할 수 있다. 그 후, 목적하는 재배열체를 클로닝할 수도 있다(예컨대 수 확장).

인플루엔자 B 바이러스에 대한 목적하는 재배열체의 전형적인 최적화, 선별 및 클로닝은 통상적으로 바이러스 균주를 세포 배양물(예: CEK 세포)에 공감염시킨 후에, 예컨대 모 바이러스 중 하나로부터 얻은 물질에 대한 적절한 항체로 선별하고(이것은 일반적으로 난에서 행해짐), 보통 세포 배양물에서 행해지는 바이러스를 클로닝 또는 증식하는 것 등에 의해 실시된다. 그러나, 이러한 전형적인 재배열은 목적하는 세그먼트 혼합물을 형성하는데 필요한 재배열 회수가 수천번에 이른다는 단점이 있다. 그러한 재배열이 행해지는 경우에는, 무작위 재배열이 최종 결과가 아니라는 점은 분명하다. 즉, 상기 과정을 편중시키는 압력이 시스템내에 존재한다. 그러나, 인플루엔자 A 균주의 경우, 상기와 같은 과정은 이러한 편중성을 보이지 않는다. A 균주의 경우, 균주의 (통상적으로는 CEK 세포와 같은 세포 배양물로의) 공감염 후에, 통상적으로 세포 배양물 내에서 선별 및 클로닝을 동시에 재 실시한다.

재배열 최적화

필요한 재배열 수를 줄이는(이에 따라 백신 제조 공정의 처리량/안정성이 증가됨) 것 등을 위해 그룹 1의 단계를 이용하여 재배열 과정을 최적화할 수 있다. 이 단계들을 이용하는 최적화 방법은 통상적으로 인플루엔자 B 균주의 재배열에 대해 구체화되어 있고, 보통 세포 배양물(예: CEK 세포)에서 실시된다. 예를 들어, 섹션내 및 명세서 전반에 걸쳐 모든 목적을 위해 전체를 참고로 포함하는 2004년 2월 25일 출원된 USSN 10/788,236호 및 PCT/US04/05697호를 참조하기 바람.

인플루엔자 바이러스의 다른 재배열 방법은 마스터 도너 바이러스(MDV)와 야생형 바이러스의 희석물, 예컨대 1:5 희석물(각 용액의 농도는 별로 중요하지 않음)을 혼합한 다음, 25℃ 및 33℃에서 24시간 및 48시간 동안 인큐베이션하는 것일 수 있다. 이러한 방법이 인플루엔자 A 균주에 대해 허용가능한 경우가 빈번하지만, 인플루엔자 B 균주는 일반적으로 그러한 프로토콜에 대해 긍정적인 결과를 제공하지 않는다. 예를 들어, 적당한 6:2 재배열체(즉, MDV로부터의 6 유전자 및 야생형 바이러스로부터의 두 유전자인 NA 및 HA)를 실현하기 위해서, 종종 수천회의 재배열을 실시해야 한다.

재배열체의 선별 및 클로닝

그룹 1의 단계는 또한 재배열 인플루엔자 바이러스의 선별을 포함한다. 재배열된 인플루엔자 A 균주를 세포 배양물(예: CEK 세포) 또는 난에서 선별할 수 있다. 그러나, 세포 배양물에서 재배열되는 경우(예컨대, CEK에서 선별되는 경우) 재배열 인플루엔자 B 균주는 문제를 야기한다. CEK 세포는 인플루엔자 B 균주내의 M 유전자를 방해하여, 총 생산을 감소시킬 것으로 판단된다. 예를 들어, 선별과 같은 바이러스 재배열에 상이한 단계(이들 단계는 백신 조성물에 대한 바이러스를 생산하기 위해 선택적으로 이용될 수 있다)를 이용하는 2004년 2월 25일 출원된 USSN 10/788,236호 및 PCT/US04/05697호를 참조하기 바람.

재배열체의 특성화

바이러스/백신 생산의 또 다른 방법은 본원에서 사용된 인플루엔자 바이러스의 유전자 배치를 결정하기 위해서 고 처리량의 단일 가닥 형태 다형성/모세관 전기영동(SSCP/CE) 분석의 응용을 이용한다. 인플루엔자 바이러스는 8개의 유전자 세그먼트를 포함하며, 전술한 바와 같이 두개의 상이한 인플루엔자 균주로 단일 세포를 공감염시키면 양 부모와 구별되는 새로운 유전자 배치를 갖는 재배열 바이러스를 생성할 수 있다. 따라서, 일부 방법은 다수의 인플루엔자 바이러스 샘플의 유전자 세그먼트 배치를 신속하게 결정하기 위해서 SSCP/CE 분석을 이용한다. 인플루엔자 바이러스 세그먼트는, 경우에 따라 8개의 각 세그먼트에 특이적인 형광 표지된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 증폭된다. 또한, 예를 들어 모든 목적을 위해 본원에 참고로 인용되는 [Arvin et al., (2000) J. Clin. Micro. 38 (2): 839-845]를 참조하기 바람.

박테리아 오염 예방

일부 바이러스/백신 생산 방법은 인플루엔자 바이러스가 생성되는 난의 미생물 오염을 검출 및/또는 예방/검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 미생물 검출법은 신속한/고 처리량 미생물 검출에 유용하며, 따라서 다른 여러 단계들과 마찬가지로 바이러스/백신 생성시 처리량 및 경우에 따라서는 안정성을 증가시키는데 유용하다.

본원의 발명과 함께 임의로 사용될 수 있는 다수의 인플루엔자 백신 제조 전략은 구성 성분으로서 특이적 병원균 무함유 수정난에서 인플루엔자 바이러스 증식을 위한 전형적인 방법을 이용한다. 난내 바이러스 생성시 몇몇 지점에서 가능한 미생물 오염이 일어날 수 있다. 유감스럽게도, 난은 그의 천연 플로라(flora)의 일부로서 껍질 밖에 일부 미생물을 가질 수도 있다. 닭의 배아 발생 동안 난 껍질내에 미생물이 포함될 수도 있다. 배아 발생을 위해 다습한 37℃에서 닭의 수정란을 인큐베이션하는데, 이는 여러 종류의 미생물 오염물에 대한 중요한 배양 조건을 구성한다. 또 다른 가능한 미생물 오염 시점은, 껍질에 천공을 내어 난을 접종할 때 일어난다. 바이러스 접종전에 난에 알콜을 자주 스프레이한다고 해도, 미생물이 난으로 진입할 기회는 여전히 존재한다.

난 내에 2 내지 3일간 바이러스를 증식시킨 후에, 난 내에 바이러스를 함유하는 요막액을 수동으로 수거하기 위해 전형적으로 계란 껍질의 상부를 제거한다. 상기 참조. 이 수거 시점이 미생물 오염이 일어날 수 있는 또 다른 기회가 된다. 유감스럽게도, 그러한 오염성 유해 생물(bioburden)을 포함하는 난은 검출되지 않을 수 있으므로, MPA 테스트 불합격으로 인해 그 전체가 거부되는 것을 최소화하기 위해 여러 개의 병에서 풀을 형성하는 것이 필요하다. 통상적으로, 3종의 인플루엔자 균주를 백신 제조에 사용하기 때문에, 최종 벌크를 위해 3종의 균주를 혼합하는 것이 필요하다. 예컨대 미생물 무함유 생성물을 보장하기 위해서 블렌딩 및 충전에 사용하기 전 바이러스 수거시에 제조 과정의 MPA(미생물 순도 분석) 테스트를 실시한다.

인큐베이션 후, "전형적인" 투시 검란법을 이용하여, 자연적인 원인 또는 미생물 오염에 의해 죽은 듯한 사란 및 무정란을 확인한다(즉, 사란은 바이러스 감염 및/또는 미생물 증식으로 인해 일어날 수 있으며, 양자의 경우에 사란의 검출 및 제거가 필요하다). 투시 검란이란, 예컨대 발생 중인 배아를 육안으로 관찰할 수 있도록 암실에서 난을 광원 앞에 두는 과정을 포함한다. 사란에는 바이러스 접종을 실시하지 않는다.

상기로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 인플루엔자 백신의 제조 도중 여러 단계에서 미생물 오염의 검출이 필요할 수 있다. 조류 및 환경 미생물을 제거하거나 감소시킬 필요성과, 환경 및 인간 미생물의 도입을 제거하거나 감소시킬 필요성이 있다. 현재 널리 실시되고 있는 미생물 오염 검출법은, 예컨대 간단한 방법(MPA 및 유해 생물 테스트)을 포함한다. 현재 널리 실시되고 있는 방법은, 예컨대 난의 접종 전/후 동안 투시 검란(통상 약 500 난/시간/1인의 속도로 수동으로 실시됨); MAP 및 유해 생물 테스트(통상 수동으로 실시되고, MPA의 경우 약 14일, 유해 생물 테스트의 경우 약 3일이 소요되고, 바이러스 수확시 실시됨); 미코플라즈마 테스트(통상 수동으로 실시되고 약 28일이 소요되며, 바이러스 수확시 실시함); 및 미코박테리아 테스트(통상 수동으로 실시되고 약 56일이 소요되며, 바이러스 수확시 실시됨)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명과 함께 이용할 수 있는 다양한 기술들을 설명하고 있는 2004년 2월 25일 출원된 USSN 10/788,236호 및 PCT/US04/05697호를 참조하기 바람.

그룹 2

그룹 2에 속하는 바이러스/백신 제조 측면은 추가의 정제 및 바이러스 증식 등을 포함한다. 재배열체(즉 6:2 바이러스)의 정확한 재배열 및 클로닝 과정 후에, 재배열된 바이러스 입자를 발육난에서 추가로 정제하고 적당한 클론을 양적으로 확장시켜(난에서 다시 증식시켜) 마스터 바이러스 균주(MVS) 또는 마스터 바이러스 시드를 형성하며, 이를 추가로 증식시켜 마스터 작용성 바이러스 균주(MWVS) 또는 제조자 가공 바이러스 시드를 형성한다. 난으로부터 바이러스 입자를 정제하고 바이러스 입자의 양을 증가시키기 위해 이렇게 정제된 바이러스를 더 많은 난의 접종을 위해 사용하는 것에 관한 여러 측면들이 당업자들에게 알려져 있다. 그러한 다수의 기법은 현행 바이러스 입자 제조 방법에서 통용되는 것이며, 적어도 40년간 이용되어 왔다. 예를 들어, [Reimer, et al. Influenza virus purification with the zonal ultracentrifuge, Science 1966, 152:1379-81]을 참조하기 바람. 정제 프로토콜은, 예컨대 수크로스 구배(예: 10-40% 수크로스)에서의 초원심분리 등을 포함할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 바와 같이, 다른 그룹에서 언급된 그밖의 절차, 예컨대 미생물 오염 예방 등이 임의로 그룹 2에 제공된다.

그룹 3

그룹 3의 골자에 속하는 바이러스/백신 생산 측면은, 예를 들어 발육난의 컨디셔닝(예를 들어, 바이러스 감염란의 인큐베이션과 관련된 특수 처리 및 환경 조건) 및 난의 요막액으로부터 인플루엔자 바이러스의 수확 및 정제를 포함한다.

예를 들어, 백신에 사용될 재배열 바이러스를 함유하는 난의 컨디셔닝, 세정, 투시 검란 및 인큐베이션 단계; 이러한 난의 접종, 실링 등; 상기 난의 투시 검란; 난으로부터 바이러스 용액(즉, 요막액 또는 바이러스 수확물(VH))의 수확; 및 상기 바이러스 용액의 정제가 모두 그룹 3의 범주에 속한다. 또한, 그룹 2의 단계들에 적용가능한 몇몇 기술이 그룹 3의 단계들(예컨대, 투시 검란 등)에도 동일하게 적용될 수 있음을 유의하여야 한다. 그룹 3을 구성하는 바이러스/백신 생산의 일부 측면이 당업자들에게 널리 알려져 있다. 바이러스 제조시 난의 다양한 투시 검란 측면은 난을 바이러스로 접종하고 이들 난을 세정, 인큐베이션하는 것 등과 마찬가지로 난의 바이러스/백신 제조에서 잘 알려진 기술이다. 물론, 이러한 잘 알려진 기술들은 본 발명의 독특하고 혁신적인 측면과 함께 이용된다는 점을 이해하여야 할 것이다. 예를 들어, 2004년 2월 25일 출원된 USSN 10/788,236호 및 PCT/US04/05697호는 본 발명의 방법 및 조성물과도 함께 사용될 수 있는 로킹(rocking) 등과 같은 추가의 단계를 제공한다. 다른 유사 단계는 또한 조성물의 특수 여과 및 가온을 포함할 수 있다(상기 동일 참조).

여과 및 가온

본 발명은 본 발명의 그룹에 속할 수 있는 상술된 바와 같은 초원심분리 측면을 포함한다. 또한, 2004년 2월 25일 출원된 USSN 10/788,236호 및 PCT/US04/05697호가 또한 본 발명의 방법 및 조성물과 함께 임의로 사용될 수 있는 다른 여과 및 가온 단계들을 제공한다. 상술된 바와 같이, FluMist^TM 제조 과정은 마스터 바이러스 시드(MVS), 제조자 가공 바이러스 시드(MWVS) 및 바이러스 수확물(VH)을 생성시키기 위해 닭의 발육난을 사용할 수 있다. 시드 및 바이러스 수확물은 유해 생물(통상 세균 오염)을 포함할 수 있는데, 이로 인해 백신 제조 과정에서 시드나 벌크 바이러스 산물 로트가 거부될 수 있다. 물론, 사용된 제품 형태 및 크기 등에 대한 특정 목록 또는 설명은 특별히 언급하지 않는 한 본 발명으로 국한되는 것으로 간주되지 않을 것이라는 것을 이해할 것이다.

그룹 4

백신 제제/조성물 제조 측면의 그룹 4는, 예를 들어 주로 안정화(예컨대, 구성 성분 첨가, 완충제/NAF 비율 변경 등) 및 바이러스 함유 용액의 효능/무균성 분석을 포함한다. 상기 본 발명의 설명은 경우에 따라 본 범주내로 분류될 수 있는 다양한 측면들을 제공한다(상기 참조).

일부 실시예에서, 생 바이러스를 함유하는 최종 바이러스 용액/백신은 인플루엔자 접종 기간(예컨대, 북반구에서 전형적으로 대략 9월부터 3월까지)에 "시중에서"(예컨대, 2-8℃, 4℃, 5℃ 등으로 냉장되어 판매 및 상용화) 저장하기에 충분한 시간 동안 액체 형태로 안정하다. 따라서, 이러한 바이러스/백신 조성물은 저장 기간 동안 효능을 유지하거나, 그의 효능이 허용 비율로 감소하는 것이 바람직하다. 다른 구체예에서, 이러한 용액/백신은 약 2 내지 약 8℃, 예를 들어 냉장 온도에서 액체 형태로 안정하다. 예를 들어, 0.3 log 효능 손실이 허용가능하고 저장 기간이 9개월이면, 0.05 log/월의 효능 감소는 허용 범위내일 것이다. 다른 예로서, 0.75 log 이하의 효능 손실이 허용적이면, 0.09 log/월 이하의 비율이 냉장 온도(예컨대 4℃)에서 연속 저장된 재료의 안정성을 보장하기에 충분할 것이다. 다른 구체예에서, 상기 용액/백신은 약 2 내지 약 8℃에서 저장되는 경우 액체 형태로 안정하다. 조성물의 안정성은 약 1일 내지 2년, 약 10일 내지 약 2년, 약 20일 내지 약 2년, 약 1개월 내지 약 2년, 약 2개월 내지 약 2년, 약 3개월 내지 약 2년, 약 4개월 내지 약 2년, 약 5개월 내지 약 2년, 약 6개월 내지 약 2년, 약 7개월 내지 약 2년, 약 8개월 내지 약 2년, 약 9개월 내지 약 2년, 약 10개월 내지 약 2년, 약 11개월 내지 약 2년, 약 12개월 내지 약 2년, 약 13개월 내지 약 2년, 약 14개월 내지 약 2년, 약 15개월 내지 약 2년, 약 16개월 내지 약 2년, 약 17개월 내지 약 2년, 약 18개월 내지 약 2년, 약 19개월 내지 약 2년, 약 20개월 내지 약 2년, 약 21개월 내지 약 2년, 약 22개월 내지 약 2년, 약 23개월 내지 약 2년, 또는 약 2년 초과를 포함한다.

본 발명의 제제 안정성은 다수의 방법으로 조사할 수 있다. 예를 들어, 먼저, 제제를 냉동 온도(예: -25 또는 -7O℃(±10, 20, 30, 또는 40℃)에서 인큐베이션한 후, 제제를 4-8℃에서 일정 시간 저장(또는 "인큐베이션")할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제제 안정성은 제제를 단순히 4-8℃에서 일정 시간 저장(또는 "인큐베이션")하여 조사할 수도 있다.

바이러스 수확물의 농축/정용여과

백신 조성물을 제조하는 일부 방법에서, 바이러스 수확물은 임의로 적절한 칼럼을 이용하여 농축된다. 2004년 2월 25일 출원된 USSN 10/788,236호 및 PCT/US04/05697호를 참조하기 바람.

안정제/완충제

바이러스 조성물의 제조는 임의로 관심 바이러스 및, 예를 들면 수크로스, 아르기닌, 젤라틴, EDTA 등의 조합을 포함하는 다양한 NAF(전형적으로 비분획화 NAF)의 희석물을 포함한다. 예를 들어, 상이한 백신 제제에서 가능한 다양한 조합을 예시하고 있는 USSN 10/788,236호 및 PCT/US04/05697호를 참조하기 바람. 이러한 방법 및 조성물은 바람직하게는 안정하며, 예를 들어 소정의 온도(예를 들어 전형적으로 4℃, 5℃, 8℃, 약 2 내지 약 8℃ 또는 2℃ 이상 등)에서 소정의 시간(전형적으로 적어도 6개월, 적어도 9개월, 적어도 12개월, 적어도 15개월, 적어도 18개월, 적어도 24개월 등) 동안, 예를 들어 0.5-1.0 log, 또는 0.5 log 미만, 또는 1.0 log 미만의 효능 손실과 같이 허용되지 않는 수준의 효능 손실을 보이지 않는다.

일부 제제에서, 조성물은 젤라틴 또는 젤라틴 관련 및/또는 유래 산물(예: 젤라틴 가수분해물)과 함께 또는 이들 대신, 예를 들어 아르기닌(약 7.0 내지 약 7.2의 pH) 안정제를 포함할 수도 있다. 예를 들어, USSN 10/788,236호 및 PCT/US04/05697호를 참조하기 바람. 또한, 다수의 바이러스 용액/백신 용액에서, 경우에 따라 SPG(수크로스, 인산칼륨 및 글루탐산일나트륨)의 염기 용액이 사용된다.

2004년 2월 25일 출원된 USSN 10/788,236호 및 PCT/US04/05697호는 바이러스/백신 조성물의 안정화의 기타/추가의 방법, 예컨대 NAF 수준 조작 등을 제공한다.

정의

달리 정의하지 않는 한, 모든 과학 용어 및 기술 용어는 이들이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어들은 이하 정의되는 바와 같다.

"핵산", "폴리뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 서열"이라는 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체, 또는 이들의 키메라 또는 유사체를 의미한다. 본원에 사용되는 경우 이들 용어는 경우에 따라, 이들이 자연 생성 뉴클레오티드(예: 펩티드 핵산)와 유사한 방식으로 단일 가닥 핵산에 하이브리드화 한다는 점에서 천연 뉴클레오티드의 필수 성질을 갖는 자연 생성 뉴클레오티드의 유사체 중합체를 포함한다. 달리 명시하지 않으면, 특정 핵산 서열은 임의로 상기 명시된 서열 이외에, 상보 서열을 포함한다.

"유전자"라는 용어는 생물학적 기능과 관련된 임의의 핵산을 지칭하기 위해 널리 사용되고 있다. 따라서, 유전자는 이들의 발현에 필요한 코딩 서열 및/또는 조절 서열을 포함한다. "유전자"라는 용어는 게놈 서열에 의해 코딩된 cDNA 또는 mRNA 뿐 아니라 특정 게놈 서열에도 적용된다.

유전자는 또한 예컨대, 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비발현 핵산 세그먼트도 포함한다. 비발현 조절 서열은 전사 인자와 같은 조절 단백질이 결합하여 인접하거나 가까운 서열의 전사를 일으키는 "프로모터(promoter)" 및 "인핸서(enhancer)"를 포함한다. "조직 특이적" 프로모터 또는 인핸서는 특정 조직 유형 또는 세포 유형(들)에서 전사를 조절하는 것이다.

"벡터"라는 용어는 유기체, 세포 또는 세포 성분 사이에서 핵산이 증식 및/또는 전이될 수 있는 수단을 지칭한다. 벡터는 자가 복제되거나 숙주 세포의 염색체로 통합될 수 있는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 프로바이러스, 파지미드, 트랜스포손 및 인공 염색체 등을 포함한다. 벡터는 또한 자가 복제되지 않는 틈(naked) RNA 폴리뉴클레오티드, 틈 DNA 폴리뉴클레오티드, 동일 가닥내 DNA 및 RNA 둘다로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 폴리-리신-콘쥬게이트된 DNA 또는 RNA, 펩티드-콘쥬게이트된 DNA 또는 RNA, 리포좀-콘쥬게이트된 DNA 등일 수 있다. 가장 일반적으로, 본원에서 벡터는 플라스미드를 지칭하나, 예외적인 경우도 있다.

"발현 벡터"는 그에 도입된 핵산의 복제 뿐 아니라 발현을 촉진할 수 있는 플라스미드와 같은 벡터이다. 전형적으로, 발현될 핵산은 프로모터 및/또는 인핸서에 "작동가능하게 결합"되고, 프로모터 및/또는 인핸서에 의해 전사 조절이 제어된다.

"이방향 발현 벡터"는 발현이 양 방향으로 개시될 수 있어서 예컨대, 양쪽 플러스(+) 또는 센스 가닥, 및 네거티브(-) 또는 안티센스 가닥 RNA의 전사를 일으키도록, 두 교대 프로모터가 두 프로모터 사이에 위치한 핵산에 대해 반대 방향으로 배향되었다는 것에 특징이 있다.

본원에서, "분리된"이라는 용어는 자연 생성 환경에서 통상 동반되거나 상호작용하는 성분들이 실질적으로 존재하지 않는, 핵산 또는 단백질과 같은 생물학적 물질을 의미한다. 분리된 물질은 임의로 그의 자연 환경, 예를 들어 세포내 물질에서 발견되지 않는 물질을 포함한다. 예컨대, 물질이 세포와 같은 그의 자연 환경에 놓일 경우, 물질은 그와 같은 환경에서 발견되는 물질에 고유하지 않은 세포내 장소(예: 게놈 또는 유전 원소)에 위치한다. 예를 들어, 자연 생성 핵산(예: 코딩 서열, 프로모터, 인핸서 등)은 비자연 생성 수단에 의해 핵산에 고유적이지 않은 게놈 자리(예: 플라스미드 또는 바이러스 벡터 등의 벡터 또는 앰플리콘)에 도입될 경우 분리된다. 이러한 핵산은 "이종 유래" 핵산으로도 지칭된다.

"재조합"이라는 용어는 물질(예: 핵산 또는 단백질)이 인공적으로 또는 합성적으로(비자연적으로) 변경된 것을 의미한다. 이 변경은 그의 자연 환경 또는 상태의 물질 상에서 수행될 수 있거나, 그로부터 제거될 수도 있다. 구체적으로, 바이러스를 언급할 경우, 인플루엔자 바이러스가 재조합 핵산의 발현에 의해 제조되는 경우 이는 재조합체이다.

바이러스를 언급할 경우 "재배열체(reassortant)"라는 용어는 바이러스가 복수개의 부모 바이러스 균주 또는 공급원으로부터 유래된 유전자 성분 및/또는 폴리펩티드 성분을 포함하는 것을 의미한다. 예컨대, 7:1 재배열체는 제 1 부모 바이러스로부터 유래된 7개의 바이러스 게놈 세그먼트(또는 유전자 세그먼트) 및 제 2 부모 바이러스로부터 유래된 단일 상보 바이러스 게놈 세그먼트, 예컨대, 코딩 적혈구 응집소 또는 뉴라미니다제를 포함한다. 6:2 재배열체는 제 1 부모 바이러스로부터 유래된 6개의 게놈 세그먼트, 가장 일반적으로 6개의 내부 유전자 및 상이한 부모 바이러스로부터 유래된 두개의 상보 세그먼트, 예컨대, 적혈구 응집소 및 뉴라미니다제를 포함한다.

이종 유래 또는 분리된 핵산과 관련하여, "도입된"이라는 용어는 핵산이 세포의 게놈(예: 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)에 도입될 수 있거나, 자가 복제단위로 전환될 수 있거나, 또는 일시적으로 발현될 수 있는(예: 형질감염 mRNA) 진핵 세포 또는 원핵 세포로 핵산이 도입된 것을 의미한다. 이 용어는 "감염", "형질감염", "형질전환" 및 "형질도입"과 같은 방법을 포함한다. 본원에서 이와 관련하여, 전기 천공, 인산칼슘 침전, 리피드 매개 형질감염(리포펙션: lipofection) 등을 비롯한 다양한 방법들이 핵산을 원핵 세포로 도입하는데 이용될 수 있다.

"숙주 세포"라는 용어는 벡터와 같은 이종 유래 핵산을 포함하고, 핵산의 복제 및/또는 발현을 지지하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 E. coli와 같은 원핵 세포 또는 효모, 곤충, 양서류, 조류 또는 인간 세포를 비롯한 포유동물 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 본원에서 이와 관련한 예시적인 숙주 세포는 베로(Vero: 아프리카 녹색 원숭이 신장) 세포, BHK(어린 햄스터 신장) 세포, 1차 병아리 신장(PCK) 세포, MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포, MDBK(Madin-Darby Bovine Kidney) 세포, 293 세포(예: 293T 세포) 및 COS 세포(예: COS1, COS7 세포)를 포함한다.

인플루엔자 바이러스

본원에서 조성물 및 방법은 주로 백신용 인플루엔자 바이러스의 제조와 관련된다. 인플루엔자 바이러스는 분절된 단일 가닥의 RNA 게놈을 함유하는 내부 리보핵산단백질 핵과 매트릭스 단백질에 의해 결합된 외부 지질단백질 외피로 이루어진다. 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스는 각각 8개 세그먼트의 단일 가닥 네거티브 센스 RNA를 함유한다. 인플루엔자 A 게놈은 11개의 폴리펩티드를 코딩한다. 세그먼트 1-3은 RNA-의존성 RNA 중합 효소를 구성하는 세개의 폴리펩티드를 코딩한다. 세그먼트 1은 중합효소 복합체 단백질 PB2를 코딩한다. 나머지 중합 효소 단백질 PB1 및 PA는 각각 세그먼트 2 및 세그먼트 3에 의해 코딩된다. 또한, 일부 인플루엔자 균주의 세그먼트 1은 PB1 코딩 영역내 대체 해독 프레임으로부터 생성된 소형 단백질 PB1-F2를 코딩한다. 세그먼트 4는 감염중에 세포 부착 및 진입에 관여하는 적혈구 응집소(HA) 표면 당단백질을 코딩한다. 세그먼트 5는 바이러스 RNA에 관련된 주 구조 성분인 뉴클레오캡시드 핵산 단백질(NP) 폴리펩티드를 코딩한다. 세그먼트 6은 뉴라미니다제(NA) 외피 당단백질을 코딩한다. 세그먼트 7은 상이하게 스플라이싱된 mRNA로부터 해독된 M1 및 M2로 명명된 두개의 매트릭스 단백질을 코딩한다. 세그먼트 8은 교대로 스플라이싱된 mRNA 변이체로부터 해독된 두개의 비구조 단백질인 NS1과 NS2를 코딩한다.

인플루엔자 B의 8개 게놈 세그먼트가 11개의 단백질을 코딩한다. 3종의 가장 큰 유전자는 RNA 중합 효소, PB1, PB2 및 PA 성분을 코딩한다. 세그먼트 4는 HA 단백질을 코딩한다. 세그먼트 5는 NP를 코딩한다. 세그먼트 6은 NA 단백질 및 NB 단백질을 코딩한다. NB 및 NA 두 단백질은 양시트론성(biscistronic) mRNA의 중복 해독 프레임으로부터 해독된다. 인플루엔자 B의 세그먼트 7은 또한 M1 및 BM2 두 단백질을 코딩한다. 가장 작은 세그먼트는 전장 RNA로부터 해독된 NS1 및 스플라이싱된 mRNA 변이체로부터 해독된 NS2의 두 산물을 코딩한다.

인플루엔자 바이러스 백신

역사적으로, 인플루엔자 바이러스 백신은 주로 관련 균주의 실험적 예측을 기준으로 하여 선택된 바이러스 균주를 이용하여 닭의 발육난에서 제조되었다. 보다 최근에, 재배열 바이러스는 승인된 온도 민감성 약독화 마스터 균주 환경에 선택한 적혈구 응집소 및 뉴라미니다제 항원을 도입하여 제조되었다. 계란에서 수회 계대배양하여 바이러스를 배양한 후, 인플루엔자 바이러스를 회수하고, 임의로 포름알데히드 및/또는 β-프로피오락톤을 이용하여 불활성화시킨다(또는, 대안으로 생 약독화 백신에서 사용됨).

그러나, 이러한 방법으로 인플루엔자 백신을 제조하는 것은 몇 가지 중요한 문제가 있다. 예컨대, 계란으로부터의 잔류 오염물은 고 항원성 및/또는 발열성일 수 있고, 이는 투여시 빈번하게 상당한 부작용을 일으킬 수도 있다. 따라서, 다른 방법은 난 성분의 일부를 무동물성 배지로 대체하는 것을 포함한다. 보다 중요하게, 백신 제조를 위해 지정된 바이러스 균주는 통상 인플루엔자 백신을 제조하고 불활성화하는데 필요한 시간을 위해 다음 인플루엔자 시즌에 몇달 앞서 선택되고 배급되어야 한다. 따라서, 좀 더 편리한 온도(예를 들어 본 발명의 방법 및 조성물을 사용함으로써 약 2-8℃의 냉장 온도)에서 저장 시간 및/또는 저장 안정성에 어떠한 개선이라도 이루어지는 것이 매우 요망된다.

세포 배양물에서 재조합 및 재배열 백신을 제조하려는 시도는 백신 제조를 위해 승인된 일부 균주가 표준 세포 배양 조건하에서 효율적으로 증식할 수 없기 때문에 곤란을 받고 있다. 따라서, 본 발명자들 및 공동 연구원에 의한 선행 작업은 벡터 시스템, 및 배양물에서 재조합 및 재배열 바이러스를 제조하는 방법을 제공하였고, 이에 따라 하나 또는 다수의 선택된 바이러스 항원 균주에 상응하는 백신을 신속히 제조하는 것이 가능하게 되었다. 예를 들어, 2002년 4월 26일 출원된 USSN 60/375,675호, 2003년 4월 25일 출원된 PCT/US03/12728호, 2003년 4월 25일 출원된 10/423,828호 및 2005년 5월 20일 출원된 PCT/US05/017734호를 참조하기 바람. 물론, 이러한 재배열은 임의로 계란에서 추가 증폭된다. 전형적으로, 배양물은 온도가 35℃를 초과하지 않도록 항온기와 같은 온도 조절기를 이용하여 일정한 온도에서 제어된 습도 및 CO₂ 하에 세포 배양 인큐베이터와 같은 시스템내에 유지된다. 이러한 도전적인 작업 뿐 아니라 기타 백신 생산은 본 발명을 전체로 또는 부분적으로 이용하여 추가로 최적화될 수 있다.

재배열 인플루엔자 바이러스는 관심 균주(예: 관심 항원 변이체) 유래 상보 세그먼트와 함께, 마스터 인플루엔자 바이러스의 게놈 세그먼트에 상응하는 벡터 아집단을 도입함으로써 용이하게 얻을 수 있다. 전형적으로, 마스터 균주는 백신 투여에 대한 바람직한 특성을 기준으로 하여 선택된다. 예컨대, 백신 제조, 이를테면 생 약독화 백신의 제조를 위해, 마스터 도너 바이러스 균주는 약독화 표현형, 한랭 적응 및/또는 온도 민감성에 대해 선택될 수 있다.

FluMist ^®

상기 언급한 바와 같이, 인플루엔자 백신의 다수의 예 및 유형이 존재한다. 예시적인 인플루엔자 백신은 인플루엔자 질환으로부터 어린이와 성인들을 보호하는 생 약독화 백신인 FluMist이다[Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N. Engl. J. Med. 338:1405-12; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44)]. 전형적인 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 바람직하게는 FluMist 백신의 제조에 적용되거나, 이와 함께 사용된다. 그러나, 당업자들은 본원에서의 단계/조성물이 또한 유사하거나 또는 심지어 상이한 바이러스 백신 및 그의 조성물의 제조에도 적용될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

FluMist^TM 백신 균주는 예컨대, 일반 마스터 도너 바이러스(MDV)로부터의 6개 유전자 세그먼트 PB1, PB2, PA, NP,M 및 NS와 함께 백신의 표적이 되는 야생형 균주로부터 유래된 HA 및 NA 유전자 세그먼트를 포함한다. 야생형 A/앤아버/6/60(A/AA/6/60) 균주를 연속적으로 온도를 낮추면서 1차 닭 신장 조직 배양물에서 계대배양하여 FluMist의 인플루엔자 A 균주용 MDV(MDV-A)를 생성시켰다[Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213:612-4)]. MDV-A는 25℃에서 효율적으로 복제되었으나(ca, 한랭 적응), 그의 증식은 38℃ 및 39℃에서 제한되었다(ts, 온도 민감성). 또한, 이 바이러스는 감염된 흰족제비의 폐에서는 복제되지 않았다(att, 약독화). ts 표현형은 기도의 가장 차가운 구역을 제외한 모든 구역에서 그의 복제를 제한함으로써 인간에서 백신의 약독화에 기여할 것으로 여겨진다. 이러한 특성의 안정성은 동물 모델 및 임상 연구에서도 증명되었다. 화학적 돌연변이유발에 의해 생성된 인플루엔자 균주의 ts 표현형과 대조적으로, MDV-A의 ts 특성은 감염된 햄스터를 통한 계대 후에 또는 어린이로부터 배출된 분리물(shed isolate)에서 역전하지 않는다(최근 보고로서, [Murphy & Coelingh (2002) Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol. 15: 295-323]를 참조하기 바람).

12개의 상이한 6:2 재배열 균주와 관련된 20,000명 가량의 어른과 어린이에 대한 임상 연구에 따라 이들 백신이 약독화되었고, 안전하며, 효능이 있는 것으로 입증되었다[(Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children N. End. J. Med. 338:1405-12; Boyce et al. (2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine 19:217-26; Edwards et al. (l994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J. Infect. Dis. 169:68-76; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44)]. 야생형 바이러스의 두 HA 및 NA 유전자 세그먼트 및 MDV-A의 6개의 내부 유전자를 가지는 재배열체(즉, 6:2 재배열체)는 ca, ts 및 att 표현형을 일관적으로 유지한다[(Maassab et al. (1982) Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets J. Infect. Dis. 146:780-900)]. 그러나, 인플루엔자의 B 균주를 이용하여 이러한 재배열 바이러스를 제조하는 것은 보다 어렵다.

최근의 연구[참조예: 2002년 4월 26일 출원된 USSN 60/375,675호, 2003년 4월 25일 출원된 PCT/US03/12728호, 2003년 4월 25일 출원된 USSN 10/423,828호 및 2005년 5월 20일 출원된 PCT/US05/017734호]는 전적으로 클론화 cDNA로부터 인플루엔자 B 바이러스를 생성하기 위한 8개의 플라스미드 시스템, 및 비강 투여에 유용한 생 바이러스 백신 제제와 같은 백신 제제에 적합한 생 약독화 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 제조방법을 제시하였다.

상기 설명한 시스템 및 방법은 FluMist^®과 같이 비강 투여에 적합한 백신과 같은 생 약독화 백신을 비롯하여, 백신으로서 사용하기에 적합한 바이러스를 포함한 재조합 및 재배열 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 세포 배양물에서 신속한 제조에 유용하다. 본원에 개시된 본 발명의 방법은 임의로 더욱 안정적이고 일관적이면서 생산적인 방법으로 백신용 바이러스를 제조하기 위해, 예를 들어 백신 제조용 재배열 인플루엔자 바이러스와 관련된 기존의 연구와 함께 또는 조합하여 사용되기도 한다.

세포 배양

상기 설명한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스를 임의로 세포 배양으로 증식시킬 수도 있다. 전형적으로, 바이러스 증식은 숙주 세포가 일반적으로 배양되는 배지 조성물 중에서 이루어진다. 인플루엔자 바이러스의 복제에 적절한 숙주 세포는, 예컨대 베로 세포, BHK 세포, MDCK 세포, 293T 세포와 COS7 세포를 비롯한 293 세포 및 COS 세포를 포함한다. 일반적으로, 예를 들어 MDCK 세포 및 293T 또는 COS 세포와 같은 상기 세포주중 두 개를 포함하는 공-배양물은 복제 효율을 향상시키기 위해, 예컨대 1:1 비율로 사용된다. 전형적으로, 세포는 중성 완충 pH(예: 7.0 내지 7.2의 pH)를 유지하기에 적합한 제어된 습도 및 CO₂ 농도하에 혈청(예: 10% 소 태아 혈청)을 첨가한 DMEM(듈베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium))과 같은 표준 상업적 배양 배지 또는 무혈청 배지내에서 배양된다. 임의로, 배지는 박테리아 성장을 방지하기 위한 항생제, 예컨대, 페니실린, 스트렙토마이신 등, 및/또는 추가의 영양소, 예컨대, L-글루타민, 피루빈산나트륨, 비필수 아미노산, 유리한 증식 특성을 촉진하기 위한 추가의 보충물, 예컨대, 트립신, β-머캅토에탄올 등을 함유한다.

배양물내 포유동물 세포를 유지하기 위한 절차는 광범하게 보고되었고, 당업자들에게 잘 알려져 있다. 일반적인 프로토콜이 예를 들어, [Freshney (1983) Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, New York; Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5^th ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Amsterdam]에 제공되었다. 시험관내 인플루엔자 바이러스의 제조에 대한 특히 관심있는 조직 배양 절차에 관한 추가의 상세한 정보가 예컨대, 이를 위해 전체를 본원에서 참고로 인용하는 [Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation in Cohen and Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines]에 포함되어 있다. 또한, 본 발명에 응용하기 위해 상기 절차를 변형하는 것은 일상적인 실험을 통해 용이하게 결정할 수 있으며, 당업자들에게는 친숙한 내용이다.

본 발명의 특정 구체예로, 본 발명의 숙주 세포는 무혈청 조건하에 트립신의 존재 또는 부재하에서 배양 및/또는 감염되고, 30 내지 39℃; 또는 30℃, 또는 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 또는 39℃ 범위의 온도에서 배양 및/또는 감염된다.

인플루엔자 바이러스 제조용 세포는 혈청 함유 또는 무혈청 배지에서 배양될 수 있다. 예컨대, 정제된 바이러스의 제조를 위한 일부 경우에서, 통상적으로 무혈청 조건에서 숙주 세포를 증식시키는 것이 바람직하다. 세포는 소규모, 예컨대 25 mL 미만의 배지, 배양관 또는 플라스크에서, 또는 대용량 플라스크에서 교반하면서 또는 회전 병에서 또는 마이크로캐리어 비드(microcarrier bead)(예컨대 Dormacell(Pfeifer & Langen)과 같은 DEAE-덱스트란 마이크로캐리어 비드; 슈퍼비드(Flow Laboratories); 스티렌 공중합체-트리-메틸아민 비드, 예컨대 Hillex(SoloHill, Ann Arbor)) 상에서 배양될 수 있다. 마이크로캐리어 비드는 세포 배양물 부피당 부착 세포 증식을 위해 큰 표면적을 제공하는 소형 구(직경 100 내지 200 마이크론)이다. 예를 들어, 1L 배지는 8,000 cm² 이상의 증식 표면을 제공하는 2,000 만개 이상의 마이크로캐리어 비드를 포함할 수 있다. 예컨대, 백신 제조와 같은 상업적 바이러스 제조를 위해, 생물반응장치 또는 발효기에서 세포를 배양하는 것이 바람직한 경우가 종종 있다. 생물반응장치는 1L 이하에서 100 리터를 초과하는 부피에 이르는 제품, 예컨대, Cyto3 생물반응장치(미국 미네소타주 미네톤카 소재, 오스모닉사(Osmonics) 제품; NBS 생물반응기(미국 뉴저지주 에디슨 소재, 뉴 브룬스윅 사이언티픽사(New Brunswick Scientific) 제품); B. 브라운 바이오테크 인터내셔널사(B. Braun Biotech International)로부터 구입한 연구 및 상업적 규모의 생물반응장치(독일 멜스운젠 소재, B. 브라운 바이오테크사 제품)가 유용하다.

배양물 부피와 관계없이, 본 발명의 다수의 바람직한 측면에서, 온도 의존성 멀티 플라스미드 시스템(상기 언급한 인플루엔자 바이러스 제조를 위한 멀티-플라스미드 시스템 참조)을 이용한 경우 재조합 및/또는 재배열 인플루엔자 바이러스의 효율적인 회수를 보장하기 위해, 배양물을 여과 바이러스 용액을 가열하는 것 등에 의해 적당한 온도로 유지하는 것이 중요하다. 전형적으로, 적절한 시기 동안(예: 바이러스 복제 등) 온도를 정확한 수준으로 유지하기 위해, 세포 배양 시스템 및/또는 기타 용액의 온도를 감지하고 유지하기 위한 조절기, 예컨대, 항온기 또는 기타 장치가 사용된다.

일부 방법(예: 재배열 바이러스가 벡터상의 세그먼트로부터 제조된 경우)에서, 인플루엔자 게놈 세그먼트를 포함하는 벡터는, 예를 들어 인산칼슘 공침전, 전기천공, 마이크로주입, 리포펙션 및 폴리아민 형질감염 시약을 이용한 형질감염을 비롯하여 이종 유래 핵산을 진핵 세포에 도입하기 위해 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 숙주 세포에 도입(예: 형질감염)된다. 예컨대, 플라스미드와 같은 벡터는 재배열 바이러스 등을 제조하기 위한 제조자의 사용 설명서에 따라 폴리아민 형질감염 시약 TransIT-LT1(Mirus)을 이용하여, COS 세포, 293T 세포 또는 COS 또는 293T 세포의 조합물 및 MDCK 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염될 수 있다. 약 2 ㎕의 TransIT-LT1을 이용하여 숙주 세포 집단에 도입되는 약 1 ㎍의 각 벡터를 총 부피가 200 ㎕가 되도록 160 ㎕의 배지, 바람직하게는 무혈청 배지에서 희석하였다. DNA:형질감염 시약 혼합물을 45 분간 실온에서 인큐베이션하고, 80 ㎕의 배지를 첨가하였다. 형질감염 혼합물을 숙주 세포에 첨가하고, 이 세포를 상기와 같이 배양하거나, 또는 당업자들에게 잘 알려진 다른 방법을 이용하여 배양하였다. 따라서, 세포 배양물내 재조합 또는 재배열 바이러스의 제조를 위해, 8개의 각 게놈 세그먼트(PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA 및 NA)가 도입된 벡터를 약 20 ㎕의 TransIT-LT1과 혼합하고, 숙주 세포에 형질감염시켰다. 임의로, 혈청 함유 배지를 형질감염시키기 전에 무혈청 배지, 예컨대, Opti-MEM I로 대체하고, 4 내지 6시간 동안 인큐베이션하였다.

대안적으로, 인플루엔자 게놈 세그먼트가 도입된 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하기 위해 전기천공을 이용할 수도 있다. 예를 들어, 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B 바이러스가 도입된 플라스미드 벡터를 하기 절차에 따라 전기천공을 이용하여 베로 세포에 도입하는 것이 바람직하다. 요약하면, 예를 들어 10% 소태아 혈청(FBS)을 첨가한 변형 이글 배지(MEM)에서 증식시킨 약 5×10⁶ 개의 베로 세포를 0.4 mL의 OptiMEM에 재현탁시키고, 전기천공 큐벳에 위치시킨다. 25 ㎕ 이하 부피중 20 ㎍의 DNA를 큐벳내 세포에 첨가하고, 톡톡 쳐서(tapping) 살살 혼합하였다. 제조자의 사용 설명서(예: BioRad Gene Pulser II with Capacitance Extender Plus connected)에 따라 25-33 msec의 일정한 시간으로 300 볼트, 950 microFarad에서 전기천공을 수행한다. 세포를 가볍게 톡톡 쳐서 재혼합하고, 전기천공 약 1-2 분후, 10% FBS와 함께 0.7 mL의 MEM을 큐벳에 직접 첨가한다. 그 다음, 세포를 2 mL의 MEM, 10% FBS를 함유하는 표준 6 웰 조직 배양 접시의 두 웰로 옮긴다. 큐벳을 세척하여 임의의 잔류 세포를 회수하고, 세척 현탁액을 두 웰에 나눈다. 최종 부피는 약 3.5 mL이다. 이어서, 세포를 바이러스 증식을 허용하는 조건하에, 예컨대 한랭 적응 균주의 경우 약 33℃에서 인큐베이션하였다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 USSN20050158342호를 참조하기 바람.

키트

본 발명의 방법 및 조성물의 이용을 용이하게 하기 위해, 임의의 백신 성분 및/또는 조성물, 예컨대, 다양한 제제중의 바이러스 등, 및 실험 또는 치료 백신 목적으로 인플루엔자 바이러스를 포장 및 감염시키는데 유용한 완충제, 세포, 배양 배지와 같은 추가의 성분들을 키트의 형태로 포장할 수 있다. 전형적으로, 키트는 상기 성분 외에도, 예컨대, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 사용 설명서, 포장재 및 용기를 포함할 수 있는 추가의 물질을 포함한다.

실시예 1

액체 FluMist 개발

네개의 개발 로트(CB0006H, CB0008H, CG0017H, CBOO18H 및 CB0019H)를 포함하여 총 19개의 1가 바이러스 벌크 로트를 프로토콜하에 실시하였다. 로트 CB0018H 및 CB0019H는 다양한 연구에 공급 물질로 이용되고 있어서 본 출원에서는 더 이상 논의하지 않는다. 초원심분리 단계후 두 로트(CBOO180H 및 CBOO12H)를 합하여 A/시드니 1가 벌크 CB0020H를 제조하였다. 각 로트를 약 2,000개의 난으로 실시하였다.

난 취급 및 인큐베이션 조건은 동결 FluMist의 제조에 이용된 공정과 유사하게 설정되나, 소규모 등의 이유로 수동 접종 및 수확이 이용되었다. 초원심분리 과정은 총 용량이 약 470 mL인 Model P32CT 로토를 구비한, 동일 제조업자(Discovery 90, 히타치사(Hitachi) 제품으로서 Sorvall/heraus가 시판하고 있다)가 제작한 좀 더 작은 장비로 규모를 축소시켰다. 정제한 안정화 바이러스 수확물을 20 내지 60% 수크로스 구배상에 로딩하고, 32,000 rpm에서 1시간 밴딩한 다음, 20 mL 분획으로 용출시켰다. 피크 수준의 HA를 함유하는 분획을 풀링하여 0.2M 수크로스 농도로 희석하고, 0.2 미크론 필터를 통해 여과한 후, 250 mL 가요성 중합체 백(Stedim)으로 옮겨 추가 제조를 위해 -60℃ 이하에서 동결 유지하였다.

간결한 일련의 시험 수행후, 액체 FluMist의 추가 임상 실험을 위해 cGMP 제조를 시작하였다. A/베이징/262/95(H1N1) 및 A/시드니/05/97(H3N2)을 또 다시 제조하고, B 균주를 B/야마나시/166/98로 변경하였다. 제조된 1가 벌크물을 동결시키고, 블렌딩, 충전 및 포장을 위해 운반하였다. 물론, 특별한 언급이 없으면, 특정 균주(예: 베이징 등)의 사용이 제한적이지 않은 것으로 이해하고 받아들여야 한다. 즉, 예를 들어, 본원의 방법 및 제제는 상이한 RTS 조성물 등을 제조하기 위해 각 인플루엔자 시즌에 상이한 균주를 사용할 수도 있다.

개발 및 임상 실험

액체 조성물의 제조방법이 개발되었으며, 1가 벌크 로트 CAZOOl-024 및 CAZ035-043을 포함하였다. 임상 실험 물질(CTM)은 1가 벌크 로트 CAZ025-CAZ034를 포함하였다.

액체 FluMist 제조방법이 개발되었으며, 하기 6개의 상이한 공정 단계로 분류된 CTM-1을 위해 사용되었다. 공정 단계 1 내지 5는 별도의 제조 설명을 이용하여 수행되는 바와 같이 주요 공정 단계에 적절하게 제시되었다. 단계 6은 전체 블렌드 및 충전 공정을 포함하였다. 이들 단계가 일반적으로 백신 조성물의 제조/생산을 위해 후술하는 일반화 단계에 대략적으로 비교될 수 있는 것으로 이해하여야 한다.

단계

단계 1: SPF 난 수령 및 소독; 단계 2: 바이러스 수확물 생산; 단계 3: 띠원심분리에 의해 바이러스 농축; 단계 4: 피크 분획의 풀링 및 희석; 단계 5: 멸균 여과 및 1가 벌크 저장; 및 단계 6: 블렌딩 및 충전.

CTM-1 1가 벌크물 생산에 대한 공정 흐름도가 도 1에 예시되었다. 블렌딩 및 충전 공정 흐름도는 도 2에 예시되었다.

SPF 난 수령 및 소독

질병을 갖지 않는 난을 적절히 보장하도록 설계된 집단 관리 및 감시 프로그램을 이용하는 스파파스사(SPAFAS, Inc.)로부터 특정 무병원균(SPF) 발육난을 구매하였다. 난을 일제히 가로 눕히고, Clorwash 및 Quat 800 스프레이를 이용하여 살균하였다. 그후, 난을 청결하게 관리하고 동결되거나 과도하게 가열되는 것을 방지하기에 충분한 패키징을 이용하여 공기로에 의해 운송하였다. 수거하여 냉각된 수정난이 있는지를 관찰하고 SPF 인큐베이션 유닛에서 14℃±2℃ 및 60-80% 상대습도(RH)로 최장 7일간 저장하였다. 난을 상인이 공급한 상자로부터 트레이로 옮기고, 배치수를 할당하였다. 난을 36-난 제임스웨이(Jamesway) 트레이에 놓고, 난 껍질 표면을 자동화 난 소독 시스템에서 Chlorwash 및 Quat 800으로 소독하여 인큐베이터에 도입되기 전에 유해 생물을 최소화하였다. Chlorwash를 43-44℃ 및 48-49℃ 범위에서 제조하고, Quat 800은 48-49℃ 범위에서 제조하였다. 소독후, 난을 트롤리에 놓고 주변 온도에서 2시간 이상으로 공기 건조시켰다. 그 다음에, 난을 Buckeye 인큐베이터에 놓고, 37.5℃±1℃ 및 60-80% RH에서 264시간±12시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후, SPF 난을 SPF 난 유닛으로부터 투시 검란 장소로 옮겼다. 광섬유 램프를 이용하여 각 난에서 기낭 위치를 찾아 내었다. 사멸 또는 무정난을 버리고, 수정난을 접종용으로 표시하였다.

바이러스 수확물 생산

수정난 표면을 접종 전에 70% 공업용 메틸화 알콜(IMS)로 소독하고, 대량 접종을 위해 이동시켰다. 희석한 제조자 가공 바이러스 종자(MWVS)를 준비하는데, 종래 재배열 방법을 이용하여 마스터 바이러스 시드로 제 1 상 임상 실험을 위한 MWVS를 제조하였다. MWVS를 AVU로 옮기고, 미생물 안전 캐비넷에서 각 전달을 위해 1회용 무균 피펫을 이용하여 일련의 해동 MWVS 희석물을 무균 0.01M 포스페이트 완충 염수(pH 7.7)에서 제조하였다. 접종은 10,000 클래스 룸에서 트레이당 36개의 난을 침투하여 접종하는 반자동 Bibby 접종기를 이용하여 층류하에 실시되었다. 접종물의 표적 역가는 0.1 mL당 log₁₀2.1 TCID₅₀이었으며, MWVS의 예정 역가로부터 희석을 산출하였다. 각 바이러스 접종물의 제조는 냉동실부터 바이얼을 제거하고 2 시간내에 완료하였다. 접종물의 분취물을 사용시까지 5±3℃에서 저장하였다. 접종물은 제조하고 8시간 이내에 사용하였다.

SPF 난 접종

각 트레이의 난들을 Bibby 자동 접종 기계에 수동 공급하였다. 펀치를 이용하여 난각을 천공하고 난을 미리정한 조정 깊이로 침투시켰다. 접종 바늘을 난속으로 연장하여 0.1 mL의 MWVS 접종물이 각 난으로 전달되도록 펌프 투여한 다음, 펀치를 철수하였다. 접종후, 난 트레이를 오퍼레이터로 제거하고 공정을 새로운 난 트레이로 반복하였다. CAIV 접종 난을 33±1℃에서 바이러스 균주 성장 곡선으로 결정된 시간 동안 인큐베이션하였다. 접종후, SPF 발육난을 18±6 시간동안 28℃로 냉각하였다. 냉각 후, 난을 수확 단계로 이동시켰다.

띠원심분리에 의한 바이러스 농축

바이러스 수확(VH)

난을 자동 수거 기계(Bibby)로 수거하였다. 트레이를 단두 장소로 수동 공급하고 난각의 상부를 제거하여 수확 바늘이 진입하기 위한 접근 구멍을 형성하였다. 수확 전에 난을 육안 관찰하고, 적합하지 않은 난(예: 변색)은 제외시켰다. 허용가능한 난을 수확 장소에서 처리하는데, 여기에서는 바늘을 이용하여 요막액을 흡수하고 진공 시스템으로 흡인한다. 수확물을 모아 쟈켓 온도 2-8℃인 100L 쟈켓 스테인레스 용기에서 혼합하였다. 바이러스 수확물 샘플을 VH 풀로부터 수집하고 효능(TCID₅₀), 안전성, 조류 백혈증, M. tuberculosis, 미코플라즈마, 외래 바이러스, 동질성, 역전사효소 어세이, 바이러스 유전자형, 바이러스 표현형 및 약독화에 대해 조사하였다.

안정화 및 정제

풀링한 바이러스 수확물(VH)을 즉시 2-8℃에서 1OX SPG(VH 9 부 대 1OX SPG 1 부)와 함께 0.2M 수크로스, 0.01M 포스페이트, 0.005M 글루타메이트(SPG)의 최종 농도로 안정화시켰다. 샘플을 정제전 효능 및 유해 생물용으로 수집하였다. 안정화시킨 바이러스 수확물을 5 ㎛ 심층 여과에 의해 정제하여 입자들을 제거하고 고속 연속 유동 원심분리에 의해 정제하였다. 정제된 바이러스 수확물을 효능용으로 샘플링하였다.

띠원심분리, 수집 및 피크 분획의 HA 분석

사용하기 전에, 원심분리기의 로토를 포름알데히드 농축 용액을 1:20으로 희석하여 소독하였다. 정제된 VH를 Hitachi CP40Y 띠원심분리기를 이용하여 연속적으로 고속 원심분리되도록 수크로스 구배(포스페이트 완충제(pH 7.2)중 10-60% 수크로스) 상에 로딩하였다. 원심분리기에 60% 수크로스 용액에 이어 포스페이트 완충제중 10% 수크로스 용액을 첨가하여 구배를 형성시켰다. 원심분리 속도를 20분간 4,000 rpm으로 설정하여 수크로스 용액이 밀도 구배를 형성하도록 하였다. 구배 형성 동안 원심분리 온도는 2-8℃로 설정하였다. 구배 형성후, 완충제 유동을 개시하고, 로토 속도를 40,000 rpm으로 증가시킨 다음, 정제한 VH를 40,000 rpm에서 시간당 2OL의 속도로 구배상에 로딩하였다. 수확한 10,000개의 난을 포함하는, 6 mL/난의 전형적인 CTM-1 배치의 경우, 로딩 단계 시간은 약 3 시간이었다. 정제한 VH를 로딩한 후, 원심분리를 1 시간 동안 더 40,000 rpm으로 계속하여 바이러스가 밴드를 이루도록 하였다. 바이러스 입자가 38-45% 수크로스 구배 부분으로 이동하여 "밴드"로 집중되었다. 이 단계를 마치고, 바이러스 피크물의 수집을 위해 원심분리 속도를 서서히 늦춘 후 중단시켰다. 100 mL 분획을 층류하에 125 mL 무균 폴리카보네이트 병에 수집하였다. 분획을 2-8℃에서 약 1 시간 동안 유지하면서 분획에 대해 HA 활성을 조사하였다. 피크 분획은 전형적으로 38-45% 수크로스 구배에서 관찰되었다.

피크 분획의 풀링(pooling) 및 희석

분획을 5L 무균 유리병에 무균 도입하여 HA 분석으로 확인한 원심분리 피크 분획을 층류 후드하에 풀링하고, 와동 혼합하였다. 효능용으로 샘플링되는 풀 및 수크로스 농도 결정을 위하여 굴절률(RI)을 조사하였다. 계산된 부피의 멸균 냉각(2-8℃) 포스페이트-글루타메이트 완충제, pH 7.2(PBG 완충제)를 0.2M 수크로스, 0.1M 포스페이트 및 0.005M 글루타메이트의 최종 농도로 무균 첨가하여 원심분리 피크 분획 풀(CP)을 희석하였다. 이는 전형적으로 1:6 희석이다. 희석한 원심분리 피크 분획 풀(DCP)을 효능 및 유해 생물용으로 샘플링하였다.

멸균 여과 및 1가 벌크물 저장

DCP를 무균 튜빙을 통해 멸균 여과를 위한 100 클래스 충전실로 펌핑하였다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 DCP를 층류 후드하에 무균 5L 유리병으로 멸균 여과하였다. 여과된 1가 벌크물을 혼합하고, 효능, 동질성 및 무균성 시험용으로 샘플링하였다. 0.22 ㎛ 필터에 대해 여과 공정 전, 후 보전성에 대해 조사하였다. 이어서, MB를 무균 1L 폴리카보네이트 병에 분취하였다. MB를 500 mL 분취물로서 총 3 내지 4L 부피로 수집하였다. 무균 1L PC 병을 -60℃ 이하로 저장하였다. TCID₅₀을 조사하여 벌크 바이러스의 역가를 결정하였다. 이어서, 1가 벌크물을 블렌딩 및 테스트를 위해 -60℃ 이하에서 운반하였다.

블렌드 및 충전

벌크 3가 블렌드를 제조하기 위한 블렌드 및 충전 공정의 주 단계는 다음과 같다: 해동, 희석제 제조, 블렌딩, 충전 및 포장

해동 및 블렌딩

적절한 1가 벌크물 1병을 동결 저장물(MB에 대해 ≤-60℃)로부터 꺼내 해동실로 옮겼다. 3개의 각 1가 벌크물 및 SPG 희석제의 필요한 양을 벌크 전염성 역가 및 필요한 제제 강도에 기초해 산출하였다. MB 병을 33±3℃ 수조에 놓고 5분마다 손으로 흔들어 주었다. 해동을 육안으로 모니터하여 수조로부터 제거되기 전에 모든 병들이 해동된 것을 확인하였으며, 해동된 모든 병은 15분마다 제거하였다. 해동되면, MB 병을 5±3℃ 냉장고로 옮겨 필요한 모든 병들이 해동될 때까지 유지시켰다.

무균 수크로스 포스페이트 글루타메이트(SPG) 희석제는 바이오휘타커사(BioWhittaker, 메릴랜드 월커스빌 소재)가 제조한 것이다. 액체 FluMist 블렌드를 제조하기 직전에, 블렌드에 필요한 SPG 희석제의 약 1/3을 무균 2L 병에 가하였다. 병을 실온으로 가온한 후, 가수분해된 돼지 젤라틴(분말)을 최종 블렌드에서 10 mg/ml의 수준에 이르기에 필요한 양으로 첨가하였다. 그후, SPG 희석제를 필터에 통과시켜(임의 잔류 젤라틴 세척) 블렌드 계산에서 제시한 표적 부피로 만들고, 사용시까지 5±3℃에서 저장하였다.

해동된 병을 블렌드실로 이동시키고, 바이러스를 5L 무균 유리 가공 용기에 무균적으로 옮겼다. 냉장 냉각팩을 사용하여 용기를 블렌딩 공정 및 후속 충전 공정 동안 5±3℃로 유지하였다. 3종의 바이러스 균주를 첨가한 후 SPG-젤라틴 희석제를 가하고, 필요에 따라 HCl로 pH를 7.2±0.3으로 조정하였다. 세 바이러스 균주 및 희석제를 자석 교반바 및 교반판으로 연속 혼합하여 블렌딩하였다.

충전 및 포장

pH 조정후, 3가 벌크 블렌드 용기를 충전실로 옮겨 INOVA 필러에 연결하였다. INOVA 충전 기계는 소정 부피의 생성물을 일렬로 놓여진 여덟개의 BD HYPAK 일회용 스프레이에 충전한 후, 스프레이를 중단시켰다. 스프레이 충전 및 중단 공정과 중량 점검 확인 과정을 지시된 대로 속행하였다. 각 충전 사이클 완료시 새로운 스프레이통을 인-피드(in-feed) 장소에 수동으로 위치시키고, 충전 스프레이통을 하역 장소로 옮겼다. 블렌드 용기를 충전 공정 동안 냉각팩으로 5±3℃로 유지하였다.

비강용 스프레이 충전후, 충전된 3가 백신을 튜브에 로딩하고, 카트를 이용하여 즉시 포장 및 라벨링 작업을 위해 포장 장소로 운반하였다. 포장 및 라벨링된 스프레이를 5±3℃에서 저장하였다.

업스트림 공정 파라미터의 최적화

여과(5 ㎛)에 의한 수확물 정제

여과 vs. 저속 원심분리: 동결 FluMist의 표준 저속 원심분리를 이용한 정제 효능 손실은 전형적으로 0.2 내지 0.3 log₁₀TCID₅₀/mL로 추정된다. 두 균주에 대한 추정 원심분리 손실은 다음과 같다: 한 균주에 대한 역가 손실은 무시할만하며, 20분 동안 3,40Og의 표준 조건을 이용한 제 2 균주에 대해서는 0.3 log(단계 수율 59%)이다. 5 미크론 심층 필터를 예비-CTM 개발 작업 동안 원심분리에 대한 대안으로 사용한 경우, 평균 정제 단계 수율은 41%로 추정되었다. TCID₅₀ 분석 변동성을 고려하여, 두 정제 방법이 정제후 첨가보다 더 좋은 결과를 제공한다고 결론지을 수 있다. 조작 및 확장성(scalability)의 용이면에서 여과가 정제방법으로 선택되었다.

심층 필터 기공 크기 비교: 개발 로트 CAZ015-CAZO17 + 10개의 CTM-1 로트 CAZ025 내지 CAZ034를 사용하여 CTM-1 공정에 대한 심층 여과 손실을 추정하였다. A/베이징, A/시드니 및 B/하얼빈의 정제 단계 수율은 5 ㎛ 정제 단계에 대해 각각 147%, 78% 및 73%였다.

5 ㎛(Pall Profile II) 필터를 로트 CAZ035(A/시드니), CAZ036(A/베이징) 및 CAZ037(B/하얼빈)에 대해 사용된 20 ㎛ 심층 필터(Pall Profile Star)와 비교하였다. A/베이징, A/시드니 및 B/하얼빈의 정제 단계 수율은 20 ㎛ 정제 단계에 대해 각각 65%, 35% 및 209%였다. 이들 수율은 5 ㎛ 정제 결과에 비유할만하나, 공정을 20 ㎛ 필터로 변경하는 것은, 더 큰 기공 크기가 사용되면 적혈구에 의해 정제된 수확물이 상당히 오염되기 때문에 모든 구체예에 대해 권장되지 않았다.

다운스트림 공정 파라미터의 최적화:

원심분리 스케일

대규모 CP40Y 원심분리 및 RP40CT 타입 D 연속 유동 로토를 이용하여 원심분리 로딩 및 온도 조사를 수행하였다; 다양한 난 배치 크기 및 원심분리 온도 설정점을 비교하였다(도 3 참조). CAOZ15(B/하얼빈), CAZO18(A/시드니), CAZ020(A/베이징) 및 CAZ022(A/시드니)는 배치 크기가 1OK 난이며, 원심분리 설정 온도가 4℃이었다. CAZ016(B/하얼빈), CAZ019(A/시드니) 및 CAZ021(A/베이징)은 배치 크기가 2OK 난이며, 원심분리 설정 온도가 14℃이었다. 이들 모든 조사에 20L/hr의 로딩 유속이 이용되었다. 희석 피크-분획 풀에서의 회수율(%)(단계 수율)은 정제 수확물의 역가 수치를 기초로 한다. 알 수 있는 바와 같이, 1OK 난 배치 로트는 회수율 범위가 40-184%인데 반해 20K 난 배치 로트는 회수율 범위가 40-55%였다. 1OK 난 배치 크기에 대한 평균 회수율은 113%이고, 2OK 난 배치 크기에 대한 평균 회수율은 46%였다. 이러한 개발 공정 단계에서 보전 한계로 작업당 10,000개의 난 배치 크기를 CTM 제조에 선택하였다.

온도

4℃ 또는 14℃중 어느 하나로 초원심분리 로토 온도를 설정하여 개발 작업 CAZO15 내지 CAZ022를 수행하였다. 예외적으로, 14℃에서 개발 작업은 또한 전형적인 것보다 대규모로 수행되었다(배치당 20,000개의 난). 일반적으로, 이들 배치는 생 바이러스 회수율이 낮으나, 이는 온도 효과라기 보다는 원심분리 로딩에 의한 것일 수 있다. 4℃에서의 결과가 더 좋고 고온에서 미생물 증식 속도가 증가할 가능성 때문에, 본 개발 공정에서는 4℃의 온도를 초원심분리 설정 온도로 선택하였다.

임상 실험 1(CTM-1)

CTM-1에 대한 1가 바이러스 로트가 제조되었고 1가 벌크 로트 CAZ025 내지 CAZ034를 포함하였다. 제조공정에서 CTM-1 1가 벌크 로트에 대한 QC 분석 결과를 도 3 및 본원에 나타내었다. 균주당 평균 단계 수율을 도 3 및 본원에 나타내었다. 결과를 이하에 요약하였다.

효능: B/하얼빈 및 A/베이징 바이러스 수확물 로트의 효능(log₁₀TCID₅₀mL)은 8.1이거나 그보다 크다. A/시드니는 CAZ030을 제외하고 7.5 내지 8.8이었으며, 이는 수학물에서 난황의 오염으로 인해 매우 낮은 역가(6.0)를 나타내었다. A/베이징에 대한 1가 벌크의 역가는 9.3 이상이고, B/하얼빈 역가는 8.4 내지 9.85이며, A/시드니 역가는 7.9 내지 8.6이었다(CAZ030은 제외). CAZ030 역가는 후술하는 바와 같이 블렌딩에 필요한 허용 수준에 못미쳤다.

공정 수율: 각 로트에 대한 공정 수율은 도면을 참조로 하여 본원에 상세히 설명되었다. 공정 수율은 샐플링 손실에 대해 보정하지 않은 것이다. A/베이징은 평균 총 공정 수율이 16%(163 용량/난)이고, A/시드니는 평균 수율이 13%(6 용량/난)이며, B/하얼빈은 평균 수율이 93%(86 용량/난)이었다. 도면을 참조바람. 불규칙한 수율로 실질적인 공정 성능뿐 아니라 분석 변동성을 반영한 것으로 추정된다. 특히, B/하얼빈 결과는 로트 CAZ028 1가 벌크 역가의 매우 높은 추정값(이에 따라 추정 공정 수율이 252%이고 246 용량/난임)으로 상향 왜곡되었다. 이 경우 희석한 피크 풀 역가는 희석으로 인해 감소될 것이 예상됨에도, 원심분리 피크 풀보다 0.95 log 높은 것으로 결정되었다. 마찬가지로, 여과된 1가 벌크 역가는 여과 전 물질보다 높았으며, 이는 분석 변동성으로 설명될 수 있다. 다른 두 B/하얼빈 로트(CAZ026 및 CAZ027)는 공정 수율이 각각 20% 및 8%이었으며, 양 로트에 대한 난 수율은 7 용량/난이다. 벌크 로트 CAZ028(CBF1004 및 CBF1007)를 포함하는 3가 블렌드는 최종 제품 스프레이에서 B/하얼빈 효능이 용량당 0.6 및 0.4 1og₁₀ TCID₅₀이었다. 이는 CAZ028 1가 벌크 역가가 과대평가되었음을 추가로 제안하는 것이다.

유해 생물 및 내독소: 바이러스 수확물, 안정화된 수확물 및 희석한 원심분리 피크 분획물을 유해 생물에 대해 조사하였다. 유해 생물 조사 결과는 공정을 통해 유기체 적재에 대한 명확한 상황을 보여주지 않았다: 바이러스 수확물 및 희석한 원심분리 피크 분획 풀 샘플에 대한 조사 결과는 주로 "비검출"(8개 판독); 또는 두개의 중간값만을 가지는 ">100 cfu/mL"(10개 판독)로 구성되었다. 1가 벌크에 대한 내독소 값은 <5 EU/mL 에서 587 EU/mL로 변하였다.

수크로스 농도: 원심분리 피크 분획 풀의 수크로스 농도는 39 내지 43.5%(CAZ030은 이 범위에 포함되지 않음)이었다. 1가 벌크의 평균 수크로스 농도는 7.6%였다.

1가 벌크 방출 조사 결과를 도면에 나타내었다. CAZ030을 제외한(조사되지 않음) 모든 CTM-1 로트는 벌크 방출 조사를 통과하였다.

SDS-PAGE 분석: 1가 벌크물을 겔 코드 블루(Gel Code Blue)로 염색한 10% SDS-PAGE 겔에 의해 추가로 특성화하였다. 인플루엔자 A 및 B 균주에 대한 입자당 계산한 단백질 분자량 및 카피수에 기초해, 50-6OkDa(HA1 단백질), 56kDa(NP 단백질) 및 27kDa(M1 단백질) 영역에서의 겔 밴드가 정제된 인플루엔자 바이러스 겔에서 현저할 것으로 예상된다. Ha2 단백질(23 내지 3OkD)이 또한 존재할 수도 있다.

A/베이징/262/95 CAZ031, 및 33 및 A/시드니/05/97 CAZ029, 30 및 34에 대한 SDS-PAGE 겔을 비교하였다. 10% 겔에 대한 분해 범위는 명목상 200-31kDa이었다. 이러한 제한때문에, HA1 단백질(23-3OkDa) 및 M 단백질 밴드(21-27kDA)에 대한 해석은 주의를 기울여야만 했다.

A/베이징 및 A/시드니 1가 벌크(MB) 로트의 경우, A/베이징 샘플에 대해 어두운 밴드가 NP 단백질의 예상 영역에서 관찰(55kDa 마커 바로 위) 되었으며, 밴드는 두 균주에 대해 116 kDa 바로 위인 것으로 보였다. 두 균주는 M 단백질과 일치하는 겔 프론트에 가까운 밴드(31kD 아래)를 함유하였다. 66kD 마커 또는 바로 위에서 예상되는 HA1 밴드는 아마도 당단백질 분자량의 불균질성으로 밴딩 패턴이 보다 분산될 것으로 보이기 때문에 덜 강하다. 추정 NP1 단백질 염색이 또한 감소될 것으로 보인다. A/시드니 샘플에 있어서 더 광범한 밴드가 발견되었으며, 이는 1가 벌크내 난 단백질의 비율이 증가한 것과 일치한다.

로트 및 난당 용량: 세 모든 균주에 대한 용량 산정은 1.2E+07 TCID₅₀ 입자를 함유하는 0.24 mL 평균 충전 부피에 기초하였다. 상기 용량 산정에 근거해, A/베이징 1가 로트는 로트당 평균 총 용량이 1,576,022이었다. B/하얼빈 및 A/시드니에 대한 로트당 평균 총 용량은 각각 601,446 및 50,825 또는 각각 로트당 평균 A/베이징 총 용량의 38% 및 3.2%였다. 이들 결과는 난당 1가 용량으로 다음 값으로 환산된다: A/베이징에 대해 163 용량/난, B/하얼빈-류에 대해 86 용량/난 및 A/시드니에 대해 6 용량/난. 용량/난은 로트를 제조하기 위해 수확한 난의 총수를 기초로 하였다.

난 수율 요약: A/시드니가 난 산출당 평균 수확 부피가 가장 높았으며, 그 다음으로 A/베이징 및 B/하얼빈이 뒤를 이었다. 난당 평균 산출량은 B/하얼빈에 대해 5.6 mL/난, A/베이징에 대해 6.5 mL/난 및 A/시드니에 대해 6.8 mL/난이었다. 생육 생산난의 총 수율은 평균 82%였다. 난 산출량은 수확한 난의 총수를 생산 난의 총수와 비교한 것에 기초한다. 접종전 난 불량 퍼센트는 평균 10%였다. 접종후 난 불량 퍼센트는 평균 5%이었으나, 단 CAZ028은 불량률이 29%였다.

정제 수율 요약(TCID₅₀): 정제된 수확물의 효능값은 일부 로트의 경우 출발물질보다 높았으며, 이는 단계 수율이 100%보다 크다는 것을 의미한다. 단계 수율 추정치는 TCID₅₀ 분석의 변동성에 영향을 받으며, 생산 작업시 수행한 경우 표준편차가 0.3 log₁₀ TCID₅₀/mL를 초과하였다. 또한, 희석한 원심분리 Pak 분획 풀 단계에서의 단계 수율은 세 모든 균주에 대해 광범하게 변하였으며, 10개의 모든 CTM 로트에 대해 100%가 넘었다. 이는 이들 샘플에서 수크로스 수준이 높은 것과 관련이 있을 것으로 생각되는, 원심분리 피크 분획 풀에 대한 역가의 조직적인 하방 편향성 때문인 것으로 보여진다(다음 단계의 수율이 100을 넘는 것으로 제시되는 바와 같음).

CTM-1 로트에 대한 설명

본원의 다양한 구체예 및 실시예에서는, 수확물 유체에서 예를 들어 부적절한 수확 기계 세팅으로 일어날 수도 있는 난황 오염이 없는 것이 바람직하다.

0.2 미크론 여과 단계: 배치 기록에서는 실제로 Pall Kleenpak 일회용 필터를 언급하고 있으나, 이는 어떠한 CTM 로트에도 사용되지 않았다. 로트 CAZ025 - 030은 Kleenpak 대신 하우징된 캐트리지 필터(AB1DFL7PH4 - Pall 친수성 PVDF Fluorodyne II 필터)를 사용하였다. 필터 구조 재료는 유사하나(친수성 PVDF), 필터 면적은 Fluorodyne II 캐트리지 필터의 경우 5100 ㎠ 대 Kleenpak Fluorodyne II 필터의 경우 1500 ㎠이다. 로트 CAZ031/032/033/034의 경우에는, 일회용 Pall NovaSip C3DFLP1 필터 어셈블리가 Kleenpak 대신 사용되었다. C3DFLP1 필터에 대한 막 표면적은 Kleenpak 필터(1500 ㎠)와 동일하였다.

온도 범위: CAZ031에 대한 이차 인큐베이션 단계 동안, 온도는 13 시간 동안 34.4℃로 상승되며, CAZ032에 있어서는 4 시간 동안 31.5℃로 강하되었다. 이들 로트는 9.0 log₁₀ TCID₅₀/mL를 초과하는 정상 수확물 역가에 이르렀으며, 따라서 이들 범위는 산물에 영향을 미치지 않는 것으로 간주되었다.

요약

임상 실험 제조 전략(CTM-1 및 CTM-2)에 기초해, 액체 FluMist 공정 개발 및 제조 작업은 공정이 방출 규격을 통과한 임상 공급물을 제조하는데 적합함을 의미한다. 두 CTM 작업 및 다양한 개발 조사로부터의 데이터를 통합하여 다음과 같은 중간 공정 수율 추정치를 얻었다:

정제: 50% 수율

초원심분리 정제: 50% 수율

피크 희석 및 멸균 여과: 20 내지 50% 수율.

실시예 2

안정성 시험

3종의 상이한 재배열 인플루엔자 바이러스(7.0±0.5 log₁₀ FFU/용량[약 7.0 ±0.5 log₁₀TCID₅₀/용량]) 및 100 mM 인산칼륨 완충제(pH 7.2)중의 200 mM 수크로스; 1%(w/v) 돼지 젤라틴 가수분해물; 1.21%(w/v) 아르기닌 모노하이드로클로라이드[1%(w/v) 아르기닌 염기에 상당]; 및 5 mM 글루탐산일나트륨을 포함하는 3가 백신 제제를 제조하였다. 안정한 제제를 -25.0℃±5.0℃에서 24시간 이상 내지 2 주 이하로 저장한 후, 2-8℃에서 다양한 기간 동안 저장하였다. 이 제제(예: 로트 0141500003)는 4-8℃에서 적어도 12주간 안정한 것으로 조사되었다. 특히, 각 바이러스 균주에 대한 효능은 4-8℃ 저장전 초기 효능의 0.5 log₁₀이내로 남아 있었다.

다른 조사에 따라 상이한 임상 로트(예: "전략 3")의 등가 제제(3종의 상이한 재배열 인플루엔자 바이러스(7.0±0.5 log₁₀FFU/용량[약 7.0±0.5 log₁₀ TCID₅₀/용량]) 및 100 mM 인산칼륨 완충제(pH 7.2)중의 200 mM 수크로스; 1%(w/v) 돼지 젤라틴 가수분해물; 1.21%(w/v) 아르기닌 모노하이드로클로라이드[1%(w/v) 아르기닌 염기에 상당]; 및 5 mM 글루탐산일나트륨을 포함함)는 5.0(±3.0)℃에서 약 12-15개월 동안 안정하다.

후속 조사에 따라 100 mM 인산칼륨 완충제(pH 7.2)중의 200 mM 수크로스; 1%(w/v) 젤라틴 가수분해물; 1.21%(w/v) 아르기닌 모노하이드로클로라이드[1%(w/v) 아르기닌 염기에 상당] 만을 함유하며 글루타메이트를 함유하지 않는 제제는 글루타메이트를 함유하는 상기 제제와 안정성이 동등하였다.

상술된 발명이 보다 명확한 이해를 도울 목적으로 다소 상세히 기술되었더라도, 당업자들은 본 발명의 내용에 비추어 본 발명의 실질적인 범주를 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변화가 형식상 세세하게 가해질 수 있음을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 상술된 모든 기술 및 장치는 다양하게 조합하여 사용될 수 있다. 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌이 개별적으로 모든 목적을 위해 참고로 인용된 것과 마찬가지로, 본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌은 모든 목적을 위해 동일한 정도로 전체를 참고로 포함한다. 특히, 2004년 10월 6일 출원된 미국 가출원 60/616,711호; 2004년 2월 25일 출원된 USSN 10/788,236호; 및 2003년 2월 25일 출원된 미국 가출원 60/450,181호는 전체가 본원에 참고로 포함된다.

Claims

생 약독화 인플루엔자 바이러스 조성물의 제조 방법으로서,
(a) 숙주 난(host egg) 집단을 생 약독화 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계;
(b) 숙주 난 집단을 적절한 온도에서 배양하는 단계;
(c) 생 약독화 인플루엔자 바이러스를 바이러스 수확물(harvest)로 회수하는 단계;
(d) 생 약독화 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스 수확물을 여과에 의해 정제함으로써, 정제된 바이러스 수확물을 생성하는 단계;
(e) 정제된 바이러스 수확물에 대해 연속 띠원심분리를 실시함으로써, 추가로 정제된 바이러스 수확물을 생성하는 단계;
(f) 상기 추가로 정제된 바이러스 수확물을 희석하고 멸균 여과에 의해 멸균함으로써, 멸균 바이러스 수확물을 생성하는 단계; 및
(g) 상기 멸균 바이러스 수확물을, 6∼8 중량/부피(w/v)% 수크로스, 1∼2 w/v% 아르기닌, 0.05∼0.1 w/v% 글루탐산일나트륨 및 0.5∼2 w/v% 젤라틴 가수분해물의 최종 농도가 얻어지도록 안정제와 배합하는 단계
를 포함하며, 이로써 생 약독화 인플루엔자 바이러스 조성물이 생성되는 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 약독화 인플루엔자 바이러스가 약독화 한랭 적응 인플루엔자 바이러스, 약독화 온도 민감성 인플루엔자 바이러스, 또는 약독화 한랭 적응 온도 민감성 인플루엔자 바이러스 중 하나 이상을 포함하는 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 약독화 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 바이러스 A/Ann Arbor/6/60 및 인플루엔자 바이러스 B/Ann Arbor/1/66 중 하나 이상의 유전자 골격을 포함하는 것인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 전에, 안정제를 첨가함으로써 2∼8℃에서 바이러스 수확물을 안정화시키는 것인 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 안정제가 수크로스, 포스페이트 및 글루타메이트(SPG)를 포함하는 것인 제조 방법.
제5항에 있어서, 상기 안정제를 0.2 M 수크로스, 0.01 M 포스페이트 및 0.005 M 글루타메이트의 최종 농도가 얻어지도록 첨가하는 것인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 수확물을 하나 이상의 필터를 통한 심층 여과에 의해 정제하는 것인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 수확물을 5 ㎛ 필터를 통한 여과에 의해 정제하는 것인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 연속 띠원심분리를 수크로스 밀도 구배에 의해 수행하는 것인 제조 방법.
제9항에 있어서, 수크로스 밀도 구배가 포스페이트 완충제 중 10∼60 중량/부피(w/v)% 수크로스 구배인 제조 방법.
제10항에 있어서, 포스페이트 완충제 중 수크로스 구배가 pH 7.2에서의 구배인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 연속 띠원심분리를 약 2℃∼약 8℃의 온도에서 수행하는 것인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서, 추가로 정제된 바이러스 수확물에 포스페이트 및 글루타메이트를 포함하는 희석액을 첨가하는 것인 제조 방법.
제13항에 있어서, 추가로 정제된 바이러스 수확물에 희석액을 0.2 M 수크로스, 0.1 M 포스페이트 및 0.005 M 글루타메이트의 최종 농도가 얻어지도록 첨가하는 것인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균 바이러스 수확물을 1종 이상의 다른 멸균 바이러스 수확물과 배합함으로써, 혼합 바이러스 수확물을 생성하는 단계를 포함하는 제조 방법.
제15항에 있어서, 멸균 바이러스 수확물을 2종의 다른 멸균 바이러스 수확물과 배합함으로써, 3가 혼합 바이러스 수확물을 생성하는 것인 제조 방법.
제15항에 있어서, 혼합 바이러스 수확물을 100 mM 포스페이트 완충제 중 6∼8 중량/부피(w/v)% 수크로스, 1∼2 w/v% 아르기닌, 0.05∼0.1 w/v% 글루탐산일나트륨 및 0.5∼2 w/v% 젤라틴 가수분해물의 최종 농도가 얻어지도록 희석함으로써, 냉장 안정성 액체이고 4∼8℃에서 저장 시 12개월의 기간 동안 1.0 log 미만의 효능 감소를 보이는 인플루엔자 바이러스 조성물을 생성하는 것인 제조 방법.
제16항에 있어서, 3가 혼합 바이러스 수확물을 100 mM 포스페이트 완충제 중 6∼8 중량/부피(w/v)% 수크로스, 1∼2 w/v% 아르기닌, 0.05∼0.1 w/v% 글루탐산일나트륨 및 0.5∼2 w/v% 젤라틴 가수분해물의 최종 농도가 얻어지도록 희석함으로써, 냉장 안정성 액체이고 4∼8℃에서 저장 시 12개월의 기간 동안 1.0 log 미만의 효능 감소를 보이는 인플루엔자 바이러스 조성물을 생성하는 것인 제조 방법.
제12항에 있어서, 연속 띠원심분리를 4℃의 온도에서 수행하는 것인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서 멸균하기 전에 희석을 수행하는 것인 제조 방법.
제7항에 있어서, 단계 (d)에서 바이러스 수확물을 2개 이상의 필터를 통한 여과에 의해 정제하는 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d)에서 바이러스 수확물을 0.2∼1.5 미크론 범위의 필터를 통한 여과에 의해 정제하는 것인 제조 방법.
제22항에 있어서, 단계 (d)에서 바이러스 수확물을 0.2∼0.8 미크론 범위의 필터를 통한 여과에 의해 정제하는 것인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서 바이러스 수확물을 심층 필터를 통한 여과에 의해 정제하는 것인 제조 방법.
제24항에 있어서, 단계 (d)에서 바이러스 수확물을 0.2∼0.8 미크론 범위의 필터를 통한 심층 여과에 의해 정제하는 것인 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균 바이러스 수확물을 비강 투여에 적합한 인플루엔자 바이러스 조성물이 생성되도록 제제화하는 단계를 포함하는 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균 바이러스 수확물을 인간에게 투여하기에 적합한 인플루엔자 바이러스 조성물이 생성되도록 제제화하는 단계를 포함하는 제조 방법.