CN102302773B - 冷藏温度稳定的流感疫苗组合物 - Google Patents

冷藏温度稳定的流感疫苗组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN102302773B
CN102302773B CN201110270932.4A CN201110270932A CN102302773B CN 102302773 B CN102302773 B CN 102302773B CN 201110270932 A CN201110270932 A CN 201110270932A CN 102302773 B CN102302773 B CN 102302773B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
influenza
harvest thing
influenza virus
vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201110270932.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102302773A (zh
Inventor
G·坎宝
G·特拉格
R·施瓦茨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MedImmune LLC
MedImmune Vaccines Inc
Original Assignee
MedImmune Vaccines Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MedImmune Vaccines Inc filed Critical MedImmune Vaccines Inc
Publication of CN102302773A publication Critical patent/CN102302773A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102302773B publication Critical patent/CN102302773B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

提供了用于优化和生产冷藏温度稳定的病毒(例如流感病毒)组合物的方法和组合物。提供了含有冷藏温度稳定的病毒组合物的制剂和免疫原性组合物。

Description

冷藏温度稳定的流感疫苗组合物
本发明专利申请是国际申请日为2005年10月4日、国际申请号为PCT/US2005/035614、进入中国国家阶段的申请号为200580039793.7、发明名称为“冷藏温度稳定的流感疫苗组合物”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
抗流感的各种毒株和演变毒株的疫苗对于社区健康和经济上都至关重要，因为每年有许多个体感染不同毒株和不同类型的流感病毒。特别是婴儿、老年人、那些卫生保健不足和免疫受损的人处于因这种感染而死亡的风险中。流感感染问题因新型流感毒株易于演变而愈加复杂，因此需要不断制造新型疫苗。
过去50年间生产了许多对不同流感病毒能产生特异性免疫保护应答的疫苗，包括，例如全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和减毒活病毒疫苗。然而，尽管这些疫苗类型的合适制剂能产生全身性免疫应答，但减毒活病毒疫苗具有能刺激呼吸道局部粘膜免疫力的优点。因此，若能快速且经济地生产易于储存/运输的含减毒活病毒的疫苗非常理想。疫苗若能在冷藏温度(例如，2-8℃)储存/运输则更加理想。
迄今为止，在美国可商业购得的所有流感疫苗是在鸡胚蛋中增殖。虽然流感病毒在鸡蛋中生长良好，但疫苗的产量取决于这种鸡蛋的可利用量。因为必须组织(这种)鸡蛋的供应，和在下一流感爆发季前数月选择可用于疫苗生产的毒株，所以此方法的灵活性有限，常导致生产和销售滞后和短缺。因此，非常需要能提高所生产疫苗稳定性(例如，在冷藏温度)的方法，例如这种方法能防止疫苗储存时变质，否则可能需要重新生产等。
近年来也开发了通过细胞培养制备流感疫苗的系统(参见，例如Furminger.，“疫苗生产”(Vaccine Production)，刊于Nicholson等编，《流感教材》(Textbookof Influenza)，第324-332页；Merten等，(1996)，“在用于疫苗制备的细胞培养物中生产流感疫苗”(Production of influenza virus in cell cultures for vaccinepreparation)，刊于Cohen和Shafferman编，《疫苗设计和生产的新方案》(NovelStrategies in Design and Production of Vaccines)，第141-151页)，因此，也非常需要能在这些系统中提高疫苗组合物稳定性(例如，在冷藏温度储存/运输)的任何方法。
本发明人与同事在制备流感病毒疫苗生产中做了大量工作；参见，例如2002年4月26日提交的美国专利申请号60/375,675；2003年4月25日提交的PCT/US03/12728；2003年4月25日提交的10/423,828和2005年5月20日提交的PCT/US05/017734。
本发明提供，例如在冷藏温度(例如4℃)稳定的疫苗组合物和生产该疫苗组合物的方法。本发明的各方面内容适用于常规的鸡蛋和新型细胞培养物的疫苗生产方法(也适用于组合系统)，包括可从下文明白的许多其它优点。
发明概述
本发明提供在4℃到8℃温度范围基本稳定的液体疫苗制剂。这些和其它液体制剂是本发明的具体实施方案，在本文中称为，例如“本发明疫苗制剂”、“冷藏稳定的疫苗制剂”、“本发明液体制剂”、“本发明制剂”、“冷藏温度稳定(RTS)的本发明制剂”或简单称为“本发明组合物”或“本发明病毒组合物”。
本发明提供在4℃到8℃温度范围基本稳定的液体疫苗制剂。在本发明的一个具体实施方案中，本发明液体疫苗制剂在2℃到8℃温度范围内或在4℃，在3个月，或4个月，或5个月，或6个月，或9个月，或12个月，或18个月，或24个月，或36个月或48个月期间基本稳定，即在所述时间段终点的效力丧失(例如，流感病毒效力丧失)可以接受，例如效力丧失介于0.5-1.0log，或效力(丧失)低于0.5log，或低于1.0log。
一个实施方案提供含有流感活病毒的本发明冷藏稳定的疫苗制剂。例如，本发明制剂包括以下一种或多种：减毒流感病毒，冷适应(cold-adapted)流感病毒、温度敏感型流感病毒、减毒的冷适应温度敏感型流感病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。在一个实施方案中，本发明液体疫苗制剂包含两种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株。
或者，本发明制剂可包含其它活病毒，例如副黏病毒(例如，RSV、麻疹病毒、腮腺炎病毒、仙台病毒、新城疫病毒)和副流感病毒。
本发明还提供含有本发明制剂的免疫原性组合物。本发明还提供含有本发明制剂和免疫原性组合物的疫苗(例如，流感疫苗)。
本发明还提供制备这种液体疫苗制剂的方法。例如，在一些实施方案中，本文提供了含有一种或多种流感病毒的液体制剂的制备方法。在一个具体的实施方案中，制备本发明液体制剂的方法包括以下一个或多个步骤：1)将多种载体[一种或多种载体掺入了(或编码)流感病毒基因组的一部分]引入一群宿主蛋或一群宿主细胞中，所述宿主蛋或宿主细胞群能支持流感病毒复制；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)在病毒收获物中回收流感病毒；4)加入稳定剂(例如，上述含蔗糖和谷氨酸的溶液)；5)澄清该病毒收获物(例如，通过深过滤或膜过滤)，从而得到澄清的病毒收获物；6)离心该病毒收获物(例如，连续区带离心(continuous zonal centrifugation)、连续流式离心(continuous flow centrifugation))；7)除菌过滤步骤(例如，利用0.2或0.2-0.5微米滤膜(在过滤期间加热或不加热))；和8)在-60℃储存。
在另一具体实施方案中，制备本发明液体制剂的方法包括以下一个或多个步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)加入稳定剂；5)澄清该病毒收获物(例如，通过深部过滤或使之通过0.2-0.8微米的一个或多个滤器，或先通过0.5或1.5微米的再通过0.2微米的滤器)，得到澄清的病毒收获物；6)离心该病毒收获物(例如，连续区带离心、连续流式离心)；7)除菌过滤步骤(例如，利用0.2或0.2-0.5微米滤膜(在过滤期间加热或不加热))；和8)在-60℃储存。
在另一具体实施方案中，制备本发明流感病毒组合物的方法包括以下一个或多个步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)采用过滤澄清该病毒收获物，得到澄清的病毒收获物；5)离心该澄清的病毒收获物(例如，连续流式离心)，得到进一步澄清的病毒收获物；；6)加入稳定剂(例如，以下一种或多种：6-8％蔗糖；1-2％单盐酸精氨酸；0.05-0.1％谷氨酸单钠一水合物和0.5-2％明胶水解物)；6)采用过滤使所述进一步澄清的病毒收获物除菌。
在其它具体的实施方案中，制备本发明流感病毒组合物的方法包括以下所有步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；T)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)采用过滤澄清该病毒收获物，得到澄清的病毒收获物；5)离心该澄清的病毒收获物(例如，连续流式离心)，得到进一步澄清的病毒收获物；和6)采用过滤使所述进一步澄清的病毒收获物除菌。
在其它具体的实施方案中，制备本发明流感病毒组合物的方法包括以下一个或多个步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；T)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)澄清该病毒收获物；5)离心该澄清的病毒收获物(例如，连续流式离心)，得到进一步澄清的病毒收获物；和6)采用过滤使所述进一步澄清的病毒收获物除菌。
在其它具体的实施方案中，制备本发明流感病毒组合物的方法包括以下一个或多个步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；T)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)澄清该病毒收获物；和5)渗滤该澄清的病毒收获物。
在另一实施方案中，制备本发明流感病毒组合物的方法包括以下一个或多个步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)澄清该病毒收获物；5)渗滤该澄清的病毒收获物；和6)加入稳定剂(例如，以下一种或多种：6-8％蔗糖；1-2％单盐酸精氨酸；0.05-0.1％谷氨酸单钠一水合物和0.5-2％明胶水解物)。
阅读以下详述并结合附图可更全面理解本发明的这些和其它目的及特征。
附图简述
图1：显示了说明CTM工艺流程的流程图。
图2：显示了说明CTM工艺流程的流程图。
图3：显示了说明离心时加载和温度研究的表格。
图4：显示了总结QC检验数据的表格。
图5：显示了说明许多流感毒株平均产率的表格。
图6：显示了总结单价散装液放行试验(release assay)结果的QC检验数据的表格。
发明详述
本发明提供在4℃-8℃温度范围基本稳定的液体疫苗制剂。在本发明的一个具体实施方案中，本发明液体疫苗制剂在2-8℃温度范围内或在4℃，在至少1个月、或至少2个月、或至少3个月、或至少4个月，或至少5个月，或至少6个月，或至少9个月，或至少12个月，或至少18个月，或至少24个月，或至少36个月或至少48个月期间基本稳定，即在所述时间段终点的效力丧失(例如，流感病毒效力丧失)可接受，例如效力丧失介于0.5-1.0log(通过，例如TCID50或荧光聚焦试验(FFA)测定)。
本发明提供在4℃-8℃温度范围基本稳定的液体疫苗制剂。在本发明的一个具体实施方案中，本发明液体疫苗制剂在2-8℃温度范围内或在4℃，在至少1个月、或至少2个月、或至少3个月、或至少4个月，或至少5个月，或至少6个月，或至少9个月，或至少12个月，或至少18个月，或至少24个月，或至少36个月或至少48个月期间基本稳定，即在所述时间段终点的效力丧失(例如，流感病毒效力丧失)可接受，例如效力丧失小于10％、或小于20％、或小于30％、或小于40％、或小于50％、或小于60％、或小于70％、或小于80％、或小于90％。
本发明还提供含有本发明制剂的免疫原性组合物。本发明还提供含有本发明制剂和/或免疫原性组合物的疫苗(例如，流感疫苗)。
一个实施方案提供的本发明液体疫苗制剂含有流感活病毒。例如，本发明制剂可含有以下一种或多种：减毒流感病毒、冷适应流感病毒、温度敏感型流感病毒、减毒的冷适应温度敏感型流感病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。在一个实施方案中，本发明液体疫苗制剂含有两种甲型流感病毒毒株和一种乙型流感病毒毒株。
或者，本发明制剂可包含其它活病毒，例如副黏病毒(例如，RSV、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、仙台病毒、新城疫病毒)。
本发明还包括制备这种液体疫苗制剂的方法。例如，在一具体实施方案中，本文提供了制备包含一种或多种流感病毒的液体制剂的方法。在一具体实施方案中，制备本发明液体制剂的方法包括以下一个或多个步骤：1)将多种载体[一种或多种所述载体掺入了(或编码)流感病毒基因组的一部分]引入一群宿主蛋或一群宿主细胞中，所述宿主蛋或宿主细胞群能支持流感病毒复制；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)加入稳定剂(例如，本文所述含蔗糖和谷氨酸的溶液)；5)澄清病毒收获物(例如，通过深过滤或膜过滤)，得到澄清的病毒收获物；6)离心该病毒收获物(例如，连续区带离心、连续流式离心)；7)除菌过滤步骤(例如，利用0.2或0.2-0.5微米滤膜(在过滤期间加热或不加热))；和8)在-60℃储存。
在另一具体实施方案中，制备本发明液体制剂的方法包括以下一个或多个步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)加入稳定剂；5)澄清病毒收获物(例如，通过深过滤和/或使之通过0.2-0.8微米的一个或多个滤膜，或先通过0.5或1.5微米的再通过0.2微米的)，得到澄清的病毒收获物；6)离心该病毒收获物(例如，连续区带离心、连续流式离心)；7)除菌过滤步骤(例如，利用0.2或0.2-0.5微米滤膜(在过滤期间加热或不加热))；和8)在-60℃储存。
在其它具体实施方案中，制备本发明流感病毒组合物的方法包括以下一个或多个步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)过滤澄清该病毒收获物，得到澄清的病毒收获物；5)离心该澄清的病毒收获物(例如，连续流式离心)，得到进一步澄清的病毒收获物；6)加入稳定剂(例如，以下一种或多种：6-8％蔗糖；1-2％单盐酸精氨酸；0.05-0.1％谷氨酸单钠一水合物和0.5-2％明胶水解物)；和6)采用过滤使所述进一步澄清的病毒收获物除菌。
在其它具体实施方案中，制备本发明流感病毒组合物的方法包括以下所有步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)过滤澄清该病毒收获物，得到澄清的病毒收获物；5)离心该澄清的病毒收获物(例如，连续流式离心)，得到进一步澄清的病毒收获物；和6)采用过滤使所述进一步澄清的病毒收获物除菌。
在其它具体实施方案中，制备本发明流感病毒组合物的方法包括以下一个或多个步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)澄清该病毒收获物；5)离心该澄清的病毒收获物(例如，连续流式离心)，得到进一步澄清的病毒收获物；和6)采用过滤使所述进一步澄清的病毒收获物除菌。
在其它具体实施方案中，制备本发明流感病毒组合物的方法包括以下一个或多个步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)澄清该病毒收获物；和5)渗滤澄清的病毒收获物。
在其它具体实施方案中，制备本发明流感病毒组合物的方法包括以下一个或多个步骤：1)用流感病毒感染一群宿主蛋或一群宿主细胞；2)在合适的温度孵育该群宿主蛋或该群宿主细胞；3)从病毒收获物中回收流感病毒；4)澄清该病毒收获物；5)渗滤该澄清的病毒收获物；和6)加入稳定剂(例如，以下一种或多种：6-8％蔗糖；1-2％单盐酸精氨酸；0.05-0.1％谷氨酸单钠一水合物和0.5-2％明胶水解物)。
在一个实施方案中，制备液体制剂的方法包括冷冻这种制剂的步骤。冷冻步骤可在，例如最终的稳定性检验和销售之前和/或在冷藏温度(例如，4-8℃)储存前进行。冷冻疫苗制剂，然后在冷藏温度储存可增加本发明疫苗制剂的稳定性至少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或80％。
本发明还提供通过过滤流感病毒收获物并在过滤期间加热该病毒收获物来制备一种或多种流感病毒组合物的方法。在这些具体实施方案中，过滤包括使该组合物流过孔径0.2微米-约0.45微米的微滤膜。此外，在各种实施方案中，这种实施方案的加热温度任选包括约28℃-约40℃或更高，而在一些实施方案中，该温度包括31℃或约30℃-约32℃。在这种实施方案中，加热任选在过滤之前或期间进行，任选进行约50分钟-约100分钟，约60-约90分钟或约60分钟。本发明也提供采用这种方法制备的流感病毒组合物(包括该组合物是疫苗组合物)。
稳定剂和缓冲剂
本发明的稳定剂包含，例如一种或多种以下成分：精氨酸{如，0.5-1％、1-2％、1％、1.2％、1.5％、0.75-2％}；泊洛沙姆；蔗糖{如，2-8％、2％、6-8％、3％、4％、5％、6％、7％或8％}；水解的明胶{如，1％、0.5-2％、1.5％、0.5％、0.75％}；和谷氨酸{如，0.05-0.1％、0.02-0.15％、0.03％、0.04％、0.06％、0.02-0.3％或0.094％}。
本发明的缓冲剂包含，例如一种或多种以下成分：磷酸缓冲剂(一元或二元或二者){如，10-200mM，pH 7-7.5；100mM，pH 7.2；100mM，pH 7-7.3}；和组氨酸缓冲剂{如，25-50mM组氨酸，pH 7-7.5；50-100mM组氨酸，pH7-7.5}。
工艺的产率
在一个实施方案中，制备本发明液体制剂的方法得到工艺的实际或平均产率(病毒收获物(VH)与最终制剂)低于10％、低于16％、低于20％、低于30％、低于40％、低于50％、低于60％、低于70％、低于80％、低于90％、或低于93％、或低于95％。
本领域技术人员应该知道在同一生产流程(series)中无需进行本文所述方法(所有)各步骤或各步骤无需存在于同一生产流程中。因此，尽管一些实施方案进行了本文所述所有步骤和/或存在本文所述所有组合物，但在其它实施方案中，可任选，例如省略、改变(改变范围、次序、位置等)一个或多个步骤，等等。
本领域技术人员也应知道典型的实施方案包括本领域已知的步骤/方法/组合物，例如含病毒鸡蛋的透光检验，用病毒接种鸡蛋等。因此，本领域技术人员不难确定已知步骤的合适条件、子步骤、步骤细节等来制备在2-8℃基本稳定的合适病毒、病毒溶液、组合物等。下文详细描述了各步骤。
此外，本发明提供了这种液体疫苗制剂的用法。例如，可将疫苗制剂给予人来预防或减轻病毒感染，例如流感病毒感染的影响。在一个实施方案中，可将本发明制剂作为免疫原性组合物给予来预防或减轻流感病毒感染的影响。
冷藏稳定的CAIV制剂
本发明人和同事以前的工作开发了通过鼻部喷剂给药的三价冷适应流感活疫苗(CAIV-T，
Figure BSA00000573320100081
该疫苗在本文称为FluMist，但应假定是
Figure BSA00000573320100082
)。本发明涉及开发在冷藏温度的稳定性状况改良的CAIV-T制剂。本文提供了制备这种改良制剂的方法，其包括以下一个或多个步骤：除菌过滤步骤以降低污染风险、超离心(例如，差速区带离心(rate zonal centrifugation))和渗滤。此外，本文包括液体FluMist和其它本发明冷藏稳定(RTS)制剂的一些制备方法。
在20世纪60年代，CAIV毒株的开发受到密歇根大学John Maassab博士的帮助，他将甲型和乙型流感病毒在递减温度下在PCK细胞中连续传代直至获得可重复地显示冷适应(与野生型病毒相比，该病毒在低温下生长良好)、温度敏感(病毒在体外提高温下生长不良)和减毒(在雪貂中病毒复制受限制)特性的毒株。通过，例如本发明人和同事的开发，可利用这些特性作为每年三价疫苗开发的基础，所述三价疫苗反映了采用6∶2遗传重配方法的某年特定的CDC-指定疫苗毒株。例如，可通过有关的甲型或乙型毒株主供体病毒(Master Donor Virus)(MDV)和正流行的感兴趣流感毒株的体外共同感染，及抗体介导的合适重配体的选择来制备6∶2CAIV毒株。目标6∶2重配体含有流行毒株的HA和NA基因，其余基因来自冷适应的主供体病毒(MDV)。该重配体保留了上述冷适应的表型特性。本发明人和同事对CAIV作了进一步开发。FluMist已证明有安全的分布状况，显示对抗病毒攻击有效，经批准可在许多情况中作为商品化药物应用。
FluMist的原始制剂含有用所选毒株的生产商工作病毒种子病毒(MWVS)感染无特定病原体的鸡蛋，然后孵育2-3天，收集感染的尿囊液而制备的病毒收获物(VH)。加入1/10体积的10×蔗糖磷酸谷氨酸(SPG)溶液来稳定VH。通过将给定的某年疫苗中三种毒株各自的VH和稳定的正常尿囊液(NAF)混合达到各毒株7.3log10TCIDso/mL的目标浓度来制备三价FluMist。然后将得到的混合物注入装有喷嘴的喷雾器以鼻内递送FluMist疫苗。此产品形式以“冷冻的FluMist”使用，以冷冻形式储存。应该知道此MWVS也能任选通过，例如质粒重配制备。参见，例如2002年4月26日提交的美国专利申请60/375,675；2003年4月25日提交的PCT/US03/12728；2003年4月25日提交的10/423,828；2005年5月20日提交的PCT/US05/017734和US20050186563。
虽然冷冻的FluMist是可以在制备后冷冻并保持冷冻直至使用的知名疫苗，但仍非常需要在运输/储存时冷藏温度下稳定的FluMist剂型。这种“冷藏温度稳定”(或RTS)剂型具有以下一种或多种特征(但不一定在各种实施方案中都具有)：当作为冷藏液体分发时维持稳定；经过除菌过滤(例如，0.2微米)以确保是无菌产品；鸡蛋蛋白质含量低(例如，基本上不含NAF)；无需制备NAF稀释液；单剂量体积小；和含有精氨酸和明胶作为赋形剂(例如，作为稳定剂)。在本文的某些方面，具有一个或多个这种特征的制剂称为“液体FluMist”或RTS或各种类似术语以区别于其它形式的CAIV-T疫苗，例如冷冻(疫苗)。本发明提供了这些和其它方面的内容。
在本发明液体RTS病毒组合物的生产/检验中，进行了多批生产。生产批次是每批2000-20,000枚蛋，而GMP批次是每批约10,000枚蛋。应该知道虽然本文给出了生产MWVS病毒(例如，重配体)的各种实例和方案，但在不同实施方案中此病毒可任选通过不同方法生产。例如，在某些实施方案中，任选用本文所述方案制备本文病毒，而在其它实施方案中，任选用例如质粒重配或“质粒拯救”技术制备MWVS病毒。参见，例如2002年4月26日提交的美国专利申请号60/375,675；2003年4月25日提交的PCT/US03/12728；2003年4月25日提交的USSN10/423,828；2004年2月25日提交的10/788,236；2005年5月20日提交的PCT/US05/017734和US20050186563，各份文献纳入本文作为参考。因此，本文所用的“感染一群宿主细胞”包括用质粒重配法产生的或在质粒重配期间产生的病毒感染宿主细胞。
在各种实施方案中，本发明包括基本稳定的病毒和疫苗组合物，例如在所选时期内在所需温度下不会显示不可接受的效力丧失，如效力丧失介于0.5-1.0log之间，或低于0.5log，或低于1.0log，所选择的时期通常是至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月、至少15个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少19个月、至少20个月、至少21个月、至少22个月、至少23个月、或至少24个月、或24个月以上等；所需温度一般是4℃、5℃、8℃、约2℃-约8℃或2℃以上、或介于2℃-4℃之间、或介于2℃-8℃之间。
尽管利用FluMist示范或说明了本发明的许多方面，但本发明所体现的原理也适用于其它病毒/疫苗组合物，而无需局限于本文的具体毒株/病毒。因此，其它减毒活流感病毒和疫苗及组合物也属于本发明的范围，例如通过人为干预的合理方式产生的病毒和疫苗及组合物等。所有任选的其它流感毒株的其它病毒等也都属于本发明的实施方案，例如甲型流感毒株、乙型流感毒株、减毒的和非减毒的流感毒株、冷适应的和冷不适应的流感毒株、温度敏感型和温度不敏感型流感毒株等。所述其它病毒和疫苗可用作，例如新型疫苗和/或对照在人或动物中检验其它疫苗，等等。此外，其它病毒活疫苗组合物，特别是含有能在鸡细胞或蛋中生长的活病毒(例如，麻疹病毒)的那些组合物是本发明的具体实施方案。另外，本发明体现的原理在很大程度上也适用于含有能在哺乳动物细胞中生长的活病毒的病毒和疫苗组合物。参见，例如美国专利号6,244,354；6,146,873和6,656,720。
制备散装病毒收获物
冷适应的流感病毒(或其它类似病毒)的纯化和这些组合物的实际制剂是RTS或液体病毒组合物的特征。作为生产灭活疫苗的工业化生产方法的一部分是实施从尿囊液中分离流感病毒。选择这种灭活疫苗的方法是超离心。工业化规模的连续流式超离心在1969年开始应用，并迅速应用于制备灭活流感疫苗。尽管层析纯化流感活病毒是有吸引力的备选方案，但还不是能保留病毒活性的可靠大规模方法。这认为是因流感病毒颗粒的包膜和多形性本质造成。
本发明人和同事回收了通过超离心纯化的活病毒(与灭活病毒相反)，这是本发明实施方案之一。其它工作证明深过滤能作为翻斗离心(swinging-bucketcentrifugation)商业可行备选方案，然后超离心，经0.2微米滤膜过滤后活病毒的回收率可接受，这也是本发明的实施方案之一。
在一具体实施方案中，本发明方法VH澄清步骤的产率中值是至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。
在另一具体实施方案中，本发明方法的超离心(例如，区带离心)步骤的产率中值是至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。
在另一具体实施方案中，本发明方法的峰稀释(peak dilution)和除菌过滤步骤的产率中值是至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％。
超离心步骤能提供浓缩CAIV的优点。这支持应用较小的递送体积(每鼻孔0.1mL而不是每鼻孔0.25mL，例如冷冻FluMist所用的体积)。这种体积减少对于鼻部给药产品更为典型，它能提高使用者接受程度以及降低因吞咽或疫苗流出鼻孔而造成的产品损失。对于CAIV，受感染的尿囊液收获物滴度通常介于8.3-9.5log10TCID50/mL之间，这比冷冻FluMist的目标产物浓度(7.3log10TCID50/mL，或log10TCID50/剂量)高一个数量级。如果每年的疫苗推荐中包括极低滴度的毒株，液体或RTS FluMist能提高制备全面强化三价疫苗的可能性，虽然与冷冻FluMist相比，该终产物中病毒浓度增加。液体或RTS FluMist任选配制为7.7log10TCID50/mL的终浓度，其每剂量递送的活病毒量与冷冻FluMist相同。
一具体实施方案提供了低滴度流感疫苗组合物，其中病毒滴度低于7.3log10TCID50/mL、或低于7.0log10TCID50/mL、或低于6.0log10TCID50/mL、或低于5.0log10TCID50/mL、或低于4.0log10TCID50/mL、或低于3.0log10TCID50/mL、或低于2.0log10TCID50/mL。这种低滴度流感疫苗组合物还可包含药学上可接受的佐剂，例如大肠杆菌热不稳定毒素(或其片段)、百日咳毒素、铝。其它佐剂包括但不限于：磷酸铝，氢氧化铝，MPL.TM.(3-O-脱酰基单磷酰脂质A；RIBI ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.，现为Corixa)，合成的脂质A类似物，例如529(Corixa)，Stimulon.TM.QS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Framingham，Mass.)，IL-12(Genetics Institute，Cambridge，Mass.)，合成的多核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646(28))和霍乱毒素(野生型或突变体形式，例如根据公布的国际专利申请号WO 00/18434，氨基酸29位的谷氨酸被另一氨基酸，最好是组氨酸取代)。
一具体实施方案可采用渗滤制备本发明病毒组合物。例如，可利用渗滤浓缩病毒，再配制。除超离心外还可采用渗滤，或者可用渗滤替代超离心。
在本文稍后所述的初始阶段后，以每批10,000个蛋的规模开始cGMP生产。生产了A/北京/262/95(H1N1)、A/悉尼/05/97(H3N2)和B/Ann Arbor/1/94(B/哈尔滨/7/94-样)纯化的单价CAIV散装液以支持随后的临床试验。下文将B/AnnArbor毒株称为B/哈尔滨/7/94-样毒株。为方便起见，毒株名称往往是缩写(例如A/北京)。本申请最着重描述了液体FluMist独特的加工步骤，然而，本文也描述了涉及液体和冷冻FluMist或二者共有的步骤。
在本发明的各种实施方案中，冷冻FluMist的处理蛋和制备新鲜病毒收获物的方法与液体FluMist的基本一样(除了自动接种和收集外)，本领域技术人员知道本发明能利用的类似或等价步骤。本发明利用Hitachi CP40Y区带离心机和RP40CT D型连续流式转头(转头体积＝3.2L)进行超离心。首先合并病毒收获物，用蔗糖磷酸谷氨酸(SPG)稳定以促进过滤，然后使之通过5微米的聚丙烯滤膜。再将滤液加载于10％-60％蔗糖梯度液上，以40,000rpm离心1小时形成条带，流出液分为100-mL的组分。
合并含有高水平血凝素(HA)的组分，稀释至0.2M蔗糖浓度，然后利用0.2微米的聚偏二氟乙烯(PVDF)滤膜进行除菌过滤。将得到的纯化单价CAIV液在-60℃以下冷冻于1L瓶中，储存待进一步加工。
制剂和灌注
初始制剂的筛选确定了冷藏温度的纯化CAIV的液相稳定性(是否)适用于年度疫苗。向冷冻FluMist的稳定剂SPG中加入水解的动物明胶能得到最佳稳定性结果，其中最不稳定的毒株和得自CTM-I阶段(campaign)的各批显示在6.9个月期间(效力)丧失1个对数。其它制剂的开发研究显示生产后立即冷冻储存和在最终分发前融化能进一步提高液体FluMist的稳定性。加入精氨酸也提高了最差毒株的稳定性。虽然动物明胶可引起对传播性海绵状脑病(TSE)的关注，但缺乏明胶的可用制剂在所有实施方案中均未达到所需稳定性。因此，液体FluMist制剂的一些实施方案选用猪明胶是因其稳定特性和在猪中未见发生TSE的报道。也认为胶原水解所用的严苛化学处理步骤可导致朊病毒大小蛋白质的灭活。
运输冷冻纯化的单价CAIV散装液和在cGMP条件下生产三价疫苗以支持液体FluMist的临床检验。总共进行6次充填。利用4-升玻璃吸气烧瓶进行小规模混合，利用INOVA自动充填/加塞机和相关装置充填0.5mL Becton Dickinson(BD)Hypack SCF(无菌，清洁，易装填)玻璃喷雾器。下文详述了充填的三价液体FluMist的生产。
本发明具体制剂的实施方案
在一个实施方案中，本发明的疫苗制剂在最终制剂中包含以下一种或多种成分：蔗糖：6-8％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸：1-2％w/v；谷氨酸单钠一水合物：0.05-0.1％w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)：0.5-2％w/v；磷酸氢二钾：1-2％；和磷酸二氢钾：0.25-1％w/v。
在一具体实施方案中，疫苗制剂包含以下一种或多种成分：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾：1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。在另一具体实施方案中，疫苗制剂包含以下所有成分：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一具体实施方案中，疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在10％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一具体实施方案中，疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在10％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v。在这类实施方案中，制剂用缓冲液{例如，磷酸钾缓冲液(pH 7.0-7.2)}配制。
在另一具体实施方案中，疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在20％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一具体实施方案中，疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在30％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一具体实施方案中，疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在40％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾：0.48％w/v。
在另一具体实施方案中，疫苗制剂包含以下所有(一种或多种成分的偏差在1％以内)：蔗糖：6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸：1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物：0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)：1％w/v；磷酸氢二钾：1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一具体实施方案中，疫苗制剂包含以下所有成分(一种或多种成分的偏差在3％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；单盐酸精氨酸1.21％w/v；谷氨酸单钠一水合物0.094w/v；明胶水解物，猪A型(或其它来源)1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在一具体实施方案中，本发明制剂可含有，例如用作缓冲液的磷酸钾(如，至少50mM，或至少100mM，或至少200mM，或至少250mM)或组氨酸(如，至少50mM，或至少100mM，或至少200mM，或至少250mM)。
本发明的其它具体实施方案，例如给药，效力
另一具体实施方案包括鼻内给予本发明疫苗制剂的方法。例如，可鼻内给予的本发明疫苗制剂的最终剂量是0.5mL/剂；0.75mL/剂；0.1mL/剂；0.15mL/剂；0.2mL/剂；0.25mL/剂；0.5-0.1mL/剂；0.5mL-2mL/剂；或0.5-2.5mL/剂。
在一个实施方案中，本发明疫苗制剂约含有107荧光聚焦单位(FFU)或107TCID50的各三种不同的流感重配毒株。在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂包含的各流感病毒毒株的效力为7.0(+/-0.5)log10FFU/剂(或TCID50/剂)。在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂包含的至少一种流感病毒毒株的效力为7.0(+/-0.5)log10FFU/剂(或TCID50/剂)。在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂的效力至少为(或等于)：6.0log10FFU/剂、6.5log10FFU/剂、6.7log10FFU/剂、6.7log10FFU/剂、6.8log10FFU/剂、6.9log10FFU/剂、7.0log10FFU/剂、7.1log10FFU/剂、7.2log10FFU/剂、7.3log10FFU/剂、7.4log10FFU/剂、7.5log10FFU/剂、7.6log10FFU/剂、7.7log10FFU/剂、7.8log10FFU/剂、7.9log10FFU/剂、8.1log10FFU/剂、8.5log10FFU/剂或8.8log10FFU/剂。
在本发明的各实施方案中，可用TCID50替代FFU来衡量效力。荧光聚焦试验(FFA)可直接衡量疫苗的感染力，而TCID50是间接衡量在MDCK或其它细胞中的生产性复制能力。
在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂具有介于每剂(例如，每0.2mL剂量)6.5-7.5log10FFU之间的效力。
在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂具有至少(或等于)以下的效力：7.0log10TCID50/剂、或至少6-8TCID50/剂、或至少6.4TCID50/剂、或至少6.6log10TCID50/剂。
在一个实施方案中，本发明疫苗的pH为6.7-7.7、或6.6、或6.7、或6.8、或6.9、或7.0、或7.1、或7.2、或7.3、或7.4、或7.5、或7.6、或7.7。
在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂具有不超过60EU/mL的内毒素，或不超过200EU/mL的内毒素。例如，本发明疫苗制剂具有低于或等于5EU/mL的内毒素。在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂具有低于或等于1.0EU/7.0log10FFU。
在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂不含以下一种或多种(或所有)成分：支原体、逆转录病毒、禽白血病病毒和分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis))。制备本发明这种制剂的方法可包括检验这种杂质的步骤。
在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂所包含的流感病毒具有不同于FluMist中三种病毒的HA和NA基因。
在一具体实施方案中，每剂量(例如，每0.2mL剂量)本发明制剂可含有以下一种或多种(或所有)成分：蔗糖(13.68mg)、磷酸氢二钾(2.26mg)、磷酸二氢钾(0.96mg)、明胶水解物(2.0mg)、单盐酸精氨酸(2.42mg)和谷氨酸单钠(0.188mg)。
在一具体实施方案中，每剂量(例如，每0.2mL剂量)本发明制剂可含有以下一种或多种(或所有)成分：蔗糖(13.68mg)、磷酸钾(100mM)、明胶水解物(2.0mg)、单盐酸精氨酸(2.42mg)和谷氨酸单钠(0.188mg)。
在另一具体实施方案中，每剂量本发明制剂可含有以下一种或多种成分(或所有)(+/-10％、或20％、或30％或40％)：蔗糖(13.68mg)、磷酸氢二钾(2.26mg)、磷酸二氢钾(0.96mg)、明胶水解物(2.0mg)、单盐酸精氨酸(2.42mg)和谷氨酸单钠(0.188mg)。
在另一具体实施方案中，每剂量本发明制剂可含有以下一种或多种成分(或所有)(+/-10％、或20％、或30％或40％)：蔗糖(13.68mg)、磷酸钾(100mM)、明胶水解物(2.0mg)、单盐酸精氨酸(2.42mg)和谷氨酸单钠(0.188mg)。
在另一具体实施方案中，本发明制剂包含的流感病毒具有一种或多种以下流感病毒的遗传骨架：A/Ann Arbor/6/60(A/AA/6/60)B/Ann Arbor/1/66病毒、FluMist MDV-A(ca A/Ann Arbor/6/60)、FluMist MDV-B(caB/Ann Arbor/1/66)、A/Leningrad/17供体毒株骨架和PR8。在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂包含的流感病毒含有以下一种或多种(病毒)的HA和NA多肽序列(与这些序列至少90％相同或至少95％相同)：B/Yamanashi；A/新喀里多尼亚；A/悉尼；A/巴拿马；B/约翰内斯堡；B/维多利亚；B/香港；A/山东/9/93；A/约翰内斯堡/33/94；A/武汉/395/95；A/悉尼/05/97；A/巴拿马/2007/99；A/怀俄明/03/2003；A/德克萨斯/36/91；A/深圳/227/95；A/北京/262/95；A/新喀里多尼亚/20/99；B/AnnArbor/1/94；B/Yamanashi/166/98；B_约翰内斯堡_5_99；B/维多利亚/504/2000；B/香港/330/01；B_布里斯班_32_2002；B/吉林/20/03；H1N1甲型流感病毒；H3N2甲型流感病毒；H9N2甲型流感病毒；H5N1甲型流感病毒；乙型流感病毒；和流行性流感病毒毒株(WHO所指定或不在人群中流行的)。参见，例如US 20050042229。
在另一具体实施方案中，本发明疫苗制剂是无菌的。
疫苗制备中代表性步骤的描述
为便于讨论和描述，一般认为疫苗组合物生产的各步骤包括或属于四个大组(大体上类似于以上概述的)。第一组包括诸如共感染、重配、重配体选择和重配体克隆的方面。第二组包括诸如重配体的纯化和扩增的方面。第三组包括在蛋中进一步扩增重配体、收集、纯化这种收集的病毒溶液。第四组包括稳定收集的病毒溶液，和病毒溶液的效力/无菌性试验。然而，应该知道将本发明各方面分为上述四个通用类别只是出于说明/组织目的，而不能作出这些步骤相互依赖的推论，等等。也应该知道其它步骤(相似和不同的)也任选可与本发明方法和组合物(例如，用于RTS疫苗组合物的方法和组合物)联用。
如上所述，为便于讨论和描述，可认为疫苗生产中各步骤包括四个大组。第一组包括诸如共感染、重配、重配体选择和重配体克隆的方面。
组1
在本文概括归类为属于组1的疫苗组合物生产的各方面包括与以下有关的方法和组合物：优化利用(例如)主供体病毒(master donor virus)和一种或多种野生型病毒共感染培养的细胞系以特异性产生所需的重配病毒；选择合适的重配病毒；克隆所选择的重配病毒。本领域技术人员熟知流感病毒毒株的重配。甲型流感病毒和乙型流感病毒的重配已同时用于细胞培养和蛋中以产生重配的病毒毒株。参见，例如Tannock等，“制备和特征鉴定源自A/Leningrad/′134/17/′57供体毒株的减毒冷适应的甲型流感病毒重配体”(Preparation and characterisation of attenuatedcold-adapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/′134/17/′57donor strain)，Vaccine，(2002)，20：2082-2090。也利用质粒构建物显示流感病毒毒株的重配。参见，例如2002年4月26日提交的美国专利申请号60/375,675、2003年4月25日提交的PCT/US03/12728、2003年4月25日提交的美国申请10/423,828、2005年5月20日提交的PCT/US05/017734；和US20050186563。
简言之，重配通常包括混合(例如，在蛋或细胞培养物中)不同病毒的基因区段。例如，可组合乙型流感病毒毒株的含有感兴趣表位的野生型毒株和“供体”毒株(如包含冷适应的毒株)的典型8个区段。在两种病毒类型间重配本身能产生含有野生型毒株表位的一个区段和冷适应毒株的另一区段的病毒。不幸的是，为产生所需重配体，有时需要进行大量重配。也可在重配后选择病毒(例如，以发现所需重配体)。然后可克隆所需的重配体(例如，扩增其数量)。
一般通过将病毒毒株共感染入细胞培养物(例如，CEK细胞)，然后用合适的抗体(例如针对亲代病毒之一成分的抗体)选择(通常在蛋中进行)，克隆或扩增病毒等(通常在细胞培养物中进行)进行乙型流感病毒所需重配体的常规优化、选择和克隆。然而，这种常规重配的缺陷在于需要数千次重配来产生所需的区段组合物。当进行这种重配时，真正的随机重配(truly random reassortment)明显不是最终结果。换言之，该系统中存在导致该方法偏向的压力。然而对于甲型流感病毒，这种方法显示没有这种偏向。对于甲型毒株，先进行毒株共感染(通常感染入细胞培养物，例如CEK细胞)，然后通常对细胞培养物同时进行选择和克隆。
重配的优化
采用组1各步骤的各种实施方案可优化重配方法以减少所需的重配次数(从而提高疫苗生产方法的产量/稳定性)等。采用这种优化技术的步骤一般实施方案为乙型流感病毒毒株重配，所述步骤通常在细胞培养物(例如，CEK细胞)中进行。参见，例如均在2004年2月25日提交的美国专利申请号10/788,236和PCT/US04/05697，二者出于所有目的在本章节和整个说明书中全文纳入作为参考。
流感病毒重配的其它方法可任选混合主供体病毒(MDV)和野生型病毒的稀释液，例如各自的1∶5稀释液，而不论各溶液的浓度，然后将混合液在25℃和33℃培育24和48小时。尽管对于甲型流感病毒毒株这种方法通常可接受，但采用这种方法乙型流感病毒毒株通常不能得到阳性结果。例如，为达到合适的6∶2重配(即，MDV的6种基因与野生型病毒的NA和HA二种基因)必须进行数千次重配。
重配的选择和克隆
组1的步骤也包括选择重配的流感病毒。可在细胞培养物(例如，CEK细胞)或蛋中选择重配的甲型流感病毒毒株。然而，当在细胞培养物(例如，当在CEK细胞中选择时)中重配时，重配的乙型流感病毒毒株存在问题。据认为，CEK细胞可干扰乙型流感病毒毒株的M基因，从而降低总产量。疫苗组合物生产的各种方法(参见，例如均是2004年2月25日提交的美国专利申请号10/788,236和PCT/US04/05697)采用不同的病毒重配步骤(例如选择)，可任选采用这种步骤来产生用于疫苗组合物的病毒。
重配的特征鉴定
病毒/疫苗生产的其它方法还应用高通量单链构象多态性/毛细管电泳(SSCP/CE)试验来测定本文所用流感病毒的基因格局(gene constellation)。流感病毒含有8个基因区段，如上所述，用两种不同流感病毒毒株共感染一个细胞可产生具有不同于任一亲代的新型基因构象的重配体病毒。因此，一些方法可采用SSCP/CE试验来快速测定大量流感病毒样品中的基因区段格局。可利用这8个区段各自的特异性荧光标记引物任选通过RT-PCR扩增流感病毒的基因区段。也可参见出于所有目的纳入本文作为参考的Arvin等，(2000)，Clin.Micro.J，38(2)：839-845。
防止细菌污染
病毒/疫苗生产的一些方法可包括检测和/或防止/检测用于生产流感病毒的蛋的微生物污染步骤。本发明的微生物检测方法可用于快速/高通量的微生物检测，因此与许多其它步骤一样可用于提高病毒/疫苗生产的产量及任选提高稳定性。
本发明任选可采用的目前许多流感疫苗生产方法利用在无特定病原体的鸡胚蛋中扩增流感病毒的常规方法作为组成部分。在用鸡蛋生产病毒的几个阶段中可能发生微生物污染。不幸的是，鸡蛋壳外可能有一些微生物组成它们天然菌群的一部分。在鸡胚胎发育期间，蛋壳内也可能含有微生物。受精的鸡蛋于37℃在高湿度中孵育以使胚胎发育，这也构成了许多类型微生物污染物的基本培育条件。刺穿蛋壳以接种鸡蛋是发生微生物污染另一可能的时间。即使常在病毒接种前用酒精喷洒鸡蛋，微生物也仍可能进入鸡蛋。
病毒在鸡蛋中扩增2-3天后，通常除去蛋壳顶部后手工收集鸡蛋中含有病毒的尿囊液。参见上文。这种收集是可能引起微生物污染的另一时间。不幸的是，含有这种污染性生物负载(bioburden)的鸡蛋可能逃过检测，而必须合并成多瓶以尽可能降低因MPA检验失败而弃去整批的可能性。由于疫苗生产中通常利用3种流感病毒毒株，对于最终的散装液需要混合这3种毒株。应在混合和充填之前，例如病毒收集加工过程中采用MPA(微生物纯度试验)检验以确保产品不含微生物。
孵育后，采用“常规”透光检验方法来鉴定未受精和因天然原因或微生物污染而死亡的死蛋(即，因病毒感染和/或微生物扩增而发生的死蛋，两种情况均需检测并除去这种蛋)。透光检验包括，例如在暗室中将鸡蛋握持在光源前从而能目测观察胚胎发育的方法。排除病毒接种后的死蛋。
从上述时间点可以看出，流感疫苗生产期间有多个步骤需要检测微生物污染。需要消除或减少禽类和环境微生物，需要消除或减少引入的环境和人微生物。目前检测微生物污染的方法包括，例如简化的(compendial)方法(MPA和生物负载)。目前的方法包括，例如接种前/后鸡蛋透光检验(通常以约500枚蛋/小时/人的速度手工进行)；MPA和生物负载检验，通常手工进行，对于MPA要约14天，对于生物负载要约3天(在病毒收集期间进行)；支原体检验，通常手工进行，需要约28天(在病毒收集期间进行)；和分枝杆菌检验，通常手工进行，需要约56天(在病毒收集期间进行)。对于本发明能采用的各种技术的描述也可参见例如均在2004年2月25日提交的美国专利申请号10/788,236和PCT/US04/05697。
组2
属于组2的病毒/疫苗生产各方面还包括纯化和病毒扩增等。经正确的重配和重配体(即，6∶2病毒)克隆过程后，可进一步纯化鸡胚蛋中的这种重配病毒颗粒，大量扩增正确的克隆(还是通过在鸡蛋中培养)以产生主病毒毒株(MVS)或主病毒种子，进而再扩增以产生主工作病毒毒株(MWVS)或生产商的工作病毒种子。本领域技术人员熟知从鸡蛋纯化病毒颗粒和利用这种纯化的病毒来接种更多鸡蛋以扩增大量病毒颗粒的许多方面。许多这些技术是目前病毒颗粒生产中常用的，已至少使用了40年。参见，例如Reimer等，“采用区带超离心纯化流感病毒”(Influenzavirus purification with the zonal ultracentrifuge)，Science，1966，152：1379-81。纯化方法可包括，例如蔗糖梯度超离心(例如，10-40％蔗糖)等。如本文所述，组2中也可任选包括其它组所列方法等，例如防止微生物污染等。
组3
属于组3的病毒/疫苗生产各方面包括，例如条件化孵育含胚胎的鸡蛋(如，涉及孵育病毒感染的鸡蛋的特定处理和环境条件)和从鸡蛋尿囊液中收集以及澄清流感病毒。
例如，条件化、洗涤、透光检验和孵育含有用于疫苗的重配病毒的蛋；接种、密封这种蛋等；透光检验这种蛋；收集蛋中的病毒溶液(如，尿囊液或病毒收获物(VH))；和澄清病毒溶液均属于这种范畴。也应注意适用于组2步骤的几种技术同样适用于组3的步骤(例如，透光检验)。本领域技术人员熟知包括组3病毒/疫苗生产的几个方面。病毒生产中透光验蛋以及用病毒接种蛋和这种蛋的洗涤、孵育等各方面是用蛋生产病毒/疫苗的熟知技术。当然，应该知道这种熟知技术可与本发明独特且创新的方面联用。参见，例如均是2004年2月25日提交的美国专利申请号10/788,236和PCT/US04/05697中给出的也可与本发明方法和组合物联用的其它步骤，如摆动(rocking)等。其它类似的步骤可包括组合物的具体过滤和升温步骤，也参见相同的文献。
过滤和升温
本发明包括属于目前分组的上述超离心的各方面，参见上文。此外，均是2004年2月25日提交的美国专利申请号10/788,236和PCT/US04/05697中给出了可任选与本发明方法和组合物联用的其它过滤和升温步骤。如(本文)所述，FluMistTM生产方法可利用鸡胚蛋来产生主病毒种子(MVS)、生产商工作病毒种子(MWVS)和病毒收获物(VH)。这些种子和病毒收获物可能含有生物负载(通常是细菌污染)该从而导致疫苗生产过程中弃去该种子或散装病毒产品批次。当然，应该知道，除非另有明确表述，不应将所用具体产品的类型、大小等的具体列表或描述认为是对本发明的限制。
组4
疫苗制剂/组合物生产的组4的各方面包括，例如基本上与稳定有关的步骤(例如，通过加入一些组分，改变缓冲液/NAF比值等)和含病毒溶液的效力/无菌性试验。以上对本发明的描述给出了属于此范畴内的任选分组的各方面。参见上文。
在一些实施方案中，含有活病毒的液体形式的最终病毒溶液/疫苗可稳定足够时间从而能在整个流感疫苗季节(例如，在北半球通常大概从9月到3月)“现场”储存(例如，在2-8℃、4℃、5℃等冷藏时销售和(付诸)商业化)。因此，需要这种病毒/疫苗组合物在储存期间保持其效力或其丧失效力的速度可以接受。在其它实施方案中，液体形式的这种溶液/疫苗在约2℃-约8℃(例如冷藏温度)下稳定。例如，如果0.3log的效力丧失可接受并且储存时间是9个月，则效力降低为0.05log/月是可接受的。试举另一例子，如果允许(效力)丧失最多为0.75log，则(效力降低)速度低于或等于0.09log/月足以维持冷藏温度(例如，4℃)下连续储存物质的稳定性。在其它实施方案中，当储存在约2℃-约8℃时，液体形式的这种溶液/疫苗稳定。组合物的稳定性可包括在约1天-2年之间、约10天-约2年之间、约20天-约2年之间、约1个月-约2年、约2个月-约2年之间、约3个月-约2年之间、约4个月-约2年之间、约5个月-约2年之间、约6个月-约2年之间、约7个月-约2年之间、约8个月-约2年之间、约9个月-约2年之间、约10个月-约2年之间、约11个月-约2年之间、约12个月-约2年之间、约13个月-约2年之间、约14个月-约2年之间、约15个月-约2年之间、约16个月-约2年之间、约17个月-约2年之间、约18个月-约2年之间、约19个月-约2年之间、约20个月-约2年之间、约21个月-约2年之间、约22个月-约2年之间、约23个月-约2年之间、或大于约2年。
可通过许多方法检验本发明制剂的稳定性。例如，可首先在冷冻温度(例如，-25或-70℃(+/-10、20、30或40℃))培育制剂，然后在4-8℃储存(或“培育”)该制剂一段时间。或者，可通过在4-8℃简单地储存(或“培育”)该制剂一段时间。可通过本文所述或其它已知的方法检测效力。
病毒收获物的浓缩/渗滤
在疫苗组合物生产的一些方法中，可任选用合适的柱浓缩病毒收获物。参见均是2004年2月25日提交的美国专利申请号10/788,236和PCT/US04/05697。
稳定剂/缓冲液
疫苗组合物生产也任选包括含有感兴趣病毒和诸如蔗糖、精氨酸、明胶、EDTA等混合物的NAF(通常是未分级的NAF)的各种稀释液。不同疫苗制剂中可能的各种组合物的例子可参见，例如美国专利申请号10/788,236和PCT/US04/05697。这种方法和组合物优选在所需温度(例如，通常在4℃、5℃、8℃，约2℃-约8℃之间或高于2℃等)下，在所选择的时期(通常至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少15个月、至少18个月、至少24个月等)内稳定，例如不显示不可接受的效力丧失，如效力丧失介于0.5-1.0log之间，或低于0.5log，或低于1.0log。
在一些制剂中，组合物可含有与明胶或明胶相关和/或衍生产品(例如明胶水解物)相混合或替代其的稳定剂，例如精氨酸(pH约7.0-约7.2)。参见美国专利申请号10/788,236和PCT/US04/05697。许多病毒溶液/疫苗溶液也任选利用SPG基础溶液(蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠)。
均是2004年2月25日提交的美国专利申请号10/788,236和PCT/US04/05697给出了稳定病毒/疫苗组合物的其它方法，例如操控NAF水平等。
定义
除非另有定义，所有科技术语应理解为具有和其所属领域常规使用相同的意义。出于本发明的目的，下文定义了以下术语。
术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”和“核酸序列”指单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，或其嵌合物或类似物。本文所用的术语任选包括具有天然核苷酸基本性质的天然产生的核苷酸类似物的聚合物，即它们能以类似于天然产生的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如，肽核酸)。除非另有指明，具体核酸序列任选含有互补的序列，除了明确指出的序列以外。
术语“基因”广泛用于指与生物学功能相关的任何核酸。因此，基因包含它们表达所需的编码序列和/或调节序列。术语“基因”适用于特定的基因组序列以及该基因组序列所编码的cDNA或mRNA。
基因也包含不表达的核酸区段，例如所述区段形成其它蛋白质的识别序列。不表达的调节序列包括能与诸如转录因子的调节蛋白结合从而导致毗连或毗邻序列转录的“启动子”和“增强子”。“组织特异性”启动子或增强子是能在特定组织类型或细胞类型，或多种类型中调节转录的启动子或增强子。
术语“载体”指能在生物、细胞或细胞组分之间扩增和/或转运核酸的工具。载体包括能自主复制或能整合入宿主细胞染色体中的质粒、病毒、细菌噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子和人工染色体等。载体也可是不能自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链中由DNA和RNA构成的多核苷酸、聚-赖氨酸-偶联的DNA或RNA、肽-偶联的DNA或RNA、脂质体-偶联的DNA等。本文的载体最常用于(但并非专门)指质粒。
“表达载体”是能促进掺入其中的核酸表达以及复制的载体，如质粒。待表达的核酸通常“操作性连接于”启动子和/或增强子，并受启动子和/或增强子的转录调节控制。
“双向表达载体”的特征是两个交替的启动子(alternative promoter)的朝向相对于它们之间的核酸呈相反方向，从而可以两个方向启动表达，进而导致，例如同时转录产生正(+)链或有义链和负链(-)或反义链RNA。
在本文中，术语“分离的”指生物物质，例如核酸或蛋白质基本上不含在其天然产生环境中与其正常相伴或相互作用的成分。分离的物质任选含有在其天然环境，例如细胞中未发现的与其相伴的物质。例如，如果该物质处于其天然环境，例如细胞中，则该物质在细胞中的位置(例如，基因组或遗传元件)对该环境中发现的物质是非天然的。例如，如果通过非天然产生的工具将天然产生的核酸(例如，编码序列、启动子、增强子等)引入对该核酸是非天然的基因组基因座中(例如，载体，如质粒或病毒载体或扩增子)，在该核酸是分离的。这种核酸也称为“异源”核酸。
术语“重组体”表示经人工或合成(非天然)方法改变的物质(例如，核酸或蛋白质)。可对处于其天然环境或状态中，或对从其天然环境中除去的物质进行改变。具体地说，当提及的病毒，例如流感病毒是重组体时，可通过重组核酸的表达产生。
当术语“重配体”指病毒时，其表示该病毒包含衍生自多个亲代病毒毒株或来源的遗传成分和/或多肽成分。例如，7∶1重配体包含衍生自第一亲代病毒的7个病毒基因组区段(或基因区段)和第二亲代病毒的一个互补病毒基因组区段，例如编码血凝素或神经氨酸酶的基因组区段。6∶2重配体包含第一亲代病毒的6个基因组区段(最常见的6个内部基因)和不同亲代病毒的两个互补区段，例如(编码)血凝素或神经氨酸酶的区段。
当术语“引入”指异源或分离的核酸时，其指将某核酸掺入真核或原核细胞中，从而可将该核酸掺入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转变为自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。该术语包括诸如“感染”、“转染”、“转化”和“转导”等方法。在本发明内容中，可采用各种方法将核酸引入原核细胞中，包括电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质介导的转染(脂转染)等。
术语“宿主细胞”表示含有异源核酸，例如载体并能支持该核酸复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，或真核细胞，例如酵母菌、昆虫(细胞)、两栖类(细胞)、禽类(细胞)或哺乳动物细胞，包括人细胞。本发明内容中的示范性宿主细胞包括Vero(非洲绿猴肾)细胞、BHK(幼仓鼠肾)细胞、原代雏鸡肾(PCK)细胞、Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞、Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞、293细胞(例如，293T细胞)和COS细胞(例如，COS1、COS7细胞)。
流感病毒
本文的组合物和方法主要涉及流感病毒疫苗的生产。流感病毒由含有分节段的单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心及具有基质蛋白衬里的脂蛋白外包膜构成。甲型流感病毒和乙型流感病毒各自含有单链负链RNA的8个区段。甲型流感病毒基因组编码11种多肽。区段1-3编码构成RNA依赖性RNA聚合酶的3种多肽。区段1编码聚合酶复合物蛋白PB2。其余的聚合酶蛋白PB1和PA分别由区段2和区段3编码。此外，一些流感病毒毒株的区段1编码在PB1编码区内由交替读框产生的小蛋白PB1-F2。区段4编码参与感染期间的细胞黏附和进入的血凝素(HA)表面糖蛋白。区段5编码核衣壳核蛋白(NP)多肽，病毒RNA相关的主要结构组分。区段6编码神经氨酸酶(NA)包膜糖蛋白。区段7编码由另路剪接mRNA翻译的两种基质蛋白，称为M1和M2。区段8编码由另路剪接mRNA变体翻译的NS1和NS2，两种非结构蛋白。
乙型流感病毒的8个基因组区段编码11种蛋白质。3个最大的基因编码RNA聚合酶的组分PB1、PB2和PA。区段4编码HA蛋白。区段5编码NP。区段6编码NA蛋白和NB蛋白。蛋白NB和NA均由双顺反子mRNA的重叠读框翻译。乙型流感病毒的区段7也编码两种蛋白质：M1和M2。最小的区段编码两种蛋白质：由全长RNA翻译的NS1和由剪接mRNA变体翻译的NS2。
流感病毒疫苗
历史上，主要利用根据相关毒株的经验性预测选出的病毒毒株在鸡胚蛋中生产流感病毒疫苗。近年来，将选择的血凝素和神经氨酸酶抗原掺入已批准的减毒的温度敏感型主毒株中制备了重配体病毒。通过在鸡蛋中传代多次培养病毒后，回收流感病毒并任选，例如用甲醛和/或β丙内酯灭活(或者用于减毒活疫苗)。
然而，以此方式生产流感疫苗有几个明显的问题。例如，鸡蛋中残留的污染物可以是高度抗原性和/或热源性的，给药后常可导致明显的副作用。因此，另一方法包括利用不含动物(成分)的培养基替换一定百分比的鸡蛋组分。更重要的是，通常必须在下一次流感季节前数月选择和分发为疫苗生产所指定的病毒毒株，从而有时间生产和灭活流感疫苗。因此改进在储存期间和/或在更方便的温度(例如，约2-8℃的冷藏温度，如本发明方法和组合物所用的温度)下储存的稳定性也是非常需要的。
批准用于疫苗生产的一些毒株在标准细胞培养条件下不能充分生长阻碍了在细胞培养物中生产重组和重配疫苗的尝试。因此，本发明人及同事先前的工作提供了载体系统和在培养物中生产重组和重配病毒的方法，从而能快速生产对应于一种或多种选择的抗原性毒株的疫苗。参见，例如2002年4月26日提交的美国专利申请号60/375,675；2003年4月25日提交的PCT/US03/12728；2003年4月25日提交的USSN 10/423,828；2005年5月20日提交的PCT/US05/017734。当然，任选在鸡蛋中进一步扩增这种重配(体)。通常在受控的湿度和CO2条件下，利用温度调节器，例如恒温箱以确保温度不超过35℃的恒定温度下将培养物维持在诸如细胞培养箱的系统中。通过全部或部分利用本发明可进一步优化这种前驱性工作以及其它疫苗生产工作。
通过引入对应于主流感病毒基因组区段的载体亚组联同衍生自感兴趣毒株(例如，感兴趣的抗原性变体)的互补区段不难获得重配流感病毒。通常根据与疫苗给予相关的所需特性来选择主毒株。例如，为疫苗生产，如为生产减毒的活疫苗，可选择减毒表型、冷适应和/或温度敏感的主供体病毒毒株。
Figure BSA00000573320100271
如上所述，流感疫苗有许多实例和类型。示范性流感疫苗FluMist是一种保护儿童和成年人免患流感疾病的减毒活疫苗(Belshe等，(1998)，“减毒的、冷适应的、三价、鼻内流感病毒活疫苗在儿童中的效力”(The efficacy of liveattenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine in children)，N.Engl.J.Med.，338：1405-12；Nichol等，(1999)，“减毒的鼻内流感病毒活疫苗在健康工作成人中的效力：一项随机对照试验”(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，working adults：arandomized controlled trial)，JAMA，282：137-44)。在典型的实施方案中，本发明方法和组合物宜适用于生产FluMist疫苗或与之联用。然而，本领域技术人员应知道本文的步骤/组合物也适用于生产相似，或者甚至不同的病毒疫苗及其组合物。
FluMistTM疫苗毒株含有，例如衍生自该疫苗的野生型毒株的HA和NA基因区段联同常规主供体病毒(MDV)的6个基因区段，PB1、PB2、PA、NP、M和NS。通过在连续低温下在原代雏鸡肾组织培养物中连续传代野生型A/AnnArbor/6/60(A/AA/6/60)毒株制备了FluMist的甲型流感病毒毒株的MDV(MDV-A)(Maassab，(1967)，“25℃时流感病毒的适应性和生长特性”(Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25degrees C)，Nature，213：612-4)。MDV-A可在25℃有效复制(ca，冷适应的)，但其生长在38和39℃受限(ts，温度敏感的)。此外，该病毒在受感染雪貂的肺中不能复制(att，减毒的)。据信，ts表型可通过限制疫苗在最冷区域以外的所有呼吸道中复制从而导致其在人中减毒。动物模型和临床研究证明了此特性稳定。与通过化学诱变产生的流感病毒毒株的ts表型相反，通过在受感染的仓鼠或在儿童的蜕皮分离物中传代后MDV-A的此ts特性不回复(最近的综述可参见Murphy和Coelingh，(2002)，“减毒的冷适应甲型流感病毒和乙型流感病毒活疫苗的开发原理和应用”(Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adaptedinfluenza A and B virus vaccines)，Viral Immunol.，15：295-323)。
在20,000以上的成人和儿童中进行的涉及12种不同6∶2重配毒株的临床研究显示这些疫苗是减毒、安全而有效的(Belshe等，(1998)，“减毒的、冷适应的、三价、鼻内流感病毒活疫苗在儿童中的效力”(The efficacy of liveattenuated，cold-adapted，trivalent，intranasal influenza virus vaccine in children)，N.Engl.J.Med.，338：1405-12；Boyce等，(2000)，“鼻内给予健康成人的加佐剂和未加佐剂亚单位流感疫苗的安全性和免疫原性”(Safety andimmunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccinesadministered intranasally to healthy adults)，Vaccine，19：217-26；Edwards等，(1994)，“用于预防甲型流感疾病的冷适应和灭活疫苗的随机对照试验”(Arandomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for theprevention of influenza A disease)，J.Infect.Pis.，169：68-76；Nichol等，(1999)，“减毒的鼻内流感病毒活疫苗在健康作成人中的效力：一项随机对照试验”(Effectiveness of live，attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy，working adults：a randomized controlled trial)，JAMA，282：137-44)。携带MDV-A的6个内部基因和野生型病毒的两个HA和NA基因区段的重配体(即，6∶2重配体)始终保留了ca、ts和att表型(Maassab等，(1982)，“在雪貂中评估低温重组流感病毒疫苗”(Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine inferrets)，J.Infect.Pis.，146：780-900)。然而，利用乙型流感病毒毒株制备这种重配病毒更困难。
近年来的工作可参见，例如2002年4月26日提交的美国专利申请号60/375,675；2003年4月25日提交的PCT/US03/12728；2003年4月25日提交的USSN 10/423,828；2005年5月20日提交的PCT/US05/017734；这些文献公开了用于完全从克隆的cPNA制备乙型流感病毒的8种质粒系统，和适用于疫苗制剂(例如用于鼻内给予的病毒活疫苗制剂)的减毒活甲型流感病毒和乙型流感病毒的制备方法。
上述系统和方法可用于在细胞培养物中快速生产重组和重配甲型流感病毒和乙型流感病毒，包括适合用作疫苗，包括减毒活疫苗(例如适用于鼻内给予的疫苗，如)的病毒。本发明方法任选与涉及(例如)用于疫苗生产的先前工作所制备的重配流感病毒联用或组合从而以更稳定、均一和多产的方式生产用于疫苗的病毒。
细胞培养
如上所述，流感病毒任选在细胞培养物中生长。一般在常规培养宿主细胞的培养基组合物中实现病毒增殖。用于流感病毒复制的合适宿主细胞包括，例如Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞和COS细胞，包括293T细胞、COS7细胞。通常利用例如1∶1比例的两种上述细胞系，例如MDCK细胞和293T或COS细胞的共同培养物来提高复制效率。细胞一般在适合于维持缓冲液中性pH(例如，介于7.0-7.2间的pH)的受控湿度和CO2下，在标准商品化培养基，例如补加血清(例如，10％胎牛血清)的Dulbecco改进Eagle培养基，或不含血清的培养基中培养。培养基任选含有抗生素，例如青霉素、链霉素等以防止细菌生长，和/或其它营养素，例如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、其它补充物质，例如胰蛋白酶、β-巯基乙醇等以促进有利的生长特征。
在培养基中维持哺乳动物细胞的方法已有大量报道且为本领域技术人员所熟知。通用方法可见，例如Freshney，(1983)，《动物细胞培养：基础技术手册》(Culture of Animal Cells：Manual of Basic Technique)，Alan R.Liss，纽约；Paul，(1975)，《细胞和组织培养》(Cell and Tissue Culture)，第五版，Livingston编，爱丁堡；Adams，(1980)，《生物化学家的生物化学和分子生物学-细胞培养的实验室技术》(Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Cell Culture for Biochemists)，Work和Burdon编，Elsevier，阿姆斯特丹。在流感病毒体外生产中特别感兴趣的组织培养方法有关的其它细节包括，例如Merten等，(1996)，“在细胞培养物中生产用于疫苗制备的流感病毒”(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)，刊于Cohen和Shafferman编，《疫苗设计和生产的新方法》(Novel Strategies in Design andProduction of Vaccines)，该文献出于所有目的全文纳入本文作为参考。此外，通过常规实验不难确定适应于本发明的这些方法中的改变，而本领域技术人员所熟悉这些改变。
在本发明一具体实施方案中，在存在或不存在胰蛋白酶和不含血清的条件下，在以下温度范围内培养和/或感染本发明宿主细胞：30℃-39℃；或30℃、或31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃。
可在含有血清或不含血清的培养基中培养用于生产流感病毒的细胞。在一些情况中，例如制备纯化的病毒，通常需要在不含血清的条件下培养宿主细胞。可以小规模，例如在低于25ml培养基中，在培养试管或培养瓶中，或采用搅拌的大瓶，摇瓶，或在烧瓶、瓶或反应器培养液的微载体珠上(例如，DEAE-Dextran微载体珠，如Dormacell，Pfeifer&Langen；Superbead，FlowLaboratories；苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，例如Hillex，SoIoHill，Ann Arbor)培养细胞。微载体是能为每份细胞培养液体积的黏附细胞生长提供大表面积的小球体(直径为100-200微米)。例如，1升培养基可含有两千万以上的微载体珠，这些微载体珠能提供8000平方厘米以上的生长表面。对于病毒的商品化生产，例如疫苗生产，往往需要在生物反应器或发酵罐中培养细胞。可用的生物反应器的容积从1升到100升以上，例如Cyto3生物反应器(Osmonics，Minnetonka，MN)；NBS生物反应器(New Brunswick Scientific，Edison，新泽西)；B.BraunBiotech International的实验室和工业化规模的生物反应器(B.Braun Biotech，Melsungen，德国)。
无论培养液的体积，在本发明的许多理想方面，重要的是将培养液维持在合适温度从而确保能利用温度依赖性多质粒系统(参见，例如上文引用的用于流感病毒生产的多质粒系统)，(通过)加热用于过滤的病毒溶液等来有效回收重组和/或重配流感病毒。通常利用调节器，例如恒温箱或感测和维持细胞培养系统和/或其它溶液温度的其它装置来确保合适时期(例如，病毒复制期等)的温度处于正确水平。
在一些方法中(例如，其中要从载体上的区段制备重配病毒)，根据本领域将异源核酸引入真核细胞的熟知方法将含有流感(病毒)基因组区段的载体引入(转染)宿主细胞，所述方法包括，例如磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染和利用聚胺转染试剂转染。例如，可根据生产商的使用说明书利用聚胺转染试剂TransIT-LT1(Minis)将载体(如质粒)转染入宿主细胞，例如COS细胞、293T细胞或COS或293T细胞和MDCK细胞的混合物中，从而产生重配病毒等。待引入宿主细胞群的约1μg各载体与约2μl TransIT-LT1用160μl培养基(优选不含血清的培养基)稀释，终体积200μl。DNA：转染试剂混合物在室温培育45分钟，然后加入800μl培养基。向宿主细胞中加入此转染混合物，如上所述或通过本领域技术人员熟知的其它方法培养细胞。因此，为在细胞培养物中制备重组或重配病毒，将掺有8个基因组各个区段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)的载体与约20μl TransIT-LT1混合，转染入宿主细胞中。任选用不含血清的培养基，例如Opti-MEM I替换含血清的培养基，再转染并培育4-6小时。
或者，可采用电穿孔将掺有流感(病毒)基因组区段的这种载体引入宿主细胞中。例如，优选根据以下方法用电穿孔将掺有甲型流感病毒或乙型流感病毒的质粒载体引入Vero细胞中。简言之，例如将生长在补加10％胎牛血清(FBS)的改进Eagle培养基(MEM)中的约5×106个Vero细胞重悬于0.4μl OptiMEM中，置于电穿孔小杯中。向该小杯细胞中加入20微克DNA至体积25μl，然后轻扣混合。根据生产商的使用说明书(例如，连有Capacitance Extender Plus的BioRad Gene Pulser II)以300伏、950微法和28-33毫秒的时间常数进行电穿孔。轻扣重新混合细胞，电穿孔后约1-2分钟直接在小杯中加入含10％FBS的0.7ml MEM。然后将细胞转转入含有2ml MEM，10％FBS的标准6孔组织培养皿的两个孔中。洗涤小杯以回收任何剩余的细胞，洗涤悬液分入所述两个孔中。终体积约3.5mL。然后在允许病毒生长的条件下(例如冷适应毒株的约33℃)培育细胞。参见，例如纳入本文作为参考的US20050158342。
试剂盒
为有利于本发明方法和组合物的使用，可将任何疫苗组分和/或组合物，例如各种制剂中的病毒等，和为实验或治疗性疫苗目的包装和感染流感病毒的其它组分，如缓冲液、细胞、培养基包装成试剂盒形式。除了上述组分外，试剂盒通常含有其它材料，包括，例如执行本发明方法的使用说明书、包装材料和容器。
实施例1
开发液体FluMist
根据方案先着手(制备)了总共19批病毒单价散装液，包括4个开发批(CB0006H、CB0008H、CG0017H、CBOO18H和CB0019H)。制备了CB0018H和CB0019H批为各种研究提供材料，本申请书中不对它们进一步讨论。超离心步骤后，合并两批(CBOO180H和CBOO 12H)以产生A/悉尼单价散装液CB0020H。各批以约2000枚蛋开始。
建立类似于生产冷冻FluMist所用方法的蛋处理和孵育条件，然而因为规模较小等原因采用手工接种和收集。超离心方法按比例缩小为同一生产商制造的较小装置(Discovery 90，Hitachi制造，由Sorvall/heraus投放市场)，该装置配有总容量约470mL的P32CT型转头。将澄清、稳定的病毒收获液加载于20％-60％蔗糖梯度层上，以32,000rpm离心展开区带1小时，流出液分为20mL的组分。合并含有HA峰水平的组分，稀释为0.2M蔗糖浓度，经0.2微米滤膜过滤，然后转移入250mL柔性聚合物袋(Stedim)中，冷冻并维持于-60℃以下用于进一步生产。
简短的几次试验运作后，开始cGMP生产以支持液体FluMist的其它临床试验。再次生产A/北京/262/95(H1N1)和A/悉尼/05/97(H3N2)，乙型毒株更换为B/Yamanashi/166/98。冷冻并运输生产的单价散装液用于混合、充填和包装。当然应该知道在本文中，除非另有专门表述，利用的具体毒株(例如，北京等)不一定理解为是限制性的。因此，例如，本文的方法和制剂在各流感季节时可任选利用不同毒株来产生不同的RTS组合物等。
开发和临床试验
开发了液体组合物的(生产)方法，包括单价散装液批CAZOO1-024和CAZ035-043。临床试验的材料(CTM)包括单价散装液批CAZ025-CAZ034。
为CTM-I开发和使用的液体FluMist生产方法分为以下6个不连续的加工阶段。与采用独立的生产指令文件所进行的一样，加工阶段1-5规定为符合主要加工步骤。步骤6包括完全混合及充填过程。应知道这些阶段在总体上可粗略地相当于下文概述的疫苗组合物生产的通用步骤。
阶段
阶段1：SPF蛋的接受和消毒处理；阶段2：病毒收获物的生产；阶段3：区带离心浓缩；阶段4：峰组分的合并和稀释；阶段5：除菌过滤和单价散装液储存；和阶段6：混合及充填。
图1显示了CTM-I单价散装液生产的流程图。图2显示了混合及充填加工流程。
SPF蛋的接受和消毒
无特定病原体(SPF)的胚蛋购自SPAFAS，Inc.，该公司采用指定的禽群管理和监督程序以恰当确保提供无病蛋。蛋在美国产下，用Clorwash和Quat 800喷雾剂消毒。然后通过航空和公路，利用足以维持清洁度并能避免冷冻或过热的包装来运输这些蛋。收到后，检查冷的受精蛋，在14℃+/-2℃，60-80％相对湿度(RH)下在SPF培育箱中最多储存7天。将蛋从买方提供的纸板盒中转移至托盘，给予批号。将蛋置于可装36只蛋的Jamesway托盘上，利用自动蛋消毒系统以Chlorwash和Quat 800消毒蛋壳表面从而尽可能降低生物负载，然后将它们放入培养箱中。在43-44℃和48-49℃的范围制备Chlorwash，在48-49℃的范围制备Quat 800。消毒后，将蛋放在推车上，在室温下空气干燥不少于2小时。然后将蛋放入培养箱中，在37.5℃+/-1℃，60-80％RH下孵育264小时+/-12小时。孵育后，将SPF蛋从SPF蛋室转移至透光检验区。用光纤灯确定每个蛋中气囊的位置。弃去死蛋和未受精的蛋，给受精蛋作标记用于接种。
制备病毒收获物
先用70％工业用甲醇变性酒精(IMS)对受精蛋进行表面消毒，再接种，然后转移用于大量接种。在制备稀释的生产商工作病毒种子(MWVS)中，采用经典重配方法制备用于生产临床I期试验用的MWVS的主病毒种子。将MWVS转移入AVU，在微生物安全橱中用无菌0.01M磷酸缓冲盐水(pH 7.7)配制融化的MWVS的连续稀释液，每次移液使用无菌的一次性移液管。在10,000级房间中用半自动Bibby接种器在层流条件下进行接种，该接种器刺穿并接种36枚蛋/托盘。接种物的目标滴度是每log102.1TCID50/0.1mL，从MWVS的预测滴度计算稀释度。从冷冻机中取出病毒后两小时内完成各病毒接种物的制备。将该接种物的等份试样在5+/-3℃储存待用。接种物应在制备后8小时内使用。
SPF蛋的接种
将各托盘的蛋手工放入Bibby自动接种器中。利用冲头刺破蛋壳，刺入蛋中预定深度。接种针伸入蛋中，给药泵将0.1mL MWVS接种物递送入每枚蛋中，然后取出冲头。接种后，操作人员拿走蛋托盘，用一托盘新的蛋重复该过程。CAP/接种的蛋在33+/-1℃孵育时间通过病毒毒株生长曲线确定。孵育后，将SPF胚蛋在28℃冷藏18+/-6小时。冷藏结束后，将蛋移出用于收集步骤。
区带离心浓缩病毒
病毒收获物(VH)
利用自动收集器(Bibby)收集蛋。将托盘手工放入去顶站(decapitationstation)，除去蛋壳上部从而形成收集针可进入的进入孔。目测观察这些蛋，然后收集并弃去不合适的蛋(例如，变色的)。将可接受的蛋放于收集站(harveststation)，利用针头和真空系统抽吸取出尿囊液。收集收获物，混合后装入100L有夹套的不锈钢容器，夹套温度为2-8℃。从VH合并物中采集病毒收获物的样品并检测：效力(TCID50)、安全性、禽类白血病(病毒)、结核分枝杆菌、支原体、外来病毒、均一性、逆转录酶试验、病毒基因型、病毒表型和减毒(情况)。
稳定和澄清
在2-8℃将合并的病毒收获物(VH)立即用终浓度为0.2M蔗糖、0.01M磷酸、0.005M谷氨酸(SPG)配成10×SPG(9份VH对1份1O×SPG)而稳定。采集样品进行效力和生物负载(检测)，然后澄清。稳定的病毒收获物经5μm深过滤澄清除去颗粒，然后用高速连续流式离心纯化。澄清的病毒收获物取样(检测)效力。
区带离心、收集和峰组分的HA试验
使用前，用浓缩甲醛溶液的1∶20稀释液消毒离心机转头。将澄清的VH加样于蔗糖梯度(磷酸缓冲液配制的10-60％蔗糖，pH 7.2)层中，利用Hitachi区带离心机进行连续高速离心。向离心机中加入磷酸缓冲液配制的60％蔗糖溶液，再加入10％蔗糖溶液形成梯度。离心机速度设置为4,000rpm，20分钟以使蔗糖溶液形成密度梯度。梯度形成期间离心机温度设置为2-8℃。梯度形成后，启动缓冲液流，转头速度提高至40,000rpm，然后将澄清的VH在40,000rpm时以20L/小时的速度加样于梯度液上。对于收获了10,000个蛋和6mL/蛋的典型CTM-I批，加样步骤持续时间是约3小时。澄清的VH加样后，以40,000rpm继续离心1小时以使病毒形成条带。病毒颗粒迁移至38-45％蔗糖梯度部分，浓缩为一条“带”。此步骤结束时，离心机逐渐减速，然后停止以收集病毒峰。在层流下将100mL诸组分收集于125mL灭菌聚碳酸酯瓶中。诸组分维持于2-8℃约1小时，同时检测组分的HA活性。峰组分通常发现介于38-45％蔗糖梯度间。
峰组分的合并和稀释
在层流罩下将诸组分无菌倒入5L灭菌玻璃瓶中以合并经HA试验鉴定的离心后峰组分，涡流混合。读取折射指数(RI)以测定蔗糖浓度，合并物取样以(检测)效力。加入适当体积的灭菌冷(2-8℃)磷酸-谷氨酸缓冲液，pH 7.2(PBG缓冲液配制)至终浓度为0.2M蔗糖、0.1M磷酸和0.005M谷氨酸以稀释离心后峰组分合并物(CP)。这通常是1∶6稀释液。稀释的离心后峰组分合并物(DCP)取样(检测)效力和生物负载。
除菌过滤和单价散装液储存
将DCP经灭菌管道泵入用于除菌过滤的100级填充室。在层流空气罩(Laminair Air Flow hood)下用0.22μm滤膜将DCP除菌过滤入灭菌的5L玻璃瓶中。混合过滤的单价散装液，取样用于效力、均一性和无菌性检验。过滤前后检查0.22μm滤膜的完整性。然后将MB等份加入灭菌的1L聚碳酸酯瓶中。以500mL等份收集MB，总体积为3-4升。灭菌的1升PC瓶在-60℃或更低储存。通过TCID50试验测定散装病毒的滴度。然后在＜-60℃运输单价散装液用于混合和检验。
混合和充填
制备散装三价混合液的混合和充填过程的主要步骤是：融化、制备稀释液、混合、充填和包装。
融化和混合
从冷冻储存物(MB＜-60℃)中取出合适的1瓶单价散装液，转移至融化室。根据散装液感染力滴度和所需的制剂强度计算三份散装液各自的和SPG稀释剂的所需用量。将各瓶MB放入33±3℃水浴中，每5分钟手工搅拌一次。目测监测融化情况以确保所有瓶子均融化，然后拿出水浴，每15分钟拿出所有融化的瓶子。一旦融化，将各瓶MB转移至5±3℃的冰箱中，保存至所有所需瓶子均融化。
灭菌的蔗糖磷酸谷氨酸(SPG)稀释液由BioWhittaker(Walkersville，MD)生产。将混合所需的约三分之一用量SPG稀释液加入灭菌的2-L瓶中，立即制备液体FluMist混合物。瓶子暖至室温，然后加入所需含量的水解猪明胶(粉末)使最终混合物中达到10mg/ml水平。然后使SPG稀释液通过滤膜(洗去任何残留的明胶)从而达到混合物计算的目标体积，在5±3℃储存待用。
将融化的瓶子转移至混合室，将病毒无菌转移至5L玻璃处理容器中。在混合过程以及随后的充填过程中利用冷藏冰袋使该容器维持于5±3℃。加入3种病毒毒株后加入SPG-明胶稀释液，如果需要可用HCl将pH调节至7.2±0.3。利用磁性搅拌棒和搅拌盘连续搅拌混合这3种病毒毒株和稀释液。
充填和包装
调节pH后，将散装三价混合液容器转移至填充室并与INOVA充填机连接。INOVA充填机将预定体积的产物填入一列八个BD HYPAK一次性喷雾器中，然后给喷雾器加塞。按照指导连续进行喷雾器充填和加塞操作及重量核查验证。每次充填循环完成后，将一批新的喷雾器手工置于进料台中，将已充填的喷雾器移至卸货台。充填过程中用冰袋使混合容器维持于5±3℃。
鼻喷雾器充填后，将充填的三价疫苗(喷雾器)放入桶中，立即用推车运至包装区作最后包装和标记。包装和标记好的喷雾器于5±3℃储存。
优化上游操作参数
通过过滤(5μm)澄清收获物
过滤与低速离心：对于冷冻FluMist，采用标准低速离心法澄清后效力损失一般估计是0.2-0.3log10TCID50/mL。两种毒株的估计离心损失是：采用标准条件3400g，20分钟，一种毒株的滴度损失可忽略不计，第二毒株是0.3log(59％步骤产率)。当在前-CTM生产运作中用5微米深过滤作为离心的替代方案时，澄清步骤平均产率估计是41％。当考虑到TCID50试验存在差异时，结论是任一澄清方法提供的结果优于澄清后加入方法。根据操作的难易和可否扩大规模，选择过滤作为澄清方法。
深过滤膜孔径的比较：利用开发批CAZ015-CAZO17加上10批CTM-I(CAZ025-CAZ034)评估了用CTM-I方法的深过滤损失。对于5μm澄清步骤，A/北京、A/悉尼和B/哈尔滨的澄清步骤产率分别是147％、78％和73％。
5μm(Pall Profile II)滤膜与用于批次CAZ035(A/悉尼)、CAZ036(A/北京)和CAZ037(B/哈尔滨)的20μm深过滤膜(Pall Profile Star)作比较。对于20μm澄清步骤，A/北京、A/悉尼和B/哈尔滨的澄清步骤产率分别是65％、35％和209％。这些产率与5μm澄清结果相当，然而对于所有的实施方案不推荐将此方法改变为20μm滤膜，因为当利用较大孔径时红细胞会显著污染澄清的收获物。
优化下游操作参数：
离心规模
利用大规模CP40Y离心机和RP40CT D型连续流式转头进行离心机加样和温度研究；比较了不同批蛋的多少和离心机温度设定值(参见图3)。CAOZ15(B/哈尔滨)、CAZO18(A/悉尼)、CAZ020(A/北京)和CAZ022(A/悉尼)批为1OK个蛋，离心机设定温度为4℃。CAZ 016(B/哈尔滨)、CAZ019(A/悉尼)和CAZ021(A/北京)批为2OK个蛋，离心机设定温度为14℃。所有研究均采用20L/小时的加样流速。稀释的峰组分合并物的回收百分比(步骤产率)以图中澄清收获物滴度为基础。由此可看出，每批1OK个蛋的回收率为40-184％，而每批2OK个蛋的回收率为40-55％。1OK批次大小的平均回收率是113％，2OK个蛋的批次的平均回收率是46％。在该开发工艺的此步骤中，选择每批运作10,000个蛋作为CTM生产的保守性限制。
温度
采用4℃或14℃为超速离心机转头的设定温度进行CAZO15-CAZ022的开发运作。一个例外是也以大于典型(每批20,000个蛋)的规模进行了14℃的开发运作。总体上这些批次的活病毒回收率较低，然而这可能是因为离心机加样而非温度的影响。鉴于4℃的结果较好以及较高温度可能增加微生物的生长速率，选择4℃作为此开发工艺中此时的超速离心机温度设定值。
临床试验1(CTM-I)
制备了多批用于CTM-I的单价病毒，包括单价散装液批次CAZ025-CAZ034。图3和本文给出了CTM-I单价散装液各批加工过程中的QC试验结果。图3和本文给出了每种毒株的平均步骤产率。结果总结于下。
效力：B/哈尔滨和A/北京病毒收获物各批的效力(logi0TCID50mL)等于或大于8.1。A/悉尼的滴度为7.5-8.8，除了CAZ030因收获物中有蛋黄污染而显示滴度非常低(6.0)。A/北京的单价散装液的滴度是9.3或更高，B/哈尔滨的滴度是8.4-9.85，A/悉尼的滴度是7.9-8.6(不包括CAZ030)。CAZ030的滴度低于下文讨论的混合物可接受水平。
工艺产率：各批次的工艺产率见附图，本文将进一步讨论。未对取样损失而校正工艺产率。A/北京的平均总工艺产率是16％(163剂量/蛋)，A/悉尼的平均产率是13％(6剂量/蛋)，B/哈尔滨的平均产率是93％(86剂量/蛋)。参见附图。不稳定的(erratic)产率估计值反映了试验存在差异以及该工艺的实际性能。具体地说，B/哈尔滨因CAZ028批单价散装液滴度的极高估计值而向上歪斜(导致估计的工艺产率为252％和246剂量/蛋)。在该情况中测定到稀释的峰合并物的滴度比离心后峰合并物的高0.95log，虽然因为稀释而估计会降低。同样，经过滤的单价散装液滴度高于预先过滤物质的，这可通过试验存在差异得以解释。其它两批B/哈尔滨(CAZ026和CAZ027)的工艺产率分别是20％和8％，这两批的蛋产率是7剂量/蛋。含有CAZ028批(CBF1004和CBF1007)散装液的三价混合物导致最终产品喷雾剂的B/哈尔滨每剂效力为0.6和0.4log10TCID50。这进一步提示高估了CAZ028单价散装液滴度。
生物负载和内毒素：检验病毒收获物、稳定的收获物和稀释的离心后峰组分的生物负载。生物负载检验结果未能给出通过该工艺后生物负载的清晰图像，对于病毒收获物和稀释的离心后峰组分合并样品的检验结果基本上由“未检测的”(8个读数)；或具有两个中间数值的“＞100cfu/mL”(10个读数)构成。单价散装液的内毒素值为＜5EU/mL-587EU/mL。
蔗糖浓度：离心后峰组分合并物的蔗糖浓度是39-43.5％(CAZ030未包括于此范围中)。单价散装液的平均蔗糖浓度是7.6％。
单价散装液放行试验结果见附图。除CAZ030(未测试)外用于CTM-I的所有批次均通过了散装液放行试验。
SDS-PAGE分析：用Gel Code Blue染色的10％SDS-PAGE进一步特征鉴定了单价散装液。根据计算的甲型流感病毒和乙型流感病毒每个颗粒的蛋白质分子量和拷贝数，预计50-60kDa(Hal蛋白)、56kDa(NP蛋白)和27kDa(M1蛋白)区域的凝胶条带是纯化流感病毒凝胶中主要的条带。也可能存在Ha2蛋白(23-30kD)。
比较了A/北京/262/95CAZ031和33与A/悉尼/05/97CAZ029、30和34的SDS-PAGE凝胶。10％凝胶的分辨率范围通常是200-3IkDa。因为此局限性，应谨慎地对HA1蛋白(23-30kDa)和M蛋白条带(21-27kDa)作出解释。
对于A/北京和A/悉尼各批单价散装液(MB)，A/北京样品在预计的NP蛋白(恰在55kDa标记物之上)区域观察到暗条带，两种毒株均观察到恰在116kDa上有一条带。两种毒株在接近凝胶前端(低于3IkD)含有与M蛋白一致的条带。预计处于66kD标记或恰好在其之上的HA1条带强度较弱，可能是因为糖蛋白分子量的异质性导致更分散的条带模式。此推测的NP1蛋白染色似乎也有所降低。A/悉尼样品观察到更宽的多种条带，这与该单价散装液中鸡蛋蛋白质比例较高一致。
每批和每只蛋的剂量：根据含有1.2E+07TCID50颗粒的0.24mL平均充填体积计算所有三种毒株的剂量。根据以上剂量计算，各批A/北京单价液的每批平均总剂量是1,576,022。B/哈尔滨和A/悉尼每批平均总剂量分别是601,446和50,825剂量，或者A/北京的每批平均总剂量分别是38％和3.2％。这些结果转变为以下单价剂量值/蛋：A/北京为163剂量/蛋；B/哈尔滨样为86剂量/蛋和A/悉尼为6剂量/蛋。根据收获用于制备该批的蛋总数计算剂量/蛋。
蛋产率总结：A/悉尼每个蛋产量的平均收获体积最高，其后是A/北京和B/哈尔滨。B/哈尔滨的每个蛋产量平均为5.6mL/蛋，A/北京是6.5mL/蛋和A/悉尼是6.8mL/蛋。存活蛋的总产率平均为82％。蛋产率以收获的蛋的总数与用于生产的蛋的总数比较为基础。接种前弃去的蛋百分比平均是10％。接种后弃去的百分比平均是5％，除了CAZ028的弃去率是29％外。
纯化产率总结(TCID50)：一些批次的澄清收获物的效力值高于初始物质，导致步骤产率超过100％。步骤产率的估计值受TCID50试验差异的影响，该试验在生产运作时的标准偏差在0.3log10TCID50/mL以上。此外，所有3种毒株的稀释离心后峰组分合并步骤的步骤产率变化很大，所有10批CTM的步骤产率大于100％。这似乎是因为离心后峰组分合并物的滴度存在系统性向下偏移(如下一步骤的产率＞100所提示的那样)，有人认为与这些样品中的蔗糖水平高有关。
CTM-I各批的评价
在本文的各种实施方案和实施例中，优选收获物液没有蛋黄污染，这种污染可能发生在，例如收获器设置不恰当时。
0.2微米过滤步骤：有效批记录指定Pall Kleenpak一次性滤膜，然而不是任何CTM批次均使用该滤膜。CAZ025-030各批使用具有外壳的筒式(cartridge)滤膜(AB 1DFL7PH4-Pall亲水性PVDF Fluorodyne II滤膜)以替代Kleenpak。这些滤膜的构成材料相似(亲水性PVDF膜)，然而Fluorodyne II筒式滤膜的滤膜面积是5100cm2，而Kleenpak Fluorodyne II滤膜的滤膜面积是1500cm2。CAZ031/032/033/034各批使用一次性Pall NovaSip C3DFLP1滤膜组件代替Kleenpak。C3DFLP1滤膜的膜表面积与Kleenpak滤膜相同(1500cm2)。
温度偏移：在CAZ031的第二孵育步骤期间，温度升至34.4℃，13小时，CAZ032的温度降低至31.5℃，4小时。这些批次达到9.0log10TCID50/mL以上的正常收获物滴度，因此不认为(温度)偏移对产品有影响。
总结
根据两次临床试验生产阶段(CTM-I和CTM-2)，液体FluMist工艺的开发和生产工作表明该工艺适合于生产能通过放行条件的临床供给品。CTM运作和各种开发研究的组合数据得到了该工艺中值产率的以下估计值：
澄清：50％产率
超速离心机纯化：50％产率
峰稀释和除菌过滤：20-50％产率
实施例2稳定性检验
制备含有三种不同的重配流感病毒(7.0+/-0.5log10FFU/剂量[约7.0+/-0.5log10TCID50/剂量])和以下物质的三价疫苗制剂：100mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)配制的200mM蔗糖；1％(w/v)猪明胶水解物；1.21％(w/v)单盐酸精氨酸[等于1％(w/v)精氨酸碱]；和5mM谷氨酸单钠。将该制剂在-25.0℃+/-5.0℃储存大于或等于24小时，但小于或等于两周，然后在2-8℃储存不同时期(来检测)其稳定性。测定到该制剂(例如，批次0141500003)在4-8℃至少能稳定12周。具体地说，4-8℃储存时，各病毒毒株的效力维持在初始效力的0.5log 10以内。
其它研究显示不同临床批的等价制剂在5.0℃+/-3.0℃能稳定约12-15个月，所述制剂含有三种不同的重配流感病毒(7.0+/-0.5log10FFU/剂量[约7.0+/-0.5log10TCID50/剂量])和100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)配制的200mM蔗糖；1％(w/v)猪明胶水解物；1.21％(w/v)单盐酸精氨酸[等于1％(w/v)精氨酸碱]；和5mM谷氨酸单钠。
随后的研究显示只含有100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)配制的200mM蔗糖；1％(w/v)明胶水解物；1.21％(w/v)单盐酸精氨酸[等于1％(w/v)精氨酸碱]而没有谷氨酸盐的制剂的稳定性与含有谷氨酸盐的上述制剂相等。
尽管出于清晰和理解的目的描述了上述发明的一些细节，但本领域技术人员阅读本文内容后应明白可对形式和细节作出各种改变而不脱离本发明的真正范围。例如，上述所有技术和装置可以各种组合使用。如同单独每篇出版物、专利、专利申请或其它文件单独表明出于所有目的纳为参考那样，本申请书中引用的所有出版物、专利、专利申请或其它文件出于所有目的全文纳为参考。具体地说，2004年10月6日提交的美国临时申请号60/616,711；2004年2月25日提交的美国专利申请10/788,236；和2003年2月25日提交的美国临时申请号60/450,181全文纳入本文作为参考。

Claims (28)

1.一种制备减毒活流感病毒组合物的方法，所述方法包括：
(a)过滤澄清包含减毒活流感病毒的病毒收获物，从而得到包含减毒活流感病毒的澄清的病毒收获物滤液；
(b)对所述包含减毒活流感病毒的澄清的病毒收获物滤液进行连续区带离心，从而得到包含减毒活流感病毒的进一步澄清的病毒收获物；
(c)对所述包含减毒活流感病毒的进一步澄清的病毒收获物进行稀释和通过无菌过滤进行除菌；和
(d)将已除菌的病毒收获物与稳定剂混合以达到终浓度6-8%蔗糖重量/体积(w/v)，1-2%精氨酸w/v，0.05-0.1%谷氨酸单钠w/v和0.05-2%明胶水解物，从而产生除菌的病毒收获物，
从而得到减毒的活流感病毒组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述减毒流感病毒包括以下一种或多种：减毒的冷适应流感病毒，温度敏感型减毒流感病毒、或减毒的冷适应性温度敏感型流感病毒。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述减毒流感病毒含有一种或多种以下流感病毒的遗传骨架：A/Ann Arbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66。
4.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，通过在步骤(a)的澄清之前加入稳定剂使得所述病毒收获物在2-8℃稳定。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述稳定剂包含蔗糖、磷酸盐和谷氨酸盐(SPG)。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，加入所述稳定剂使得最终浓度为0.2M蔗糖、0.01M磷酸盐和0.005M谷氨酸盐。
7.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，通过一个或多个滤器作深部过滤来澄清所述病毒收获物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在(a)中通过两个或更多个滤器来澄清所述病毒收获物。
9.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，通过5μm滤器进行过滤来澄清所述病毒收获物。
10.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，在蔗糖密度梯度上进行所述连续区带离心。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述蔗糖密度梯度是磷酸盐缓冲液配制的10%-60%蔗糖梯度。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液配制的所述蔗糖梯度为pH7.2。
13.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，在2℃-8℃的温度下进行所述连续区带离心。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在4℃的温度下进行所述连续区带离心。
15.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)所用稀释剂包含磷酸盐和谷氨酸盐。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，向所述进一步澄清的病毒收获物中加入所述稀释剂使得最终浓度为0.2M蔗糖、0.1M磷酸盐和0.005M谷氨酸盐。
17.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，包括在步骤(c)后混合所述除菌病毒收获物与至少一种其它除菌病毒收获物，从而得到混合的病毒收获物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述除菌病毒收获物与两种其它除菌病毒收获物混合，从而得到三价混合病毒收获物。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中先添加稀释剂再除菌。
20.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中通过0.2微米到1.5微米的滤器进行过滤来澄清所述病毒收获物。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中通过0.2微米到0.8微米的滤器进行过滤来澄清所述病毒收获物。
22.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中通过深部滤器作过滤来澄清所述病毒收获物。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中通过0.2微米到0.8微米的滤器作深部过滤来澄清所述病毒收获物。
24.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，包括配制所述除菌病毒收获物，从而得到适合鼻内给药的流感病毒组合物。
25.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其特征在于，包括配制所述除菌病毒收获物，从而得到适合给予人的流感病毒组合物。
26.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法制备的减毒活流感病毒组合物。
27.如权利要求17所述的方法制备的减毒活流感病毒组合物。
28.如权利要求18所述的方法制备的减毒活流感病毒组合物
CN201110270932.4A 2004-10-06 2005-10-04 冷藏温度稳定的流感疫苗组合物 Expired - Fee Related CN102302773B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61671104P 2004-10-06 2004-10-06
US60/616,711 2004-10-06

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800397937A Division CN101060859B (zh) 2004-10-06 2005-10-04 冷藏温度稳定的流感疫苗组合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102302773A CN102302773A (zh) 2012-01-04
CN102302773B true CN102302773B (zh) 2014-05-14

Family

ID=36148654

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800397937A Active CN101060859B (zh) 2004-10-06 2005-10-04 冷藏温度稳定的流感疫苗组合物
CN201110270932.4A Expired - Fee Related CN102302773B (zh) 2004-10-06 2005-10-04 冷藏温度稳定的流感疫苗组合物

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800397937A Active CN101060859B (zh) 2004-10-06 2005-10-04 冷藏温度稳定的流感疫苗组合物

Country Status (9)

Country Link
EP (2) EP1796719B1 (zh)
JP (3) JP5147405B2 (zh)
KR (3) KR101376889B1 (zh)
CN (2) CN101060859B (zh)
AU (1) AU2005294528B2 (zh)
CA (1) CA2583698C (zh)
ES (2) ES2531734T3 (zh)
HK (2) HK1102047A1 (zh)
WO (1) WO2006041819A1 (zh)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2482946C (en) 2002-04-26 2013-09-17 Medimmune Vaccines, Inc. Multi plasmid system for the production of influenza virus
US7465456B2 (en) 2002-04-26 2008-12-16 Medimmune, Llc Multi plasmid system for the production of influenza virus
EP2481819A1 (en) 2003-02-25 2012-08-01 MedImmune Vaccines, Inc. Cross flow filtration in the production of stabilized influenza vaccine compositions
US20060110406A1 (en) 2003-02-25 2006-05-25 Medimmune Vaccines, Inc. Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions
WO2005062820A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Medimmune Vaccines, Inc Multi plasmid system for the production of influenza virus
KR101376889B1 (ko) * 2004-10-06 2014-03-25 메디뮨 엘엘씨 냉장 온도 안정성 인플루엔자 백신 조성물
GB0614460D0 (en) * 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
JP5260525B2 (ja) 2006-09-15 2013-08-14 メディミューン，エルエルシー 高力価までウイルス増殖を支持するｍｄｃｋ細胞株と、それを用いたバイオリアクタープロセス
AU2008225501B2 (en) * 2007-03-09 2013-08-29 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Lyophilized preparation comprising influenza vaccine, and method for preparation thereof
US8673613B2 (en) 2007-06-18 2014-03-18 Medimmune, Llc Influenza B viruses having alterations in the hemaglutinin polypeptide
CA2738024A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Medimmune, Llc Methods for purification of viruses
GB0822672D0 (en) 2008-12-12 2009-01-21 Univ Warwick Anti-viral protection with viruses containing a defective genome
AU2009333208A1 (en) 2008-12-16 2010-07-08 Baxter Healthcare Sa Production of influenza vaccines
CN102191226A (zh) * 2010-03-08 2011-09-21 北京清大天一科技有限公司 细胞培养混合物的分离纯化方法
TW201233802A (en) * 2010-12-02 2012-08-16 Oncolytics Biotech Inc Liquid viral formulations
JP6200949B2 (ja) * 2012-05-31 2017-09-20 エイジェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 固相ウレイドに対する生物学的標的物の選択的結合
US9314519B2 (en) * 2012-08-21 2016-04-19 Intervet Inc. Liquid stable virus vaccines
CN104984357B (zh) * 2015-06-02 2018-01-30 长春百克生物科技股份公司 不含明胶的疫苗保护剂组合物及流感减毒活疫苗
WO2020165912A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 Serum Institute Of India Pvt Ltd. Live attenuated influenza vaccine composition and process for preparation thereof
CA3174826A1 (en) 2021-01-19 2022-07-28 Katsuro HAGIWARA Virus stabilizer, gelatin hydrolysate for virus stabilizer, and virus-containing composition

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1533434A (zh) * 2001-05-30 2004-09-29 ʷ��˿�������ȳ�ķҩƷ���Ϲ�˾���� 流感疫苗组合物

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4512972A (en) * 1980-06-30 1985-04-23 Kureha Chemical Industry Co., Ltd. Nasal preparation and processes for their production
FR2505657A1 (fr) * 1981-05-13 1982-11-19 Pasteur Institut Perfectionnements apportes aux agents de stabilisation de virus vivants pour la preparation de vaccins, et vaccins stabilises contenant lesdits agents de stabilisation
AU2088992A (en) * 1992-05-05 1993-11-11 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University, The Stabilized live vaccine
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6146873A (en) 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
KR960037065A (ko) * 1995-04-24 1996-11-19 허영섭 약독화 수두 생바이러스 백신의 안정제
US6244354B1 (en) 1995-09-15 2001-06-12 Harmelerwaard Patents B.V. Device and process for cutting grass sods with a constant thickness from grass land
CA2235257A1 (en) * 1995-10-20 1997-04-24 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusale M Influenza vaccine
DE19612966B4 (de) 1996-04-01 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren
KR20020013466A (ko) * 1998-09-01 2002-02-20 로버트 오 웹스터 온도-민감 및 한랭-적응 인간 파라인플루엔자 바이러스 제2 형 (ｈｐｉｖ-2) 및 상기 바이러스 기재의 백신
ATE378066T1 (de) 1998-09-30 2007-11-15 Wyeth Corp Mutiertes cholera holotoxin als hilfsmittel
WO2000035481A2 (en) * 1998-12-17 2000-06-22 Connaught Laboratories Limited Multivalent immunogenic composition containing rsv subunit composition and influenza virus preparation
JP2003513988A (ja) * 1999-11-12 2003-04-15 ファイブローゲン、インコーポレーテッド ワクチンに含まれる組換えゼラチン
HU229101B1 (en) 2000-04-28 2013-07-29 St Jude Childrens Res Hospital Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus
PT1361890E (pt) * 2001-02-23 2011-06-07 Glaxosmithkline Biolog Sa Formulações vacinais de influenza para distribuição intradérmica
KR20050011741A (ko) * 2002-04-11 2005-01-29 메드이뮨 백신즈 인코포레이티드 분무 건조에 의한 생물학적 활성 물질의 보존
WO2003087327A2 (en) * 2002-04-11 2003-10-23 Medimmune Vaccines, Inc. Preservation of bioactive materials by freeze dried foam
JP4680601B2 (ja) * 2002-12-17 2011-05-11 メディミューン・エルエルシー 生物活性材料の高圧噴霧乾燥
EP2481819A1 (en) * 2003-02-25 2012-08-01 MedImmune Vaccines, Inc. Cross flow filtration in the production of stabilized influenza vaccine compositions
EP2581093B1 (en) 2003-06-16 2015-03-18 MedImmune, LLC Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
WO2005062820A2 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Medimmune Vaccines, Inc Multi plasmid system for the production of influenza virus
KR101376889B1 (ko) * 2004-10-06 2014-03-25 메디뮨 엘엘씨 냉장 온도 안정성 인플루엔자 백신 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1533434A (zh) * 2001-05-30 2004-09-29 ʷ��˿�������ȳ�ķҩƷ���Ϲ�˾���� 流感疫苗组合物

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070083964A (ko) 2007-08-24
CN102302773A (zh) 2012-01-04
JP2013035861A (ja) 2013-02-21
KR101346989B1 (ko) 2014-02-06
JP5632435B2 (ja) 2014-11-26
CN101060859B (zh) 2011-11-09
CA2583698C (en) 2014-12-02
EP1796719A4 (en) 2010-06-09
CA2583698A1 (en) 2006-04-20
EP2769735A1 (en) 2014-08-27
HK1102047A1 (zh) 2007-11-02
EP2769735B1 (en) 2017-04-19
ES2531734T3 (es) 2015-03-18
HK1201720A1 (zh) 2015-09-11
WO2006041819A1 (en) 2006-04-20
JP2008515894A (ja) 2008-05-15
KR20120123729A (ko) 2012-11-09
EP1796719B1 (en) 2014-12-03
CN101060859A (zh) 2007-10-24
KR101230187B1 (ko) 2013-02-07
KR101376889B1 (ko) 2014-03-25
ES2633471T3 (es) 2017-09-21
JP5818940B2 (ja) 2015-11-18
KR20130048280A (ko) 2013-05-09
AU2005294528A1 (en) 2006-04-20
EP1796719A1 (en) 2007-06-20
JP2014193877A (ja) 2014-10-09
AU2005294528B2 (en) 2011-04-07
JP5147405B2 (ja) 2013-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102302773B (zh) 冷藏温度稳定的流感疫苗组合物
AU2004263813B8 (en) Methods of producing influenza vaccine compositions
CN102216450B (zh) 培养细胞、增殖和纯化病毒的方法
US8247207B2 (en) Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions
US8012737B2 (en) Methods of producing influenza vaccine compositions
AU2013203203B2 (en) Refrigerator-temperature stable influenza vaccine compositions
AU2014210661A1 (en) Methods of producing influenza vaccine compositions

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140514

Termination date: 20161004

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee