KR101364622B1 - 메타리지움 속 곰팡이의 대량 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 메타리지움(Metarhizium) 속 곰팡이 및 이의 대량 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 균주를 경제적으로 산업적으로 대량 생산하기 위한 최적의 배지 조성, 및 산업적 활용을 위한 메타리지움 속 곰팡이의 산업적 포자 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 메타리지움 속 곰팡이의 대량 생산 배지 조성, 배양 방법 및 포자 생산 방법은 다양한 해충의 방제를 위한 산업화에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

메타리지움 속 곰팡이의 대량 생산 방법{Mass production method of Metarhizium anisopliae HY-2}
본 발명은 메타리지움(Metarhizium) 속 균주의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 균주를 해충 방제용 활용을 위해 산업적으로 대량 생산하기 위한 배지 조성, 상기 배지 조성을 이용한 배양 방법, 및 상기 배양 방법을 이용한 메타리지움 속 곰팡이의 산업적 포자 생산 방법에 관한 것이다.
21세기 국내외 농산업은 이상 기후에 따른 식량의 안정적 확보 및 웰빙 요구와 더불어 식품의 안전성이 무엇보다도 강조되고 있으므로 지난 어느 때보다도 양적, 질적인 성장 속도가 빠를 것으로 전망되고 있다. 특히 안전한 식품 문제는 생산되는 작물의 1차적인 안전성과 연계되어 있으므로 정부에서는 친환경농업육성 계획을 수립 추진 중에 있으며, 친환경농산물의 생산 비중을 확대하고 화학농약 및 비료 사용량을 현재 수준에서 계속적으로 절감하고자 추진 중이다.
인간·환경 독성문제 해결과 친환경 농업을 위한 방안으로 유기합성 화학농약을 대체할 수 있는 생물농약(Biopesticides)의 개발이 가장 유력한 대안으로 제시되고 있다. 미국의 경우 생물농약연구를 청정화학(Green Chemistry) 분야로 인식하여 폭넓은 연구개발이 진행되고 있다.
현재 전 세계적으로 등록된 생물농약이 370여 종으로 알려져 있는데, 이 중에서 살충제가 270여 종으로 전체의 약 75%를 차지하고 있으며, 생물농약의 개발은 비교적 소규모 회사들을 중심으로 이루어지고 있다는 점과 대부분 미생물에 근간한 미생물 농약 개발이 주요 특징이라 할 수 있다. 미생물 농약으로 등록되어 이용되는 미생물의 종류를 살펴보면 곰팡이와 세균이 가장 많고 그 다음으로 해충방제용으로 이용되는 바이러스이다.
해충 방제를 위해서 우리나라에서는 골프장 잔디 및 인삼밭을 가해하는 풍뎅이 유충뿐만 아니라, 온실가루이, 배추좀나방, 거세미나방 및 벼멸구 등의 방제에 많은 노력을 하고 있으나, 방제를 위해서는 많은 비용이 들고 화학살충제로 인한 환경오염의 문제 등으로 인해서 어려운 점을 겪고 있다. 이에 종래에 사용되고 있는 화학살충제에 의한 토양 및 수질오염, 인체에 대한 독성 및 환경호르몬 피해, 저항성 해충 출현, 유용천적의 감소 등으로 인한 피해를 최소화하기 위한 환경친화적 해충방제의 필요성이 증가되고 있다.
이러한 해충의 친환경적인 방제를 위하여 몇 년 전부터 천적을 방사하는 방법이 이용하고 있으나 현재 많은 농가들은 국내에서 판매되고 있는 BT제와 천연물제제를 주로 사용하고 있다. 그러나 이들 제제의 경우 원료를 중국 등에서 수입하여 사용하는 것이 대부분이지만 저항성 발현이 빨리 일어나 개발 제품의 라이프 사이클(Life Cycle)이 짧은 큰 단점을 지니고 있다.
따라서 기존의 개발된 BT제, 천연물제로 방제가 불가능한 흡즙 해충 및 토양해충 방제제의 개발을 위하여 우수한 방제효과가 있는 새로운 유효미생물의 발굴이 절실히 요청되고 있다. 그 중에서도 특히 곤충병원성 곰팡이는 방제효과가 좋아 외국에서 이미 제품으로 개발되어 사용되고 있다. 곤충병원성 곰팡이 제품들의 주원료는 백강균(Beauveria bassiana) 또는 녹강균(Metarhizium anisopliae)이 차지하고 있다. 그러나 이 제품들은 곰팡이 포자를 이용한 생균제 제품으로서 제품의 대량 생산적인 측면과 적용상의 문제점 때문에 시장 확대가 부진한 것으로 평가되고 있는 실정이다.
곤충병원성 곰팡이를 이용한 해충방제는 환경친화적인 방제수단으로, 표적 해충에만 선택적으로 작용하며, 해충의 저항성 출현을 억제하고, 지속적인 방제가 가능하며, 환경, 인축 및 식물에는 전혀 해가 없으면서 잔류독성이 없는 양질의 농산물 생산을 가능하게 하는 등 여러 가지 장점을 가지고 있으므로 미국을 비롯한 여러 농업 선진국에서는 범국가적인 차원에서 자국 환경에 적합한 곤충병원성 곰팡이를 분리, 대량생산 및 제제화하여 실용화하고 있는 실정이다.
국내의 경우에서도 현재까지의 연구개발은 곤충병원성 곰팡이 생균제 자체 개발에만 국한되어 있어 실제로 산업적인 성과를 확보하기가 어려웠다. 그로 인하여 실제 개발 제품의 경제성과 현장에서의 우수한 효과 확보가 어려웠고, 이러한 문제점들이 시장 확대 부진에 중요한 원인으로 작용하고 있다.
전 세계 생물농약 시장은 계속 증가세를 보이고 있으며, 2005년도의 경우 전체 농약시장의 2.5% 시장을 형성하고 있다. 현재 친환경 농산물의 급속한 수요확대를 기반으로 전체 농약시장의 4.3%까지 확대될 것으로 예측되고 있다. 2006년 1월의 생물 농약 시장(The New Biopesticide Market)의 보고에 의하면 생물농약은 연성장 9.9% 성장률을 보이는 것에 비해 화학농약은 1.1%의 감소세를 보일 것으로 예측하고 있다. 화학농약을 대체할 정도의 우수한 생물농약이 개발되면 시장은 더욱 확대될 것으로 예상된다.
국내의 경우, 생물농약 시장은 화학농약에 비하여 크지 않으나 친환경 농업의 확대로 시장은 확대될 것으로 예측되며, 특히 정부의 화학농약 사용량 40% 감소 정책과 화학농약을 대체할 수 있는 새로운 우수 생물농약이 개발되면 시장은 더욱 확대될 것으로 생각된다.
지난 2000년 이후 정부의 1차 친환경농업 육성정책에 의거한 다양한 지원책을 펼치고 있음에도 불구하고 국내 화학농약의 사용량은 전혀 감소되지 않았으며, 친환경 생물농약 시장 또한 3% 미만의 낮은 시장성을 보이고 있다. 이것의 주된 원인으로는 연구 개발의 부재와 그나마 개발된 기술의 제품화를 위한 방향성 부재(전략)와 시장성 높은 제품 개발 기술의 미흡을 들 수 있다.
국내의 미생물농약과 생화학농약을 포함한 생물농약에 대한 연구는 1970년대 후반부터 대학교 및 정부 연구기관에서 산발적으로 시작되었으나 1990년대에 들어서부터 연구개발이 어느 정도 활성화되기 시작하였으며 1997년 친환경농업육성법이 제정되고 정부의 화학농약 사용량 감소를 위한 친환경농업에 대한 지원이 추진되면서 생물농약 및 미생물제제 개발이 본격적으로 진행되고 있는 실정이다.
생물농약 및 미생물 제제의 연구개발의 경우 초기 연구개발은 실내 실험 위주로 우수한 미생물 또는 신규 미생물 유래 활성물질의 확보에 중점을 두었으나, 최근 벤처기업을 중심으로 제품화에 필요한 대량생산 및 제형화 기술 등이 축적되고 있다.
또한, 국내 미생물 살충제의 연구 개발 역사는 매우 길지만, 가격 및 활성의 문제로 시장 진입이 매우 제한적인 실정이다. 사회적 요구로 안전한 먹거리의 생산 및 환경에 대한 고려가 증대되었고 기술의 진전으로 상당한 생물농약이 살충제로 사용되고 있지만 아직 화학농약에 대한 실질적인 의존률이 높은 실정이다.
그러나 개발전략 및 노하우에 대한 부재로 아직도 초기 단계의 기술계발에만 머무르고 있으며, 이로 인하여 산업화와 밀접하게 관련된 대량생산 및 제형화 기술은 산업적 제품을 만들기에는 여전히 부족한 실정이다.
기존에 본 발명자들은 산업적 미생물 살충제 개발을 위하여 노력의 결과, 시장 요구도가 높은 난방제 해충을 효과적으로 방제할 수 있는 신규 메타리지움 속 균주를 분리 및 동정하였다(미국 등록특허 7,416,880; 대한민국 등록특허 10-0457258; 균주 수탁번호 KCTC 0156BP).
이에, 본 발명자들은 상기 발명한 메타리지움 속 균주를 경제적으로 산업적으로 대량 생산하기 위하여, 균주의 대량 생산을 위한 최적의 배지 조성, 배양 환경, 및 산업적 활용을 위한 메타리지움 속 곰팡이의 산업적 포자 생산 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 메타리지움(Metarhizium) 속 균주를 해충 방제용으로 활용을 위한 산업적 대량 생산을 위해 확립된 메타리지움 속 균주의 최적의 배지 조성, 이렇게 확립한 배지를 이용한 메타리지움 속 균주의 배양 방법, 및 이러한 배양 방법을 이용한 메타리지움 속 곰팡이의 포자 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 메타리지움(Metarhizium) 속 곰팡이를 전배양하는 단계;
2) 전배양된 메타리지움 속 곰팡이를 1차 배양으로 액상 배양하는 단계; 및
3) 액상 배양된 메타리지움 속 곰팡이를 2차 배양으로 고체 배양하는 단계를 포함하는, 메타리지움 속 곰팡이의 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 메타리지움 속 곰팡이를 전배양하는 단계;
2) 전배양된 메타리지움 속 곰팡이를 1차 배양으로 액상 배양하는 단계;
3) 액상 배양된 메타리지움 속 곰팡이를 2차 배양으로 고체 배양하는 단계; 및
4) 고체 배양된 배양액으로부터 포자를 분리하는 단계를 포함하는, 메타리지움 속 곰팡이의 포자 생산 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 질소원으로서 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v)의 번데기, 및 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v)의 쌀 또는 밀기울을 포함하는, 메타리지움 속 곰팡이의 배양 배지를 제공한다.
본 발명은 메타리지움(Metarhizium) 속 곰팡이의 대량 생산을 위한 최적의 배지 조성을 확립하고, 이를 이용하여 토양 해충을 방제할 수 있는 메타리지움 속 곰팡이를 대량 생산할 수 있음을 확인함으로써, 상업적으로 중요한 여러 농경 작물에 해를 입히는 다양한 토양 해충의 방제를 위한 산업화에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 SDY 액체 배지에서 형성된 메타리지움 아니소필에 HY-2의 균사체(A) 및 메타리지움 아니소필에 HY-2의 균사체의 전자현미경 사진(B)을 나타낸 결과이다.
도 2는 SDAY 배지(A)와 0.5%(w/v) 번데기가 함유된 SDAY 배지(B)에서의 메타리지움 아니소필에 HY-2의 포자 생산을 보여주는 사진이다.
도 3은 0~1.0%(w/v) 농도의 번데기가 함유된 SDAY 배지에서의 메타리지움 아니소필에 HY-2의 포자 생산량을 보여주는 그래프이다.
도 4는 SDAY 배지에 0.1, 0.3, 0.5 그리고 0.6%(w/v)의 번데기 첨가 후 생산된 포자를 보여주는 사진이다.
도 5는 포자 형성한 메타리지움 아니소필에 HY-2의 포자 회수를 용이하기 위해 SDAY 에 0.5%(w/v) 번데기 함유 배지(A)와 SDAY 에 0.5%(w/v) 번데기와 0.5%(w/v) 밀기울 함유 배지(B)를 스크래퍼로 회수하는 것을 보여주는 사진이다.
도 6은 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 32℃ 72시간 배양 후, 전자현미경으로 40배 배율에서 발아 정도를 확인한 사진이다.
도 7은 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 다양한 온도(24℃, 28℃, 32℃ 및 36℃)에 대한 시간별(24h, 48h, 72h, 96h, 120h 및 144h) 발아율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 8은 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 다양한 온도(24℃, 28℃, 32℃ 및 36℃)에서 168시간까지의 시간당 성장률(μm/h)을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 메타리지움(Metarhizium) 속 곰팡이를 대량생산하기 위한 배지를 제공한다.
상기 메타리지움(Metarhizium) 속 곰팡이는 수탁번호 KCTC 0156BP로 기탁된 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 배지는 기본 배지로서 SDA(Sabouraud Dextrose Agar, Difco, Sparks, MD 21152, USA) 또는 SDA 배지에 1 %(w/v)의 효모 추출물(yeast extract)이 추가된 SDAY 배지인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 곰팡이 배양을 위한 배지는 모두 사용가능하다.
본 발명에 따른 배지는 탄소원, 질소원 또는 무기질을 물에 혼합하여 제조되는 것이 바람직하며, 고압 멸균하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 탄소원으로는 포도당, 옥수수녹말, 사카로스, 당밀, 밀기울, 쌀겨 등을 이용하는 것이 바람직하고, 밀기울 또는 쌀겨를 이용하는 것이 더욱 바람직하며, 밀기울을 이용하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 질소원으로는 번데기, 효모추출물, 콩가루, 옥수수침지, 말트 추출물, 펩톤 등을 이용하는 것이 바람직하며, 번데기를 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 무기질로는 포타슘 클로라이드(KCl), 마그네슘 설포네이트(MgSO4), 페로익 설페이트(FeSO4), 소듐 니트레이트(NaNO3), 또는 인산 이칼륨(K2HPO4) 등을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 배지는 질소원으로서 배지 전체 조성의 0.1 내지 1.0%(w/v)의 번데기를 포함하는 것이 바람직하고, 배지 전체 조성의 0.5 내지 0.6%(w/v)의 번데기를 포함하는 것이 더욱 바람직하며, 배지 전체 조성의 0.5%(w/v)의 번데기를 포함하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 배지는 탄소원으로서 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v)의 밀기울을 포함하는 것이 바람직하고, 배지 전체 조성의 0.5%(w/v)의 밀기울을 포함하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시예에서는 대량 생산을 위한 배양 미생물로서 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 균주를 사용하였으며, 상기 미생물은 기존의 본 발명자들이 곤충병원성 미생물에 감염되어 죽은 곤충 및 해충이 서식하는 토양 시료로부터 해충에 대한 살충효과를 가지는 미생물을 분리하한 후 동정하여 메타리지움(Metarhizium)속 임을 확인하여, 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 균주로 명명하고 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁한 미생물이다(수탁번호 KCTC 0156BP).
본 발명의 한가지 실시예에서는 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 균체 생성의 산업적 배양 조건의 최적화하기 위해, 기존 SDAY 배지 조건에서 질소원으로 0.5%(w/v) 농도의 번데기를 갈아 넣은 배지를 이용하여 상기 균주를 배양한 후 생산된 포자 농도를 측정하였다. 그 결과, 동일한 배양 조건에서 0.5%(w/v)의 번데기를 첨가한 것이 약 2.23배의 포자 생성을 증가시키는 것을 확인하였다(표 1 및 도 1 참조).
본 발명의 한가지 실시예에서는 배지 내 최적의 번데기 분말 함유량을 확인하기 위하여, 고체 배양시 0.1 ~ 1.0%(w/v)의 다른 비율로 제조된 번데기 분말을 넣은 고체 배지를 조성하여 생성된 분생포자의 생산량을 측정하였다. 그 결과, 0.5%(w/v)까지 포자 생산 수율이 높아지는 것을 확인하였고, 0.5%(w/v) 이상부터는 생산 수율의 증가가 미약함을 확인하여 산업적으로 대량 배양하기 위한 배지 조건에서 0.5%(w/v)가 최적의 번데기 분말 투입량이 될 수 있음을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).
본 발명의 한가지 실시예에서는 배지 내 최적의 양적 비율을 확인하기 위하여 기질의 용량을 달리하여 배양하였고, 그 결과 기질의 양에 비례하여 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 포자 수득량도 증가하였으며, 이를 통해 배지량 30ml이 최적의 기질 양임을 확인하였다(표 2 참조).
본 발명의 한가지 실시예에서는 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 산업적 대량 회수를 위한 배지 조성을 확립하기 위하여, SDAY 배지에 0.5%(w/v) 번데기와 0.5%(w/v) 농도의 밀기울을 함께 함유한 배지에서 포자 농도 및 생균수를 각각 측정하였다. 그 결과, SDAY 배지에 0.5%(w/v) 번데기와 0.5%(w/v) 밀기울을 첨가하여 배양하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비해 포자 농도 및 생균수를 증가시키는 것을 확인하였다(도 5 및 표 3 참조).
본 발명의 한가지 실시예에서는 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 최적 배양 온도 및 시간을 확인하기 위하여, 메타리지움 아니소필에 HY-2 포자를 SDAY 배지에 0.5%(w/v) 번데기와 0.5%(w/v) 농도의 밀기울을 함께 함유한 배지에서 다양한 온도 및 시간으로 배양한 후 발아율을 측정하였다. 그 결과, 36℃를 제외한 나머지 온도(24℃, 28℃ 및 32℃)에서 144시간에 90%(w/v) 이상의 발아가 형성됨을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조).
특히, 168시간을 기점으로 시간당 성장률이 32℃에 비해 28℃에서 54.2 ㎛m/h로 높게 나타났으며(도 8 참조), 이를 통해 배양에 최적 온도는 28℃임을 확인하였다.
결론적으로, 기본 배지로서 SDAY배지에 0.5%(w/v) 농도의 번데기 및 밀기울을 첨가한 배지 조성이 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 포자 농도 및 생균수를 증가시키고, 포자 회수율을 높이는 것을 확인함으로써, 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 대량생산을 위한 배지로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 메타리지움(Metarhizium) 속 곰팡이의 대량 생산을 위한 배양 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 배양 방법은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 메타리지움(Metarhizium) 속 곰팡이를 전배양하는 단계;
2) 전배양된 메타리지움 속 곰팡이를 1차 배양으로 액상 배양하는 단계; 및
3) 액상 배양된 메타리지움 속 곰팡이를 2차 배양으로 고체 배양하는 단계.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 1)의 메타리지움 속 곰팡이는 수탁번호 KCTC 0156BP로 기탁된 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 메타리지움 속 곰팡이는 모두 사용 가능하다.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 1) 내지 단계 3)의 배양은 탄소원 또는 질소원을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 상기 질소원으로는 번데기, 효모추출물, 콩가루, 옥수수침지, 말트 추출물, 펩톤 등을 이용하는 것이 바람직하며, 번데기를 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 상기 탄소원으로는 포도당, 옥수수녹말, 사카로스, 당밀, 밀기울, 쌀겨 등을 이용하는 것이 바람직하며, 밀기울을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 상기 번데기는 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v) 첨가되는 것이 바람직하고, 0.5%(w/v) 첨가되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 상기 밀기울은 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v) 첨가되는 것이 바람직하고, 0.5%(w/v) 첨가되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 1) 내지 단계 3)의 배양은 24℃ 내지 32℃에서 배양되는 것이 바람직하고, 28℃ 내지 32℃에서 배양되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 1)또는 단계 2)의 배양은 7 내지 10일 동안 배양되는 것이 바람직하고, 7 내지 8일 동안 배양되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 단계 3)의 배양은 15 내지 25일 동안 배양되는 것이 바람직하고, 20일 동안 배양되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 1) 내지 단계 3)의 배양은 SDA(sabouraud dextrose agar) 배지 또는 SDAY(sabouraud dextrose agar + yeast extract) 배지를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한가지 실시예에서는 메타리지움 아니소필에 HY-2의 최적 생장 온도를 확인하기 위해 온도별 발아율을 측정하였다. 그 결과, 발아율은 36℃를 제외한 나머지 온도(24℃, 28℃ 및 32℃)에서 높게 나타났고, 발아률은 32℃, 28℃, 24℃ 순으로 높게 나타내었다(도 6 및 도 7 참조).
본 발명의 한가지 실시예에서는 메타리지움 아니소필에 HY-2의 온도에 대한 균사의 시간당 성장률(Growth rate in diameter; μm/h)을 측정하였다. 그 결과, 시간당 성장률은 28℃에서 가장 높게 나타났다(도 8 참조).
따라서, 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 최적의 배양온도는 24℃ ~ 32℃인 것이 바람직하고, 온도별 발아율과 시간당 성장률을 고려해 볼 경우 28℃가 이상적인 배양 온도이며, 배양온도가 36℃ 이상이 되면 포자 형성이 어려워지는 것을 알 수 있다.
아울러, 본 발명은 메타리지움(Metarhizium) 속 곰팡이의 포자의 대량 생산 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 포자 생산 방법은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 메타리지움(Metarhizium) 속 곰팡이를 전배양하는 단계;
2) 전배양된 메타리지움 속 곰팡이를 1차 배양으로 액상 배양하는 단계;
3) 액상 배양된 메타리지움 속 곰팡이를 2차 배양으로 고체 배양하는 단계; 및
4) 고체 배양된 배양액으로부터 포자를 분리하는 단계.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 1)의 메타리지움 속 곰팡이는 수탁번호 KCTC 0156BP로 기탁된 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 메타리지움 속 곰팡이는 모두 사용 가능하다.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 1) 내지 단계 3)의 배양은 탄소원 또는 질소원을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 상기 질소원으로는 번데기, 효모추출물, 콩가루, 옥수수침지, 말트 추출물, 펩톤 등을 이용하는 것이 바람직하며, 번데기를 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 상기 탄소원으로는 포도당, 옥수수녹말, 사카로스, 당밀, 밀기울, 쌀겨 등을 이용하는 것이 바람직하며, 밀기울을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 상기 번데기는 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v) 첨가되는 것이 바람직하고, 0.5%(w/v) 첨가되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 상기 밀기울은 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v) 첨가되는 것이 바람직하고, 0.5%(w/v) 첨가되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 1) 내지 단계 3)의 배양은 24℃ 내지 32℃에서 배양되는 것이 바람직하고, 28℃ 내지 32℃에서 배양되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 1)또는 단계 2)의 배양은 7 내지 10일 동안 배양되는 것이 바람직하고, 7 내지 8일 동안 배양되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 단계 3)의 배양은 15 내지 25일 동안 배양되는 것이 바람직하고, 20일 동안 배양되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 1) 내지 단계 3)의 배양은 SDA(sabouraud dextrose agar) 배지 또는 SDAY(sabouraud dextrose agar + yeast extract) 배지를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 배양 방법에 있어서, 단계 4)의 포자의 분리는 고체 배양액으로부터의 포자회수 공정을 통하여 분리할 수 있으며, 이런 포자회수는 당업계에 알려져 있는 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 상기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 메타리지움 아니소필에 ( Metarhizium anisopliae ) HY -2 균주의 전 배양
메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 균주(수탁번호 KCTC 0156BP)의 보관 및 대량배양을 위한 전 배양을 위하여 SDAY 배지를 사용하였다. 상기 SDAY 배지는 SDA(Sabouraud Dextrose Agar, Difco, Sparks, MD 21152, USA) 배지에 1 %(w/v)의 효모 추출물(yeast extract)을 추가한 것으로, 이러한 SDAY 배지를 이용하여 87 x 15mm 크기의 페트리 디쉬(petri dish)에서 28℃ 7일간 암실 조건으로 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주를 전 배양하였다.
< 실시예 2> 메타리지움 아니소필에 ( Metarhizium anisopliae ) HY -2 균주의 고체 배양
메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 대량 배양을 위한 일차 배양으로 액상 배양을 통해 배양액의 균사체를 최대로 배양하였고, 이후 산업적 보관 및 산업적 미생물 살충제제로의 이용을 위해 이차 배양인 고체 배양을 수행하였다.
구체적으로, 균사체 배양을 위한 1차 액상배양은 상기 <실시예 1>의 SDY(Sabouraud Dextrose + 1%(w/v) 효모 추출물) 배지에서 28℃, 7일간 교반기를 이용한 배양 조건을 통해 균사체를 형성하였다. 이후 액상 조건으로 배양된 2 ml의 균사체 배양액을 각 25 mL의 SDAY 배지가 들어있는 페트리디쉬(150 x 25mm)에 분주하여 스프레더로 고루 도말한 다음, 20일간 고체 배양하였다.
< 실시예 3> 메타리지움 아니소필에( Metarhizium anisopliae ) HY -2 균주의 산업적 배양을 위한 배지 내 질소원 첨가
<3-1> 배지 내 질소원 첨가를 통한 산업적 액상 배양
메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 균체 생성의 산업적 배양 조건을 최적화하기 위하여, 기존의 SDAY 배지 조건에서 질소원으로 번데기(pupa)를 갈아 넣은 배지를 이용하였다.
구체적으로, 번데기는 식용의 제품을 시중에서 구입하였고, 드라이 오븐에 건조 후 분쇄하여 사용하였으며, 1차 액상 배양은 기본 배지인 SDY 배지에 상기 건조된 번데기 분말을 0.5 %(w/v) 첨가하여 번데기 첨가 유무에 따른 배양 양상을 비교하였다.
그 결과, 기본 배지의 경우 일주일에서 균사체가 형성된 반면, 0.5%(w/v) 번데기 분말을 첨가한 SDY배지는 3일 만에 균사체가 형성된 것을 확인할 수 있었다(도 1A). 또한 균사체는 기존의 균사체보다 작은 사이즈(지름 기준으로 약 1/4 크기)의 균사체를 형성함을 확인하였다(도 1B).
이를 통해, SDY 액상 배지에 0.5%(w/v) 번데기 분말의 첨가된 경우 빠른 균사체 형성을 유도하여 전체 배양 시간을 단축시킬 수 있을 뿐 아니라, 작은 사이즈의 균사체를 형성하여 조작 편의성 및 [표면적/부피] 비율이 높은 건강한 종균을 생산할 수 있어 고체 배양에의 적용성을 높일 수 있음을 확인하였다.
<3-2> 배지 내 질소원 첨가를 통한 산업적 고체 배양
상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>의 방법에 따라 SDAY 배지와 SDAY 배지에 0.5%(w/v) 번데기 분말을 함께 함유한 배지에서의 포자 농도를 측정하였다.
그 결과, [표 1]에서 나타낸 바와 같이, 같은 배양 조건에서 배지에 0.5%(w/v)의 번데기를 첨가하는 경우, 이를 첨가하지 않은 경우에 비해 약 2.23배로 포자 생성이 증가함을 확인하였다(도 2).
기질(substrate) 포자농도(conidia/g)
SDAY 3.9 ×109
SDAY + 0.5%(w/v) 번데기 분말 8.7 ×109
< 실시예 4> 배지 내 최적의 번데기 분말 함유량의 확인
메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 포자 생산을 최대화할 수 있는 최적의 번데기 분말량을 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>의 방법과 동일한 조건의 1차 액상 배양을 수행한 후, 2차 고체 배양시 SDAY 배지에 0.1 ~ 1.0 %(w/v)의 다른 비율로 제조된 번데기 분말을 넣은 고체 배지를 조성하여 각 페트리디쉬(150 x 25mm) 당 생성되는 분생포자 (Conidia)의 생산량을 확인하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에서 보여주는 것과 같이, 0.5%(w/v)까지 포자 생산 수율이 높아지는 것을 확인할 수 있었고, 0.5%(w/v) 이상부터는 생산 수율의 증가가 미약함을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4).
따라서, 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주를 경제적·산업적으로 대량 배양하기 위한 배지 조건에서 0.5%(w/v)가 최적의 번데기 분말 투입량이 될 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 5> 배지 내 최적의 양적 비율 확인
메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 포자 생산을 최대화할 수 있는 번데기가 함유된 기질의 최적의 양을 확인하였다.
구체적으로, 150 x 25mm의 페트리디쉬에 이용되는 기질의 용량을 15 mL ~ 35 mL로 달리하여 배양하였을 경우 생산되는 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 포자 생산량을 확인하였다.
그 결과, [표 2]에서 보는 바와 같이, 기질의 양에 비례하여 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 포자 수득량도 증가하였으며, 이를 통해 배지량 30 mL이 최적의 기질 양임을 확인하였다.
기질(ml) 전체 건조 중량(g/플레이트) 분생포자 수득량(g/플레이트)
15.0 1.28 0.41
20.0 1.70 0.53
25.0 2.22 0.75
30.0 2.55 0.84
35.0 2.98 0.85
< 실시예 6> 메타리지움 아니소필에 HY -2 균주의 포자의 대량 회수를 위한 배지 조성 확인
메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 포자의 산업적 대량 회수를 위한 최적의 배지 조성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>의 방법으로 고체 배양하여 페트리디쉬에 형성된 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 포자를 스크래퍼(Scraper)를 통해 회수하였다. 20여 일이 지난 고체 배지의 경우 수분이 거의 없는 상태이며 회수시 상대적인 회수율이 많이 떨어지는 면이 있어, 보다 많은 포자의 생산량과 회수율을 위해 0.5%(w/v)의 밀기울을 추가로 사용하였으며, 각 성분이 첨가된 배지 조건에서 배양 후 회수된 포자와 발아 후 성장한 생균수 측정으로 회수율을 확인하였다.
그 결과, 밀기울의 경우, 비교적 경제적이며 메타리지움 속 곰팡이가 성장을 위한 영양소로 이용할 수 있어 메타리지움 곰팡이의 성장과 포자 생성에도 도움을 주는 것을 확인하였다. 또한 20여일 배양 후 스크래퍼로 회수시 밀기울을 첨가한 경우, 그렇지 않은 대조군에 비하여 배지 표면이 부드러워져 회수가 훨씬 용이함을 확인하였다(도 5).
또한, [표 3]에서 보여주는 바와 같이, 각 배지 조건에 대한 포자의 회수율을 확인한 결과 실험실 배지 조성인 SDAY 배지에 비해 2.23 ~ 2,56배 높은 포자 농도가 회수될 뿐 아니라, 생균수 또한 51 ~ 71배로 높게 나옴을 확인하였다.
따라서, SDAY 배지에 0.5%(w/v) 번데기 및 0.5%(w/v) 밀기울을 첨가한 조건이 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주 포자의 대량 회수에 적합함을 알 수 있었다.
배지조성 수율(g/플레이트) 수율(g·g-1 건조중량) 포자농도(conidia/g) 생균수(cfu/g)
SDAY 0.15 0.07 3.9×109 4.5×107
SDAY+0.5%(w/v) 번데기 0.86 0.36 8.7×109 2.3×109
SDAY+0.5%(w/v) 밀기울 0.53 0.22 9.3×109 3.1×109
SDAY
+0.5%(w/v) 번데기
+0.5%(w/v) 밀기울		 0.88 0.35 1.0×1010 3.2×109
< 실시예 7> 메타리지움 아니소필에 HY -2 균주의 최적 배양 온도 및 시간 확인
메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 최적 배양 온도 및 시간을 확인하기 위하여 배양 온도 및 시간별 발아율을 측정하였다.
구체적으로, 메타리지움 아니소필에 HY-2의 포자(1 X 105 conidia/ml)를 SDA 배지와 0.1%(v/v) Tween-80에 희석 후 희석된 포자 100 ㎕를 상기 <실시예 6>의 SDAY 배지에 0.5%(w/v) 번데기와 0.5%(w/v) 밀기울이 포함된 배지를 이용하여 상기 <실시예 2>와 같은 방법으로 다양한 온도(24℃, 28℃, 32℃ 및 36℃) 및 시간(24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간 및 168시간)에서 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주를 배양하였다. 각 온도에서 3개의 군을 키웠으며 무작위로 각 10개의 샘플링을 통해 전자현미경으로 그 발아 정도를 측정하였다.
그 결과, 36℃를 제외한 나머지 온도(24℃, 28℃ 및 32℃)에서 144시간에 90%(w/v) 이상의 발아가 형성됨을 확인하였으며, 발아율의 경우 32℃, 28℃ 및 24℃ 순으로 높게 나타내었다(도 6 및 도 7).
또한, 168시간을 기점으로 온도에 대한 균사의 시간당 성장률(Growth rate in diameter; um/h)을 측정한 결과, 도 8에서 보여지는 바와 같이, 168시간을 기점으로 한 시간당 성장률은 28℃에서 54.2 um/h으로 32도의 33.3 um/h보다 높게 나타내었다.
따라서, 배양 온도가 36℃ 이상이 되면 포자 형성이 어려워지는 것을 확인하였으며, 이를 통해 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주의 최적의 배양 온도는 28℃ ~ 32℃가 적정할 것으로 볼 수 있으며, 배양 시간이 2주 이상인 것을 고려해 볼 경우, 시간당 성장률이 높은 28℃가 최적의 배양 온도임을 확인하였다.
< 실시예 8> 메타리지움 속 곰팡이 살충제 제형화
메타리지움 아니소필에 HY-2 균주 원분의 안정적인 제제화를 목적으로 물에 희석시 수화되는 분상의 수화제를 제조하였다.
구체적으로, 본 발명의 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주를 접종한 후 상기 <실시예 6>의 SDAY 배지에 0.5%(w/v) 번데기와 0.5%(w/v) 밀기울을 포함시켜 상기 <실시예 2>와 같이 제조한 후 회수한 포자(1.1 x 109conidia visible/gram) 10%(w/w)와 90%(w/w)의 부형제를 골고루 섞어 수화제를 제조하였다.
또한, 포자의 안정성을 증가시키기 위해 다양한 식물성 오일과 미네랄 오일을 사용할 수 있다. 식물성 오일로는 대두유, 옥수수 기름, 해바라기 기름, 올리브오일, 카놀라, 팜, 땅콩 및 포도씨유 등을 사용할 수 있다. 미네랄 오일로는 등유(kerosene oil), 파라핀유(paraffin oil)등을 사용할 수 있다.
< 실시예 9> 메타리지움 속 곰팡이 살충제 입제 제조
메타리지움 아니소필에 HY-2 균주 원분의 안정적인 제제화를 목적으로 입상으로서의 원상태대로 사용이 가능한 입제를 제조하였다.
구체적으로, 본 발명의 메타리지움 아니소필에 HY-2 균주를 접종한 후 <실시예 6>의 SDAY 배제에 0.5%(w/v) 번데기와 0.5%(w/v) 밀기울을 포함시켜 <실시예 2>와 같이 제조한 후 회수한 포자(1.6 x 109conidia visible/gram) 10 %(w/v)와 90 %(w/v)의 부형제를 골고루 섞어 입제를 제조하였다.
또한, 포자의 안정성을 증가시키기 위해 다양한 식물성 오일과 미네랄 오일을 사용할 수 있다. 식물성 오일로는 대두유, 옥수수 기름, 해바라기 기름, 올리브오일, 카놀라, 팜, 땅콩 및 포도씨유 등을 사용할 수 있다. 미네랄 오일로는 등유(kerosene oil), 파라핀유(paraffin oil)등을 사용할 수 있다.
본 발명은 메타리지움(Metarhizium) 속 곰팡이, 특히 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 균주 및 이의 포자를 대량 생산할 수 있으므로, 다양한 해충의 방제를 위한 산업화에 유용하게 이용될 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC0156BP 19950310

Claims (12)

1) 수탁번호 KCTC0156BP로 기탁된 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 곰팡이를 전배양용 기본 배지로서 SDAY(Sabouraud dextrose agar + yeast extract) 배지에서 전배양하는 단계;
2) 전배양된 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 곰팡이를 액상 기본 배지로서 SDY(Sabouraud dextrose + yeast extract) 배지에 번데기가 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v)로 첨가된 배지에서 1차 배양하여 균사체를 대량으로 얻는 단계; 및
3) 단계 2)에서 얻은 균사체를 고체 기본 배지로서 SDAY(Sabouraud dextrose agar + yeast extract) 배지에 번데기가 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v)로 첨가되고 밀기울이 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v)로 첨가된 배지에서 2차 배양하는 단계를 포함하는, 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 곰팡이 포자의 대량 생산 방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 단계 1) 내지 3)의 배지는 탄소원 또는 질소원을 포함하는 것을 특징으로 하는 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 곰팡이 포자의 대량 생산 방법.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 단계 1) 내지 단계 3)의 배양은 28℃ 내지 32℃에서 배양되는 것을 특징으로 하는 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 곰팡이 포자의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1) 또는 단계 2)의 배양은 7 내지 10일 동안 배양하고, 단계 3)의 배양은 15 내지 25일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 곰팡이 포자의 대량 생산 방법.
제 1항에 있어서, 고체 배양된 배양액으로부터 포자를 분리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 곰팡이 포자의 대량 생산 방법.
질소원으로서 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v)의 효모 추출물 및 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v)의 번데기, 및 탄소원으로서 배지 전체 조성의 0.5 내지 1.0%(w/v)의 밀기울을 포함하는, 수탁번호 KCTC0156BP로 기탁된 메타리지움 아니소필에(Metarhizium anisopliae) HY-2 곰팡이의 배양 배지.
제 11항에 있어서, 상기 배지는 기본 배지로 SD(Sabouraud Dextrose) 또는 SDA(Sabouraud Dextrose Agar) 배지인 것을 특징으로 하는 배양 배지.
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