KR101341416B1 - 항노화 활성을 갖는 여주 추출물 및 이를 함유하는 건강식품 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생명연장(항노화) 활성이 우수한 여주(Bitter gourd) 추출물 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 여주 추출물 및 추출물에 함유된 트리터페노이드계 성분인 cucurbitane을 유효성분으로 포함하는 신 기능성 바이오 소재에 관한 것이다. 여주 추출물 또는 주성분 cucurbitane을 함유하는 기능성 식품 또는 약제학적 조성물은 생명을 연장시키는 효과가 있으며 전반적인 건강을 향상시키는 효과를 나타내는 바, 성인용 및 노인용 건강식음료와 식품, 화장품, 의약품 등의 원료로 이용이 가능하다.

Description

항노화 활성을 갖는 여주 추출물 및 이를 함유하는 건강식품 조성물 {Bitter gourd extracts for anti-aging activity and a healthy food composition containing the same}

본 발명은 항노화 활성을 갖는 여주 추출물(bitter gourd; Momordica Charantia) 및 이를 함유하는 건강식품 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Sir2(Silent Information Regulator2), Cct1(chaperonin containing TCP-1), 카탈라아제(catalase), SOD(Superoxide dismutases)의 발현을 증가시켜서 궁극적으로는 생명연장 효과를 발생시키는 여주 추출물, 이로부터 분리된 쿠커비테인 및 상기 여주 추출물 또는 쿠커비테인을 함유하는 건강식품 조성물에 관한 것이다.

노화를 지연시키고 오래 사는 것은 모든 사람의 바람으로, 노화를 억제시키는 물질을 찾는 노력은 과거부터 현재까지 계속 진행되고 있다. 노화를 촉진시키는 가장 큰 원인으로 슈퍼옥사이드, 과산화수소와 같은 활성 산소종들의 대사산물로 생성된 자유기(free radical)들이 생체내의 단백질과 생체막, DNA 등에 작용하여 산화적 손상을 주는 것으로 보고 있다. 따라서 항산화작용을 갖는 소재를 탐색하기 위한 연구가 국내외에서 활발하게 이루어지고 있다.

항노화제라는 이름으로 연구가 된 물질은 대부분 항산화제로서 Vitamin C와 E, thiol 그룹을 갖는 oltipraz, S-allyl-L-cysteine, DHEA (dehydroepiandrosterone) 등이 연구가 되었다. 그러나, DHEA인 경우 유방암과 전립선암의 위험이 있으며 다른 물질들 역시 과량 또는 시기적으로 부적절한 복용 시 부작용이 있는 것으로 알려졌다 (Jones J.A. et al., 50:784-788, Ann. clinic. lab. sci., Cauley J.A. et al., 130:270-277, Ann. Intern. Med. 1999).

따라서, 최근에는 식물 추출물과 같이 안전성이 보장된 천연물을 이용하여 기능성 보조제를 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이중 레스베라트롤(RSV) 이라는 포도껍질 속의 폴리페놀류 성분이 항산화, 항노화, 생명연장, 대사기능 촉진 등 다양한 생리 활성이 밝혀지고 있어 RSV와 같은 새로운 물질탐색과 개발에도 지대한 관심을 나타내고 있다.

천연물을 이용한 생명연장 효능에 관련하여 종래 특허 등록된 기술을 살펴보면, 항노화 활성이 우수한 현삼 추출물 및 이를 포함하는 조성물(대한민국 특허등록 제 10-2003-0010074호), 항노화제(대한민국 특허등록 제 10-2004-7020931호), 항노화 활성을 갖는 겨우살이 추출물(대한민국 특허등록 제 10-2009-0020883호) 등이 있으나 아직까지는 임상에 사용하기에는 미비한 실정이다.

이에 본 발명자들은 생명연장을 효과적으로 증강시키면서 부작용이 없는 보조제에 대해 연구하던 중, 여주 추출물에 초점을 맞추어 진행하게 되었다.

여주(bitter gourd; Momordica Charantia)는 아시아에서 널리 재배되는 박과의 다년생 덩굴식물로서 쓴 맛의 멜론이라는 뜻으로 중국에서는 고과(苦瓜), 일본에서는 고야로 한국에서는 여주, 여자, 여지 등으로 불리고 있다. 항산화 효능을 가지고 있는 비타민 C를 포함하여 케라틴, 카로틴, 칼슘, 철, 엽산, 판토텐산, 식물섬유, 모모르데신 등이 풍부하게 함유되어 있으며 항암효과와 말라리아치료, 체중감소, 소화 촉진 기능을 가지고 있어 한방의 재료로 쓰이고 있으며 최근 당뇨병의 치료에도 사용될 수 있다 (Miura T. et al., J. Nut. Sci. Vitaminol., 47:340-344, 2001)고 보고되어 의학계에서도 관심이 높아지고 있는 식물성 채소이다.

여주의 한 성분인 쿠커비테인은 트리터페노이드 계통의 다환 탄화수소(polycyclic hydrocarbon) 구조를 가지고 있는 물질이며 항당뇨나 항암, 항에이즈와 같이 다양한 생리활성에 효능이 있다고 연구되고 있으며, 하기와 같은 화학식 1을 갖는다:

또한, 쿠커비테인은 하기와 같은 유도체를 갖는다:

여주와 관련하여서는, 여주의 효소처리 추출물을 함유하는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 조성물 (대한민국 특허등록 제 10-2008-0101282호), 통풍치료용 여주 추출물의 제조방법과 그 제조방법에 의해 제조된 여주추출물 (대한민국 특허등록 제 10-2009-0018214호)등이 알려져 있다.

그러나, 여주 추출물 및 이로부터 분리된 쿠커비테인이 Sir2, Cct1, 카탈라아제(catalase), SOD의 발현을 증가시키는 메카니즘을 통해 인간을 비롯한 포유동물의 평균 수명을 증가시키는 효과에 대해서는 아직까지 보고되지 않았다.

본 발명은 Sir2, Cct1, 카탈라아제(catalase), SOD의 발현을 증가시키는 여주 추출물 및 이를 포함하는 건강식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 여주 추출물을 포함하는 조성물을 제조하고, 상기 조성물을 초파리에 투여하여 항노화 활성을 확인함으로써 달성하였다.

본 발명에 따르면, 여주 추출물은 여주를 분쇄한 후에 열수 추출하여 수득할 수 있다.

다르게, 본 발명에 따르면, 여주 추출물은 여주를 에탄올로 추출하고 물로 희석한 후에 디클로로메탄으로 분배하고, 그 수용액을 n-부탄에 의해 분리한 후에 여러 차례의 크로마토그래피로 분리하고, 이어서 아세트산 수용액에서 교반시켜 수득할 수 있다. 여기서, 바람직하게는 원료인 여주를 잘게 분쇄하여 건조시킨 후 10배의 95% 약전용 알콜 (에탄올)을 첨가하여 4℃에서 24시간 이상 충분히 추출한다.

본 발명에 있어서, “유효성분”이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능 및 효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강식품 조성물은 여주 추출물 외에 식품 제조 시 허용 가능한 첨가물 을 혼합하거나, 기타 활성성분을 포함하여 당업자에게 자명한 통상의 형태(과자, 음료 등)를 가질 수 있다.

본원에서 정의되는 “건강식품”은 건강기능식품에 관한 법률 제 6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 또한 “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 결과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명은 Sir2(Silent Information Regulator2)와 Cct1(chaperonin containing TCP-1), 카탈라아제(catalase), SOD(Superoxide dismutases)의 발현을 증가시켜서 궁극적으로는 인간을 비롯한 포유동물의 수명을 연장시키는 여주 추출물 및 이를 함유하는 건강식품 조성물에 관한 것으로, 이러한 생명 연장 효과로 인해 기능성 식품 분야에서 매우 유용한 발명이다.

도 1에서 A)와 B)는 여주 추출물과 쿠커비테인의 추출 정제방법을 도식화한 것이다.
도 2에서 A) 및 B)는 여주 추출물 급여량에 따른 초파리의 평균수명을 나타낸 그래프이다.
도 3에서 A) 및 B)는 여주 추출물 급여량에 따른 초파리의 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 4에서 A) 내지 D)는 여주 추출물 급여량에 따른 초파리 Sir1, Cct1, Catalase 및 SOD 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 5에서 A) 및 B)는 여주 추출물에서 얻은 쿠커비테인 급여량에 따른 초파리의 평균수명을 나타낸 그래프이다.
도 6에서 A) 내지 D)는 여주 추출물에서 얻은 쿠커비테인 급여량에 의한 초파리 Sir1, Cct1, Catalase, SOD 유전자 발현량을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명하도록 한다. 하지만 본 발명을 설명하기 위한 실시예에만 한정되는 것은 아니며 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 여주 추출물을 제조하는 실시예 1과 여주 추출물로부터 쿠커비테인을 제조하는 실시예 2, 초파리의 생명연장 효과를 실험하는 실험예 1, 활성산소 저항성을 측정하는 실험예 2, 항노화 관련 유전자 발현을 측정하는 실험예 3, 쿠커비테인을 초파리에 급여하여 초파리의 생명연장 효과를 확인하는 실험예 4, 쿠커비테인 섭취 후 초파리에서의 항노화 관련 유전자 발현을 측정하는 실험예 5로 구성되어 있다.

<실시예>

실시예 1: 열수 추출법에 의한 여주 추출물의 제조 : YJ -2

국내에서 생산되는 여주 과실을 잘게 분쇄하여 건조시킨 후 200g에 물 1L를 가하여 100℃에서 1시간 가열하여 열수추출액을 얻은 후 이를 동결건조하여 여주 추출물을 얻었으며, 상기 열수 추출법에 의한 여주 추출물을 YJ-2이라 명명하였다.

실시예 2: 유기용매 추출법에 의한 여주 추출물의 제조

국내에서 생산되는 여주 과실을 잘게 분쇄하여 건조시킨 후 1kg에 90% 에탄올 10L를 가해 상온에서 24시간 이상 추출 후 얻은 추출물을 물 50L로 희석한 후 디클로로메탄(dichloromethane) 20L와 액-액 분배하여 디클로로메탄 부위와 수용액을 얻는다. 상기 수용액과 n-부탄 20L를 다시 액-액 분배하여 얻은 n-부탄 부위를 AB-8형 다공성수지가 들어있는 컬럼 크로마토그라피를 사용하여 분리하였다. 분리물을 TLC 후 MCI 컬럼으로 한 번 더 분리하였다. 용출액을 혼합하여 momordicoside A를 수득 후 0.1M 아세트산 수용액에 7일간 교반 후 동결건조하여 쿠커비테인을 얻었다.

이하 실험예에서는 본 발명에 따른 조성물의 항노화 활성을 in vivo의 초파리를 이용한 실험에 의해 검증하였다.

실험예 1 : 초파리의 항노화 활성 측정

1-1. 초파리 사육 및 여주 추출물의 투여

초파리( Drosophila Melanogaster )의 여러 종 중 Canton-S wild type strain을 사용하였다. 초파리 사육방법은 25℃, 습도 65%에서 12시간 명암 순환주기를 가졌다. 성체가 되었을 때부터 여주 추출물 (25-100 ug/ml)을 sugar/yeast/agar (SYA) 배지에 섞어 매일 먹이로 사용하였다.

1-2. 초파리의 암수 구분

같은 날 성체가 된 암수 초파리를 같은 수를 세어 하나의 케이지에서 사육하였다. 암수 감별은 배의 모양과 성즐(sex comb)을 통해 확인하였다.

1-3. 초파리의 항노화 활성 측정

수명조사는 여주 추출물 50 ㎍/mL 또는 100㎍/mL을 먹고 자란 초파리와 일반 먹이를 먹고 자란 초파리를 각각 암수 구별하여 2일마다 오후 3시를 기준으로 하여 생사를 판정하고, 도 2의 A)에 암컷 평균 수명을, 도 2의 B)에 수컷 평균 수명을 나타내었다. 상기 실험 결과는 실험군과 대조군의 집단별 t 검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다 (***=p<0.0001).

*실험 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 여주 추출물 섭취군 암수 초파리의 평균수명은 일반 먹이를 먹은 대조군 초파리의 암수 평균수명보다 현저하게 증가함을 알 수 있다.

상기 결과는 여주 추출물의 항노화 활성을 통해 초파리의 생명을 연장시키는 효과가 있으며 여주 추출물을 항노화 활성 의약품이나 기능성 식품으로 이용할 수 있다는 것을 보여준다.

실험예 2 : 여주 추출물 처리에 따른 초파리의 활성산소 저항성 측정

활성산소 저항성을 알아보기 위하여 동일한 사육조건 아래 14일간 일반식 + 여주 추출물 (50 ㎍/mL 또는 100㎍/mL) 또는 일반식을 식이시킨다. 14일째 되는 날 동성 초파리 10마리 씩 새로운 vial로 옮긴 후 활성산소를 만들어 내는 20mM paraquat를 함유시킨 푸드로 바꿔 먹인다. 이 후 2일마다 오후 3시를 기준으로 하여 생사를 판정하였다. 실시 결과는 도 3의 A)에 암컷 생존율을, 도 3의 B)에 수컷 생존율을 나타내었다. 상기 실험 결과는 실험군과 대조군의 집단별 t 검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다 (**=p<0.005).

실험 결과, 도 3에 나타난 것과 같이 여주 추출물을 섭식시켰을 때 대조군에 비해 활성산소에 대한 저항성이 높게 나타나는 것으로 확인되었다.

실험예 3: 여주 추출물 처리에 따른 초파리의 생명연장 관련 유전자 발현 증 가 측정

Sir2 유전자는 생명연장 관련 유전자로서, 에너지와 대사 항상성에 주요 조절 인자로 관여한다고 알려져 있으며 시르투인(sirtuins)이라는 항산화 효소를 조절하는 유전자이다. 시르투인 효소는 세포에 에너지를 공급하는 미토콘드리아를 보호하며, 미토콘드리아는 인체 세포내 존재하는 작은 에너지 창고로 항노화에 중요한 역할을 한다. Cct1은 성체 초파리의 수명에 직접적으로 관여하는 유전자로 Cct1의 발현량이 증가할 때 수명이 연장되는 것으로 밝혀져 있다. 또한 catalase와 SOD(superoxide dismutase)은 사람과 동물의 장기와 혈액 중에 존재하는 생리활성 효소로써 유해산소를 제거하여 항산화방어기작 역할을 한다. 따라서 상기 sir2, Cct1, catalase, SOD 유전자의 발현량을 측정하면, 항노화 활성에 따른 생명연장 효과를 파악할 수 있다.

이에 본 실험예에서는 여주 추출물(50 ㎍/mL 또는 100㎍/mL)을 급여한 초파리의 생명연장효과가 위 유전자의 발현량에 미치는 영향을 검토하였다.

이들 유전자의 염기서열은 다음과 같다:

Sir2

Forward : 5'-CGCACACCAACAACTATTCG-3'

Reverse : 5'-CGGTAGCAATGGTGACAATG-3'

Cct1

F : 5'-GAGATGGCCGAGAAGTTGAG-3'

R : 5'-ATTGCTTCGACGCTCGTACT-3'

Catalase

F : 5'-GTTGAGTGCGGAAGGCTAGA-3'

R : 5'-GAGTAATCCGAGACCGCTCC-3'

SOD

F : 5'-AGCTCACTTGTTCGTAAAGT-3'

R : 5'-AAGTTAGGCATACCGTTCCT-3'

GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)

F : 5'-TTCGTGTGCGGCGTTAACCT-3'

R : 5'-GATGACCTTGGCCAGGGGAG-3'

그룹 당 초파리 20 마리씩 트라이졸(Trizol)을 넣고 갈아 RNA를 추출하고 역전사 효소 중합효소 연쇄반응을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 대조군으로 GAPDH를 사용하였으며 타겟인 네 종류의 유전자의 발현량을 알아보기 위해 각각의 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 하였다 ((50℃ 2분, 90℃ 10분, 95℃ 15초, 60℃ 1분) 총 40회 반복, 녹는 곡선은 65℃에서 95℃까지 0.1씩 상승시키며 작성). 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다 (*=p<0.05, **=p<0.005, ***=p<0.0001).

실험 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 암컷과 수컷 모두 여주 추출물 급여량 의존적으로 대조군에 비해 2-3배 생명연장 관련 유전자 발현을 증가시키는 것을 관찰하였다.

이러한 결과는 본 발명 여주 추출물의 생명연장 효능을 입증하는 분자생물학적 근거이다.

실험예 4 : 여주 추출물에서 분리한 쿠커비테인에 의한 초파리의 항노화 활 성 측정

4-1. 초파리 사육 및 암수 구분, 쿠커비테인의 투여

초파리 사육 및 암수 구분은 여주 추출물 방법과 동일하게 실험하였으며 여주 추출물로부터 얻은 쿠커비테인을 성체가 되었을 때부터 10 또는 20 ug/ml을 sugar/yeast/agar (SYA) 배지에 섞어 매일 먹이로 사용하였다.

4-2. 초파리의 항노화 활성 측정

수명조사는 여주 추출물을 먹고 자란 초파리와 동일 방법을 사용하였으며 실시 결과는 도 5의 A)에 암컷 평균 수명을, 도 5의 B)에 수컷 평균 수명을 나타내었다. 상기 실험 결과는 실험군과 대조군의 집단별 t 검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다 (***=p<0.0001).

실험 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 여주 추출물로부터 얻은 쿠커비테인 섭취군 암수 초파리의 평균수명은 일반 먹이를 먹은 대조군 초파리의 암수 평균수명보다 현저하게 증가함을 알 수 있다.

상기 결과는 여주 추출물 속의 쿠커비테인 성분이 항노화 활성을 통해 초파리의 생명을 연장시키는 효과가 있으며 쿠커비테인을 항노화 활성 의약품이나 기능성 식품으로 이용할 수 있다는 것을 보여준다.

실험예 5: 여주 추출물로부터 얻은 쿠커비테인 처리에 따른 초파리의 생명연 장 관련 유전자 발현 증가 측정

여주 추출물을 이용한 실험예 3과 같은 프라이머를 사용하여 동일한 방법으로 실험을 진행하였다. 상기 실험결과는 실험군과 대조군의 집단별 t검정을 실시하여 그 유의성을 검증하였으며, 통계학적으로 유의한 차이를 보였다 (**=p<0.005, ***=p<0.0001).

실험 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 암컷과 수컷 모두는 쿠커비테인 급여량 의존적으로 대조군에 비해 2-3배 생명연장 관련 유전자 발현을 증가시키는 것을 관찰하였다.

이러한 결과는 본 발명 여주 추출물로부터 얻은 쿠커비테인의 생명연장 효능을 입증하는 분자생물학적 근거이다.

이상 실험에서 증명된 바와 같이, 본 발명에 따른 항노화 활성용 기능식품에서 바람직한 여주 추출물 또는 쿠커비테인의 바람직한 사용량은 50 내지 100㎍/mL 또는 쿠커비테인 10 내지 20 ug/mL이다. 본 발명의 항노화 활성용 기능식품은 음료, 정제, 캡슐제 등으로 사용이 가능하나, 바람직한 배합비는 하기와 같다:

여주 추출물	100mg
구연산	100mg
올리고당	100g
매실 농축액	2g
타우린	1g
정제수	전체 1000mL이 되도록 하는 잔량

상기 기능성 식품은 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 제조할 수 있으나, 그 제조방법은 당업계에서 통상적인 방식으로 변형될 수 있다.

Claims (4)

1. 하기 화학식 1의 쿠커비테인 또는 그 유도체를 포함하는 항노화 활성용 식품 조성물:
   화학식 1
   

   
2. 제 1항에 있어서,
   sir2(Silent Information Regulator2), Cct1(chaperonin containing TCP-1), 카탈라아제(catalase) 및 SOD(Superoxide dismutases) 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 항노화 활성용 식품 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   섭취 시 평균 수명 증가능을 갖는 것을 특징으로 하는 항노화 활성용 식품 조성물.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 쿠커비테인은 여주 유래인 것을 특징으로 하는 항노화 활성용 식품 조성물.
   
   

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