KR101333735B1

KR101333735B1 - 디페닐프로페논 화합물를 유효성분으로 포함하는 신경계 염증질환 예방 및 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101333735B1
Application number: KR1020110112917A
Authority: KR
Inventors: 신순영; 하규섭; 임융호; 현지예; 고동수; 박준철; 이영한
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-11-01
Filing date: 2011-11-01
Publication date: 2013-11-27
Also published as: KR20130048022A; WO2013065922A1

Abstract

본 발명은 신경계 염증질환의 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 신경계 염증반응을 일으키는 마이크로글리아(microglia) 세포의 NF-kB(nuclear factor-kappa B) 활성억제를 통하여 염증억제 효과를 갖는 신규 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one) 및 이를 포함하는 신경계 염증질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공함으로써, 신경계 염증질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

디페닐프로페논 화합물를 유효성분으로 포함하는 신경계 염증질환 예방 및 치료용 약학조성물{ANTI-NEUROINFLAMMATORY COMOSITION CONTAINING DIPHENYLPROPENONE}

본 발명은 신경계 염증질환의 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신경계 염증반응을 일으키는 마이크로글리아(microglia) 세포의 NF-kB(nuclear factor-kappa B) 활성억제를 통하여 염증억제 효과를 갖는 하기 화학식 1로 표시되는 신규 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one) 및 이를 포함하는 신경계 염증질환의 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

칼콘 화합물은 식물의 이차대사물 생합성 과정에서 생성되는 화합물들 중 하나로 다양한 구조를 가진 화합물들이 보고되어 있고 이들 중 여러 유도체들이 항염증 효과를 보이는 것으로 알려져 있다 (Bioorg Med Chem Lett. 2011 21(15):4480-4).

본 발명에서는 이미 알려진 칼콘 화합물들이 보이는 항염증 효과를 좀 더 개선하고 신규성을 갖는 새로운 칼콘 화합물을 찾기 위하여 구조-활성 관계 연구를 통하여 기존의 칼콘 화합물에 히드록시기와 메톡시기를 추가하여 변형시킨 새로운 화합물을 고안하였고 DK139라고 명명한 화합물을 생산하게 되었다.

과도한 면역반응으로 발생하는 질병으로는 아토피, 알레르기, 루프스, 관절염 등 여러 가지 자가면역 질환이 있으며, 노화 과정과도 밀접한 관련이 있다 (J. Invest Dermatol, 2000, 115:177), (Ann. N.Y. Acad. Sci, 2001,928:327), (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2001, 98:10630). 노화 과정에서 발생하는 여러 가지 산화 스트레스는 염증반응을 지속적으로 증폭시켜 여러 조직의 손상을 초래한다. 특히 혈관 내피세포와 평활근 세포에서 두드러지게 나타나는데 이는 염증반응이 주요 혈관질환과 밀접한 관계가 있음을 시사한다(Lab Invest, 1993, 68:499).

NF-kB(Nuclear Factor-kappa B) 단백질은 염증반응과 면역기능, 노화, 종양 등에 관계하는 다양한 신호전달 합성을 조절하는 전사인자 단백질이다. NF-kB는 p50(NFκB1), p52(NFκB2), p65(Rel-A), c-Rel과 Rel-B와 같은 Rel 계 동종이량체 (homodimer)나 이종이량체 (heterodimer)로 이루어져 있으며, inhibitory κB (IκB)라 불리는 저해성 분자와 결합하여 불활성화된 상태로 세포질에 존재한다. 염증신호가 세포내로 전달되면 IKK(IκB kinase)에 의해 IκB가 인산화되어 일련의 분해과정을 통해 단백분해 됨으로써 NFkB는 활성형태로 되어 핵으로 이동하여 표적 유전자의 전사(transcription)를 야기시킨다(Annu Rev Immunol,1998,16,225). NFkB 활성에 관여하는 인자들은 TNF-α, lymphotoxin과 IL-1β, mitogens, LPS(lipopolysaccharide) 등이 있다(Int Rev Cytol, 1993, 143:1).

신경계에서 염증 반응을 주도하는 세포중 하나가 마이크로글리아(microglia) 세포이다(J Neuroinflammation 2004,1:14). Microglia 세포는 병원균을 탐식하는 세포인 마크로파지(macrophage)와 유사한 기능을 가지는 뇌조직의 면역세포로서, 조직 손상이나 외부 병원균 침입에 의해 NFkB의 활성을 유도하여 각종 염증매개인자를 분비함으로써 혈액의 백혈구를 뇌염증 부위로 유입시키게 하고 astroglia를 활성시켜 뇌의 항상성을 유지하는 역할을 한다(J Neurosci Res 2005, 81:302). 그러나 microglia 세포에서 비정상적으로 NF-kB가 과도하게 활성화되면 만성 염증 상태가 되고, 염증성 싸이토카인(cytokine)과 케모카인(chemokine), 프로스타글란딘, 에이코사노이드, 산화질소 등과 같은 염증 매개인자의 생산이 비정상적으로 증가된다(Life Science 2011, 89:141). 이는 뇌의 면역반응을 과도하게 활성시켜 뉴런의 손상과 변성을 포함하는 다양한 퇴행성 질환을 야기시킨다 (Neurisci. Lett, 1997,22:61). 알츠하이머(Alzheimer's disease)와 같은 퇴행성 뇌질환에서도 염증 반응이 주요 원인으로 간주되고 있다(Brain Res, 1993, 629:245)(Glia 2002, 40:232). 알츠하이머의 특징인 변성 아밀로이드 단백질은 microglia 세포에서 NF-kB의 활성을 유도하여 각종 염증매개 인자를 분비시킴으로써 궁극적으로 뉴런등과 같은 신경계 세포의 변성과 죽음을 야기시킨다. 또한 정신분열병(schizophrenia)도 뇌염증 반응과 관련 있으며(Medical Hypotheses, 1995, 45:135),뇌염증 억제가 우울증 치료에 도움을 준다는 보고들이 발표되었다(Biol Psychiatry 2009, 65:732). 실제로 우울증 치료제인 Imipramine, trazodone, Fluoxetine 등이 항염증 효과가 있음이 증명되었다(Hum Psychopharmacol Clin Exp 2001, 16:95)(Pharmacol Res 2004, 49:119).

현재까지 알려진 NF-kB의 표적 유전자는 60여개 이상이 보고되었으며, 다양한 염증반응에서 중추적 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 NF-kB의 활성을 적절하게 제어할 수 있다면, 만성관절염, 퇴행성관절염, 위염과 간염등과 같은 다양한 만성 염증 질병뿐만 아니라 치매, 우울증, 파킨슨씨병 등과 같은 퇴행성 뇌질환의 예방과 치료제의 새로운 선도 물질로 개발할 수 있다.

본 발명에서는 박테리아 감염에 의해 염증을 매개하는 LPS에 의한 NF-kB 활성을 염증 모델 신호로 이용하였다. 본 발명의 DK139 화합물이 신경계에서 염증 반응을 주도하는 microglia 세포에서 LPS에 의한 NF-kB 활성을 억제하는 결과를 획득함으로써 본 발명을 완성하였다.

칼콘 또는 이의 유도체를 약학조성물로 이용한 종래기술로는 MMP 활성을 억제하여 혈관신생 억제효과가 있는 등록특허 제10-0567125호(칼콘 또는 이의 유도체를 함유하는 매트릭스메탈로프로테아제 활성 억제용 약학 조성물), 글리코시다아제에 의해 유발되는 질환을 예방 및 치료하는 효과가 있는 등록특허 제10-0751899호(신규한 칼콘 유도체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이들을 유효성분으로 함유하는 글리코시다아제에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 조성물) 등이 있다.

본 발명의 목적은, 신경계 염증반응을 일으키는 마이크로글리아(microglia) 세포의 NF-kB(nuclear factor-kappa B) 활성억제를 통하여 염증억제 효과를 갖는 신규 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one) 및 이를 포함하는 신경계 염증질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공함에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 신규 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one)을 포함하는 신경계 염증질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one)의 제조방법에 있어서, (1) 2-히드록시-5-메톡시-아세토페논(2-hydroxy-5-methoxy-1-acetophenone)과 3,5-디메톡시벤즈알데히드(3,5-dimethoxybenzaldehyde)를 에탄올에 용해시키는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의한 혼합용액에 50% KOH 수용액을 첨가하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 제조된 혼합용액을 상온에서 교반한 후 3 내지 5℃로 냉각시키는 단계;와 (4) 상기 (3)단계에 의해 냉각된 혼합용액에 6N HCl용액을 첨가하여 중화시킨 후 디클로로메탄으로 2번 추출하는 단계;와 (5) 상기 (4)단계에 의해 추출된 각각의 유기용매를 합친 후 황산마그네슘을 가하여 물을 제거하는 단계;및 (6) 상기 (5)단계에서 물이 제거되고 남은 혼합물을 감압여과 및 건조한 다음 관 크로마토그라피로 분리정제하는 단계;를 포함하는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one)의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 신경계 염증반응을 일으키는 마이크로글리아(microglia) 세포의 NF-kB(nuclear factor-kappa B) 활성억제를 통하여 염증억제 효과를 갖는 제1항의 화학식 1로 표시되는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one)과 약학적으로 허용되는 염을 포함하여 이루어지는 신경계 염증질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 약학조성물은 약학적으로 허용 가능한 1종 이상의 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one) 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 신경계 염증질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태인 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 신경계 염증반응을 일으키는 마이크로글리아(microglia) 세포의 NF-kB(nuclear factor-kappa B) 활성억제를 통하여 염증억제 효과를 갖는 신규 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one) 및 이를 포함하는 신경계 염증질환의 예방 및 치료용 약학조성물과 신경계 염증질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공함으로써, 신경계 염증질환을 예방 및 치료하는데 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 신경계 염증질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1 은 디페닐프로페논 화합물(DK139)의 수소핵자기공명분광스펙트럼(400MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용).
도 2 는 디페닐프로페논 화합물(DK139)의 탄소핵자기공명분광스펙트럼(100MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용).
도 3 은 면역블롯법을 이용하여 디페닐프로페논 화합물(DK139)의 NF-kB 인산화 억제효과를 나타낸 것.
도 4 는 루시퍼라제 리포터 실험을 이용하여 디페닐프로페논 화합물(DK139)의 NF-kB 전사능(transcriptional activity) 억제효과를 나타낸 것.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

[화학식 1]

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one)의 제조방법에 있어서, (1) 2-히드록시-5-메톡시-아세토페논(2-hydroxy-5-methoxy-1-acetophenone)과 3,5-디메톡시벤즈알데히드(3,5-dimethoxybenzaldehyde)를 에탄올에 용해시키는 단계;와 (2) 상기 (1)단계에 의한 혼합용액에 50% KOH 수용액을 첨가하는 단계;와 (3) 상기 (2)단계에 의해 제조된 혼합용액을 상온에서 교반한 후 3 내지 5℃로 냉각시키는 단계;와 (4) 상기 (3)단계에 의해 냉각된 혼합용액에 6N HCl용액을 첨가하여 중화시킨 후 디클로로메탄으로 2번 추출하는 단계;와 (5) 상기 (4)단계에 의해 추출된 각각의 유기용매를 합친 후 황산마그네슘을 가하여 물을 제거하는 단계; 및 (6) 상기 (5)단계에서 물이 제거되고 남은 혼합물을 감압여과 및 건조한 다음 관 크로마토그라피로 분리정제하는 단계;를 포함하는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 신경계 염증반응을 일으키는 마이크로글리아(microglia) 세포의 NF-kB(nuclear factor-kappa B) 활성억제를 통하여 염증억제 효과를 갖는 제1항의 화학식 1로 표시되는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one)과 약학적으로 허용되는 염을 포함하여 이루어지는 신경계 염증질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 염은 약제학적으로나 생리학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산과의 산 부가 염을 포함한다. 적합한 무기산으로는, 예를 들면 염산, 황산 등의 할로겐산 또는 인산이 있다. 적합한 유기산으로는, 예를 들면 카르복실산, 포스폰산, 술폰산, 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 글루탐산, 아스파르트산, 말레산, 벤조산, 살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 메틸황산, 에틸황산, 도데실황산 등이 있다.

상기 약학조성물은 약학적으로 허용 가능한 1종 이상의 담체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 희석제 또는 부형제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 약학조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균주사용액의 형태 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 유활제들도 사용된다. 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 우한 제제에는 멸균된 수용액, 비수서용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여시간, 투여경로 및 배출비율, 치료시간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결절될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화합물의 투여량은 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 체중 1㎏당 1일 0.001~ 150㎎으로, 바람직하게는 0.01 ~ 100 ㎎으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one) 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 신경계 염증질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 예를 들면, 건강기능식품으로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등에 벤조히드록시메톡시칼콘 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 그의 염을 첨가하여 제조할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 디페닐프로페논 화합물(DK139)의 합성

본 발명에서는 상기 화학식 1로 표시되는 디페닐프로페논 화합물(DK139)(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one)을 아래 반응식 1에 나타낸 방법을 사용하여 다음과 같이 합성하였다.

[반응식 1]

2-히드록시-5-메톡시-아세토페논(2-hydroxy-5-methoxy-1-acetophenone, 116 mg, 1 mmol)과 3.5-디메톡시벤즈알데히드 (3,5-dimethoxybenzaldehyde, 116 mg, 1 mmol)를 15㎖의 에탄올에 녹인 후 온도를 약 4℃로 낮춘 후에 50% KOH 수용액 1㎖을 천천히 가하였다. 그 다음 상온에서 48시간 교반 후 온도를 약 4℃로 냉각시키고, 6 N HCl용액 4 ㎖를 가하여 중화시킨 후, 이 수용액을 디클로로메탄 30㎖로 두 번 추출하였다. 상기 추출된 각각의 유기 용매를 합친 후 황산마그네슘을 가하여 물을 제거하고, 남은 혼합물을 감압여과 하였다. 상기 감압여과시킨 혼합물을 회전증발기를 이용하여 여액의 용매를 제거한 후, 남은 혼합물을 관 크로마토그라피로 분리정제함으로써 목적화합물인 디페닐프로페논 화합물(DK139)(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one) 217 mg(69 %의 수율)을 얻었다. M. P. ; 80-82 ℃

디페닐프로페논 화합물(DK139)의 생성여부를 확인하기 위하여 수소핵자기공명분광스펙트럼(Bruker 400㎒)과 탄소핵자기공명스펙트럼(Bruker 100㎒)을 통해 확인 하였다. 사용한 기기는 브루커사 400MHz 기기였다. 수소핵자기공명분광스펙트럼과 탄소핵자기공명스펙트럼은 각각 도 1. 및 도 2.에 나타낸 바와 같고, 화학적 이동도는 아래와 같다.

1H-NMR(400MHz) δ (다중도, 커플링상수/Hz) : 3.81(s), 3.81(s), 6.62(t, 2.2), 6.96(d, 9.0), 7.09(d, 2.2), 7.22(dd, 9.0, 3.1), 7.66(d, 3.1), 7.75(d, 15.5), 7.98(15.5), 11.97(bs)

13C-NMR(400MHz) δ : 55.4, 55.9, 103.0, 107.1 113.9, 118.6, 120.8, 122.6, 123.6, 136.4, 144.9, 151.7, 155.9, 160.7, 193.3

실시예 2. 면역블롯법을 이용한 디페닐프로페논 화합물(DK139)의 NF-kB(nuclear factor-kappa B) 활성억제 효과

BV2 microglia 세포를 ATTC(American Type Culture Collection)로부터 구입하여 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies), Antibiotic-Antimycotic solution (Invitrogen Life Technologies) 포함한 DMEM/F12(Invitrogen Life Technologies) 배양액을 2일에 한 번씩 100-mm 세포배양접시에 1 x 10⁶의 접종 밀도(seed density)로 계대하면서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

디페닐프로페논 화합물(DK139)에 의한 NF-kB 활성 억제 효과를 분석하기 위하여, BV2 microglia 세포에 염증을 유도시키는 1㎍/㎖ 농도의 LPS(lipopolysaccharide; sigma에서 구입)를 단독 처리하거나, LPS 처리 30분전에 20μM 농도의 디페닐프로페논 화합물(DK139)을 처리하였다. LPS 처리하고 30분 경과 후에 세포를 수확하여, 20mM HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 150mM NaCl, 10㎍/㎕ Leupeptin, 1mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 함유하는 완충용액으로 세포를 용해시킨 후, 고속원심분리하여 세포 용해액만을 수확하였다. 동량의 단백질이 포함되도록 제조된 시료를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동을 실시하여 세포에 존재하는 단백질들을 분리하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 폴리스틸렌 막(polystyrene membrane)으로 옮긴 후 인산화 형태의 NF-kB와 IkB 만을 인지하는 일차 항체(Cell Signaling Technology 회사에서 구입)와 대조군으로서 단백질 발현이 변화되지 않는 Actin을 인지하는 일차항체(Santa Cruz technology 회사에서 구입)를 각각 5시간 반응 시킨 후, 일차항체를 인지하는 이차항체(Cell Signaling Technology 회사에서 구입)를 1시간 동안 반응시켰다. 화학형광감지 시스템(chemiluminescence)(Amersham Pharmacia Biotechnology에서 구입)을 이용하여 단백질 변화량을 분석하였다.

그 결과 도 3.에 나타난바와 같이 LPS를 BV2 microglia 세포에 처리하면 대조단백질인 Actin의 양은 변하지 않았지만, IkB와 p65/NFkB 단백질의 인산화 형태가 증가하였다. 이와 같은 결과는 LPS가 IKK(IκB kinase) 활성을 통해 NF-kB 억제단백질인 IkB를 인산화시켜 IkB를 단백분해시킴으로써, NF-kB 활성형의 인산화 형태가 증가된 것을 의미한다. 이때, 본 발명의 디페닐프로페논 화합물(DK139)을 LPS와 병행 처리해주면 LPS에 의한 IkB와 NF-kB의 인산화 증가가 나타나지 않았다. 이러한 결과를 통하여 본 발명의 디페닐프로페논 화합물(DK139)은 염증반응에 의해 활성되는 NF-kB를 억제시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 리포터 실험을 이용한 디페닐프로페논 화합물(DK139)의 NF-kB 전사능(transcriptional activity) 억제효과

본 발명의 디페닐프로페논 화합물(DK139)에 의한 NF-kB 인산화 억제 효과가 직접적으로 NF-kB 활성을 억제시키는지 알아보기 위하여, 전사인자 NF-kB가 활성되면 루시퍼라제(Luciferase) 유전자 발현이 증가됨으로써 루시퍼라제 효소 활성이 증가되는 루시퍼라아제 리포터 실험법(luciferase reporter assay)을 이용하였다. BV2 microglia 세포에 루시퍼라제 유전자 발현 조절 부위에 NF-kB 결합 서열이 포함되어 있는 리포터 플라스미드(pNFkB-Luc; Staratagene에서 구입) 0.5㎍을 퓨진6(Fugene6; Roche에서 구입) 시약을 이용하여 세포내로 주입시킨 후, 48 시간 후에 1㎍/㎖ 농도의 LPS 단독 또는 LPS와 20μM 농도의 디페닐프로페논 화합물(DK139)을 병행 처리하였다. 약물 처리한 세포를 12시간 더 배양한 후 수확하여 면역블롯법과 동일한 방법으로 세포를 용해시킨 후, 세포 용액 단백질에 기질인 루시페린(luciferin)을 50㎕ 첨가하여 발광되는 루시페린 형광을 측정하였다. 루시페린 형광 측정은 Promega 회사에서 구입한 Dual-Glo Luciferase Assay System을 이용하여 Centro LB960 luminometer(Berthold Technologies)에서 측정하였다.

그 결과 도 4.에 나타난 바와 같이 LPS는 루시퍼라제 효소 활성을 약 2배 증가시켰다. 이와 같은 결과는 LPS가 NF-kB 활성을 유도하여 유전자 프로모터에 존재하는 NF-kB 조절 부위(NF-kB-regulatory element)를 활성화시켜 표적 유전자인 루시퍼라제 효소 유전자 발현이 증가되어, 결과적으로 루시퍼라제 효소 활성이 증가되었다는 것을 의미하는 것이다. 이때, 본 발명의 디페닐프로페논 화합물(DK139)을 LPS와 병행 처리한 실험군에서는 LPS에 의해 증가되는 루시페라제 효소 활성이 디페닐프로페논 화합물(DK139) 처리농도에 의존적으로 억제되는 것이 관찰되었다. 따라서 본 발명의 디페닐프로페논 화합물(DK139)은 microglial 세포에 작용하여 염증 유도인자 LPS에 의해 활성되는 NF-kB 활성을 억제시킨다는 사실을 확인하였다. 이러한 결과는, 본 발명의 디페닐프로페논 화합물(DK139)이 NF-kB 활성을 억제하여 신경계 염증질환의 예방 및 치료제로 활용될 수 있다는 사실을 의미하는 것이다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims

인 비트로에서 리포폴리사카라이드로 처리된 마이크로글리아(microglia) 세포에 하기 화학식 1로 표시되는 디페닐프로페논 화합물(E-3-(3,5-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-5-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온, (E)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)-1-(2-hydroxy-5-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one)을 처리하여 인 비트로에서 마이크로글리아(microglia) 세포의 NF-kB 활성을 억제시키는 방법.
[화학식 1]
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