KR101331005B1

KR101331005B1 - 알츠하이머 치매의 조기 진단용 조성물

Info

Publication number: KR101331005B1
Application number: KR1020110095050A
Authority: KR
Inventors: 조익훈; 정화진; 이창욱; 임현국; 류훈; 묵인희
Original assignee: 서울시립대학교 산학협력단; 서울대학교산학협력단; 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2013-11-20
Also published as: KR20130031464A

Abstract

본 발명은 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도를 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단용 키트 및 바이설파이트 (bisulfite) 및 PEG1 프로모터 특이 프라이머를 이용한 알츠하이머 치매의 조기 진단 방법에 관한 것이다.

Description

알츠하이머 치매의 조기 진단용 조성물 {Composition for early diagnosis of Alzheimer's disease}

본 발명은 알츠하이머 치매의 조기 진단용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도를 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단용 키트 및 바이설파이트 (bisulfite) 및 PEG1 프로모터 특이 프라이머를 이용한 알츠하이머 치매의 조기 진단 방법을 제공한다.

최근, Wnt 신호 전달 (Wnt signaling)이 배아 발생 과정의 조절뿐만 아니라 성인 조직의 항상성의 조절에도 중요한 역할을 하고 있다고 알려졌다. Wnt 신호 전달에 이상이 생기면, 기형 발생뿐만 아니라 여러 가지 질병과 관련된 현상들이 유도된다. Wnt 신호 전달의 이상은 각종 암의 발병을 유도할 뿐 아니라, 골다공증, 비만/당뇨, 알츠하이머 치매의 유발에도 관여한다고 밝혀져 왔다 (Moon et al. 2004 Nat Rev Genet 5:691-701).

알츠하이머 질환 (Alzheimer's disease, AD)은 피질 연합 부위와의 관련성에 기여하는, 언어상실증(dysphasia) (언어능력 및 언어능력 이해력 상의 장애를 갖는 언어 장애), 통합운동장애(dyspraxia) (운동 신경계 또는 감각 신경계 부존재로 인한 특정한 목적성 동작 및 몸짓을 조화시키고 수행하는 것이 불가능함) 및 실인증(agnosia) (객체, 인간, 음향, 형태 또는 향기를 인지할 수 있는 능력) 증상들과 함께 건망증을 특징으로 하는 전향적인 외피성 치매 질환이다.

강직성 반신마비 (하지 말단에 미치는 허약증)와 같은 특이 증상도 관련될 수 있다. 알츠하이머 질환의 발생은 연령과 비례하여 급격하게 증가한다. AD는 현재 치매의 가장 빈번한 원인이 된다. 이는 임상적으로 서서히 진행하여 침실 요양이 필요하고 대소변을 못 가리고 긴급성 보호에 의존하는 말기 환자를 초래하는 인지 기능상의 전체적인 쇠퇴증상으로 특징화된 질환이다. 평균적으로 진단 후 9년에 사망에 이른다. AD 발병률은 연령에 따라 급증한다. 미국 통계청은 2050년까지 80세 이상 노인 수가 3억 7천만 명에 달할 것으로 예상하였다. 현재, 85세 이상 인구의 50%가 AD가 발병한 것으로 추정된다. 따라서, 1억명 이상의 전세계 인구가 50년 내에 치매로 고통받을 것이다. 지속적인 보호 및 기타 서비스가 요구되는 다수의 환자들이 의료적, 경제적 및 인간적 문제로 고통받을 것이다.

본 발명에서는 각인 유전자 (imprinted gene)로 알려진 PEG1이 Wnt의 co-receptor인 LRP6의 당화 과정을 저해함으로써 Wnt 신호전달을 억제한다는 사실을 바탕으로 (Jung et al. 2011 Biochem. J. 1;436(2):263-9), 노화가 진행되어 PEG1 유전자의 imprinting이 조절되지 않으면 Wnt 신호전달의 이상이 일어나 신경퇴행(neurodegeneration)을 유발하여 알츠하이머 치매로 진행될 것이라는 가설을 입증하고자 하였다.

한국공개특허 제2011-0031989호에서는 '진단용 항체 검사법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0015038호에서는 'α-시뉴클레인 검출 및 퇴행성 신경질환 진단 조성물 및 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0101465호에서는 '퇴행성 신경질환 진단용 마커'가 개시되어 있다.

본 발명은 상기 요구에 의해 도출된 것으로, 본 발명자들은 알츠하이머 치매 환자의 혈액을 이용하여 PEG1 프로모터에 존재하는 CpG의 C의 메틸화 비율이 정상인보다 증가한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도를 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 바이설파이트 (bisulfite) 및 PEG1 프로모터 특이 프라이머를 이용한 알츠하이머 치매의 조기 진단 방법을 제공한다.

본 발명을 통해 기존의 치매 마커인 APOE로 일부 확인이 불가능했던 알츠하이머 치매 환자들까지 정확한 조기 진단을 하여 조기 약물 투여가 가능하므로 심각한 치매로의 진행을 지연시킬 수 있는 점에서 본 발명은 매우 유용하다.

도 1은 정상 노인의 PEG1 프로모터의 메틸화 양상을 나타낸다.
도 2는 치매가 아닌 정신 질환 노인의 PEG1 프로모터의 메틸화 양상을 나타낸다 (검은점; 메틸화된 CpG (CG), 하얀점; 메틸화되지 않은 CpG (TG)).
도 3은 알츠하이머 치매 노인의 APOE 유전자형 및 PEG1 프로모터의 메틸화 양상을 나타낸다 (검은점; 메틸화된 CpG (CG), 하얀점; 메틸화되지 않은 CpG (TG)).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도를 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 알츠하이머 치매의 발병 여부를 확인하는 것이다.

PEG1 (paternally expressed gene 1)의 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있으나 (NCBI Reference Sequence: NG_009226.1), PEG1의 기능 및 알츠하이머 치매와의 연관성은 전혀 알려지지 않았다.

본 발명자는 다음과 같은 입증을 통하여 PEG1 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도가 알츠하이머 치매의 조기 진단에 이용될 수 있음을 규명하였다.

구체적으로, 알츠하이머 치매 환자의 혈액으로부터 분리한 게놈 DNA에 바이설파이트 (bisulfite)를 처리하고, 상기 바이설파이트를 처리한 게놈 DNA를 주형으로 PEG1 프로모터 특이 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 상기 PCR 산물의 염기서열 분석을 수행한 결과, PEG1 프로모터의 CpG의 C의 메틸화 비율이 정상인의 것보다 높은 것을 확인하였다 (도 3).

본 발명의 알츠하이머 치매의 조기 진단은 PEG1 프로모터의 CpG의 C의 메틸화 비율이 정상인의 것보다 높거나 또는 낮은 것으로 진단할 수 있는데, 바람직하게는 정상인의 것보다 높은 것으로 진단할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

PEG1 프로모터의 메틸화 정도를 측정하는 제제는 바람직하게는 바이설파이트 (bisulfite) 및 상기 프로모터에 특이적으로 결합하는 프라이머이며, PEG1 유전자의 핵산 서열이 (NCBI Reference Sequence: NG_009226.1)에 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머를 디자인할 수 있다.

본 발명의 바이설파이트는 사이토신 (C)을 우라실 (U)로 바꾸는 물질이다. 그러나 메틸화된 사이토신 (C)과는 반응을 하지 못한다. 따라서, DNA에 바이설파이트를 처리하고 PCR을 수행하면 메틸화되지 않은 사이토신 (C)은 티민 (T)으로 바뀌므로, PCR 산물의 서열 분석을 통하여 CpG의 사이토신 (C)의 메틸화 정도를 결정할 수 있는 것이다.

본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트 (template)와 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 PEG1 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 알츠하이머 치매를 조기에 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 프라이머 세트이며, 상기 서열번호 1의 프라이머는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 2의 프라이머는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 알츠하이머 치매의 조기 진단용 조성물을 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 알츠하이머 치매의 조기 진단용 키트는 PEG1 프로모터의 메틸화 정도를 측정하는 제제를 포함하는데, 바람직하게는 바이설파이트, 상기 프로모터에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함한다.

본 발명의 키트에서, PEG1 프로모터에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트는 PEG1 프로모터를 이용하여 당업자가 용이하게 디자인할 수 있으며, 이와 같이 디자인된 프라이머 세트는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 바람직하게는 서열번호 1 및 2를 포함하는 프라이머 세트이다.

상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은

(a) 혈액으로부터 분리한 게놈 DNA에 바이설파이트 (bisulfite)를 처리하는 단계,

(b) 상기 바이설파이트를 처리한 게놈 DNA를 주형으로 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터 특이 프라이머를 이용하여 PCR (polymerization chain reation)을 수행하는 단계,

(c) 상기 PCR 산물의 염기서열 분석을 통해 CpG의 C의 메틸화 비율을 결정하는 단계 및

(d) 상기 결정된 CpG의 C의 메틸화 비율이 정상인의 것보다 높은 경우 치매로 진단하는 단계를 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 알츠하이머 치매 환자의 혈액에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 분리된 게놈 DNA에 바이설파이트를 처리하고, 상기 바이설파이트를 처리한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 PEG1 프로모터 특이 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 상기 PCR 산물의 염기서열 분석을 수행한 결과, PEG1 프로모터의 CpG의 C의 메틸화 비율이 정상인의 것보다 높은 경우 치매로 진단할 수 있는 것이다. 상기 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 공지된 방법을 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 혈액 시료

혈액 시료는 서울성모병원 정신과로부터 입수하였다. 총 15개의 시료를 입수하여 바이설파이트 시퀀싱 (bisulfite sequencing)을 수행하였다 : 3명은 정상노인, 6명은 양극성 장애 또는 우울증 같은 다른 종류의 정신질환 환자 (57.5±7.5세, mean±SD), 그리고 나머지 6명은 치매 환자 (72.7±11.7세)였다.

실시예 2. 게놈 DNA 의 분리

각 시료를 원심분리하여 (2500RPM, 5min) 혈구를 얻어낸다. 각 200μl의 혈구를 게놈 DNA 추출 키트 (BIONEER, K-3032)를 이용하여 게놈 DNA를 얻어낸다. 실험은 제공된 매뉴얼에 따라서 수행하였다.

실시예 3. 바이설파이트의 처리

각 시료로부터 얻어낸 게놈 DNA 500ng을 사용하였다. EZ DNA Methylation Kit (ZYMO RESEARCH, D5001)을 이용하여 CT 변환을 유도하고 정제한다. 실험은 제공된 매뉴얼에 따라서 수행하였다.

실시예 4. PCR 을 이용한 PEG1 프로모터 영역의 증폭

PEG1의 프로모터 영역을 증폭시키기 위해 PCR을 수행하였다. 프라이머는 정방향 : 5‘-TYGTTGTTGGTTAGTTTTGTAYGGTT-3' (서열번호 1), 역방향 : 5'-AAAAATAACACCCCCTCCTCAAAT-3' (서열번호 2)을 사용하였다. PCR은 95℃ 10분 (1cycle), 95℃ 30초 / 55℃ 35초 / 72℃ 40초 (40cycle), 72℃ 7분 (1cycle)의 조건을 사용하였다.

실시예 5. PEG1 프로모터 영역의 TA 클로닝

PCR 산물을 1% 아가로스 젤에 전기영동하고, 젤 절편을 얻어낸다. Gel extraction kit (ELPIS BIOTECH, EBD-1005)을 이용하여 DNA를 분리한다. 실험은 제공된 매뉴얼에 따라서 수행하였다. 이 PCR 산물을 pGEM-T easy vector system (Promega, A1360)을 이용하여 연결한다. 실험은 제공된 매뉴얼에 따라서 수행하였다.

실시예 6. PEG1 프로모터 영역의 클론 획득 및 플라스미드 DNA 분리

위의 연결 (ligation) 반응물로 E. coli (DH5α)를 형질전환시킨다. LB / 암피실린 / IPTG / X-Gal 플레이트에 배양하고, 다음날 12개의 콜로니를 LB / 암피실린 배지에 키운다. 그리고 그 다음날 12개의 클론을 plasmid DNA purification Kit (LaboPass, CMP0112)을 이용해 플라스미드 DNA를 분리한다. 실험은 제공된 매뉴얼에 따라서 수행하였다.

실시예 7. 시퀀싱 및 결과

각각의 플라스미드 DNA는 시퀀스 분석업체 (Bionics)에 의뢰하여 염기서열을 얻어낸다. 각각의 CpG 염기를 점 (dot)으로 표시하는데, 메틸화된 CpG (methylated CpG)는 검은 점 (closed dot) 그리고 메틸화되지 않은 CpG (unmethylated CpG)는 하얀 점 (open dot)으로 표시한다.

도 1은 바이설파이트 시퀀싱의 원리를 설명하는 간단한 도표와 정상노인의 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도를 나타낸 것이다. 바이설파이트는 시토신을 우라실로 바꾸어주는 물질이다. 하지만 바이설파이트는 메틸화된 시토신과는 반응하지 못한다. 이러한 원리를 이용하여 각인유전자의 CpG 염기의 메틸화정도를 측정할 수 있다. 각인유전자는 두쌍의 게놈중 한쪽의 CpG 염기가 메틸화되어 발현이 억제된 유전자를 의미한다. 따라서 정상의 경우 절반의 메틸화된 양상을 보여준다. 도 1에서 정상노인 3명의 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도는 52.8%임을 보여준다. 따라서 정상노화에 의한 결과임을 배제할 수 있다.

도 2는 양극성 장애 또는 우울증 같은 다른 종류의 정신질환 환자 6명의 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도를 나타낸 것이다. 이들의 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도는 54.2%임을 보여준다. 따라서 알츠하이머 치매를 제외한 다른 정신질환에 의한 결과임을 배제할 수 있다.

도 3은 6명의 알츠하이머 치매 환자의 APOE 유전자형 결과와 5명의 알츠하이머 치매 환자의 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도를 나타낸 것이다. APOE는 치매진단의 가장 대표적인 마커이지만, APOE 유전자 변형을 가지지 않은 알츠하이머 치매 환자는 42~68%에 이른다 (Pericak-Vance et al. 1997 J AmMed Assoc 278 : 1237-1241). 도 3은 6명의 알츠하이머 치매 환자 중 3명은 정상 APOE 유전자형을 가지고 있으며, 3명은 APOE 유전자 변형을 가지고 있음을 보여준다. 그 중 5명의 알츠하이머 치매 환자 (3명; 정상 APOE 유전자형, 2명; 변형 APOE 유전자형)의 PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도는 72.5%임을 보여준다. 이는 APOE 유전자형에 상관없이 알츠하이머 치매를 진단할 수 있는 방법임을 보여준다.

비교예 . RFLP 를 이용한 APOE genotyping

각각의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한다. 프라이머는 정방향 : 5‘- TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3' (서열번호 3), 역방향 : 5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCC-3' (서열번호 4)을 이용하였다. 94℃ 10분 (1cycle), 94℃ 30초 / 56℃ 30초 / 72℃ 1분 (32cycle), 72℃ 4분 (1cycle)의 조건을 이용하였다. 이 PCR 산물을 HhaI (5unit) 제한효소와 함께 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. NuSieve agarose (Lonza, 50091)를 이용하여 4% 아가로스 젤을 만들고, 위의 반응물을 100V, 40분의 조건으로 전기영동 하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

PEG1 (paternally expressed gene 1) 프로모터의 메틸화 (methylation) 정도를 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프로모터의 메틸화 정도를 측정하는 제제는 바이설파이트 (bisulfite) 및 상기 프로모터에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 알츠하이머 치매의 조기 진단용 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 알츠하이머 치매의 조기 진단용 키트.
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