KR101326688B1 - 아토피 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아토피 질환의 개선을 위하여, 메기의 담즙을 유효성분으로 함유하는 아토피 질환 치료용 약학적 조성물, 아토피 질환 개선용 화장료 조성물 및 아토피 질환 개선용 건강기능식품을 제공한다.

Description

아토피 치료용 조성물{Pharmaceutical composition for treating atopy}

본 발명은 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 아토피 치료용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 알르레기 반응은 우리 신체에 존재하는 물질에 대한 복잡한 면역반응이다. 건강한 면역계는 감염과 바이러스에 대항하는데 중요한 역할을 수행하지만, 알르레기 반응은 실제로는 유해한 물질에 대한 우리 면역계의 과민반응의 결과이다. 덧붙여, 피부는 인체에 있어서 가장 큰 면역학적 기관으로서 종종 알르레기 및 면역반응의 표적이 되곤 한다. 두드러기(urticaria), 혈관부종(angioadema), 접촉성 피부염(contact dermatis) 및 아토피성 피부염(atopic dermatis, AD)을 포함하는 알르레기성 피부 질환 중에서, 아토피성 피부염은 피부 장벽 기능장애와 알르레기원과 미생물과 같은 환경 인자 사이의 복잡한 상호작용과 관련된 유일한 질병이다(Incovaria et al., Clin. Exp. Immunol., 153: 27-29, 2003). 멜라닌세포(melanocyte)와 각질세포(keratinocyte)를 포함하는 모든 피부세포는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)와 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)을 생산한다(Pelle et al., J. Invest. Dermatol., 124: 793-797, 2005; Kornina and Pastore, Front. Biosci. 1: 123-141, 2005). 덧붙여, 피부세포로부터 생성된 ROS는 또한 지질 분자 또는 리폭시게나제(lipoxigenase)와 시클로옥시게나제(cyclooxygenase)와 같은 산화환원-민감성 지질대사 효소와 반응함으로써 지질 라디칼(lipid radical), 과산화물(peroxide), 히드로과산화물(hydroperoxide)와 같은 활성지질종(reactive lipid species) 또는 알데히드를 생산할 수 있다. 만성 염증질환인 아토피성 피부염은 그러한 산화환원균형을 붕괴시켜서 ROS, RNS의 과잉생산과 지질 과산화물의 높은 수준을 야기하는데, 이는 결국 질병상태를 악화시키고 Th2-편향된 면역반응 쪽으로 치우키게 한다(Briganti and Picardo, J. Eur. Acad. Dermatol., 17: 663-669, 2003; Wu et al., Clin. Exp. Immunol., 135: 194-199, 2004).

종래에 항산화제(예를 들어, 티올 N-아세틸-L-시스테인 또는 글루타티온)가 Th2 사이토카인인 IL-4와 IL-5를 하향조절한다고 보고된 바 있다(Bengtsson et al., Clin. Exp. Immunol., 123: 350-360, 2001). 따라서, 항산화제의 보충은 아토피성 피부염과 다른 피부 질환을 치료하기 이한 좋은 치료방법이 될 수 있다.

이와 관련하여 대한민국 특허 제913436호는 항산화 활성을 갖는 포도 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 예방 및 치료용 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 특허 제668290호는 항산화 활성을 갖는 애기수영 또는 애기수영 및 대황 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있다.

그러나 이러한 종래 기술들은 시험관 내 실험결과만으로 항산화 또는 항염증 효과가 있다는 결론에 도달하거나, 수급이 쉽지 않은 원료를 사용한다는 문제점이 있어 왔다.

본 발명을 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 저렴한 재료를 이용한 효율적인 아토피 질환 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 메기(Silurus asotus)의 담즙을 유효성분으로 하는 아토피 질환 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 메기(Silurus asotus)의 담즙을 유효성분으로 하는 아토피 질환 개선용 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 메기(Silurus asotus)의 담즙을 유효성분으로 하는 아토피 질환 개선용 건강기능식품이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 메기(Silurus asotus)의 담즙을 아토피 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 아토피 질환의 치료방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 메기탕 등 식품가공 과정에서 종래에는 폐기되던 메기의 쓸개 아토피 질환의 치료 및 개선을 위한 건강기능식품, 의약 및 화장품의 원료로 활용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 메기 담즙의 주요성분 분석 및 정량을 위한 HPLC-질량분석 그래프이다.
도 2는 대조군으로서 아스코르브산(Asc), 메기 담즙(SAB), 우르소디옥시콜린산(UDCA) 및 타우로콜린산(TCA)의 DPPH 소거능을 비교한 그래프(a) 및 상기 물질들의 히드록실기 매개 산화의 지표인 과산화수소수(H₂O₂) 및 Cu²⁺에 의한 BSA(bovine serum albumin) 분해 억제능을 비교한 폴리아크릴아마이드겔 전기영동(PAGE) 결과를 나타내는 사진(b)이다.
도 3은 메기 담즙(SAB)의 농도에 따른 LH 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 메기 담즙(SAB)의 농도에 따른 β-헥소아미니다제 방출 억제능을 보여주는 그래프(a) 및 항원에 의한 자극의 유무에 따른 β-헥소아미니다제 방출에 대한 영향을 보여주는 그래프(b)이다:
Cont: 대조군,
CsA: 싸이클로스포린, 및
DNP-HSA: 디니트로페닐화 인간 혈청 알부민.
도 5는 메기 담즙(SAB)의 농도에 따른 콘카나발린 A(concanavaline A, CoA)로 자극된 마우스 비장세포에서의 IL-2(a), IL-4(b) 및 INF-γ(c) mRAN 발현 정도를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다:
Cont: 대조군,
CsA: 싸이클로스포린, 및
ConA: 콘카나발린.
도 6은 아무 처리를 하지 않은 대조군, DNCB-유도 아토피성 피부염 모델 마우스, 메기 담즙(SAB)을 각각 1% 및 5% 투여한 상기 모델 마우스의 피부조직을 적출하여 조직학적 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진이다:
DNCB: 디니트로클로로벤젠, 및
SAB: 메기 담즙.
도 7은 아무것도 처리하지 않은 대조군 마우스, DNCB-유도 아토피성 피부염 모델 마우스, 및 메기 담즘(SAB)을 처리한 DNCB-유도 아토피성 피부염 모델 마우스로부터 적출된 림프절에서의 IL-2(a), IL-4(b) 및 INF-γ(c) mRAN 발현 정도를 RT-PCR로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
Cnt.: 대조군,
DNCB: 디니트로클로로벤젠, 및
SAB: 메기 담즙.

본 발명의 일 관점에 따르면, 메기(Silurus asotus)의 담즙을 유효성분으로 하는 아토피 질환 치료용 조성물이 제공된다.

메기(Silurus asotus)는 메기목 메기과의 민물고기로서, 몸길이 30~100 cm이며, 자신보다 작은 동물은 뭐든 잡아먹는 육식성 어류로서, 매운탕의 재료로 쓰이는 식용 물고기이다. 그러나, 메기 매운탕을 조리할 때, 통상적으로 내장 부분은 제거하여 폐기처분된다. 따라서, 폐기되는 메기의 내장 중 쓸개를 의약 재료로 활용하는 것은 경제적인 측면에서도 매우 유리한 일이다.

본 발명자들은 메기 담즙이 다른 육식 어류의 담즙과는 달리, 강한 항산화능을 가지고, 비장과 림프절과 같은 2차 림프성 기관에서 Th(helper T) 세포를 불활성화시키며, 동물모델에서 아토피 증상을 개선시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 메기 답즙의 치료학적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 메기 담즙을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13^th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18^th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 메기 담즙을 0.0001 내지 20 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%, 더 바람직하게는 0.5 내지 8%를 포함한다.

조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으나, 비경구 투여하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 국소 투여의 조성물은 임상적 처방에 따라 무수형 또는 수성형일 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 유효물질 기준으로 0.0001 내지 300 ㎎/kg이며, 바람직하게는 0.001 ~ 200 ㎎/kg이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 메기(Silurus asotus) 담즙을 유효성분으로 하는 아토피 질환 개선용 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 메기 담즙 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 각종 제형으로 제조될 수 있는데, 예를 들어, 각종 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저 등이 있으며, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 메기(Silurus asotus)의 담즙을 유효성분으로 하는 아토피 질환 개선용 건강기능식품이 제공된다.

상기 건강기능식품은 직접 환제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 액제 등의 제형으로 제조하여 사용할 수 있으며, 상기 메기 담즙 이외에 담체로서 제형에 따라 식품공전상 허용되는 식품첨가제가 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 각종 기호성 식품류, 예를 들어, 츄잉 껌, 라면 등의 면류, 사탕, 과자류, 시리얼, 빵류 등 각종 고상 식품에 첨가하여 스트레스 증상의 개선 및 예방 효과를 갖는 기능성식품을 제조할 수 있으며, 액제 제형으로 제조되는 경우에는 파우치, 음료 또는 다류로 제조될 수 있고, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등에 첨가하여 기능성식품으로 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 메기(Silurus asotus)의 담즙을 아토피 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 아토피 질환의 치료방법이 제공된다.

상기 메기 담즙은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으나, 비경구 투여하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 메기 담즙의 채취

완전히 자란 대한민국 강원도산 양식 메기(Silurus asotus)의 쓸개로부터 신선한 담즙을 채취하였고, 이를 멸균상태에서 동결건조하였다. 메기 담즙(Silurus asotus bile, SAB)을 정량한 후, 증류수에 0.1 g/mL의 농도로 희석한 후 사용전까지 -70℃에 보관하였다.

실험예 2: 메기 담즙 내의 우르소디옥시콜린산과 타우로콜린산의 정량

우르소디옥시콜린산(ursodeoxycholic acid, 이하, 'UDCA'로 약칭함)와 타우로콜린산(taurocholic acid, 이하, 'TCA'로 약칭함)을 물 또는 에탄올에 각각 20 mg/mL의 농도로 용해시켜 저장용액으로 사용하였다. 상기 저장용액을 희석하여 이용하여 2 내지 0.5 mg/mL의 농도 범위를 갖는 표준용액을 제조하였다. 시료는 상기 실시예에서 제조한 메기 담즙을 1 mg/mL의 농도로 희석하였고, XDB-C18 칼럼(4.6 mm × 150 mm)과 질량 검출기(Agilent LC/Ms VL, Agilent Technologies, USA)를 구비한 HPLC 시스템(Agilent 1100 series, Agilent Technologies, USA)을 이용하여 정량하였다. 상기 컬럼은 40℃로 유지하였고 유속은 0.8 mL/min으로 설정하였으며, HPLC 분석에 사용된 조건은 하기와 같았다: 최초 0분 내지 5분 구간 아세토니트릴/물(5:95)의 등용매(isocratic), 5분 내지 30분 구간 아세토니트릴/물(5:95) 에서 아세토니트릴/물(50:50)으로의 농도구배, 30분 내지 35분 구간 아세토니트릴/물(5:95)의 등용매. HPLC 검출은 단일 이온 모니터링 모드(음전하, 분자량: 514)로 수행되었다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 메기 담즙 내에 TCA이 다량 함유되어 있음을 발견하였다. 그 함량은 0.696 mg/ml이었다. 그러나, UDCA의 경우 HPLC 크로마토그램 상에서는 피크가 미미하게 나타나, 하기와 같이 표준품 UDCA를 1, 2, 5 10, 20 50, 100 ng/mL로 희석하여 HPLC-MS를 수행한 후, 검량곡선을 그려 정량하였으며, 그 결과, UDCA 함량은 0.0625 μg/mL임을 알 수 있었다.

실험예 2: 항산화 효과 분석

2-1: DPPH 라디칼 소거능 분석

DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼은 진한 보라색을 띠는 몇몇 안정적인 유기 질소 라리칼 중 하나로서, 다양한 항산화 물질의 유리 라디칼 소거능을 평가하기 위해 사용되는데, DPPH는 전자나 수소 라디칼을 수용하여 안정한 반자성(diamagnetic) 분자가 된다. 따라서, 본 발명자들은 메기 담즙과 주요 성분인 TCA와 UDCA가 항산화 활성을 갖는지 확인하기 위해, DPPH 라디칼을 상기 메기 담즙, TCA, 또는 UDCA와 각각 반응시킴으로써, DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 구체적으로, 동결건조된 메기 담즙을 증류수에 용해시켜 100 mg/mL의 저장농도로 조절한 다음 10 내지 100 μg/mL의 다양한 농도로 희석한 후, 상온에서 20분간 메탄올에 용해되어 있는 0.3 mM DPPH와 반응시킨 후, 517 nm에서의 흡광도를 측정하였으며, DPPH 라디칼 소거능은 하기의 식을 이용하여 계산하였다:

DPPH 라디칼 소거능 =

Ac: 대조 DPPH 용액 자체의 흡광도

A: 시료를 DPPH와 반응시켰을 때의 흡광도

As: 시료 자체의 흡광도.

상기 분석 결과, 메기 담즙은 100 μg/mL의 농도에서 20분동안 유리 라디칼을 유의하게 소거하는 것으로 나타났다. 반면, UDCA와 TCA 단독으로는 100 μg/mL의 메기 담즙과 비교할 때 100 μM 농도에서 조차도 효과적으로 유리 라디칼을 소거하지 못했다(도 2a).

2-2: 히드록실 라디칼 매개 산화 분석

본 발명자들은 상기와 같은 메기 담즙의 항산화 활성이 단배질 수준의 항산화 활성인지 확인하기 위해, 구리이온과 과산화수소수를 이용한 단백질 분해 분석 즉, 히드록실 라디칼-매개 산화분석을 수행하였다. 상기 히드록실 라디칼-매개 산화분석은 종래에 보고된 방법에서 약간 변형을 가한 금속-촉매 반응을 이용하여 수행되었다(Mayo et al., Biochim. Biophys. Acta., 1620: 139-150, 2003). 구체적으로 표적 단백질인 BSA(bovine serum albumin)를 150 mM 인산 완충용액(pH 7.3)에 용해시켜 최종 농도를 0.5 mg/mL로 조정한 후, BSA 용액을 100 μmol의 구리(Cu²⁺)를 함유하거나 함유하지 않고, 2.5 mmol H₂O₂를 처리한 상태에서 메기 담즙의 존재 또는 부존재시 반응시켰다. 대조 항산화제로는 50 μmol의 아스코르브산(ascorbic acid)을 PBS(phosphate buffered saline)에 직접 용해시켜 사용하였다. 반응은 37℃의 온도조건으로 교반수조(shaking water bath)에 안치된 개방된 시험관 내에서 수행되었고, 반응이 종료된 후 각 반응물을 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 분리하였고, 0.1% Commassie blue 염색액으로 염색하였다.

그 결과, 도 2b에서 나타난 바와 같이, 메기 담즙은 50 μM 농도의 아스코르브산과 비슷한 정도로 Cu²⁺과 H₂O₂에 의한 BSA의 분해를 억제하였다. 메기 담즙은 100 μg/mL의 농도에서 최대의 저해능을 보여줬고, 농도 의존적인 양상으로 유리 라디칼에 의한 BSA의 분해를 효과적으로 억제하였다.

실험예 3: 세포독성 분석

메기 담즙이 혹시 세포독성을 가지고 있다면, 설사 항산화 활성을 가지고 있다고 하더라도 의약이나 화장품으로 사용할 수 없다. 따라서, 본 발명자들은 메기 담즙이 세포독성을 나타내는지 확인하기 위해, 마우스 비장세포(splenocyte)와 RBL-2H3 비만세포와 마우스 유래의 비장세포(splenocyte)에서 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 방출 정도를 측정하였다. 배양중인 RBL-2H3 세포와 마우스에서 적출된 비장으로부터 분리된 비장세포에 다양한 농도의 메기 담즙(10 내지 500 μg/mL)을 처리한 후, 테트라졸리움염(tetrazolium salt)을 적색 포르마잔 산물(formazan product)로 변환시키는 연결 효소반응에 기반한 상용 비-방사성 LDH 키트(Promega, USA)를 이용하여 LDH의 농도를 측정하였다. 이 경우 배양액 상층에서의 포르마잔 산물의 양의 증가는 용해된 세포의 수의 증가와 직접적으로 연관되어 있다. 상기 포르마잔 산물은 분광광도계(Molecular Devices, USA)를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정함으로서 정량하였다. 시료에서의 세포독성은 1% Triton X-100으로 처리한 세포와 비교하여 방출된 LDH의 백분율로 결정되었다.

그 결과 도 3에서 나타난 바와 같이, 메기 담즙은 10 내지 100 μg/mL의 농도에서는 24시간까지 세포독성을 나타내지 않았으며, 높은 농도(> 500 μg/mL)에서는 LDH의 유의한 방출을 발견하였으며, 이는 이와 같은 높은 농도에서는 세포독성이 나타남을 의미한다. 500 μg/mL을 초과하는 고농도에서 세포독성이 나타났기 때문에, 이후 실험에서는 이와 같은 고농도의 메기 담즙은 사용하지 않았다.

실험예 4: β-헥소아미니다제 분비 분석

본 발명자들은 메기 담즙이 알르레기 반응을 얼마나 억제할 수 있는지 확인하기 위해, 메기 담즙 처리시 β-헥소아미니다제(β-hexoaminidase) 분비능을 분석하였다. β-헥소아미니다제는 비만 세포의 탈과립(degranulation)의 지표물질로서 비만세포에 DNP-HSA(dinitrophenylated human serum albumin)를 처리하여 탈과립을 유도한 후, 메기 담즙에 의한 β-헥소아미니다제 분비 억제능을 측정하였다. 구체적으로, 자극 전에 IgE를 제거하기 위해, 세포를 세포외 완충액(125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.5 mM CaCl₂, 1.5 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, pH 7,3)으로 4번 세척한 후, 0.1% BSA를 함유한 세포외 완충액 500 μl에 현탁된 400 ng/mL 디니트로페닐화 인간 혈청 알부민(DNP-HSA, Sigma, USA)으로 처리한 후 1시간 동안 37℃에서 반응시켜 상기 세포를 자극하였다. 자극 후, 50 μl의 상등액을 0.05 M 구연산 완충액(pH 4.5)에 용해된 1 mM p-니트로페닐 N-아세틸-β-글루코사민(p-nitrophenyl N-acetyl-β-glucosamine, Sigma, USA) 200 μl와 혼합한 후, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응은 0.05 M 탄산나트륨 완충액(pH 10.0) 500 μl를 첨가하여 종료시켰고 분광광도계(SupraMax340, Molecular Devices, USA)를 이용하여 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 반응액에서의 β-헥소아미니다제 분비는 IgE 대조군 대비 백분율로 계산하였다. 양성대조군으로는 강력한 면역억제제인 사이클로스포린(cyclosporin, CsA, Sigma, USA)를 사용하였다.

그 결과, 도 4a에서 나타나는 바와 같이, 메기 담즙은 100 μl/mL의 농도에서 RBL-2H3 비만세포로부터 β-헥소아미니다제의 분비를 효과적으로 억제하였는데(66.2%), 이는 양성대조군(60.3%)과 비교할 수 있는 정도였다. 반면, 항원의 자극이 없는 경우에는 다양한 농도의 메기 담즙 단독으로는 β-헥소아미니다제 분비에 영향을 미치지 않았다(도 4b).

실험예 5: 사이토카인 분비 분석

본 발명자들은 메기 담즙이 아토피 질환의 특징인 Th2 특이적 사이토카인의 분비를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여, 메디 담즙 처리후 다양한 사이토카인의 분비정도를 RT-PCR로 분석하였다. 구체적으로, 콘카나발린 A(concanavaline A, ConA)로 자극된 마우스 비장세포로부터 분리한 전체 세포로부터 전체 RNA를 Trizol 키트(Invitrogen, USA)로 추출한 후, 20 μl 반응부피에서 상기 전체 RNA 1 μg로부터 oligo dT 프라이머와 RT-PCR 키트(Improm-II reverse transcription system, Promega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 양성 대조군으로는 상기 실험예 4에서 사용한 사이클로스포린을 사용하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 삼아, 각종 사이토카인인 IL-2, IFN-γ, IL-4 및 IL-5 유전자를 표 1에 기재된 프라이머들을 이용하여 정량 RT-PCR용 기기(Rotor-Gene 6000, Corbett Research, Australia)로 증폭 정량하였다. RT-PCR 표준으로는 β-액틴을 사용하였다. PCR 반응은 95℃에서 10분간 초기 예열 후, 95℃ 15초 및 52℃ 15초 45회전 및 72℃ 10초의 연장반응을 통해 수행되었다.

유전자 증폭에 사용된 프라이머

유전자	프라이머	서열번호	염기서열	크기(bp)	GenBank 등록번호
IL-2	정방향	1	5'-gctctacagcggaagcacag-3'	235	NM_008366
	역방향	2	5'-gtcaaatccagaacatgccg-3'
IFN-γ	정방향	3	5'-gttctgggcttctcctcctg-3'	245	NM_008337
	역방향	4	5'-ctggctctgcaggattttca-3'
IL-4	정방향	5	5'-atatccacggatgcgacaaa-3'	252	NM_021283
	역방향	6	5'-aagcccgaaagagtctctgc-3'
IL-5	정방향	7	5'-gggggtactgtggaaatgct-3'	247	NM_010558
	역방향	8	5'-ttgcacagttttgtggggtt-3'
β-액틴	정방향	9	5'-ctaggcaccagggtgtgatg-3'	291	NM_007393
	역방향	10	5'-ctacgtacatggctggggtg-3'

상기 RT-PCR 실험 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, T 세포는 ConA에 의해 크게 활성화되었다. 그러나, IL-2, IFN-γ 및 IL-4의 mRNA 발현 수준은 50 μg/mL 보다 높은 농도의 메기 담즙으로 처리후에 유의하게 억제되었다. 특히, 메기 담즙은 Th2 사이토카인인 IL-4의 발현 억제 효과가 탁월하였다. 따라서, 이러한 결과는 ConA에 의한 자극 이후, 메기 담즙이 T 세포 유래 사이토카인, 특히 Th2 세포 유래의 사이토카인의 발현 및 방출을 효과적으로 조절할 수 있음을 분명히 보여주는 것이다.

실험예 6: 동물 모델에 대한 조직학적 분석

본 발명자들은 메기 담즙이 실제 동물 모델에서 아토피 증상을 개선할 수 있는지 확인하기 위하여, 아토피 모델 동물에 대하여 메기 담즙을 투여한 후 증상 개선 여부를 조사하였다. 구체적으로, BALB/c 마우스의 목에서 골반에 이르는 털이 제거된 2×4 cm 크기의 지역과 등쪽 피부에 피부염을 유발하는데 사용되는 아세톤에 용해된 1% DNCB(1,2-dinitrochlorobenzene, Sigma, USA) 100 μl을 7일 동안 매일 처리하여 감작시키고, 추가적인 5주동안 2일 간격으로 0.5% DNCB 100 μl을 반복적으로 처리하였다. 동시에, 상기 마우스의 전체 등쪽 피부를 대조 담체(아세톤:올리브유=4:1 혼합물) 또는 1 또는 5% 크림상으로 제조된 메기 담즙을 4주간 매일 처리하였다. 실험 마지막 날에는 실험 동물의 피부에 아무런 물질도 처리하지 않았다. 상기 마우스를 마취시킨 후, 피부와 림프절을 적출하여 분석을 수행하였다.

조직학적 분석 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이, 정상 마우스(대조군)에 비해 DNCB-처리 마우스의 피부가 더 두껍고, 메기 담즙을 처리한 마우스의 경우 피부 두께가 감소함을 알 수 있었으며, 더 고농도의 메기 담즙을 처리한 경우 아토피성 피부염-유사 피부의 회복면적의 증가를 나타냈다.

실험예 7: 동물 모델에 대한 분자생물학적 분석

본 발명자들은 상기 조직학적 분석에 더하여 상기 실험예 6에서 사용한 실험 동물로부터 적출된 림프절에서의 사이토카인의 발현 수준을 분석하였다. 구체적으로, 상기 1% DNCB로 감작된 마우스 림프절로부터 전체 RNA를 Trizol 키트(Invitrogen, USA)로 추출한 후, 상기 실험예 5에 기재된 방법대로 IL-2, IL-4 및 INF-γ mRNA 수준을 RT-PCR을 통해 분석하였고, 표준유전자로는 β-액틴을 사용하였다.

그 결과 도 7에서 나타난 바와 같이, 5% 메기 담즙은 IFN-γ 및 IL-4 mRNA의 발현을 효율적으로 억제하였는데, 이는 메기 담즙이 T 세포가 처음으로 수지상 세포와 만나고 그에 의해 활성화되는 장소인 림프절에서의 T 세포 활성화를 억제하는데 중요한 역할을 함을 시사하는 것이다.

통계처리

상기 실험예에서 그룹 사이의 차이를 결정하는데 사용된 통계분석은 Dunnet's post-hot 테스트를 수반한 Kruskal-Wallis 일원 변량분석 방법으로, SPSS 소프트웨어(v. 13)을 이용하여 수행되었으며, 통계적 유의성은 p < 0.05을 충족할 때 있는 것으로 정하였다.

제조예 1: 약학적 제제의 제조

1-1: 산제의 제조

메기 담즙 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2: 정제의 제조

메기 담즙 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3: 캡슐제의 제조

메기 담즙 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

1-4: 환의 제조

메기 담즙 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

1-5: 과립의 제조

메기담즙 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

제조예 2: 건강기능식품의 제조

건강기능식품은 인체의 건강증진 또는 보건용도에 유용한 영양소 또는 기능성분을 사용하여 정제, 캡슐, 분말(산제), 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조·가공한 식품으로서 식품의약품안전청장이 정한 것을 의미한다. 따라서, 상기 정제, 캡슘, 분말(산제), 과립 및 환의 제형은 상기 제조예 1에 기재된 바와 같이 제조가 가능하다. 따라서, 본 제조예에서는 상기 제조예 1에 언급되지 않은 액상 제형에 관한 내용만 기술한다.

2-1: 건강기능음료의 제조

메기 담즙 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강기능음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강식품 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

제조예 3: 화장료 조성물의 제조

3-1: 유연화장수의 제조

메기 담즙을 함유한 화장료 중 유연화장수의 제조예는 다음과 같으며, 이하, 표시되는 %는 모두 gram/vol %이다.

메기 담즙 5.0%

글리세린 5.0%

1.3-부틸렌글리콜 3.0%

알란토인 0.1%

DL-판테놀 0.3%

EDTA 0.02%

벤조페논-9 0.04%

소듐히알루로네이트 5.0%

니콜 HCO 60 0.4%

메틸 파라벤 0.2%

향 0.01%

증류수 잔량

합 계 100%

3-2: 영양화장수의 제조

메기 담즙을 함유한 화장료 조성물 중 영양화장수의 제조예는 다음과 같다.

메기 담즙 5.0%

글리세릴 스테아레이트 1.5%

스테아릴 알코올 1.5%

라놀린 1.5%

폴리솔베이트 60 1.3%

솔비탄스테아레이트 0.5%

경화식물유 1.0%

광물유 5.0%

스쿠알렌 3.0%

트리옥타노인 2.0%

디메치콘 0.8%

초산토코페롤 0.5%

카르복시비닐폴리머 0.12%

글리세린 5.0%

1.3-부틸렌글리콜 3.0%

소듐히알루로네이트 5.0%

트리 에탄올아민 0.12%

메틸파라벤 0.2%

향 0.02%

증류수 잔량

합계 100%

3-3: 영양크림의 제조

메기 담즙을 함유한 화장료 중 영양크림의 제조예는 다음과 같다.

메기 담즙 5.0%

친유형 모노스테아린산글리세린 2.0%

세테아릴 알코올 2.2%

스테아린산 1.5%

밀납 1.0%

폴리솔베이트 60 1.5%

솔비탄스테아레이트 0.6%

경화식물유 1.0%

스쿠알렌 3.0%

광물유 5.0%

트리옥타노인 5.0%

디메치콘 1.0%

소듐마그네슘실리케이트 0.1%

글리세린 5.0%

베타인 3.0%

트리에탄올아민 1.0%

소듐히알루로네이트 4.0%

메틸파라벤 0.2%

향 0.05%

증류수 잔량

합계 100%

3-4: 수렴화장수의 제조

메기 담즙 5.0%

글리세린 2.0%

1,3-부틸렌글리콜 3.0%

EDTA 0.05%

에탄올 7.0%

폴리옥시에틸렌경화피마자유 0.4%

방부제, 향, 색소 미량

정제수 잔량

합계 100%

3-5: 로션의 제조

수상인 정제수, 트리에탄올아민, 부틸렌 글라이콜을 70℃로 가열하여 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시켰다. 유화가 완료된 후 친수성 증점제인 잔탄검 2% 용액을 첨가하여 전체에 대해 0.05 중량%가 되도록 조절하였다. 상기 용액을 45℃로 냉각시킨 후, 메기 담즙, 향 및 색소를 첨가하고 혼합한 다음 30℃로 냉각하였다. 상기 로션의 조성은 하기와 같다.

메기 담즙 5.0%

글리세린 3.0%

카보머 0.1%

잔탄검 0.05%

1,3-부틸렌글리콜 3.0%

폴리글리세린-3 메틸글루코스 디스테아레이트 1.5%

글리세린 스테아레이트 0.5%

세테아릴 알코올 0.3%

호호바 오일 3.0%

유동 파라핀 2.0%

스쿠알렌 3.0%

디메치콘 0.5%

토코페릴아세테이트 0.2%

트리에탄올아민 0.1%

방부제, 향, 색소 미량

정제수 잔량

합계 100%

3-6: 겔의 제조

메기 담즙 5.0%

EDTA 0.02%

1,3-부틸렌글리콜 4.0%

카보머 0.6%

글리세린 5.0%

히드록시에틸 셀룰로오스 0.15%

트리에탄올 아민 0.5%

트리클로산 0.2%

에탄올 5.0%

폴리옥시에틸렌경화피마자유 4.0%

방부제, 향, 색소 미량

정제수 미량

합계 100%

3-7: 에센스의 제조

정제수에 점증제를 천천히 교반하면서 가하여 균일하게 분산시켰다. 수상 성분들을 혼합하여 수상을 제조하였다. 유화제, 피부 유연제, 향, 방부제에 에탄올을 가하여 용해시켰다. 수상에 알코올상을 교반하면서 가하고 알칼리제를 첨가하였다. 최종적으로 메기 담즙과 색소를 첨가하였다.

메기 담즙 5.0%

EDTA 0.05%

포타슘-세틸포스페이트 0.3%

글리세린 5.0%

1,3-부틸렌글리콜 4.0%

글리세릴스테아레이트/PEG-100 스테아레이트 0.5%

솔비탄스테아레이트 0.3%

호호바 오일 0.5%

마카데미아 넛 오일 0.5%

토코페릴아세테이트 0.5%

부틸레이티드히드록시 톨루엔 0.05%

디메치콘 3.0%

폴리아크릴아마이드/C13-14 이소파라핀/라우레쓰-7 1.5%

글리세릴폴리메타아크릴레이트/프로필렌 글리콜 5.0%

에탄올 3.0%

방부제, 향, 색소 미량

정제수 잔량

합계 100%

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

1. 메기(Silurus asotus)의 담즙을 0.5 내지 8 중량%로 함유하고 2차 림프성 기관에서 Th(helper T) 세포를 불활성화시키는 아토피 질환 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 메기는 자연산 또는 양식 메기인,
   아토피 질환 치료용 약학적 조성물.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 Th 세포는 Th2 세포인,
   아토피 질환 치료용 약학적 조성물.
5. 메기(Silurus asotus) 담즙을 0.5 내지 8 중량%로 함유하고 2차 림프성 기관에서 Th(helper T) 세포를 불활성화시키는 아토피성 피부 개선용 화장료 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 메기는 자연산 또는 양식 메기인,
   아토피성 피부 개선용 화장료 조성물.
7. 제5항에 있어서,
   영양크림, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 로션, 엣센스 또는 겔의 제형을 갖는,
   아토피성 피부 개선용 화장료 조성물.
8. 메기(Silurus asotus) 담즙을 0.5 내지 8 중량%로 함유하고 2차 림프성 기관에서 Th(helper T) 세포를 불활성화시키는 아토피 질환 개선용 건강기능식품.
9. 제8항에 있어서,
   상기 메기는 자연산 또는 양식 메기인,
   아토피 질환 개선용 건강기능식품.
   

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