KR101303226B1

KR101303226B1 - 대황 추출물에서 추출된 화합물을 포함하는 자외선에 대한 피부보호용 조성물

Info

Publication number: KR101303226B1
Application number: KR1020110108029A
Authority: KR
Inventors: 권태형; 박년호; 이진욱; 김태완; 김충곤; 허담; 문두환; 서명선; 추성태
Original assignee: 재단법인 경북해양바이오산업연구원
Priority date: 2011-10-21
Filing date: 2011-10-21
Publication date: 2013-10-15
Also published as: KR20130043872A

Abstract

본 발명은 대황 추출물 또는 이로부터 분리된 엑콜계 화합물을 유효성분으로 포함하며, 단일항산소(singlet oxygen, ¹O₂)와 같은 활성산소의 생성을 직접적으로 억제함으로써 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상에 대한 보호작용을 가지 조성물에 관한 것이다.

Description

대황 추출물에서 추출된 화합물을 포함하는 자외선에 대한 피부보호용 조성물 {Composition for protecting skin against ultraviolet rays comprising compounds extractd from Eisenia bicyclis}

피부 상태를 악화시키는 주된 현상인 피부노화의 원인은 크게 내인성 노화와 외인성 노화로 구분할 수 있다. 즉, 연령이 증가함에 따라 발생하는 것이 내인성 노화(intrinsic aging)이고, 자외선과 같이 외부 인자로 인한 노화를 외인성 노화(extrinsic aging)라고 한다. 특히 외인성 노화는 주로 자외선에 의해 노화가 진행되기 때문에 광노화(photo aging)라고도 불린다.

외인성 노화의 가장 큰 비중을 차지하는 태양광선 중의 자외선에 의한 광노화 과정에서는, 자외선에 의해 피부 표피에서 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 과도하게 생성된다.

단일항산소(singlet oxygen, ¹O₂)은 ROS 중에서 반응성이 가장 큰 비라디칼 활성종으로, 광증감제를 이용한 광증감반응(Type II)에 의하여 생성되며, 피부의 광노화에 있어서 핵심적인 역할을 한다. ¹O₂은 직접적으로 세포 손상에 참여하거나 콜라겐분해효소(collagenase, 예컨대, MMP-1)와 같은 단백질 분해효소를 유발시켜 결합조직의 절단과 같은 피부 구성성분들의 파괴작용을 유도함으로써, 피부의 광노화 및 광손상의 가장 큰 원인으로 작용한다.

생체 내에는 이들 활성산소를 제거할 수 있는 효소가 존재하지 않기 때문에, ¹O₂와 같은 활성산소의 생성을 억제 또는 이에 의한 세포 손상을 최소화하는 것이 광노화 및 광손상으로부터 피부를 보호하기 위한 전략으로 주목받고 있다.

이를 위하여, 기존에 알려진 항산화제들을 광노화 및 광손상에 대한 피부 보호제로 사용할 수 있는지를 검증하기 위한 여러 연구가 있었는데, 카로테노이드, 알파-토코페롤, 알파리포산, 아스타잔틴은 ¹O₂ 소거(quenching) 활성을 나타냈음에 반하여, 아스코르브산, 코엔자임 Q10 및 폴리페놀류, 예를 들어 카테킨에 속하는 EGCG((-)-epigallocatechingallate), 커큐미노이드에 속하는 커큐민, 스틸베노이드에 속하는 레스베라트롤, 탄닌류에 속하는 갈릭산, 리그난류에 속하는 세사민, 그리고 피로카테콜, 카페인산, 피로갈롤은 ¹O₂ 소거 활성이 없거나 매우 약한 활성을 나타내는 것으로 보고되었다 (Carotenoid Science, Vol.11, 2007, 16-20). 따라서, ¹O₂와 같은 활성산소의 생성을 직접적으로 억제하거나 이에 의한 피부의 광노화 및 광손상에 대한 보호작용이 검증된 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다.

한편, 대황(Eisenia bicyclis)은 갈조식물 다시마목(Laminariales) 미역과(Alariaceae)의 다년생 식물로, 일반적으로 일본과 우리나라 특히, 을릉도에 분포하고 조간대 하부 암반지역에 주로 서식한다. 통상적으로 길이는 서식처의 수심에 따라 차이가 있으나 큰 것은 1 내지 1.5m 이상이고, 4년까지 사는 다년생으로 유체는 주로 봄에 나타난다. 요오드와 칼륨이 다량 함유된 영양소와 독특한 맛으로 예로부터 다시마 대용으로서 식용으로 이용되고 있으며, 알긴산의 농도가 높아 최근 알긴산의 원료로 각광을 받고 있다.

대황과 관련하여, 국내특허등록 제10-0876922호는 대황 추출물을 포함하는 항균 조성물을 제공하고 있고, 국내특허공개 제10-2011-0057586호 대황을 주재로 한 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고 있고, 국내특허공개 제10-2011-0108751호는 대황 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 억제용 조성물을 제공하고 있다.

대황은 그 성분들이 확인되고 있으나, 그 효능이 명확하게 알려져 있지 않으며, 지금까지 알려진 대황 유래의 각종 생리활성 성분들 중에서 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상에 대한 보호작용을 하는 약리성분에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다. 따라서 본 발명자들은 대황의 여러 생리 활성 효능을 검색하던 중 대황 추출물에서 유래한 활성 화합물들이 ¹O₂와 같은 활성산소의 생성을 직접적으로 억제함으로써 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상에 대한 보호작용을 가짐을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 엑콜류 화합물을 포함하는 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. 바람직하게, 상기 엑콜류 화합물은 대황에서 추출한 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 엑콜류 화합물을 포함하는 대황 추출물을 포함하는 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 엑콜류 화합물을 포함하는 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 바람직하게, 상기 엑콜류 화합물은 대황에서 추출한 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 엑콜류 화합물을 포함하는 대황 추출물을 포함하는 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 대황 추출물 및 이로부터 분리한 활성 화합물들이 피부의 광노화 및 광손상의 중요한 원인인자인 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제하거나 또는 제거하는 항산화 효능을 갖는다는 것에 착안한 것이다.

피부는 계속해서 태양 광선에 노출되게 되는데, 자외선에 의해 피부 표피에서 단일항산소(singlet oxygen, ¹O₂) 등의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 과도하게 생성되어 피부 세포나 조직의 손상, 파괴, 돌연변이, 염증, 세포살상 및 피부 노화 등을 일으키게 된다. 본 발명의 대황 유래 화합물들은 상기 ¹O₂ 의 생성량을 유의적으로 감소시키는 것이 확인되었다.

따라서, 본 발명은 대황 또는 대황에서 추출한 화합물들을 포함하는 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 피부에 국소 적용됨으로서 자외선으로부터 피부를 보호하는 작용을 가질 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 약학 조성물일 수 있다.

또한, 바람직하게, 본 발명의 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 3의 화합물 중 어느 하나의 엑콜계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

본 발명에서 용어, '약학적으로 허용 가능한 염' 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 화합물들은 엑콜을 기본 구조로 가지고 있으며, 천연으로부터 분리 정제하거나, 화학적으로 합성 또는 상업적으로 구입하여 사용할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 화합물들은 대황(Eisenia bicyclis)에서 추출 및 분리한 것일 수 있다. 대황은 갈조류에 속하는 해양식물로서, 다시다목 미역과의 바닷말에 속하는 해조류이고, 통상적으로 길이는 서식처의 수심에 따라 차이가 있으나 큰 것은 1 내지 1.5m 이상이고, 4년까지 사는 다년생으로 유체는 주로 봄에 나타나고, 일반적으로 일본과 우리나라 특히, 을릉도에 분포하고 조간대 하부 암반지역에 주로 서식한다.

본 발명의 화합물들은 대황 추출물에 다량으로 함유되어 있으므로, 이들 화합물을 함유하는 대황 추출물 역시 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상 치료 또는 개선하는 용도로 사용될 수 있다.

따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 화학식 1 내지 3을 함유하는 대황 추출물을 포함하는 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 대황은 일본과 우리나라 동해안, 특히 울릉도나 독도 인근 해안에서 채집할 수 있으며, 대황 추출물은 상기 화합물들을 함유하는 한, 추출 방법 및 추출 용매를 불문하고 본 발명의 범위에 포함된다. 바람직하게, 본 발명의 대황 추출물은, 대황을 물, C3 내지 C5의 케톤, 및 C1 내지 C4의 직쇄 또는 분지형 알코올 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 얻어진 추출물, 그 추출물에서 물, C5 내지 C7의 알칸, C1 내지 C4의 직쇄 또는 분지형 알코올, 메틸렌클로라이드, 에틸 아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 분획된 추출물을 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 대황 추출물은 통상의 해조류 추출물의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 바람직하게는 열수 추출, 가압 추출, 환류 추출, 온침 추출, 냉침 추출, 초음파 추출 등에 의할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기한 바와 같이 제조된 추출물은 이후 감압 여과과정을 수행하거나 추가로 농축 및/또는 동결건조를 수행하여 농축하거나 용매를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명에서의 대황 추출물은 통상적 방법으로 건조된 건조물과 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물을 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 조성물은 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상을 치료 또는 개선하는데 사용될 수 있다. 자외선에 의한 피부의 광노화란 자외선에 의해 생성되는 활성산소종이 주요 원인이 되어 피부의 장력과 탄력이 약화되고 염증, 색소 침착, 주름과 같은 노화 과정이 발생 또는 진행된 상태를 의미한다. 자외선에 의한 피부의 광손상이란 자외선에 의해 생성되는 활성산소종이 주요 원인이 되어 피부 세포 또는 조직이 손상, 파괴, 세포살상, 염증 또는 발암 등이 발생 또는 진행된 상태를 의미한다. 바람직하게, 상기 자외선에 의해 생성되는 활성산소종은 단일항산소이다. 본 발명의 조성물은 이러한 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상을 억제, 완화, 개선하거나 치료하는데 사용될 수 있다.

상기 조성물 내의 상기 화합물 또는 대황 추출물의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 바람직하게는 0.001 내지 50중량%인 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분 외에도 당 분야에서 통상 사용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물이 의학적인 용도로 사용되는 경우에 약제학적으로 허용되는 통상의 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 화장품 등에 적용될 경우에는 화장품 분야에서 통용되는 통상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 의약으로의 제형화 시에는 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있으며, 화장품으로 제형화 시에는 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed., The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다. 상기 문헌들은 본 명세서의 일부로서 포함된다.

바람직하게, 상기 조성물은 계면활성제, 유화제, 비누산, 용매, 결합제, 희석제, 활택제, 안정제, 항료, 물, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 착색제, 보존제, 항생제, 항산화제, 소포제, 항균제, 항재침착제, 효소, 식물 또는 미네랄 오일, 지방, 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 보존제, 단백질, 실리콘, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 및 왁스로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 약리학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다.

상기 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 보다 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물의 투여량은 유효성분을 기준으로 1일 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg으로 하는 것이 좋으나 이에 제한되는 것은 아니다.　투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 정맥, 근육, 피하주사 등에 의해 투여되거나 피부에 도포될 수 있으며, 바람직하게는 피부에 국소 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 유효성분의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

화장료 조성물로 사용될 경우, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일과 같은 메이크업 제거제, 클렌징 폼, 비누, 바디 워쉬 등과 같은 세정제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 조성물은 ¹O₂와 같은 활성산소의 생성을 직접적으로 억제함으로써 자외선에 의한 피부의 광노화 또는 광손상에 대한 보호작용을 가지며, 약학 제제 또는 화장료로서 산업에 광범위하게 적용될 수 있다.

도 1은 대황 추출물의 활성 분획에서 분리한 3종의 화합물의 HPLC 프로필을 나타낸 것이다.
도 2는 화학식 1의 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 화학식 1의 화합물의 ¹³C NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 화학식 1의 화합물의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 화학식 1의 화합물의 HMQC 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 화학식 1의 화합물의 HMBC 스펙트럼을 나타낸다.
도 7는 화학식 2의 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 화학식 2의 화합물의 ¹³C NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 화학식 2의 화합물의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 나타낸다.
도 10는 화학식 2의 화합물의 HMQC 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 화학식 2의 화합물의 HMBC 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 화학식 3의 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 화학식 3의 화합물의 ¹³C NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 14는 화학식 3의 화합물의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 나타낸다.
도 15는 화학식 3의 화합물의 HMQC 스펙트럼을 나타낸다.
도 16은 화학식 3의 화합물의 HMBC 스펙트럼을 나타낸다.
도 17은 대황 추출물의 활성 분획에서 분리한 3종의 화합물의 단일항산소 소거 활성을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 대황으로부터 활성성분의 분리 및 정제

1-1. 활성 성분의 분리

대황 건조 분말(약 1.3 kg)을 메탄올로 추출한 후, 클로로포름과 에틸 아세테이트로 분배 추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 감압 농축한 후, 클로로포름-메탄올(50:1 -> 1:1 v/v, stepwise) 용매를 이용하여 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 용출 분획 중 활성을 나타낸 클로로포름-메탄올 (2:1) 분획을 감압 농축하여 물과 메탄올의 용매를 이용하여 ODS 컬럼 크로마토그래피를 실시하였으며, 그 결과 두 개의 활성분획 Fr. I과 Fr. II를 얻었다. 활성분획 Fr. I을 농축한 후 메탄올을 이용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시한 결과, 세 개의 활성 화합물 E-1, E-2, E-3을 정제하였다. 분리된 각 화합물의 HPLC profile (column: ODS 4.6φ x 150 mm; solvent: 10 -> 90% aqueous methanol (0-2분: 10% aqueous methanol, 2분-23분: 10 -> 100% methanol; flow rate: 1 ml/min; UV 296 nm)을 도 1에 나타내었다.

1-2. 화합물 E-1 (화학식 1의 화합물)의 화학구조 해석

활성화합물 E-1의 화학구조를 규명하기 위하여 CD₃OD에 녹여 ¹H NMR, ¹³C NMR, ¹H-¹H COSY, HMQC 및 HMBC 스펙트럼을 측정, 해석하였다.

¹ H NMR 스펙트럼의 측정 및 해석: ¹H NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 6.04, 5.98 ppm에서 aromatic singlet methine proton, 5.87 ppm에서 겹쳐진 두 개의 aromatic methine proton 및 5.85 ppm에서 한 개의 aromatic triplet methine proton이 관찰되었다. 이같은 ¹H NMR 스펙트럼은 본 화합물이 갈조류에 다량 함유된 폴리페놀계 화합물임을 나타내었다 (도 2).

¹³ C NMR 스펙트럼의 측정 및 해석: ¹³C NMR 스펙트럼을 측정한 결과, sp2 영역에서 두 개의 겹치는 탄소를 포함하여 18개의 탄소가 관찰되었다. 즉 123 - 161 ppm 사이에서 12개의 sp² 탄소가 관찰되었으며, 이들은 갈조류의 폴리페놀계 화합물에서 관찰되는 전형적인 oxygenated carbon으로 유추되었다. 고자장 영역인 94 - 100 ppm 사이에서 관찰된 6개의 탄소는 이들의 chemical shift로부터 이웃한 탄소에 산소가 결합하고 있음을 알 수 있었다. 이들 결과로부터 본 화합물은 갈조류의 대표적인 폴리페놀 화합물인 플로로탄닌계 화합물임을 유추할 수 있었다. 또한 고분해능 질량 (high-resolution mass) 분석에 의하여 분자식이 C₃₆H₂₂O₁₈로 규명되었으나 탄소수가 18개로 나타나 본 화합물이 symmetrical dimer임을 알 수 있었다. 본 화합물의 화학구조는 2D-NMR 스펙트럼의 측정 및 해석에 의하여 규명되었다 (도 3).

¹ H- ¹ H COSY 스펙트럼의 측정 및 해석: 화합물 E-1의 부분구조를 규명하기 위하여 ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 측정하여 해석하였다. 그 결과 플로로글루시놀 모이어티에 기인하는 부분구조가 규명되었다 (도 4).

HMQC 스펙트럼 및 HMBC 스펙트럼의 측정 및 해석: HMQC 스펙트럼을 측정하여 해석한 결과, 모든 proton-bearing carbon (¹J_C _-H)을 규명할 수 있었다 (도 5). 또한 HMBC 스펙트럼을 측정하여 해석한 결과, 5.87 ppm의 두 개의 aromatic methine proton과 5.85 ppm의 aromatic methine proton으로부터 관찰된 long-range correlation으로부터 플로로글루시놀 모이어티의 존재가 확인되었으며, 5.98 ppm의 singlet aromatic methine proton으로부터 관찰된 long-range correlation으로부터 펜타하이드록시벤젠 모이어티의 존재가 밝혀졌다. 또한 6.04 ppm의 singlet aromatic methine proton으로부터 100 ppm의 carbon에 long-range correlation이 관찰되어 치환된 하이드록시플로로글루시놀 모이어티의 존재가 확인되었다 (도 6).

이상의 결과로부터 본 화합물은 플로로탄닌계 화합물로 밝혀졌다.

화합물 E-1의 문헌 및 데이터베이스 검색: Mass 및 NMR 분석 데이터를 이용하여 문헌 및 데이터베이스를 검색한 결과, 본 화합물은 Eisenia arborea에서 분리, 보고된 바 있는 대표적인 플로로탄닌 계 화합물인 bieckol로 밝혀졌다. Bieckol은 6,6'-bieckol, 6,8'-bieckol, 8,8'-bieckol 등이 알려져 있으며, 이들은 각각 치환부위인 6번과 8번의 carbon chemical shift로부터 구별할 수 있다. 본 화합물의 6번 탄소의 carbon chemical shift는 100 ppm으로 이는 6,6'-bieckol과 일치하며 따라서 화합물 E-1은 다음의 화학식 1을 가지는 6,6'-bieckol로 동정되었다.

[화학식 1]

1-3. 화합물 E-2 (화학식 2의 화합물)의 화학구조 해석

활성화합물 E-2의 화학구조를 규명하기 위하여 E-1과 동일한 방법으로 CD₃OD에 녹여 ¹H NMR, ¹³C NMR, ¹H-¹H COSY, HMQC 및 HMBC 스펙트럼을 측정, 해석하였다.

¹ H NMR 스펙트럼의 측정 및 해석: ¹H NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 6.08, 6.06, 5.99 (x 2) ppm에서 네 개의 aromatic singlet methine proton과 5.83 - 5.86 ppm 사이에서 겹쳐진 여섯 개의 aromatic methine proton이 관찰되었다. 이같은 ¹H NMR 스펙트럼의 형태는 앞의 E-1 화합물과 매우 유사하였으며, 따라서 본 화합물 또한 갈조류에 다량 함유된 폴리페놀계 화합물임을 알 수 있었다 (도 7).

¹³ C NMR 스펙트럼의 측정 및 해석: ¹³C NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 일부 겹쳐진 signal을 합하여 36개의 탄소가 관찰되었다. 즉 123 - 161 ppm 사이에서 24개의 sp² 탄소가 관찰되었으며, 이들은 갈조류의 폴리페놀계 화합물에서 관찰되는 oxygenated carbon으로 유추되었다. 고자장 영역인 93 - 104 ppm 사이에서 관찰된 12개의 탄소는 이들의 chemical shift로부터 이웃한 탄소에 산소가 결합하고 있음을 알 수 있었다. 이들 결과로부터 본 화합물은 갈조류의 대표적인 폴리페놀 화합물인 플로로탄닌계 화합물임을 유추할 수 있었다. 본 화합물의 mass 분석 결과, 본 화합물은 앞의 E-1 화합물과 동일한 분자식(C₃₆H₂₂O₁₈)을 지녔으나 탄소피크가 36개로 나타나 symmetrical dimer는 아닌 것을 알았다. 본 화합물의 화학구조는 2D-NMR 스펙트럼의 측정 및 해석에 의하여 규명되었다 (도 8).

¹ H- ¹ H COSY 스펙트럼의 측정 및 해석: 화합물 E-2의 부분구조를 규명하기 위하여 ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 측정하였으며, 그 결과 두 개의 플로로글루시놀 모이어티에 기인하는 부분구조가 규명되었다 (도 9).

HMQC 스펙트럼 및 HMBC 스펙트럼의 측정 및 해석: HMQC 스펙트럼을 측정하여 해석한 결과, 모든 proton-bearing carbon (¹J_C _-H)을 규명할 수 있었다 (도 10). 또한 HMBC 스펙트럼을 측정하여 해석한 결과, 5.83 - 5.86 ppm의 aromatic methine proton으로부터 관찰된 long-range correlation으로부터 두 개의 플로로글루시놀 모이어티의 존재가 확인되었으며, 6.08과 5.99 ppm의 aromatic singlet methine proton으로부터 관찰된 long-range correlation으로부터 두 개의 펜타하이드록시벤젠 모이어티의 존재가 밝혀졌다. 또한 6.06 및 5.99 ppm의 aromatic singlet methine proton으로부터 각각 103.9, 100.2 ppm의 quaternary carbon에 long-range correlation이 관찰되어 두 개의 치환된 하이드록시플로로글루시놀 모이어티의 존재가 확인되었다 (도 11).

이상의 결과로부터 본 화합물은 E-1 화합물과 동일한 분자량을 지닌 플로로탄닌 계 화합물로 밝혀졌다.

화합물 E-2의 문헌 및 데이터베이스 검색: Mass 및 NMR 분석 데이터를 이용하여 문헌 및 데이터베이스를 검색한 결과, 본 화합물은 E-1 화합물과 동일하게 Eisenia arborea에서 분리, 보고된 바 있는 대표적인 플로로탄닌 계 화합물인 bieckol로 밝혀졌다. 특히 비대칭형의 탄소 시그널의 검출로부터 본 화합물은 다음의 화학식 2의 구조를 가지는 6,8'-bieckol로 규명되었다. 이는 6번 탄소의 chemical shift가 100.2 ppm, 8' 의 carbon chemical shift가 103.9 ppm으로 나타나 6,8'-bieckol과 일치함을 알 수 있었다.

[화학식 2]

1-4. 화합물 E-3 (화학식 3의 화합물)의 화학구조 해석

활성화합물 E-3의 화학구조를 규명하기 위하여 E-1, E-2와 동일한 방법으로 CD₃OD에 녹여 ¹H NMR, ¹³C NMR, ¹H-¹H COSY, HMQC 및 HMBC 스펙트럼을 측정, 해석하였다.

¹ H NMR 스펙트럼의 측정 및 해석: ¹H NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 6.05, 6.00 ppm에서 aromatic singlet methine proton, 5.83 ppm에서 겹쳐진 두 개의 aromatic methine proton 및 5.82 ppm에서 한 개의 aromatic methine proton이 관찰되었다. 이같은 ¹H NMR 스펙트럼은 본 화합물 또한 폴리페놀계 화합물임을 나타내었다 (도 12).

¹³ C NMR 스펙트럼의 측정 및 해석: ¹³C NMR 스펙트럼을 측정한 결과, sp² 영역에서 두 개의 겹치는 탄소를 포함하여 18개의 탄소가 관찰되었다. 즉 123 - 161 ppm 사이에서 12개의 sp² 탄소가 관찰되었으며, 이들은 갈조류의 폴리페놀계 화합물에서 관찰되는 전형적인 oxygenated carbon으로 유추되었다. 고자장 영역인 94 - 105 ppm 사이에서 관찰된 6개의 탄소는 이들의 chemical shift로부터 이웃한 탄소에 산소가 결합하고 있음을 알 수 있었다. 이들 결과로부터 본 화합물 또한 플로로탄닌계 화합물임을 유추할 수 있었다. 고분해능 질량 (high-resolution mass) 분석에 의하여 분자식이 C₃₆H₂₂O₁₈로 규명되었으나 탄소수가 18개로 나타나 본 화합물은 E-1 화합물과 유사한 symmetrical dimer로 유추되었다. 본 화합물의 화학구조는 2D-NMR 스펙트럼의 측정 및 해석에 의하여 규명되었다 (도 13).

¹ H- ¹ H COSY 스펙트럼의 측정 및 해석: 화합물 E-3의 부분구조를 규명하기 위하여 ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 측정하여 해석하였다. 그 결과 플로로글루시놀 모이어티에 기인하는 부분구조가 규명되었다 (도 14).

HMQC 스펙트럼 및 HMBC 스펙트럼의 측정 및 해석: HMQC 스펙트럼을 측정하여 해석한 결과, 모든 proton-bearing carbon (¹J_C _-H)을 규명할 수 있었다 (도 15). 또한 HMBC 스펙트럼을 측정하여 해석한 결과, 5.83 ppm의 두 개의 aromatic methine proton과 5.82 ppm의 aromatic methine proton으로부터 관찰된 long-range correlation으로부터 플로로글루시놀 모이어티의 존재가 확인되었으며, 6.05 ppm의 aromatic singlet methine proton으로부터 관찰된 long-range correlation으로부터 펜타하이드록시벤젠 모이어티의 존재가 밝혀졌다. 또한 6.00 ppm의 aromatic singlet methine proton으로부터 104.1 ppm의 quaternary carbon에 long-range correlation이 관찰되어 치환된 하이드록시플로로글루시놀 모이어티의 존재가 확인되었다 (도 16).

이상의 결과는 본 화합물 또한 E-1, E-2 화합물과 동일한 bieckol 화합물임을 나타내었다.

화합물 E-3의 문헌 및 데이터베이스 검색: Mass 및 NMR 분석 데이터를 이용하여 문헌 및 데이터베이스를 검색한 결과, 본 화합물은 Eisenia arborea 에서 분리, 보고된 바 있는 대표적인 플로로탄닌 계 화합물인 bieckol로 밝혀졌다. 본 화합물은 bieckol 중에서도 dimer를 형성하는 quaternary carbon의 chemical shift가 104.1 ppm으로 8,8'-bieckol과 일치하며, 따라서 화합물 E-3의 화학구조를 8,8'-bieckol로 동정하였으며, 이를 다음의 화학식 3으로 나타내었다.

[화학식 3]

실시예 2. 대황에서 분리한 활성 성분의 단일항산소 ( ¹ O ₂ ) 소거능 측정

대황에서 분리한 화합물들의 광손상에 대한 보호 효과를 확인하기 위하여, 광증감제인 로즈 벤갈(rose Bengal, RB)의 광증감 반응에 의해 생성된 단일항 산소의 소거능을 측정하기 위해 Suh 등(Hwa-Jin Suh et al., Journal of photochemistry and photobiology B:102, 102-107, 2011)의 방법을 따라서 RB-RNO-imidazole bleaching 방법으로 광발생되는 단일항산소를 측정하였다.

반응시료는 2 uM 로즈 벤갈, 3 uM N,N-디메틸-4-니트로아닐린 (N,N-dimethyl-4-nitrosoaniline, RNO) 과 2mM 이미다졸을 실시예 1에서 분리한 각 화합물 시료에 첨가하여 20 ℃ 에서 2분간 100 W/m²의 백색광에 노출시킨 후 분광광도계로 350nm에서 700nm까지 difference spectrum을 측정하였다. 대조구로서 단일항산소 억제제로 잘 알려져 있는 히스티딘의 효과도 같이 나타내었다.

그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 3종의 화합물 모두 농도의존적으로 우수한 단일항산소 소거 활성을 나타내었다.

Claims

하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하며, 단일항산소 소거능을 가지는, 자외선에 의한 피부의 광노화 치료용 약학 조성물.
[화학식 2]
제1항에 있어서, 상기 화합물은 대황(Eisenia bicyclis)으로부터 추출된 것인 조성물.
하기 화학식 2의 화합물을 함유하는 대황(Eisenia bicyclis) 추출물을 포함하며, 단일항산소 소거능을 가지는, 자외선에 의한 피부의 광노화 치료용 약학 조성물.
[화학식 2]
하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 화장품에 허용되는 염을 포함하며, 단일항산소 소거능을 가지는, 자외선에 의한 피부의 광노화 개선용 화장료 조성물.
[화학식 2]
제4항에 있어서, 상기 화합물은 대황(Eisenia bicyclis)으로부터 추출된 것인 조성물.
하기 화학식 2의 화합물을 함유하는 대황(Eisenia bicyclis) 추출물을 포함하며, 단일항산소 소거능을 가지는, 자외선에 의한 피부의 광노화 개선용 화장료 조성물.
[화학식 2]
제6항에 있어서, 상기 조성물은 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업 제거제 및 세정제로 구성되는 군으로부터 선택된 1종의 제형을 가지는 것인 조성물.