KR101296853B1

KR101296853B1 - 하고초 추출물을 포함하는 당뇨병성 죽상 경화증 치료 및 예방용 조성물

Info

Publication number: KR101296853B1
Application number: KR1020100120189A
Authority: KR
Inventors: 이호섭; 강대길; 이혜숙; 이윤정; 황선미
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2013-08-14
Also published as: KR20120058756A

Abstract

본 발명은 당뇨병성 죽상 경화증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 하고초 추출물을 단독 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 죽상 경화증 예방 및 치료용 약학 조성물과, 하고초 추출물을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 하고초 추출물은 NF-κB의 활성화 억제와 항산화 작용을 통해 고포도당으로 유도된 세포 부착 단백질의 발현을 현저히 감소시킴으로써 당뇨병성 죽상 경화증을 예방 및 치료할 수 있다.

Description

하고초 추출물을 포함하는 당뇨병성 죽상 경화증 치료 및 예방용 조성물{A composition for treating or preventing diabetic atherosclerosis comprising the extract of Prunella vulgaris}

본 발명은 당뇨병성 죽상 경화증 치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 하고초 추출물을 단독 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 죽상 경화증 치료 및 예방용 약학 조성물과, 하고초 추출물을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

혈관 내피 세포의 손상에 따른 단핵구 세포와 혈관 내피 세포간의 염증 반응은 초기 죽상 동맥 경화증의 중요한 병태 생리이다(Ross R. Nature 362(6423):801-809, 1993; Steinberg D. Nat Med 8(11):1211-1217, 2002). 비만, 당뇨병, 고혈압 및 고지혈증 등의 질환에서는 죽상 동맥 경화증과 같은 혈관 합병증의 발생 빈도가 높다(Mensah GA, et al., Cardiol Clin 22(4):485-504, 2004; Prabhakaran D and Anand SS. Vasc Med 9(1):55-68, 2004).

특히, 당뇨병의 경우 혈당이 많으면 지방대사에 장애가 오므로 동맥경화가 진행되어 당뇨병의 합병증인 당뇨병성 죽상 경화증은 주로 동맥경화로 기능을 잃은 혈관에서 일어난다. 이들 질환에서는 산화 스트레스가 증가되어 있고, 증가된 산화스트레스는 혈관 내피 세포 및 혈관 평활근 세포의 염증 반응에 중요한 역할을 하는 핵 전사 인자-κB (NF-κB)를 활성화하여 혈관 세포 부착 분자 (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1), 세포간 유착 분자 (intercellular adhesion molecules, ICAM-1), 내피 세포 셀렉틴 (endothelial cell selectin, E-selectin) 등의 CAMs (cell adhesion molecules) 및 단핵구 주화성 인자 (monocyte chemoattractant protein, MCP-1), 인터루킨-8 등의 발현을 증가시킨다(Kunsch C and Medford RM. Circ Res 85(8):753-766, 1999; Braun M, et al., Atherioscler Thromb Vasc Biol 17(11):2568-2575, 1997; Barks JL, et al., J Immunol 159(9):4532-4538, 1997).

CAMs는 유도성 물질이어서 인터루킨-1과 종양괴사인자-α (TNF-α) 등의 염증성 사이토카인에 의하여 발현이 증가된다(Schonbeck U and Libby P. Circ Res 89(12):1092-1103, 2001; Dustin ML, et al., J Immunol 137(1):245-254, 1986). 게다가 CAMs의 발현은 다양하게 이루어지며 성장 인자(growth factor), 혈소판 활성인자(platelet activators) 및 화학주성인자(chemotactic factor)에 의한 복잡한 조절 기전이 관여하는 것으로 추정된다. CAMs은 토끼와 생쥐 뿐만 아니라 사람의 관상 동맥과 죽상 경화성 병변 부위에서 발견되며, 신생혈관 및 염증성 침범 부위의 죽상 경화성 플라그 형성에 관여하는 것으로 보고되어 왔다(Iiyama K, et al., Circ Res 85(2):199-207, 1999; Lessner SM, et al., Am J Pathol 160(60):2145-2155, 2002; Vandel Wal AC, et al., Am J Pathol 141(6):1427-1433, 1992; O'Brien KD, et al., J Clin Invest 92(2):945-951,1993; ManduteanuI, et al., Eur J Pharmacol 477(3):269-276, 2003).

본 발명자들은 부작용이 없으면서도 세포 부착 분자의 발현을 억제하여 당뇨병성 죽상 경화증을 초기에 예방 및 치료할 수 있는 천연물을 탐색하던 중 하고초 추출물이 고포도당으로 유도된 세포 부착 분자의 발현을 억제함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 한 관점은 하고초 추출물을 단독 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 죽상 경화증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용된 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 관점은 상기 하고초 추출물을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물 중 하고초 추출물은 물로 추출되고 여과하여 수득된 것이 바람직하다.

본 발명의 하고초 추출물은 세포 부착 단백질(CAMs)의 발현을 억제하고, 이를 통해 단핵구의 혈관 내피 세포로의 부착을 억제한다.

본 발명에 따른 하고초 추출물의 CAMs 발현 억제는 NF-κB의 활성화 억제에 의한 것이다.

또한, 본 발명에 따른 하고초 추출물의 CAMs 발현 억제는 항산화 작용에 의한 것이다.

본 발명의 하고초 추출물은 NF-κB의 활성화 억제와 항산화 작용을 통해 세포 부착 분자의 발현을 억제하여 당뇨병성 죽상 경화증을 초기에 예방 및 치료할 수 있다.

도 1a는 고포도당에 의해 유도된 CAMs 발현에 대한 하고초 추출물의 영향을 ELISA로 확인한 것이다.
도 1a는 고포도당에 의해 유도된 CAMs 발현에 대한 하고초 추출물의 영향을 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 2는 혈관 내피 세포에 BCECF-AM으로 염색 표지된 단핵구의 부착을 확인한 사진 및 HL-60 부착율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 하고초 추출물이 NF-κB 핵 전사 인자 활성에 미치는 영향을 혈관 내피 세포에서 확인한 것이다.
도 4는 하고초 추출물의 항산화 효과를 확인한 것이다.

본 발명은 하고초 추출물을 단독 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 죽상 경화증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 하고초 추출물을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하도록 한다.

본 발명의 하고초 추출물은 고포도당에 의해 유도된 세포 부착 단백질(CAMs)의 발현을 억제할 수 있다(실시예 2와 3 및 도 1 참조). 상기 CAMs는 E-selectin, VCAM- 1(vascular cell adhesion molecule-1), ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule-1) 중 적어도 하나일 수 있다.

본 발명의 하고초 추출물은 CAMs의 발현 억제를 통하여 실질적으로 혈관 내피 세포로 단핵구의 부착을 억제할 수 있다(실시예 4 및 도 2 참조).

본 발명의 하고초 추출물의 CAMs 발현 억제는 NF-κB의 핵 내 전위를 억제하여 이루어진다(실시예 5 및 도 3 참조).

본 발명의 하고초 추출물의 CAMs 발현 억제는 항산화 작용에 의하여 이루어진다(실시예 6 및 도 4 참조).

따라서, 본 발명의 하고초 추출물은 NF-κB의 활성화 억제와 항산화 작용을 통해 고포도당으로 유도된 세포 부착 단백질의 발현을 현저히 감소시킴으로써 당뇨병성 죽상 경화증을 예방 및 치료할 수 있다.

이에, 본 발명은 하고초 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 죽상 경화증 치료 및 예방용 조성물을 제공한다.

본 발명의 유효성분인 하고초는 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 한약재이므로, 이로부터 추출된 본 발명의 추출물 역시 독성 및 부작용을 일으킬 가능성은 없다.

하고초 (Prunellavulgaris)는 꿀풀과에 속하는 다년생 풀인 꿀풀의 전초를 말린 것으로 우리나라 각처에 나는 여러해살이 풀이다. 맛은 쓰고 매우며 성질은 차다. 간경에 작용하고, 열을 내리고 해독하며 눈을 밝게 한다. 약리실험에서 강압작용, 이뇨작용, 억균작용 등이 밝혀졌다. 연주창, 영류, 유서선염, 두창, 옹종, 간화로 눈이 충혈되면서 붓고 아픈데, 부종, 구안와사, 대하 등에 쓴다. 고혈압병, 폐결핵, 유행성간염 등에도 쓸 수 있다.

본 발명의 하고초 추출물은 물로 추출되고 여과하여 수득된 것이 바람직하다.

본 발명의 하고초 추출물은 주요 성분으로 페놀산(phenolic acid), 로즈마린산(rosmarinic acid), 카프산(caffeic acid), 캄페롤(campherol), 루틴(rutin), 트리테르페노이드(triterpenoids), 탄닌(tannins) 등을 포함한다.

본 발명의 하고초 추출물을 함유하는 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등 경구 투여용 제형, 멸균 주사용액, 좌제 및 경피 투여용 제제로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리통, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제형화한다.

한 양태로서, 본 발명의 하고초 추출물은 경구 투여용 고상 제제로 제형화할 수 있다. 경구 투여를 위한 고상 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되는데, 이러한 고상 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 에를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 하고초 추출물을 함유한 약학 조성물을 경구 투여용 액상 제제로 제형화할 수도 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 이러한 액상 제제에는 통상적으로 사용되는 불활성 희석제 (예를 들면, 정제수, 에탄올, 리퀴드 파라핀) 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명의 하고초 추출물을 함유한 약학 조성물은 비경구, 바람직하게는 복강내 투여를 위한 제제로 제형화될 수도 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 멸균된 수용액으로는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 적절한 완충용액을 이용할 수 있으며, 비수성용제로, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 이용될 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 이용할 수도 있다. 한편, 좌제의 경우에는 이의 통상적인 기제인 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 조성물은 유효량으로 비경구 또는 경구(경피, 피하, 정맥, 근육, 복강 등)를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 "유효량"이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별, 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 보다 바람직하게는 10~1000㎍/체중kg/day의 유효량으로 투여될 수 있다.

본 발명의 하고초 추출물은 식품학적으로 허용된 담체와 혼합하여 식품 조성물로서 제공될 수 있다. 본 발명의 하고초 추출물을 식품 또는 음료 첨가물로 사용할 경우, 상기 하고초 추출물을 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 하고초 추출물의 혼합양은 그의 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

건강을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우, 상기 하고초 추출물은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에, 장기간 복용이 가능하다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿류, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

음료수로 제형화할 경우에 하고초 추출물 이외에 첨가되는 액체 성분으로는 이제 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드 (예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드 (예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드 (예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제[타우마린, 스테비아 추출물 (예, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(예, 사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 조성물 전체 중량당 10 내지 20 중량%의 범위에서 선택할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 세포배양실험

세포 배양실험

인간 혈관 내피 세포 (human umbilical vascular vein endothelial cells, HUVECs)는 Cascade Biologics (Portland Oregon)로부터 구입하였다. 세포 배양은 2% LSGS (low serum growth supplement: Cascade Biologics), 2 mM L-글루타민 등을 함유한 M200에서 5% 이산화탄소 배양기로 37℃ 조건에서 진행하였다. 배양액은 3-4일 간격으로 갈아주었으며, 세포가 배양접시 면적의 80% 이상 자라게 되면 0.25% 트립신-EDTA (GIBCO BRL, Itersburg, MD, USA)를 처리하여 계대하였으며, 7회 이상 계대하지 않았다. HL-60 단핵구 세포주는 RPMI1640 + 10% FBS(fetal bovine serum) 배지에서 배양하였다.

실시예 2. 고포도당에 의한 세포 표면 단백질 발현 억제 효과 검증

2-1. 실험방법

Cell Enzyme-Linked Immunosorbent assay

혈관 내피 세포 표면에서 VCAM-1, ICAM-1, E-selectin의 발현 정도는 cell ELISA를 이용하여 측정하였다(Manduteanu I, et al., Eur J Pharmacol 477(3):269-276, 2003). 96구판에 내피 세포를 1 x 10⁴세포/판 분주하여 배양한 후 충분히 자란 상태가 되었을 때 하고초 추출물을 농도별로 첨가하여 30분 배양 후 포도당을 25 mM의 농도로 처리하고 24 시간 후에 배양 상층액을 제거하고 PBS로 3회 세척한 후 1% 포름알데히드로 20 분간 실온에서 고정하였다. PBS로 3회 세척한 후 1% BSA/PBS를 각 구에 200 ㎕씩 넣고 37℃에서 30 분간 반응시켰다. 상층액을 제거한 후 1,000배 희석된 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin 단클론 항체를 각 구 당 100 ㎕씩 넣고, 4℃에서 하룻밤 반응시킨 후 PBS로 3번 세척하였다. 2,000배로 희석된 퍼옥시다제 접합된 고오트 항-마우스 IgG를 2차 항체로 각 구당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. 100 ml 0.05 M 구연산-인산 완충액(citrate-phosphate buffer)에 녹인 40 mg O-페닐디아민(O-phenylenediamine; Sigma, USA)과 10 ㎕ H₂O₂가 포함된 퍼옥시다제 기질 발색용액을 각 구 당 100 ㎕씩 넣어 실온에서 30분간 발색시킨 후 5N H₂SO₄용액을 동량 넣어 반응을 정지시켰다. 이를 컴퓨터가 부착된 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2-2. 실험결과

하고초 추출물이 혈관 내피 세포에서 고포도당에 의한 CAMs(cell adhesion molecules)의 발현에 어떤 영향을 미치는지를 알아보기 위하여 cell ELISA 방법을 실시하였다. 그 결과, 고포도당으로 유도한 경우 VCAM-1, E-selectin은 대조군과 비교시 1.7배 정도 증가하였고(P<0.01, vs. 대조군), ICAM-1은 2.1배 정도 증가하였다(P<0.01, vs. 대조군). 그러나 하고초 추출물 전처리한 후 고포도당 유도시 CAMs의 발현(P<0.01, vs. HG treated alone)이 모두 10 ㎍/ml에서 유의적으로 감소하였다(도 1a).

실시예 3. 고포도당으로 증가된 CAMs 단백질 발현에 대한 하고초 추출물의 억제 효과 검증

3-1. 실험방법

단백질 분리와 웨스턴 블롯 분석

세포를 수집하여 용균 완충액으로 용해시켜 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 브래드포드(Bradford)법으로 정량하고(Bradford MM. Anal Biochem 72:248-254, 1976), 10% SDS-PAGE로 전기영동하였다. 전기영동 후 웨스턴 트랜스퍼 장치(western transfer apparatus; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 겔 내 단백질들을 니트로셀루로오스 멤브레인(Amersham, Buckingg hamshire, England)에 전이시켰다. 멤브레인을 5% (w/v) 무지방 건조 밀크에 1시간 동안 담가 비 특이적인 결합을 방지하였고, 블로킹된 멤브레인에 1차 항체로 ICAM-1 (Zymed Lab, San Fransico, USA), VCAM-1, E-selectin (R&D Systems, Minneapolis, MN), β-actin (Santa Cruz Biotechnology, USA)을 이용하여 1:1000 비율로 희석해 4℃에서 반응시켰다. 그 후 TBS-T에 1:2000으로 희석한 HRP-접합된 항-마우스 혹은 고오트 IgG 항체와 상온에서 반응시키고, TBS-T로 충분히 세척하고 화학 발광기를 이용하여 발현 측정 후 정량하였다.

3-2. 실험결과

CAMs는 주로 혈관 내피 조직에 단핵구가 결집하는 것을 담당하고, 죽상 경화성 혈관 손상을 초래하며, 죽상 경화성 플라그 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 고포도당에 의한 혈관 내피 세포의 단핵구 부착에 대한 하고초 추출물의 억제 효과가 혈관 내피 세포의 CAMs 발현이 억제되어 발휘되는지 여부를 조사하였다. 도 1b는 고포도당에 의한 VCAM-1, ICAM-1, E-selectin 단백질 발현에 하고초 추출물이 미치는 영향을 나타낸 것이다. 전혀 처리되지 않은 혈관 내피 세포 대조군은 VCAM-1, ICAM-1, E-selectin의 단백질 발현이 아주 미약하지만, 고포도당을 처리하였을 때 VCAM-1, ICAM-1, E-selectin의 단백질 발현은 유의적으로 증가하였다. 그러나 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin의 단백질 발현이 하고초 추출물 처리시 유의적으로 감소하였다. 하고초 추출물은 혈관 내피 세포의 CAMs 단백질의 발현을 억제시킴으로써 혈관 내피 조직에 단핵구의 부착을 억제할 수 있다는 것을 결과를 뒷받침해주고 있다(도 1b).

실시예 4. 하고초 추출물에 의한 단핵구 세포 유착 억제효과 검증

4-1. 실험방법

HL-60 세포를 이용한 부착 실험은 이전에 연구된 방법을 이용하였다(De Clerck LS, et al., J Immunol Methods 172(1):115-124, 1994). 하고초 추출물을 혈관 내피 세포에 30분 전 처리한 후 25 mM 고포도당으로 24시간 활성화시켰다. RPMI 1640 배지에서 배양된 HL-60을 10 μM BCECF-AM으로 1시간 동안 염색시키고 PBS로 3번 세척한 후 1시간 동안 혈관 내피 세포와 동시 배양시키고 세척한 다음 0.1% SDS가 포함된 Tris-HCl, pH 8.0 용액으로 세포를 용해시킨 후 485 nm, 535 nm 파장으로 HL-60 단핵구의 혈관 내피 세포에 부착 정도를 형광 분광형광계(florescence spectrofluorometer)로 측정하였다.

4-2. 실험결과

고포도당으로 활성화된 혈관 내피 세포와 단핵구의 부착에 하고초 추출물이 어떠한 영향을 미치는지를 조사하였다. 도 2는 혈관 내피 세포에 BCECF-AM으로 염색 표지된 단핵구의 부착을 촬영하고 정량화한 결과이다. 고포도당을 24시간 처리한 혈관 내피 세포는 이것을 처리하지 않은 혈관 내피 세포에 비하여 HL-60 단핵구의 부착이 유의적으로 증가되었다. 한편, 고포도당을 처리한 혈관 내피 세포에 하고초 추출물을 농도별로 처리하였을 때 단핵구의 부착이 농도 의존적으로 감소하는 것을 볼 수 있었다(도 2).

실험예 5. 하고초 추출물의 NF-κB 전이 억제 효과

5-1. 실험방법

추출과정은 CER-I, CER-II 및 NER (Pierce, Rockford, IL) 시약이 포함되어 있는 키트를 이용하였다. 혈관 내피 세포를 디쉬에서 배양한 후 멸균된 PBS로 3번 세척한 후 다시 PBS 1 ml를 넣은 후 스크래퍼로 긁어 세포를 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 모은 후 추출 시까지 4℃에서 보관하였다. 세포를 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 200 ㎕의 CER-I를 넣었다. Protease inhibitor cocktail (Pierce, Rockford, IL) one tablet을 사용하기 전에 10 ml의 CER-I에 넣었다. 15초 동안 볼텍싱(vortexing) 후 얼음에 10분 동안 놓아둔 다음 11㎕의 CER-Ⅱ를 넣고 5초 동안 볼텍싱 후 60초 동안 얼음에 놓아둔 다음 다시 볼텍싱 후 16,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이 단계에서 세포질 부분을 포함한 상층액은 새로운 튜브에 옮긴 후 -70℃에서 보관하였다. 핵이 포함된 펠렛은 차가운 NER 시약 50 ㎕를 넣은 후 15초 동안 볼텍싱 후 다음 10분마다 볼텍싱하였고, 40분 후 16,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후 실험 전까지 -70℃에 보관하였다.

5-2. 실험결과

하고초 추출물이 전사 인자의 전이 활성을 방해함으로써 고포도당에 유도되는 CAMs 발현에 대한 자극을 억제하는지 여부를 조사하였다. 25 mM의 고포도당을 첨가한 후에 핵의 NF-κB p65는 증가되었다. 고포도당을 처리한 세포에 하고초 추출물을 첨가하였을 때, 핵에 p65 단백질의 양이 현저하게 감소하였다(도 3).

5-3. 실험방법

35mm 디쉬에 커버 글라스를 넣고 배지 1ml에 세포를 분주하였다. 70-80% 정도 자라면 FBS가 없는 배지로 교환하였다. 24시간 뒤에 하고초 추출물과 고포도당을 처리하였다. 24 시간 뒤에 4% 파라포름알데히드 1ml을 넣어 30분 반응시켰다. PBS로 2번 세척해주고, triton x-100 희석액을 1ml씩 넣고 30분 반응시켰다. PBS로 2번 세척해주고, 블로킹 용액을 1ml씩 넣고 30분 반응시켰다. PBS로 2번 세척해주고, 1차 항체를 만들어 1ml씩 넣고 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. PBS로 2번 세척해주고, 2차 항체를 만들어 1ml씩 넣고 상온에서 2시간 반응시켰다. PBS로 2번 세척해주고, 염색시약을 만들어 1ml씩 넣고 상온에서 10분 반응시켰다. PBS로 2번 세척해주고, 커버 글라스를 조심스럽게 들어냈다. 슬라이드 글라스에 mounting solution을 한 방울 떨어뜨리고 기포가 들어가지 않도록 커버 글라스를 조심스럽게 세포가 자란 면을 부착시켰다.

5-4. 실험결과

형광 면역 염색을 통한 하고초 추출물의 p65 핵 전사 인자 이동은 고포도당 처리에 의하여 증가하였다. 그러나 하고초 추출물 처리에 의하여 농도 의존적인 전이 억제 효과를 확인할 수 있었다(도 3).

실험예 6. 하고초 추출물의 항산화 효과

6-1. 실험방법

세포를 24 구판에 80% 가량까지 배양시켰다. FBS가 없는 배지 500㎕로 교환한 뒤 24시간 후에 하고초 추출물을 처리하고 고포도당을 1시간 처리하였다. PBS 500㎕로 바꾼 뒤 CM-H₂DCFDA를 0.5 ㎕ 씩 넣었다. 30분 뒤에 세척하였다. 배지로 다시 교환하고 일정시간 동안 배양시킨 뒤 세척하였다. 트립신/EDTA 500㎕ 넣고 3분 뒤 측정하였다(excitation : 492-495nm, emission : 517-527nm)

6-2. 실험결과

ROS 마커인 DCF-DA assay를 실시한 결과 고포도당에 의하여 증가한 산화 정도는 하고초 추출물 처리에 의하여 농도 의존적으로 항산화 효과를 보이는 것으로 나타났다(도 4).

실시예 7. 통계처리

실험 결과의 유의성은 실험 결과를 student t-test및 일원분산 분석(one-way ANOVA test)를 통하여 p가 0.05 이하인 경우 유의한 차이로 판정하였고, 실험치의 표현은 mean±SE로 하였다.

Claims

하고초 물 추출물을 단독 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 죽상 경화증의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
약학적으로 허용된 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
하고초 물 추출물은 세포 부착 단백질(CAMs)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 세포 부착 단백질은 E-셀렉틴 (E-selectin), VCAM- 1(vascular cell adhesion molecule-1) 및 ICAM-1 (intercellular cell adhesion molecule-1)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 하고초 물 추출물은 단핵구의 혈관 내피 세포로의 부착을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 하고초 물 추출물은 NF-κB (nuclear factor kappa B)의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 하고초 물 추출물은 항산화 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
하고초 물 추출물을 단독 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 죽상경화증의 예방 및 개선용 식품 조성물.
삭제