KR101276192B1 - 면역분석용 마이크로 입자 및 이를 사용한 면역분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (A) 소정의 형상과 크기를 가진 마이크로몰드가 소정의 패턴으로 형성된 복제몰드에 실란화합물과, 산 또는 염기 및 알콜을 포함하는 실란혼합물을 충진하는 단계; (B) 상기 실란혼합물이 충진된 복제몰드에 C8~C16의 알칸을 가하는 단계; (C) 상기 (B) 단계에서 C8~C16의 알칸을 가한 복제몰드를 30~80℃로 가열하여 마이크로 입자를 경화하는 단계; 및 (D) 상기 경화된 마이크로 입자를 회수하고 세척하는 단계; 를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 면역분석용 마이크로 입자 및 이를 이용한 면역측정 방법에 관한 것이다.

Description

면역분석용 마이크로 입자 및 이를 사용한 면역분석 방법{Microparticle for Immunoassay and Method for Immunoassy using the Same}
본 발명은 면역분석용 마이크로 입자 및 이를 사용한 면역분석 방법에 관한 것이다.
면역분석법(Immunoassay)이란 항원과 항체간의 특이적 결합능을 이용하여 불순물이 많은 생체재료로부터 목적으로 하는 미량의 항원 또는 항체를 정성·정량적으로 검출하는 방법이다. 면역분석법은 표지법에 따라 방사면역분석법(RIA), 면역형광분석법(FIA), 면역발광분석법, 효소면역분석법(EIA 또는 ELISA) 등으로 구분한다.
면역형광분석법은 시료를 슬라이드 등에 고정화시킨 후 형광이 표지된 항원 (항체)와 반응시키고 이를 세척한 후 형광 여부를 측정하여 시료 중 형광이 표지된 항원(항체)과 특이적으로 결합하는 항체(항원)을 검출하는 방법이다. 면역형광분석법에 의하면 비교적 간단한 방법에 의해 항원 또는 항체의 검출이 가능하나 검출 감도가 낮은 편이며 검출 가능 농도 영역이 좁다는 단점이 있다. 낮은 감도의 문제를 해소하기 위하여 이차항체에 형광을 표지하는 간접법이 도입되었으나, 이차항체와의 반응이 추가적으로 포함되므로 공정이 복잡해지는 문제가 있다.
방사면역분석법은 단순한 공정에 의해 고감도로 항원 또는 항체를 정량적으로 검출할 수 있기 때문에 과거에는 많이 사용되어 왔으나, 표지물질로 방사성 동위원소를 사용하기 때문에 최근에는 다른 분석 방법들로 대체되고 있다.
효소면역분석법(ELISA)은 방사면역분석법과 유사한 감도로 항원-항체 반응을 분석할 수 있어 현재 가장 널리 사용되고 있는 방법으로, 효소를 표식자로 사용하여 효소-기질의 반응 결과로 나타난 물질의 변색 정도에 의해 항원-항체 반응 정도를 분석한다. ELISA에 의한 항원(항체)의 분석은 통상 밀리미터~센티미터 단위의 직경을 갖는 웰이 수십개 형성되어 있는 마이크로 웰 플레이트를 이용하여 이루어진다. 마이크로 웰의 내벽부분에는 특정 항원과 특이적으로 결합하는 항체가 흡착되어 있으며 보다 상세한 분석방법은 다음과 같다. 1) 항체가 흡착된 마이크로 웰 플레이트의 웰에 분석하고자 하는 시료를 주입한다. 플레이트 안에 생체재료를 주입하게 되면 다른 불순물들은 반응하지 않고 특정 항원만 표면에 흡착되어있는 항체와 반응하게 된다. 반응이 완료되면 반응에 관여하지 않는 다른 불순물들을 제거하기 위해 세척단계를 거친다. 2) 세척이 완료되면 상기 마이크로 웰에 상기 항원과 결합할 수 있으며 효소가 표지되어 있는 두 번째 항체(second antibody)를 반응시킨 후 세척한다. 이는 상기 1) 단계에서 마이크로 웰에 흡착되어 있는 항체에 항원이 결합되어 있는 지 육안으로 확인하기 위한 전 단계로서, 항원이 결합되었다면 두 번째 항체는 항원과 결합하게 된다. 만일 항원이 결합되지 않았었다면 상기 두 번째 항체는 세척단계에서 모두 제거된다. 3) 상기 마이크로 웰에 두 번째 항체에 표지되어 있는 효소와 반응하여 발색되는 기질을 첨가하여 발색여부 및 그 정도에 의해 항원을 정성·정량적으로 분석한다. 전술한 설명은 항원 검출을 기준으로 설명하였으나, 항체 검출의 경우에는 마이크로 웰 플레에트에 항체 대신 항원이 흡착되어 있다는 점만 상이할 뿐 기본적인 분석 방법은 동일하다.
이와 같이 종래 기술에 의한 면역 분석은 플레이트의 웰의 바닥에 흡착되어있는 항체(항원)로만 항원-항체 반응을 시킬 수 있으므로 반응 표면적이 작은 한계점들을 가진다. 또한 간단한 공정에 의한 방법은 감도가 낮거나 위험하고, 높은 감도를 갖는 분석법의 경우 여러 단계로 구성되어 공정이 복잡하고 상품화된 ELISA 분석 킷트의 경우 가격이 비싸 경제적인 측면에서 효율성이 낮다. 따라서 종래의 방법에 비해 더욱 높은 감도로 미량의 물질을 효율적으로 분석하기 위해서는, 넓은 반응 표면적에서 보다 간단한 공정에 의해 항원-항체 반응을 분석할 수 있는 시스템의 개발이 필요하다.
본 발명은 경제적이고 간단한 공정에 의해 높은 감도로 미량의 항원 또는 항체를 정량/정성적으로 검출할 수 있도록 하는 마이크로 입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 마이크로 입자를 이용하여 항원 또는 항체를 정량/정성적으로 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 (A) 소정의 형상과 크기를 가진 마이크로몰드가 소정의 패턴으로 형성된 복제몰드에 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS), (3-glycidoxypropyl)-dimethyl- ethoxysilane (GPMES), (3-glycidoxypropyl) methyldiethoxysilane (GPMDES), beta-(3,4-Epoxycyclohexyl) ethyltriethoxysilane (EEES), beta-(3,4-epoxy- cyclohexyl) ethyltrimethoxysilane (EEMS) 및 (3-glycidoxypropyl) triethoxysilane (GPTES)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 실란화합물과, 산 또는 염기 및 알콜을 포함하는 실란혼합물을 충진하는 단계; (B) 상기 실란혼합물이 충진된 복제몰드에 C8~C16의 알칸을 가하는 단계; (C) 상기 (B) 단계에서 C8~C16의 알칸을 가한 복제몰드를 30~80℃로 가열하여 마이크로 입자를 경화하는 단계; 및 (D) 상기 경화된 마이크로 입자를 회수하고 세척하는 단계; 를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 면역분석용 마이크로 입자에 관한 것이다.
상기 알콜 용액인 실란혼합물은 친수성 성질을 가지므로, 소수성인 C8~C16 알칸을 첨가함에 따라 계면장력에 의해 구형 입자를 형성한다. 이때 C7이하의 알칸은 끓는점이 낮기 때문에 하기 경화과정에서 쉽게 증발하기 때문에 구형 마이크로 입자의 제조가 어려우며, C17이상의 알칸은 어는점이 높아서 상온에서 고체상태로 존재하기 때문에 상온에서 마이크로 몰드에 첨가하는 것이 곤란하다. 하기 실시에에서는 C16인 헥사데칸을 사용한 예만을 기재하였으나, C8-C16의 알칸의 사용에 의해 모두 마이크로 입자를 성공적으로 제조할 수 있다.
상기 실란혼합물은 가열에 의해 혼합물 중 알콜이 휘발하며 촉매의 작용에 의해 실란화합물이 경화되어 구형의 마이크로 입자가 형성된다. 이때, 상기 실란화합물들은 모두 에폭사이드(epoxide)기를 포함하기 때문에 제조된 마이크로 입자는 표면에 에폭사이드 기가 노출되게 된다. 상기 에폭사이드 기는 아민기와 축합반응을 하고, 모든 단백질은 분자내에 아민기를 갖고 있으므로 추후 면역분석 시 축합반응에 의해 항원 또는 항체를 마이크로 입자에 고정화시킬 수 있다. 하기 실시예에 구체적인 데이터를 제시하지는 않았으나, 상기 실란화합물을 사용한 예에서 GPTMS와 유사하게 마이크로입자를 제조할 수 있었으며, 프로테인 A를 고정화할 수 있었다. 이때 상기 실란혼합물 중 상기 실란화합물의 함량은 5~30 부피%인 것이 바람직하다. 실란화합물의 함량이 너무 낮으면 표면에 에폭사이드 기가 적기 때문에 고정화되는 항원 또는 항체의 양도 적어져 추후 면역반응에서의 감도가 낮아지게 된다. 반면, 실란화합물의 함량이 너무 높으면 실란혼합물의 점도가 증가하여 마이크로몰드를 이용하여 입자를 만드는 과정에서 다루기가 어렵게 되며, 이로 인해 생성되는 입자가 불균일하게 된다.
상기 실란혼합물에서 산 또는 염기는 실란화합물의 고분자화 반응에서 촉매 역할을 하는 것으로 종래 기술에서 실란화합물을 고분자화시키는 것으로 알려진 것은 모두 사용할 수 으며, 구체적인 실시예를 기재하지 않았다 하더라도 당업자라면 종래 기술에 의거하여 적절한 산 또는 염기를 선택하여 사용할 수 있음은 당연하다. 하기 실시예에서는 염산만을 예로 들었으나, 이에 한정되는 것은 아니며 HCl, HNO3, H2SO4, HF 등의 산 또는 암모니아, KOH, NaOH 등의 염기를 사용할 수 있다.
상기 (C) 단계는 실란화합물의 고분자화 및 알콜의 증발로 마이크로 입자가 경화되는 단계로 온도가 30℃보다 낮으면 고분자화 반응 및 알콜의 증발이 너무 느리므로 실용적이지 못하다. 실제 상기 (C) 단계는 상온에서도 진행이 가능하기는 하지만, 반응 완결에 하루 이상이 소요되며 날씨와 같은 다른 주변의 조건에 따라서도 영향을 받게되므로 30℃ 이상의 온도에서 반응시키는 것이 바람직하다. 80℃ 이상의 온도에서 역시 반응이 불가능한 것은 아니나, 80℃에서 반응을 시키더라도 1시간 이내에 반응이 완결되므로 반응속도가 충분히 빠르며, 온도가 너무 높은 경우 실험자가 이를 다루는 데 불편함이 유발되므로 상기 (C) 단계는 30~80℃, 더욱 바람직하게는 50~80℃로 가열하는 것이 좋다.
상기 (B) 단계의 실란혼합물에 tetraethyl orthosilicate (TEOS), tetramethyl orthosilicate, tetrapropyl orthosilicate, tetrabutyl orthosilicate와 같은 C1~C4인 tetraalkyl orthosilicate를 추가로 포함시키는 것에 의해 생성되는 마이크로 입자를 보다 단단하게 구현할 수 있다.
또한 상기 (B) 단계의 실란혼합물은 2-[methoxy(polyethyleneoxy)propyl] trimethoxysilane (MPEGTMS) 또는 mPEG-Silane (methoxyl silane PEG)를 추가로 포함할 수 있다. PEG는 생체물질과의 반응에서 비특이적 결합을 방지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(KSBB Journal 제24권 제6호 제119호 (2009. 12) pp.515-520), MPEGTMS 또는 mPEG-Silane은 생성된 마이크로 입자에 PEG 기를 도입하는 것에 의해 항원 또는 항체와의 반응 시 원하지 않는 단백질과의 결합을 막아주는 역할을 한다.
본 발명의 또 다른 일양태는 상기 마이크로 입자를 이용한 면역분석 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명의 항원-항체 반응에 의한 면역분석 방법은, (A) 제 1 항의 마이크로 입자를 시료용액에 침지하여 반응시키고 세척하는 단계; (B) 검출하고자 하는 항원 또는 항체와 특이적으로 반응하며 표지된 생체분자의 용액에 상기 (A) 단계에서 반응시킨 마이크로 입자를 침지하여 항원-항체 반응시키고 세척하는 단계; 및 (C) 상기 표지된 생체분자를 검출하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 면역분석 방법에 의하면, 종래 기술에 비해 매우 높은 감도로 면역분석을 할 수 있으므로, 형광면역분석과 같은 비교적 간단하지만 감도가 낮아 사용에 제한이 있는 방법의 적용범위를 확대시킬 수 있을 뿐 아니라 종래에 비교적 높은 감도로 분석이 가능한 효소면역분석에 있어서도 더욱 높은 감도의 분석이 가능하므로 더욱 미량의 물질에 대해서도 검출이 가능하다.
동일한 표지에 의한 면역분석의 감도는 항원 또는 항체가 고정화되는 표면적과 비례한다.
종래의 면역분석의 경우, 8mm의 직경과 8mm의 깊이을 갖는 96 웰 플레이트(well plate)가 널리 사용된다. 상기 웰 플레이트의 각 웰에 시료를 채워 반응시킨다고 하더라도 항원 또는 항체는 웰의 바닥에만 고정화되어 있기 때문에 400 mm3(웰의 부피, 8*π(8 mm/2)2)의 반응부피에 대하여 면역분석 반응이 일어나는 표면적은 50 mm2 (면적, π(8 mm/2)2)이다.
반면, 하기 실시예에서 제조한 약 70 ㎛(0.07 mm) 직경의 입자를 사용하는 경우, 상기 직경 8mm의 웰에 마이크로입자를 일렬로 배열하면 약 10,344개를 채워넣을 수 있다. 웰의 높이를 고려하면 마이크로입자를 최소 114층(8mm/0.07mm)으로 쌓을 수 있으므로 (실질적으로는 입자 사이사이로 쌓아지므로 더 높게 쌓을 수 있음) 400 mm3의 반응 부피에 적어도 1,179,216개의 마이크로 입자가 채워질 수 있다. 마이크로 입자 하나의 표면적은 0.015 mm2 (4π(0.07 mm/2)2)이므로, 1,179,216개의 마이크로 입자의 표면적은 17,688 mm2 (0.015 mm2*1,179,216개)이 되어 웰 플레이트를 사용하는 종래 방법에 비해 반응 면적이 최소 350배 이상이 된다.
웰 플레이트와 마이크로입자에서는 동일 반응에 의해 형광을 나타내므로, 반응액의 형광강도(fluoresecence intensity)는 반응부피가 동일하다면, 반응면적에 비례할 것이다. 따라서, 본 발명의 일실시예에 의한 마이크로입자의 면역반응 측정 감도는 통상의 웰 플레이트를 이용한 면역측정에 비해 최소 350배 이상이 될 것이다.
상기 (A) 단계에서 마이크로 입자는 표면의 아민기와 시료 중의 아민기를 갖는 화합물과 결합하여 시료 중 단백질을 고정시킨다. 이후 세척과정에서 마이크로 입자에 고정되지 않은 시료들을 제거한다. (B) 단계에서 검출하고자 하는 항원 또는 항체와 특이적으로 반응하며 표지된 생체분자의 용액에 상기 (A) 단계에서 반응시킨 마이크로 입자를 침지하면, 마이크로 입자에 고정된 항원 또는 항체와 상기 생체분자의 항원-항체 반응에 의해 생체분자가 마이므로 입자에 고정된다. 따라서, 시료 중 검출하고자 하는 항원 또는 항체가 존재하였다면 (A) 단계에서 마이크로 입자에 고정화되고, (B) 단계에서 표지된 생체분자와 결합할 것이므로 (C) 단계에서 표지된 생체분자가 검출되는 지 여부에 따라 면역분석이 가능하게 된다. 이러한 면역분석은 단순히 정성적인 분석 뿐 아니라, 미리 표준곡선을 작성하여 비교하는 것에 의해 정량적인 분석도 가능하다.
이때 상기 (A) 단계 이후에 마이크로 입자의 표면에 반응하지 않은 에폭사이드 기가 있을 경우, (B) 단계에서 생체분자와의 비특이적 결합에 의해 잘못된 분석 결과를 나타낼 수 있다. 이를 방지하기 위하여 상기 (A) 단계와 (B) 단계의 사이에, 상기 (B) 단계의 생체분자 및 검출하고자 하는 항원 또는 항체와 반응하지 않는 단백질 용액에 상기 (A) 단계에서 반응시킨 마이크로 입자를 침지하여 반응시키고 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 단백질로는 bovine serum albumin이나 casein과 같은 비반응성 단백질을 사용할 수 있다.
상기 분석과정은 마이크로 입자에 시료를 직접적으로 반응시키는 방법만을 설명하였으나, 마이크로 입자를 (A) 단계 이전에 검출하고자 하는 항원 또는 항체와 특이적으로 반응하는 제2생체분자와 미리 반응시켜 (A) 단계에서 검출하고자 하는 항원 또는 항체만이 마이크로 입자와 반응하도록 하는 것이 더욱 바람직하다. 제2생체분자는 (B)단계의 생체분자와 구분하기 위한 것으로 (B) 단계의 생체분자는 검출하고자 하는 항원 또는 항체와 특이적으로 반응하는 것과 함께 표지가 되어있어 추후 이를 검출할 수 있다는 것이 차이가 있으며 (B)단계의 생체분자는 제2생체분자와 동일할 수도 있고, 다른 생체분자일 수도 있다. 이 경우 비반응성 단백질과의 반응은 제2생체분자의 반응 후 시료용액과의 반응 전에 이루어질 수 있다.
상기 (B) 단계에서의 표지는 형광, 방사능 또는 효소에 의한 표지일 수 있다. 하기 실시예에서는 형광 표지에 의한 면역분석을 예시하였으나, 종래 기술과 동일한 방법을 적용하여 방사능이나 효소 표지에 의한 면역분석할 수 있음은 당연하다. 또한, 직접법에 의한 면역분석 뿐 아니라 (B) 단계에서 생체분자와 항원-항체를 반응 시킨 후 상기 생체분자와 특이적으로 반응하며, 표지된 제2생체분자를 반응시키고 이를 분석하는 간접법을 적용할 수도 있다.
하기 실시예에서는 시료용액으로 프로테인 A(protein A) 용액을 반응시키고, 이와 특이적으로 반응하며 FITC가 표지되어 있는 IgG을 사용하여 프로테인 A를 효과적으로 검출한 결과를 나타내었으나, 이는 본 발명에 의한 면역분석을 성공적으로 수행할 수 있음을 보여주는 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아니다.
이상과 같이 본 발명에 의하면 본 발명은 간단한 공정에 의해 면역분석용 마이크로 입자를 제조할 수 있으므로 보다 경제적으로 면역분석을 수행할 수 있다.
또한 상기 마이크로 입자를 이용한 본 발명의 면역분석 방법에 의하면 높은 감도로 미량의 항원 또는 항체를 정량/정성적으로 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 의해 제조된 마이크로 입자의 현미경 사진.
도 2는 본 발명에 의한 마이크로 입자의 제조과정을 보여주는 모식도.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 면역분석 과정을 보여주는 모식도.
도 4와 도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광면역분석의 결과를 보여주는 형광현미경 사진.
이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
실시예 1 : 마이크로 입자의 제작
1) 마이크로 몰드의 제작
마이크로 몰드는 도 1과 같이 가로, 세로가 150 ㎛인 원형 마이크로 웰 (micro well) 수백 개가 일정간격으로 배열되도록 고안하였다.
실리콘 웨이퍼 위에 네가티브형 감광제 (SU-8, Microchem Co., USA)를 고르게 도포한 후, 1,000rpm으로 스핀 코팅하여 100 ㎛ 높이의 감광제를 올려주었다. 실리콘 웨이퍼 위에 폭과 길이기 150 ㎛인 마이크로 웰 형상이 있는 마스크를 통해 UV를 조사하여 채널과 반대 형상을 갖는 마스터 몰드를 제작하였다. 이후, PDMS (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI)를 제작된 마스터 몰드에 부어준 후 65℃에서 4시간 경화시켜 원하는 형상의 미세유로를 가진 PDMS 몰드를 제작하였다.
2) 마이크로 입자의 제조
마이크로 입자의 제조공정의 개략도를 도 2에 도시하였다.
보다 구체적으로, 1)에서 제조된 마이크로 몰드의 마이크로 웰에 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS), 2-[methoxy(polyethyleneoxy)propyl] trimethoxysilane (MPEGTMS), tetraethyl orthosilicate (TEOS), HCl (1N) 및 에탄올 (ethanol) (99.9%)을 3:1:3:3:16의 부피비로 혼합한 졸 상태의 실란혼합물을 마이크로 파이펫 팁을 이용하여 채워 넣고 과량의 혼합물은 제거하였다.
도 2에 도시된 바와 같이 상기 혼합물이 채워진 마이크로 몰드 위에 헥사데칸 (hexadecane)을 뿌려주었다. 이때, 소수성의 성질을 가지는 헥사데칸과 PDMS 마이크로 몰드 간의 상호작용으로 인해 헥사데칸이 마이크로 몰드 벽을 타고 들어가 채워지고 친수성의 혼합물은 소수성 헥사데칸과의 계면장력에 의해 구형의 모양을 가지게 된다.
헥사데칸을 뿌린 상태에서 마이크로 몰드를 65℃의 오븐에서 하루 동안 방치하여 구형 마이크로 입자를 얻었다. 도 1은 마이크로 웰 내에 생성된 구형의 균일한 마이크로 입자를 보여주는 현미경 사진이다.
실시예 2 : 마이크로 입자를 이용한 면역분석
1) 마이크로 입자와 프로테인 A의 반응
실시예 1의 2)에서 제작한 마이크로 입자를 수거하여 pH 7의 PBS buffer로 세척하였다. 세척한 마이크로 입자를 PHS buffer를 사용하여 5 ㎍/ml 농도로 희석한 프로테인 A(Sigma-aldrich) 용액에 침지하여 상온에서 30분 동안 방치하여 반응시키고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 상등액을 제거한 후 PBS buffer를 넣고 마이크로 입자를 부유시킨 후 다시 원심분리하여 상등액을 제거하는 방법에 의해 4회 세척하였다.
세척 후, 상기 프로테인 A가 결합된 마이크로 입자를 1%(w/w)로 PBS buffer에 희석한 BSA(Sigma-aldrich) 용액에 침지하여 상온에서 30분간 rotator를 이용하여 반응시키고 상기와 동일한 방법에 의해 PBS buffer로 다시 세척하였다.
2) 형광표지된 IgG와의 반응
프로테인 A와 특이적으로 반응하며 형광을 나타내는 FITC가 표지되어 있는 Anti-Mouse IgG-FITC antibody를 사용하여 프로테인 A를 검출하였다.
보다 구체적으로, 상기 1)에서 표면에 프로테인 A가 구현된 입자를 PBS buffer에 3㎍/㎖ 농도로 희석한 Anti-Mouse IgG-FITC(Fluorescein isothiocyanate) 용액에 침지하여 상온에서 30분동안 반응시켰다. 반응이 완료되면 PBS buffer를 사용하여 실시예 1의 세척방법과 동일한 방법에 의해 상기 마이크로 입자를 세척하여 반응하지 않고 남아있는 Anti-Mouse IgG-FITC를 제거하였다. 도 3은 전체 반응의 개략도를 나타낸다.
세척된 마이크로 입자를 형광현미경 (NIKON, TE2000, Japan) 사용하여 관측하고 그 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4에서 확인할 수 있듯이, FITC 시그널이 입자 표면에 고르게 나타난 것으로부터 프로테인 A를 검출할 수 있었다.
도 5는 마이크로비드 제조 시에 사용한 혼합물 중 에탄올의 함량이 30%(v/v)인 또 다른 일실시예에 의해 제조된 마이크로 입자에 의한 면역측정결과를 보여주는 형광현미경 사진으로, 입자의 크기가 다소 증가한 것을 제외하고는 도 4에서와 마찬가지로 FITC 시그널이 입자 표면에 고르게 검출되는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. (A) 소정의 형상과 크기를 가진 마이크로몰드가 소정의 패턴으로 형성된 복제몰드에 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMS), (3-glycidoxypropyl)- dimethyl-ethoxysilane (GPMES), (3-glycidoxypropyl) methyldiethoxysilane (GPMDES), beta-(3,4-Epoxycyclohexyl) ethyltriethoxysilane (EEES), beta- (3,4-epoxy-cyclohexyl) ethyltrimethoxysilane (EEMS) 및 (3-glycidoxypropyl) triethoxysilane (GPTES)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 실란화합물과, 산 또는 염기 및 알콜을 포함하는 실란혼합물을 충진하는 단계;
    (B) 상기 실란혼합물이 충진된 복제몰드에 C8~C16의 알칸을 가하는 단계;
    (C) 상기 (B) 단계에서 C8~C16의 알칸을 가한 복제몰드를 30~80℃로 가열하여 마이크로 입자를 경화하는 단계; 및
    (D) 상기 경화된 마이크로 입자를 회수하고 세척하는 단계;
    를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 면역분석용 마이크로 입자
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (B) 단계의 실란혼합물 중 상기 실란화합물의 함량은 5~30 부피%인 것을 특징으로 하는 면역분석용 마이크로 입자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (B) 단계의 실란혼합물은 tetraethyl orthosilicate (TEOS), tetramethyl orthosilicate, tetrapropyl orthosilicate, tetrabutyl orthosilicate로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역분석용 마이크로 입자.
  4. 제 1 항 또는 제 3 항 에 있어서,
    상기 (B) 단계의 실란혼합물은 2-[methoxy(polyethyleneoxy)propyl] trimethoxysilane (MPEGTMS) 또는 mPEG-Silane (methoxyl silane PEG)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역분석용 마이크로 입자.
  5. 항원-항체 반응에 의한 면역분석 방법에 있어서,
    (A) 제 1 항의 마이크로 입자를 시료용액에 침지하여 반응시키고 세척하는 단계;
    (B) 검출하고자 하는 항원 또는 항체와 특이적으로 반응하며 표지된 생체분자의 용액에 상기 (A) 단계에서 반응시킨 마이크로 입자를 침지하여 항원-항체 반응시키고 세척하는 단계; 및
    (C) 상기 표지된 생체분자를 검출하는 단계;
    를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 (A) 단계와 (B) 단계의 사이에,
    상기 (B) 단계의 생체분자 및 검출하고자 하는 항원 또는 항체와 반응하지 않는 단백질 용액에 상기 (A) 단계에서 반응시킨 마이크로 입자를 침지하여 반응시키고 세척하는 단계;
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    (A) 단계 이전에,
    (a) 마이크로 입자를 검출하고자 하는 항원 또는 항체와 특이적으로 반응하는 제2생체분자 용액에 침지한 후 세척하는 단계;
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 (a) 단계와 (A) 단계의 사이에,
    상기 (B) 단계의 생체분자 및 검출하고자 하는 항원 또는 항체와 반응하지 않는 단백질 용액에 상기 (A) 단계에서 반응시킨 마이크로 입자를 침지하여 반응시키고 세척하는 단계;
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (B) 단계에서의 표지는 형광, 방사능 또는 효소에 의한 표지인 것을 특징으로 하는 면역분석 방법.
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