KR101249334B1

KR101249334B1 - 항산화 융합 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101249334B1
Application number: KR1020100117341A
Authority: KR
Inventors: 김용희; 임광석; 박용수
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2009-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2013-04-01
Also published as: KR20110058705A

Abstract

본 발명은 항산화 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 메탈로치오네인(metallothionein)의 아미노 말단에 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain)이 펩타이드 결합된 항산화 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기 융합 단백질은 세포 투과율이 높고, 당산화 및 당지질 스트레스로부터 췌장 베타세포 및 심근세포의 파괴를 보호하므로, 당뇨병 또는 당뇨병성 심근병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 용도로 유용하다.

Description

항산화 융합 단백질 및 이의 용도{Anti-Oxidant Fusion Protein and Use Thereof}

본 발명은 항산화 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포 투과율이 높아 당산화 및 당지질 스트레스로부터 췌장 베타세포 및 심근세포의 파괴를 보호할 수 있는 항산화 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

비만은 인슐린 저항성, 당내성 및 이상지질혈증(dylipidemia)을 포함하는 대사성 질환(Metabolic Syndrome) 중 하나로, 췌장 베타세포의 파괴와 당뇨병을 유발한다. 심장 기능장애, 당뇨성 신경병증, 당뇨성 심장병증, 및 혈관내피세포 기능장애와 같은 당뇨 합병증은 당뇨 환자의 주요한 사망원인이다. 이러한 당뇨병 및 당뇨 합병증을 설명하는 근거 중 하나로 고혈당과 저산소증에서의 활성 산소종(Reactive Oxygen Species: 이하 'ROS') 과량생산이 주목되고 있다(P.A. Low et al., Diabetes. 46 (1997) 38-42; J.W. Baynes et al., Diabetes. 40 (1991) 405-412) 고혈당은 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 양이온 생성 또는 글루코오스의 자동산화에 의해 ROS 수치를 증가시킬 수 있다.

ROS는 산소이온이나 유리기 또는 과산화물을 총칭하는 말로써, 분자 내에 존재하는 최외각 전자의 불안정함 때문에 반응성이 매우 높다. 이러한 ROS는 생체 내에서 일어나는 일반적인 호흡과 염증 반응 동안에 흔히 금속 촉매 반응에서 생성되며, 세포 신호전달에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. ROS는 높은 산화성으로 DNA, 단백질 등 세포 구성 성분에 손상을 준다. 또한 자외선이나 열에 노출되는 환경적인 스트레스가 반복이 되면 ROS의 수준이 급격히 증가할 수 있으며, 이는 세포의 구조에 막대한 피해를 입힐 수 있다. 이것을 산화 스트레스라고 부르며, 파킨슨씨병이나 치매 같은 신경성 퇴행질환이나 당뇨병 및 당뇨 합병증에서도 중요한 병인으로 여겨지고 있다.

특히, 당뇨병에서 ROS의 과잉 생산은 당뇨성 혈관 합병증 발생과 당뇨성 신증의 중요한 요소 중 하나이다. 또한 고혈당 상태에서 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 음이온 생성을 통해(T. Nishikawa, D. Edelstein, X.L. Du, et al., Nature. 404 (2000) 787-790) 또는 당의 자동 산화(S.P. Wolff et al., Free Radic Biol Med. 10 (1991) 339-352)에 의해 ROS가 과잉 생산될 가능성이 보고되고 있고, 무엇보다도 ROS는 췌장 베타세포의 기능장애를 가져온다고 알려져 있다.

제1형 당뇨병에서 ROS는 베타세포의 사멸을 유도하고, 제2형 당뇨병에서는 고혈당 상태가 지속되면서 체내에서의 산화 스트레스는 계속해서 증가하게 된다. 고혈당 상태에서는 반응성 산소기의 상승과 함께, 항산화능의 감소가 일어난다. 글루타치온 산화환원반응 시스템(glutathion redox system), Vit C-Vit E 사이클, 알파-리포산/디하이드로리포산 산화환원 반응쌍 등을 포함한 중요한 세포 내 항산화 방어기전의 감소는 당뇨병 환자에 있어 산화성 자극에 대한 민감도를 증가시킨다.

신병증, 망막병증, 신경병증, 대혈관과 미세혈관병증을 포함한 당뇨병의 많은 주된 합병증은 고혈당이 야기한다. 고혈당이 증가함에 따라 ROS의 생성이 증가하며 인슐린 저항성을 악화시키고 조직에 손상을 일으키며, 나아가 심혈관 질환이나 신장 및 안구질환과 같은 당뇨병성 합병증을 유발한다. 조절되지 않는 당뇨병에서는 슈퍼옥사이드 라디칼을 불활성화시키는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase, SOD) 및 항산화성 비타민 E, 알파-리포산이 감소된다. 즉, ROS 생성의 증가는 제1형, 제2형 당뇨병 모두에서 특히 베타세포의 사멸을 유도함으로써 당뇨병 및 합병증의 발병을 촉진하고, 악화시키는 것이다.

미토콘드리아의 대사과정에서 산소분자는 ATP 생성 과정 동안 포도당과 다른 기질의 완전한 대사에 필수적이다. 그러나 정상적인 산화성 인산화 과정 중에 소모되는 산소의 0.4~4%는 프리 라디칼 슈퍼옥사이드로 바뀐다. 결국 이는 다른 반응성 산소기와 반응성 질소기로 바뀔 수 있다. 유리기 과산화물은 정상적으로 항산화성 방어과정에 의해 제거 된다. 미토콘드리아 내 과산화물은 슈퍼옥사이드 디스뮤타제에 의해 빠르게 과산화수소로 바뀐다. 그 후 과산화수소는 미토콘드리아 내 글루타치온 퍼옥시다제에 의해 물과 산소로 약독화 되거나 세포질내로 확산되어 퍼옥시좀 내에서 카탈라아제에 의해 약독화 된다. 그러나 구리와 철과 같은 환원된 전이 금속이 있는 상태에서 과산화수소는 반응성이 높은 수산화기로 바뀔 수 있다. 과도한 반응성 산소기는 세포 구성성분에 손상을 준다. 그래서 내재적 항산화성 시스템이 반응성 산소기를 중화하기 위해 세포 내에 존재하고, 이들 시스템은 적절한 세포기능을 유지하는데 중요하다. 주된 세포 항산화제는 글루타치온(GSH)과 환원된 NADP이다. 내재적 항산화성 단계가 세포의 산화환원반응 균형을 복구할만한 충분한 보상성 반응을 야기하는데 실패할 경우 GSH는 감소하고 산화성 스트레스가 발생한다. 위와 같은 반응에 의해 생성되는 대부분의 ROS는 미토콘드리아에서 생성되며 제거하는 역할 역시 미토콘드리아 내의 효소에 의해 이루어진다. 세포 내에서 특히 ROS와 밀접한 관련이 있는 미토콘드리아를 타겟으로 약물전달을 함으로써 약물의 효과를 극대화 시킬 수 있다.

항산화제의 처리는 베타세포의 생존에 이롭다는 연구가 보고된 바 있다(Nishikawa T, Araki E et al., Antioxid Redox Signal 9 (2007) 343-353). 항산화제의 과발현을 통해 당뇨병에서 생성되는 ROS의 독성을 개선시킬 수 있고(Ha H et al., Diabetes Res Clin Pract 82 (2008) S42-S45), 전신적으로 투여하는 것 또한 제1형 당뇨병의 발병 시기를 늦출 수 있다는 연구결과도 있다(Hohmeier HE et al., J Clin Invest 101 (1998) 1811-20).

메탈로치오네인(Metallothionein, MT)는 1957년 최초로 발견되었으며, 시스테인이 풍부한 저분자(3.5~14 kDa) 물질로서, 시스테인-X-시스테인, 시스테인-X-X-시스테인, 시스테인-시스테인의 구조가 반복되는 61개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 2가 금속이온과 결합하는 20개의 시스테인 잔기를 포함한다. 메탈로치오네인은 중금속, 기아, 열 또는 감염과 같은 스트레스 환경에서 과발현된다. 메탈로치오네인은 금속 독성에 대한 생체 방어의 중요한 수단으로 생각되어져 왔으며, 또한 산화성 스트레스에 대한 방어 작용도 하는 것으로도 알려져 있다. 흔히 ROS의 산화성 손상에 대한 생물학적 방어는 ROS를 제거하는 단백질들, 금속이온을 격리시키는 분자들 및 손상된 세포 구성성분을 복구하는 효소들로 구성되어 있다. 이중 MT는 지금까지 많은 연구를 통해 산화성 스트레스에 대한 세포반응에서 항산화제 역할을 한다는 것이 증명되어 왔다.

최근 메탈로치오네인이 생체외(in vitro)와 생체내(in vivo)에서 세포와 조직을 당뇨병과 당뇨 합병증으로부터 보호할 수 있고, 이는 메탈로치오네인이 갖는 항-아포토시스(anti-apoptotic) 및 항산화능 때문인 것으로 보고 되었다(K.G. Danielson et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1982) 2301-04). 메탈로치오네인이 제거된 당뇨성 마우스(MT null diabetic mice)에 메탈로치오네인을 과발현시킨 결과, 당뇨성 심근병증은 감소되고, 심장의 악화된 허혈성 수축이 개선되었음이 보고된 바 있다(Q. Liang et al., Diabetes. 51 (2002) 174-181). 아연 또한 메탈로치오네인의 발현을 유도하고, 고혈당과 제2형 당뇨병에서 베타세포의 점진적 손상에 의해 유발된 당뇨성 손상으로부터 마우스를 보호할 수 있다. 또한 아연-메탈로치오네인은 생체외(in vitro)와 생체내(in vivo)에서 하이드록실 라디칼을 차단할 수 있음이 알려져 있다(C.G. Taylor et al., Biometals. 18 (2005) 305-312).

이와 같이 메탈로치오네인이 ROS를 제거함으로써 당뇨병 및 당뇨 합병증을 개선하거나 예방할 수 있지만, 메탈로치오네인은 세포막의 지질이중막구조를 통과하기 어렵기 때문에 치료제로서 응용하기에 어려운 한계점이 있다. 이에 따라 대부분의 연구는 메탈로치오네인을 유전자 재조합을 통해 세포 내 체내에서 과발현시키는데 그치고 있다.

한편, 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain, PTD)은 단백질, 유전자 및 입자등과 같이 생리적으로 활성인 거대 분자를 세포막을 통해 세포질 내로 효과적이고 비-특이적으로 수송 또는 흡수시킬 수 있다. HIV-1 바이러스 단백질의 Tat 펩타이드(49-57, YGRKKRRQRRR)는 이러한 단백질 형질 도입 영역으로 잘 알려져 있다. 알라닌으로 치환된 Tat 펩타이드는 세포 내로 이동될 수 없으며, 이는 Tat의 양이온 잔기가 세포 내 수송에 중요한 부분임을 의미한다. 그러나, 히스티딘, 라이신 및 오르니틴과 같은 양이온성 아미노산은 세포 내 수송 효율이 Tat 펩파이드 보다 떨어진다. 폴리아르기닌으로서 노나-아르기닌(9R)은 미카엘리스-멘튼 동역학(Michaelis-Menton kinetic) 분석 결과, Tat 펩타이드 보다 20배가량 세포 내 수송 효율이 높다(P. A. Wender et al., Proc Natl Acad Sci. 97 (2000) 13003-13008).

이에 본 발명자들은 세포막의 지질이중막 구조를 통과하기 어려워 약학적 치료제로서 적용되기 어려운 한계가 있는 메탈로치오네인을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 방법에 대해 예의 연구한 결과, 메탈로치오네인과 단백질 형질 도입영역이 결합된 융합 단백질을 제조하였고, 이러한 융합 단백질이 세포 내로 투과되어 당지질 독성(glucolipotoxicity) 또는 고혈당 스트레스로부터 췌장 베타세포 및 심근세포를 보호할 수 있음을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 과제는 세포 내 효율적으로 유입되어 메탈로치오네인의 항산화 활성 및 항-아포토시스 효과를 발휘함으로써, 고혈당 또는 당지질 독성으로부터 세포를 보호할 수 있는 항산화 융합 단백질 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

이를 위해, 본 발명은

메탈로치오네인(metallothionein)의 아미노 말단에 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain)이 펩타이드 결합된 항산화 융합 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 메탈로치오네인(metallothionein) 단백질을 코딩하는 cDNA의 5' 말단에 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain)을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 전술한 항산화 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 단백질 형질 도입 영역의 카르복시 말단에 추가적으로 미토콘드리아 타겟팅 서열(Mitochondrial Targeting Sequence)이 펩타이드 결합된 항산화 융합 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 항산화 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

아울러 본 발명은 상기한 항산화 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 심근병증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 융합 단백질은 세포 내 투과율이 높아, 고혈당 및 고지질에 의한 당산화 및 당지질 스트레스로부터 세포를 보호한다.

도 1은 본 발명의 실시예 1 및 2에서 제조한 융합 단백질의 유전자 지도이다.
도 2의 (a)는 MT, Tat-MT 융합 단백질 및 11R-MT 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔을 통해 분석한 뒤 쿠마시 블루로 염색한 결과, (b)는 아연으로 안정화한 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Tat-MT, Tat-MTS-MT 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔을 통해 분석한 뒤 쿠마시 블루로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 심근세포에서의 Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합 단백질 세포투과능을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 심근세포에서의 Tat-GFP와 Tat-MTS-GFP 융합 단백질 전달율을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 1 μM 부터 7 μM까지 Ins-1 췌장 베타세포에 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 1 μM 부터 7 μM까지 H9c2 심근세포에 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 당지질 스트레스에 노출된 췌장 베타세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 췌장 베타세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 당지질 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 11은 당지질 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 12는 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 13은 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 14는 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 15는 당지질 스트레스에 의해 유도된 심근 세포 카스파제-3 활성에 대한 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 16은 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스 조건 하에서 심근 세포의 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 카스파제-3 활성의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 17은 염화코발트로 처리하여 유도된 외인성 아포토시스에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 심근세포 카스파제-3 활성의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 고혈당 스트레스에 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현 정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 저산소 스트레스에 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현 정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20는 고혈당 스트레스와 저산소 스트레스에 함께 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 나트륨 아비산염을 처리한 심근세포에서의 활성 산소종 발현정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 스트렙토조토신 유도 제1형 당뇨 동물모델에 대해 Tat-MTS-MT 투여에 따른 췌장의 활성 산소종 함량을 나타낸 그래프이다.
도 23은 스트렙토조토신 유도 제1형 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT 투여 후 혈당변화를 나타낸 그래프이다.
도 24는 스트렙토조토신 유도 제2형 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT 투여 후 혈당변화를 나타낸 그래프이다.
도 25는 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델에 대해 스트렙토조토신 투여 전과 후 Tat-MT, Tat-MTS-MT 투여에 따른 혈당변화를 나타낸 그래프이다.
도 26은 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT, Tat-MTS-MT 투여에 따른 혈당변화를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 항산화 융합 단백질은 메탈로치오네인(metallothionein)의 아미노 말단에 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain)이 펩타이드 결합되어 있다.

상기 메탈로치오네인(metallothionein)은 인간으로부터 유래되는 것이라면 유형 I, II, III 및 IV, 이의 아형(isoform) 어떠한 것이라도 가능하다. 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시된 것이다.

본 발명의 융합 단백질은 메탈로치오네인이 펩타이드, 단백질 등을 세포 내로 효율적으로 전달 또는 흡수시키는 단백질 형질 도입 영역과 융합됨으로써, 세포 내로 융합 단백질이 효과적으로 투과될 수 있다.

상기 단백질 형질 도입 영역은 메탈로치오네인과 융합되어 세포 내로 투과시킬 수 있는 것으로, 이 분야에서 알려진 것이라면 제한 없이 사용가능하다. 일예로, HIV-1 바이러스의 Tat 단백질, 폴리아르기닌(아르기닌 6개 이상), 페너트라틴(Penetratin), HSV-1 구조단백질 VP22의 전사조절단백질, Pep-1 펩타이드, 또는 Pep-2 펩타이드 등이 가능하다. 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 Tat(Trans Activator of Transcription) 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 폴리아르기닌을 사용한다.

이때 메탈로치오네인과 단백질 형질 도입 영역은 화학적 또는 생물학적으로 융합될 수 있으며, 이러한 방법은 당 업계에서 널리 알려진 공지 기술이므로, 본 명세서에서 더욱 자세한 설명은 생략하기로 한다.

활성 산소종(ROS)은 대부분 미토콘드리아에서 생성되므로, 항산화 활성을 갖는 본원발명의 융합단백질이 세포 내 특히 ROS와 밀접한 관련이 있는 미토콘드리아 내로 전달되면 메탈로치오네인의 효과를 극대화할 수 있다.

이를 위해, 상기 단백질 형질 도입 영역의 카르복시 말단에 추가적으로 미토콘드리아 타겟팅 서열(Mitochondrial Targeting Sequence)이 펩타이드 결합될 수 있다.

이때, 상기 미토콘드리아 타겟팅 서열은 미토콘드리아 단백질로부터 유래된 것이라면 본 발명에서 특별히 제한하지 않는다. 대표적으로, 미토콘드리아 타겟팅 서열은 말레이트 디하이드로게나아제, 인간 시토크롬 c 서브유닛 옥시다제 VIII, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 c의 PI 아형, 알데히드 디하이드로게나제 타겟팅 서열, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 FI 베타 및 BCS1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 단백질로부터 유래될 수 있다. 바람직하기로 말레이트 디하이드로게나아제로부터 유래되며 서열번호 7로 표시되는 것을 사용한다.

상기 융합 단백질은 단백질 형질 도입 영역 아미노 말단에 폴리히스티딘(poly-His) 영역이 결합될 수 있다. 상기 폴리히스티딘(poly-His) 영역은 표지 펩타이드 중 하나로, 히스티딘 결합 수지와 결합하여 본 발명의 융합 단백질을 분리 및 정제하는 데 사용할 수 있다. 바람직하기로 폴리히스티딘 영역으로 헥사히스티딘을 사용한다.

또한 본 발명은 메탈로치오네인 단백질을 코딩하는 cDNA의 5' 말단에 단백질 형질 도입 영역을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 본 발명의 항산화 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

이러한 폴리뉴클레오티드는 메탈로치오네인, 단백질 형질 도입 영역, 미토콘드리아 타겟팅 서열을 코딩하는 공지의 핵산 서열로부터 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 상기 벡터는 클로닝 벡터로 사용가능한 것이라면 본 발명에서 특별히 한정하지는 않는다. 일예로, pRSET, pET3, pET11, pBAD, pThioHis, pTrcHis 등이 가능하다. 상기 벡터로 폴리히스티딘(poly-His) 영역을 코딩하는 DNA가 삽입되어 있는 벡터를 사용할 수 있다.

이러한 벡터는 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 적절한 제한효소로 절단한 클로닝 벡터에 공지된 통상의 방법으로 삽입하여 제조할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 미생물을 포함한다. 상기 미생물은 상기 융합 단백질이 효과적으로 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 가능하다. 대표적으로, E. Coli, 피키아 속(Pichia genus) 균주 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다:

(a) 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열로 표시되는 메탈로치오네인을 코딩하는 cDNA의 5' 말단에 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 단백질 형질 도입 영역을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 본 발명의 항산화 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환하는 단계;

(b) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 항산화 융합 단백질을 발현하는 단계; 및

(c) 발현된 항산화 융합 단백질을 정제하는 단계

이때 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 추가적으로 상기 단백질 형질 도입 영역을 코팅하는 cDNA의 3' 말단에 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 미토콘드리아 타겟팅 서열을 코팅하는 cDNA가 결합될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 형질전환 단계는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 운반시켜 실시된다. 상기 형질전환 방법은 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl₂ 방법, Hanahan 방법 및 전기 천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 봄바드먼트 등에 의해 발현 벡터를 숙주 세포인 미생물 내로 주입 할 수 있다. 미생물 내로 주입된 발현 벡터는 미생물 내에서 발현되어 목적의 융합 단백질을 얻게 된다.

발현된 융합 단백질은 변성상태 또는 자연 상태에서, 당 업계에 공지된 일반적인 정제방법을 통해 정제될 수 있다. 정제방법은, 예컨대, 암모늄 설페이트에 의한 분획화 (fractionation), 크기 구별 여과 (한외여과) 및 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명에 따른 항산화 융합 단백질은 세포 내 효율적으로 투과되어 메탈로치오네인의 항산화 활성 및 항-아포토시스 효과를 발휘함으로써, 고혈당 또는 당지질 독성으로부터 췌장 베타세포와 심근세포를 보호한다.

따라서, 상기 항산화 융합 단백질은 당뇨병 또는 당뇨병성 심근병증의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항산화 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 심근병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함한다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에 의한 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하고 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용할 수 있으며, 제제화 할 경우에는 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제는 본 발명에 따른 융합 단백질에 적어도 하나의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등의 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제에는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 포함되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있으며, 상기 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여용량은 체중 1kg 당 0.01 내지 1000 mg 의 양을 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 이때 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 조절될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: PTD-MT 융합 단백질 제조

1-1. PTD-MT 융합 단백질 제조를 위한 벡터 제작

PTD-MT 융합 단백질을 발현하는 벡터를 제조하기 위해 pRSET 발현벤터(Invitrogen)를 이용하였다. 먼저, 벡터에 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 TAT를 코딩하는 cDNA 또는 11R을 코딩하는 cDNA를 클로닝 하였다.

이를 위해, 서열번호 8의 Tat 올리고뉴클레오티드 또는 11R 올리고뉴클레오티드를 각각 정제한 뒤 pRSET-A 벡터에 클로닝하여 pRSET-Tat 또는 pRRET-11R 벡터를 제작하였다. 제작된 벡터는 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.

인간 메탈로치오네인을 코딩하는 cDNA를 pRSET-Tat 또는 pRRET-11R 벡터에 클로닝하기 위해, 메탈로치오네인 1H를 코딩하는 염기서열을 센스 프라이머(5'-TGCAGACTCGAGCCTAGAATGGAC-3': 서열번호 10)과 안티센스 프라이머(5'-CTGGAATTCGCCCTTTTCGTCACA-3': 서열번호 11)을 사용하여 PCR로 증폭하였다. 정제된 부분을 pRSET-Tat 또는 pRRET-11R 벡터에 hoI과 EcoRI 제한효소 부위를 사이에 클로닝 하였다. 제작된 벡터는 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.

Tat-GFP 융합 단백질 제조를 위해 pAcGFP1-N(invitrogen)로부터 얻은 GFP 유전자를 XhoI 및 NotI 위치에서 절단하여 제작된 pRSET-Tat 벡터 내로 삽입하였다. 이후 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.

1-2. PTD-MT 발현과 정제

제작된 벡터를 형질전환용 세포(Escherichia coli BL21 (DE)pLysS)에 형질전환시켜 얻은 콜로니를 50ug/ml의 암피실린이 첨가된 LB 배지에서 37 ℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이후 배양액 내 박테리아 농도, 600nm에서의 OD값이 0.4 내지 0.6이 되었을 때 단백질 발현을 위해 1mM의 IPTG를 넣고 26 ℃에서 하룻밤 동안 배양을 하였다. IPTG를 넣을 때, 단백질의 안정화를 위하여 1mM의 ZnSO₄를 넣고 배양하였다. 배양 후에 원심분리기를 이용하여 펠렛을 모으고 이를 용해성 버퍼와 100mM의 PMSF를 넣고 초음파처리를 30초씩 8번을 하여 세포를 깼다. 이를 통해 상층액을 모은 뒤 0.45um의 필터를 이용하여 여과하고, FPLC를 이용하여 니켈-니트릴로트리아세트산 레진 칼럼의 결합을 이용하여 정제하였다. 3500MW의 막을 이용하여 정제된 단백질로부터 염을 제거하고, 수득한 단백질에 단백질 분해효소 억제제 칵테일을 첨가하여 4 ℃에서 안정하게 보관하였다.

1-3. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅

발현된 단백질을 확인하기 위하여 12%의 SDS-PAGE를 이용하였다. 이중 하나는 쿠마시 블루로 60분 동안 염색하였고, 다른 하나는 웨스턴 블롯으로 메탈로치오네인을 확인하기 위해 PVDF 막으로 이동시켜, 40 mA로 4 ℃에서 하룻밤 동안 이동을 진행하였다. 이를 5% 탈지유를 포함하는 TBS에 넣고 4 ℃에서 60분간 블로킹을 한 뒤, 메탈로치오네인 토끼 다클론성 항체 IgG(1/1000 희석도)를 넣고 2 시간 동안 4 ℃에서 반응하였다. 이후 염소 항-토끼 IgG-HRP(1/1000 희석도)를 넣고 4 ℃에서 2시간 동안 반응을 시키고, 막은 Opti4-CN을 이용하여 확인하였다.

도 1의 (a)는 본 발명의 실시예 1에서 제조한 융합 단백질의 유전자 지도이다.

도 1에 나타낸 바와 같은 Tat-MT, 11R-MT 융합 단백질 및 MT 제조를 위한 발현벡터가 제대로 제작되었으며, 제작된 벡터의 염기서열은 염기서열 분석을 통해 확인하였다.

1-4. 아연의 유무에 따른 단백질의 안정성 평가

메탈로치오네인은 4개의 아연 이온이 결합되는 11개의 시스테인 잔기를 포함하는 알파 도메인과 3개의 아연 이온이 결합되는 9개의 시스테인 잔기를 포함하는 베타 도메인으로 이루어져 있다. 아연 이온이 메탈로치오네인의 시스테인 잔기와 결합하여 두 개의 메탈/티올레이트 클러스터를 형성함으로써 메탈로치오네인은 산화환원 성질을 갖게 된다(W. Maret et al., Proc.Natl.Acad.Sci U S A. 95 (1998) 3478-3482). 더욱이, 이러한 메탈로치오네인의 특이적인 구조는 아연에 의해 열역학적 안정성이 증가되고, 세포 내 공간에서 메탈로치오네인 클러스터에 대한 산화환원반응 활성을 부여한다. 이와 같이 아연은 메탈로치오네인이 항산화 단백질로 작용하기 위해 필수적인 것으로 알려져 있다(M. Wan et al., Biochem. J. 292 (1993) 609-615; M. Grattarola et al., Mol Biol Rep. 33 (2006) 265-272; Z.E. Suntres et al., Chem Biol Interact. 162 (2006) 11-23).

아연이 있거나 없는 조건하에서 MT, PTD-MT 융합단백질 발현을 유도하여, 이를 통해 메탈로치오네인 안정성 및 구조에 대한 아연의 영향을 확인하였다.

도 2의 (a)는 MT, Tat-MT 융합 단백질 및 11R-MT 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔을 통해 분석한 뒤 쿠마시 블루로 염색한 결과, (b)는 아연으로 안정화한 후의 결과를 나타낸 것이다.

도 2의 (a)를 참조하면, 아연이 없는 경우 메탈로치오네인과 본 발명의 융합 단백질은 자기 응집을 통해 다수 개의 밴드를 나타냄을 알 수 있다. 이와 달리 도 2의 (b)를 참조하면, 아연이 있는 경우 메탈로치오네인과 본 발명의 융합 단백질은 단일 밴드로 나타남을 알 수 있다. 이러한 결과는 아연이 산화환원반응 활성뿐만 아니라 메탈로치오네인의 안정성을 유지하는데 필수적인 요소임을 나타낸다.

또한 MT, Tat-MT 및 11R-MT의 분자량은 아미노산 서열로부터 계산할 결과, 각각 13.2 kDa, 12.9 kDa 및 12.7 kDa로 확인되었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, MT, Tat-MT 및 11R-MT의 단일 밴드는 각각 예상 크기에서 나타났다.

실시예 2: PTD-MTS-MT 융합 단백질 제조

2-1. PTD-MTS-MT 융합 단백질 제조를 위한 벡터제작

PTD-MTS-MT 융합 단백질을 발현하는 벡터를 제조하기 위해 pRSET 발현벤터(Invitrogen)를 이용하였다. 먼저, 벡터에 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 TAT를 코딩하는 cDNA 또는 11R을 코팅하는 cDNA를 클로닝 하였다.

이를 위해, 서열번호 8의 Tat 올리고뉴클레오티드 또는 11R 올리고뉴클레오티드와 서열번호 9의 MTS 올리고뉴클레이티드를 각각 정제한 뒤 pRSET-A 벡터에 클로닝하여 pRSET-Tat-MTS 벡터와 pRSET-11R-MTS를 제작하였다. 제작된 벡터는 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.

인간 메탈로치오네인을 코딩하는 cDNA를 pRSET-Tat-MTS와 pRSET-11R-MTS벡터에 클로닝하기 위해, 메탈로치오네인 1H를 코딩하는 염기서열을 센스 프라이머(5'-TGCAGACTCGAGCCTAGAATGGAC-3': 서열번호 10)과 안티센스 프라이머(5'-CTGGAATTCGCCCTTTTCGTCACA-3': 서열번호 11)을 사용하여 PCR로 증폭하였다. 정제된 부분을 pRSET-Tat-MTS 벡터에 hoI과 EcoRI 제한효소 부위를 사이에 클로닝 하였다. 제작된 벡터는 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.

Tat-MTS-GFP 융합 단백질 제조를 위해 pAcGFP1-N(invitrogen)로부터 얻은 GFP 유전자를 XhoI 및 NotI 위치에서 절단하여 제작된 pRSET-Tat-MTS 벡터 내로 삽입하였다. 이후 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.

2-2. PTD-MTS-MT 발현과 정제

제작된 벡터를 상기 실시예 1의 1-2와 동일한 방법으로 발현, 정제하였다.

2-3. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅

발현된 단백질을 확인하기 위하여 12%의 SDS-PAGE를 이용하여, 상기 실시예 1의 1-3과 동일하게 수행하였다.

도 1의 (b)는 본 발명의 실시예 2에서 제조한 융합 단백질의 유전자 지도이다.

도 3은 Tat-MTS-MT 융합 단백질을 SDS-PAGE 겔을 통해 분석한 뒤 쿠마시 블루로 염색한 결과를 나타낸 것이다. 왼쪽 밴드는 Tat-MT, 오른쪽 밴드는 Tat-MTS-MT를 보여준다.

Tat-MTS-MT의 분자량은 아미노산 서열로부터 계산한 결과, 13.6 kDa이었으며, 겔 분석 결과 융합 단백질이 정확한 크기에서 발현되었음을 확인하였다. 또한, Tat-MTS-MT가 조금 높게 나온 것으로 보아, MTS 삽입에 따라 분자량이 커졌음을 확인할 수 있었다.

실험예 1: PTD-MTS-MT 융합 단백질의 세포 투과능 확인

상기 실시예 2에서 제조한 Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합단백질의 세포투과능을 확인하기 위해 H9c2 세포를 6-웰 플레이트에 2×10⁵ 개씩 넣은 후 하루 동안 안정화시켰다. 이후 FBS가 없는 배지에서 3uM Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합단백질을 각각의 웰에 처리한 후 1시간 30분 동안 배양하였다. 세포를 FACS 고정 완충액으로 고정시키고 형광-활성화된 세포 분류기 (Fluorescence-activated Cell Sorter: FACS)를 사용하여 검출하였다.

도 4는 심근세포에서의 Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합 단백질후 세포투과능을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

상기 실시예 2에서 제조한 Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합단백질의 전달율을 확인하기 위해 H9c2 세포를 6-웰 플레이트에 2×10⁵ 개씩 넣은 후 하루 동안 안정화시켰다. 이후 FBS가 없는 배지에서 3uM Tat-GFP, Tat-MTS-GFP 융합단백질을 각각의 웰에 처리한 후 1시간 30분 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 세척하고, FBS가 있는 배지로 바꿔준다음 다시 1시간 30분 동안 배양하였다. 이후 세포를 FACS 고정 완충액으로 고정시키고 형광-활성화된 세포 분류기(Fluorescence-activated Cell Sorter: FACS)를 사용하여 검출하였다.

도 5는 심근세포에서의 Tat-GFP와 Tat-MTS-GFP 융합 단백질 전달율을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 미토콘드리아 타겟팅 서열이 GFP의 세포내 투과에 영향을 주지 않으며, 이를 통해 Tat-MTS-MT가 세포막 투과에 문제가 없을 것으로 판단하였다. 또한, 도 5를 참조하면, 미토콘드리아 타겟팅 서열을 포함하지 않는 Tat-GFP 융합 단백질은 시간이 지남에 따라 GFP 발현양이 감소하였다. 그러나, Tat-MTS-GFP 융합 단백질은 시간이 지나도 상대적으로 높은 강도를 유지하였다. 이러한 결과는 미토콘드리아 타겟팅 서열을 통해 세포 내 위치하는 시간이 더욱 증가함을 보여준다.

실험예 2: 세포 독성 확인

메탈로치오네인은 시토졸 단백질이므로 시토졸로 전달되어야 한다. 그러나, 메탈로치오네인의 세포 내 전달효율이 매우 낮다. PTD와 융합된 메탈로치오네인은 메탈로치오네인의 세포 내 전달 효율을 증가시킬 것으로 예상된다. 또한 본 발명의 융합 단백질은 세포 독성 없이 최적의 농도에서 세포 내 전달이 이루어져야 한다. 이를 위해 MT, Tat-MT 및 11R-MT의 췌장 세포와 심근 세포에 대한 세포 독성을 확인하였다.

2-1. 세포 배양

Ins-1 췌장 베타 세포를 RPMI 1640 배지와 10% 혈청 및 100U/ml 페니실린과 100 g/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 37 ℃에서 95% 공기, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다. 심근 세포는 마우스 심근세포 H9c2를 이용하였고, DMEM 배지와 10% 혈청 및 100U/ml의 페니실린과 100 g/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 37 ℃에서 95% 공기, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다.

2-2. 세포 독성 평가

MT 및 PTD-MT 융합단백질을 1uM에서 7uM까지 Ins-1 췌장 베타세포 및 H9c2 심근세포에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 세포 생존율을 분석하기 위하여 세포 계수 키트(CCK-8)를 사용하여 비색 분석을 수행하였다. 10ul의 CCK 반응액과 90ul의 DMEM배지를 섞어서 각 웰을 2 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 그리고 ELISA를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 비교하였다.

도 6은 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 1 μM 부터 7 μM까지 Ins-1 췌장 베타세포에 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.

도 7는 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 1 μM 부터 7 μM까지 H9c2 심근세포에 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.

도 6 및 도 7을 참조하면, MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질 모두 유의한 세포 독성을 나타내지 않았다.

실험예 3: PTD-MT 융합 단백질의 당지질 독성(glucolipotoxicity) 또는 고혈당에 의해 유도된 아포토시스(apoptosis)에 대한 베타 세포 보호 효과 확인

고혈당은 ROS 및 산화 스트레스를 증가시킴으로써 작용하는 유해 요소 중 하나로, 제1형 및 제2형 당뇨병에 중요하게 관련되어 있다. 정상 상태에서 혈당 수치는 좁은 농도 범위로 유지되나, 당뇨병에 있어서 짧은 시간 동안 혈장의 혈당 수치가 현저하게 변화한다. 이러한 혈장 혈당 수치의 급속한 변화는 혈관내피세포 기능장애 및 심근 아포토시스를 동반한 산화 스트레스를 유도한다. 고혈당과 고지혈증이 함께하는 당지질 독성 상태는 소포체(endoplasmic reticulum)의 스트레스를 유발한다. 이러한 소포체 스트레스는 베타세포 기능 및 팔미테이트 존재하에 배양 후 세포괴(mass)와 관련되어 있는 것으로 보고된 바 있다(E. Karaskov, C et al., Endocrinology. 147 (2006) 3398-3407). 메탈로치오네인의 항산화 기능을 통해 저산소 및 당지질 독성 상태에서 활성 산소종을 제거함으로써 세포의 생존율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질이 당지질 독성 및 저산소 조건 하에서 소포체 스트레스를 감소시킴으로써, 베타 세포의 기능을 보호할 수 있는지 확인하였다.

3-1. 고혈당 및 당지질 스트레스 유도

상기 실험예 1에서 배양한 베타세포 Ins-1에 다음과 같이 당지질 스트레스를 주었다. 20 mM의 팔미테이트를 0.01M NaOH에 70 ℃에서 30분간 녹이고, 지방산 비누를 5% BSA를 함유하는 PBS와 지방산 대 BSA의 몰비가 8:1이 되도록 섞어주었다. 그리고 팔미테이트/BSA 융합체를 배지에 넣고 세포에 당지질 스트레스를 주었다. 이때 췌장 베타세포에 300 uM의 팔미테이트와 50 mM의 당을 함께 처리하여 24시간동안 당지질 스트레스를 주었다. 심근세포 H9c2의 경우에는 350 mM의 글로코스만을 24 시간 동안 주어 고혈당 스트레스를 유도하였다. 이러한 스트레스를 주는 동안 함께 융합 단백질을 3uM을 처리하고 상기한 바와 같이 CCK를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

3-2. 저산소(Hypoxia) 상태 유도

저산소 상태에서의 본 발명에 따른 융합 단백질의 세포 보호 효과를 평가하기 위하여, 고혈당 및 당지질 스트레스를 유도 상태에서 저산소 스트레스를 함께 유도하였다. 이를 위해 고혈당 및 당지질 스트레스가 주어진 세포를 37 ℃, 95 % N₂, 5 % CO₂조건의 저산소 인큐베이터에 배양하여 저산소 스트레스를 함께 주었다. 24 시간 뒤에 이를 CCK를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다

도 8은 당지질 스트레스에 노출된 췌장 베타세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.

도 8을 참조하면, MT는 어떠한 효과도 나타내지 않는 반면, 11R-MT와 Tat-MT를 처리한 경우 당지질 스트레스에 노출된 베타세포의 생존율이 46.5%에서 각각 54.19%, 67.67%로 증가하였음을 알 수 있다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 융합 단백질이 당지질 스트레스에 노출된 베타 세포의 생존율을 유의하게 증가시켰음을 나타낸다.

도 9는 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 췌장 베타세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질을 처리한 후 베타세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.

도 9를 참조하면, MT는 어떠한 효과도 나타내지 않는 반면, 11R-MT와 Tat-MT를 처리한 경우 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 베타세포의 생존율이 37.31%에서 각각 40.05%, 48.33%로 증가하였음을 알 수 있다.

메탈로치오네인의 정확한 메커니즘은 보고된 바 없으나, 이러한 결과는 본 발명에 따른 융합 단백질이 항산화 작용을 통해 세포 생존율을 증가시킴으로써 당뇨병의 진행을 억제할 수 있음을 의미한다.

실험예 4: PTD-MT, PTD-MTS-MT 융합 단백질의 당지질 독성(glucolipotoxicity) 또는 고혈당에 의해 유도된 아포토시스(apoptosis)에 대한 심근 세포 보호 효과 확인

본 발명의 융합 단백질이 세포의 아포토시스를 유의하게 방지하는 것과 비교하여, 메탈로치오네인 그 자체는 세포 생존율에 어떠한 효과도 나타내지 아니하였고, 이는 본 발명의 융합 단백질의 세포 내 전달 효율이 높다는 것을 의미한다.

당뇨병 환자에 있어서, 심근병증은 고혈압과 죽상동맥경화증으로 설명될 수 없는 일반적인 증상이다. 당뇨병성 심근병증은 대사 이상, 세포이하의 결함, 유전자의 비정상적 발현 및 고혈당으로 인한 심근 세포사멸과 관련되어 있다. 더욱이, 심근병증의 원인은 섬유증과 같은 기관 손상 또는 심근세포의 직접적인 손상을 포함하며, ROS도 이러한 손상의 원인이라고 최근 보고된 바 있다. ROS는 고혈당 조건에 있는 세포에서 증가되고 생체내(in vivo)에서 심근에서의 세포 아포토시스를 유발한다(L. Cai et al., Diabetes. 51 (2002) 1938-1948). 본 발명에 따른 융합 단백질의 심근세포에 대한 보호 효과와 항산화능을 확인하기 위해, 고혈당 아래 저산소 조건을 있거나 없게 하여 쥐의 심근세포주인 H9c2에 대한 세포 생존율을 평가하였다. 구체적인 조건은 상기 실험예 3과 동일하게 수행하였다.

도 10은 당지질 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.

도 11은 당지질 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. Control은 처리하지 않은 정상 세포 대조군, HG는 처리하지 않은 당지질 스트레스 세포군, MT는 메탈로치오네인 처리군, RMT는 11R-MT 처리군, TMT는 Tat-MT 처리군, RMM은 11R-MTS-MT 처리군, TMM은 Tat-MTS-MT 처리군을 나타낸다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 당지질 스트레스에 노출된 심근 세포는 세포 생존율이 정상 세포 대조군에 비교하여 크게 감소한다. 그러나, 메탈로치오네인 자체를 처리한 군보다 PTD-MT를 처리한 군의 생존율이 보다 향상되었으며, PTD-MTS-MT 융합 단백질을 처리한 군의 경우 세포 생존율이 가장 높았다.

도 12는 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. HP는 처리하지 않은 저산소 스트레스 세포군을 나타낸다.

도 12를 참조하면, 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포는 세포 생존율이 정상 세포 대조군에 비교하여 크게 감소한다. 그러나, 메탈로치오네인 자체를 처리한 군보다 PTD-MT를 처리한 군의 생존율이 보다 향상되었으며, PTD-MTS-MT 융합 단백질을 처리한 군의 경우 세포 생존율이 가장 높았다.

도 13은 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다.

도 14는 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포에 대해 MT, Tat-MT, 11R-MT, Tat-MTS-MT 및 11R-MTS-MT 단백질 3uM을 처리한 후 심근세포의 생존율(%)을 나타낸 그래프이다. HG+HP는 처리하지 않은 당지질과 함께 저산소 스트레스에 노출된 세포군을 나타낸다.

도 10 및 도 13을 참조하면, 본 발명에 따른 융합 단백질을 처리한 경우 심근세포 생존율이 60%까지 유의하게 증가한 반면, MT는 어떠한 효과도 나타내지 않았다.

또한 11R-MT 융합 단백질은 Tat-MT 융합 단백질과 비교하여 Ins-1 및 H9c2 세포에 대해 세포 아포토시스를 보호하는 효과가 낮았다. 이는 단백질 형질 도입 영역인 11R이 Tat 보다 세포 내 전달 효율이 낮기 때문이라고 생각된다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포는 세포 생존율이 정상 세포 대조군에 비교하여 크게 감소한다. 그러나, 메탈로치오네인 자체를 처리한 군보다 PTD-MT를 처리한 군의 생존율이 보다 향상되었으며, PTD-MTS-MT 융합 단백질을 처리한 군의 경우 가장 높은 세포 생존율이 나타내었다.

실험예 4: PTD-MT 융합 단백질의 심근 세포에 대한 항-아포토시스 효과 확인

본 발명에 따른 PTD-MT 융합 단백질의 항-아포토시스 효과를 확인하기 위해, 저산소 상태가 있거나 없는 두 가지 종류의 아포토시스 조건을 유도하였다. 본 발명의 PTD-MT 융합 단백질의 항-아포토시스 효과는 포유동물 세포에서 아포토시스의 중요한 중재인자로 작용하는 카스파제-3의 세포 내 활성을 특정하여 평가하였다.

4-1. 내인성 아포토시스(Apoptosis) 유도

H9c2 세포를 두 개의 96-웰 플레이트에 시딩한 후 MT와 PTD-MT 융합 단백질로 처리하였다. 하나의 플레이트는 7시간 동안 고혈당 스트레스를 주었고, 다른 플레이트는 7시간 동안 저산소 챔버에서 배양하였다. 이어서, 융합 단백질 투여 군에서 카스파제-3의 활성이 얼마나 억제되었는지 카스파제-3 분석 키트를 이용하여 평가하였다.

도 15는 당지질 스트레스에 의해 유도된 심근세포 카스파제-3 활성에 대한 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 15를 참조하면, 아무 처리도 안 한 대조군(control group)의 경우 카스파제-3 활성이 17 배나 증가하였으나, MT, 11R-MT 및 Tat-MT를 처리한 경우 각각 13, 9, 7배가 증가하였다.

도 16은 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스 조건 하에서 심근 세포의 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 카스파제-3 활성의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 16을 참조하면, 당지질 스트레스와 함께 저산소 스트레스에 노출된 심근 세포는 당지질 스트레스에만 노출된 심근세포 보다 카스파제-3의 활성이 더욱 증가하였다. 또한 심근 세포에서 아무 처리도 안한 대조군(control group)의 경우 카스파제-3 활성이 30배나 증가한 반면, MT, Tat-MT 및 11R-MT를 처리한 경우 카스파제-3의 활성이 유의하게 저하되었다.

특히, Tat-MT 및 11R-MT 융합 단백질은 MT와 비교하여 아포토시스 보호 효과가 현저히 우수하였으며, 이는 본 발명의 융합 단백질에 세포 내로 전달되어 세포를 아포토시스로부터 보호하는 것임을 나타낸다.

4-2. 외인성 아포토시스 유도

염화코발트는 미토콘드리아 독립 경로를 통해 ROS 형성을 증가시키는 저산소 유발물질로 알려져 있다. 이에 본 발명에 따른 융합 단백질의 외인성 아포토시스 유사 환경에서의 항-아포토시스 효과를 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

H9c2 세포를 두 개의 96-웰 플레이트에 시딩한 후 MT와 PTD-MT 융합 단백질로 처리하였다. 하나의 플레이트는 7시간 동안 고혈당 스트레스를 주었고, 다른 플레이트는 7시간 동안 저산소 챔버에서 배양하였다. 이어서, 세포 사멸 중 카스파제 신호를 활성화하는 CoCl₂을 200uM 처리하여 6시간 동안 배양하고, 융합 단백질 투여 군에서 카스파제-3의 활성이 얼마나 억제되었는지 카스파제-3 분석 키트를 이용하여 평가하였다.

도 17은 염화코발트로 처리하여 유도된 외인성 아포토시스에 대해 MT, Tat-MT 및 11R-MT 단백질의 심근세포 카스파제-3 활성의 저해 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 17에 나타낸 바와 같이, 11R-MT와 Tat-MT 융합 단백질을 처리함에 따라 카스파제-3의 활성이 대조군에 비해 각각 60%, 40% 감소된 반면, MT는 카스파제-3 활성에 어떠한 영향도 미치지 않았다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 융합 단백질이 카스파제-3 활성을 저해함을 나타내는 것으로, 아포토시스로부터 세포를 보호할 수 있음을 의미한다. 이는 본 발명에 따른 융합 단백질이 메탈로치오네인 자체 보다 세포 내 투과율이 높기 때문이다.

실험예 5: 활성 산소종 발현억제 확인

본 실험은 세포 생존율을 평가하였던 실험에서 사용한 세포 스트레스 환경에 대한 활성 산소종의 발현양을 평가하고, 메탈로치오네인을 처리하여 활성 산소종의 감소를 확인하고자 진행하였다.

이를 위해 상기 실험예 3의 스트레스 환경과 동일한 시간 동안 고혈당 스트레스를 주었고, 또한 저산소 스트레스 환경도 동일하게 진행하였다. 스트레스에 심근 세포가 노출되기 직전 각각의 융합 단백질을 3uM 처리하였고, 스트레스 후 활성 산소종의 양을 평가하기 위하여 H₂-DCFDA를 사용하였다.

도 18은 고혈당 스트레스에 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현 정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. HG는 처리하지 않은 고혈당 스트레스에 노출된 세포군, MT는 메탈로치오네인 처리군, RMT는 11R-MT 처리군, TMT는 Tat-MT 처리군, RMM은 11R-MTS-MT 처리군, TMM은 Tat-MTS-MT 처리군을 나타낸다.

도 18에 나타낸 바와 같이, 메탈로치오네인 자체는 활성 산소종 억제효과가 전혀 보이지 않았으며, 11R-MT와 Tat-MT의 경우 각각 61.60%와 50.67%를 보여주었다. 이에 비해 11R-MTS-MT와 Tat-MTS-MT의 경우 32.46%와 18.06%를 보여 주어 보다 효과적으로 활성 산소종의 발생을 억제한 것을 알 수 있었다.

도 19는 저산소 스트레스에 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현 정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다. HP는 처리하지 않은 저산소 스트레스에 노출된 세포군을 나타낸다.

도 19를 참조하면, 도 18의 결과와 마찬가지로 메탈로치오네인 자체는 활상산소종 발현 억제효과를 보이지 않았다. 또한 11R-MT와 Tat-MT는 86%와 78%의 활성 산소종 발현 정도를 보인 반면, Tat-MTS-MT의 경우 다른 군과 비교하여 상당히 높은 활성 산소종 발생 억제 효과를 보여주었다.

도 20는 고혈당 스트레스와 저산소 스트레스에 함께 노출된 심근세포에서의 활성 산소종 발현정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 20에 나타낸 바와 같이, 메탈로치오네인 자체는 효과가 없었고, 11R-MT와 Tat-MT는 각각 76%와 70%의 활성 산소종 발현 정도를 보였으며, Tat-MTS-MT 처리군이 42%로 가장 높은 활성 산소종 억제 효과를 보여주었다.

나트륨 아비산염(NaAsO₂)은 활성 산소종의 발현을 증가시키는 물질로, 이를 세포에 처리하면 활성 산소종이 증가하게 된다. 10uM의 나트륨 아비산염을 24시간 동안 처리한 군을 100%로 두고, 융합 단백질 처리군의 상대적인 활상 산소종 발현을 평가하여, 그 결과를 도 21에 나타내었다.

도 21은 나트륨 아비산염을 처리한 심근세포에서의 활성 산소종 발현정도를 100%라고 했을 때 융합 단백질 처리군의 활성 산소종 발현양을 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 21을 참조하면, 다른 융합 단백질 처리군과 비교하여, Tat-MTS-MT 처리군이 31%의 활성 산소종 발현정도를 보여 TMM이 활성 산소종 발현을 가장 잘 억제하고 있는 것을 알 수 있었다.

실험예 6: 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델에 대한 치료효과 확인

5-1. 당뇨 동물모델에서 활성 산소종 감소 효과

6주령의 백서 동물 모델을 이용하여 실험을 진행하고 동물의 몸무게는 20 ~ 23g 정도로 통일하였다. 제1형 당뇨 모델로 120mg/kg로 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)을 1회 투여하고, 제2형 당뇨 모델로 40mg/kg로 5회 투여하였다. STZ 투여를 위해 동물을 8시간 정도 굶기고 STZ를 투여하였다. 투여 후 4시간 뒤에 단백질을 투여하는 방식으로 진행하였다. 제1형 당뇨 모델은 STZ 투여하고 4시간 뒤에 단백질을 500ug씩 투여하였다. 이후 매일 혈당을 측정하여 혈당의 변화를 확인하여 단백질의 효과를 판단하였다. 또한 2형 당뇨모델의 경우 8시간 동안 굶기고 STZ를 투여하였다. 투여 후 4시간 뒤에 500ug의 단백질을 투여하고 이를 5일 동안 반복하고 혈당은 매일 측정하였다. 14일 동안 평가하여 혈당의 변화를 관찰하였다.

Tat-MTS-MT 융합 단백질의 투여한 제1형 당뇨 동물모델의 췌장에서의 활성 산소종 변화를 확인하기 위해 다음과 같이 실시하였다.

제1형 당뇨 모델에 복강 주사를 통해 10uM의 H₂DCFDA 염료(2,7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate, acetylester)을 투여한 뒤 췌장을 분리하여 활성 산소종 발현양을 측정하였다. 이를 위해 형광 이미징 박스를 이용하여 활성 산소종에 의해 시약에서 발현되는 형광의 강도(intesnsity)를 측정하여 정량하였으며, 그 결과는 도 22에 나타내었다.

도 22는 스트렙토조토신 유도 제1형 당뇨 동물모델에 대해 Tat-MTS-MT 투여에 따른 췌장의 활성 산소종 함량을 나타낸 그래프이다. control은 처리하지 않은 정상 세포 대조군, STZ는 처리하지 않은 제1형 당뇨 모델군, STZ+TMM은 Tat-MTS-MT 처리한 제1형 당뇨 모델군을 나타낸다.

도 22에 나타낸 바와 같이, 정상 동물의 췌장과 비교하여 스트렙토조토신 투여에 의해 유도된 제1형 당뇨 동물 모델은 췌장 내 활성 산소종의 함량이 증가한다. 이러한 당뇨 동물 모델에 Tat-MTS-MT 융합 단백질 투여 결과, 췌장의 활성 산조종이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.

5-2. 당뇨 동물 모델의 융합 단백질 투여에 따른 혈당 변화

도 23는 스트렙토조토신 유도 제1형 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT 투여 후 혈당변화를 나타낸 그래프이다.

도 23을 참조하면, 세포 내로 유입되지 않는 MT는 혈당 변화에 어떠한 효과도 나타내지 않는 반면, Tat-MT를 투여한 동물 모델의 경우 혈당 수치가 감소하여, 당뇨 진행 속도를 지연할 수 있음을 알 수 있다.

도 24는 스트렙토조토신 유도 제2형 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT 투여 후 혈당변화를 나타낸 그래프이다.

도 24에 나타낸 바와 같이, MT는 제1형 당뇨 동물모델에서와 마찬가지로 혈당 수치에 효과가 없었으며, Tat-MT를 투여한 동물 모델의 경우 혈당 수치가 감소하여, 당뇨 진행 속도를 지연할 수 있음을 알 수 있다.

5-3. 당뇨 동물 모델의 융합 단백질 투여시기에 따른 혈당 변화

6주령의 백서 동물 모델을 이용하여 실험을 진행하고 동물의 몸무게는 20 ~ 23g 정도로 통일하였다. 당뇨 모델로 80mg/kg로 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)을 투여하였다. STZ 투여를 위해 동물을 8시간 정도 굶기고 STZ를 투여하였다. STZ 투여 전, 후 4시간 뒤에 Tat-MT, Tat-MTS-MT 단백질을 500ug씩 투여하는 방식으로 진행하였다. 이후 매일 혈당을 측정하여 혈당의 변화를 확인하여 단백질의 효과를 판단하고, 그 결과를 도 25에 나타내었다.

도 25는 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델에 대해 스트렙토조토신 투여 전과 후 Tat-MT, Tat-MTS-MT 투여에 따른 혈당변화를 나타낸 그래프이다.

도 25를 참조하면, 융합 단백질을 투여하지 않은 대조군(STZ)에서 이틀째 혈당이 당뇨로 판단할 수 있는 기준인 300 mg/dl에 도달하였고, 스트렙토조토신 투여 전 Tat-MTS-MT를 투여한 실험군이 혈당이 가장 낮게 유지되었다.

5-4. 당뇨 동물 모델의 융합 단백질 장기 투여에 따른 혈당 변화

6주령의 백서 동물 모델을 이용하여 실험을 진행하고 동물의 몸무게는 20 ~ 23g 정도로 통일하였다. 당뇨 모델로 80mg/kg로 스트렙토조토신(streptozotocin, STZ)을 5회 투여하였다. STZ 투여를 위해 동물을 8시간 정도 굶기고 STZ를 투여하였다. STZ 투여 4시간 뒤에 MT, Tat-MT, Tat-MTS-MT 단백질을 500ug씩 투여하는 방식으로 진행하였다. 이후 매일 혈당을 측정하여 혈당의 변화를 확인하여 단백질의 효과를 판단하고, 그 결과를 도 26에 나타내었다.

도 26은 스트렙토조토신 유도 당뇨 동물모델에 대해 MT, Tat-MT, Tat-MTS-MT 투여에 따른 혈당변화를 나타낸 그래프이다.

도 26을 참조하면, 융합 단백질을 투여하지 않은 대조군(STZ)에서 이틀째 혈당이 당뇨로 판단할 수 있는 기준인 300 mg/dl에 도달하였고, 스트렙토조토신 투여 전 Tat-MTS-MT를 투여한 실험군이 혈당이 10일째까지 가장 낮게 유지되었다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation, Hanyang University <120> Anti-Oxidant Fusion Protein and Use thereof <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 61 <212> PRT <213> Metallothionein 1H <400> 1 Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ser Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys Thr 1 5 10 15 Ser Ser Cys Ala Cys Lys Asn Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser 20 25 30 Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ser Lys Cys Ala Gln Gly Cys 35 40 45 Val Cys Lys Gly Ala Ala Asp Lys Cys Thr Cys Cys Ala 50 55 60 <210> 2 <211> 61 <212> PRT <213> metallothionein 2 <400> 2 Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala 1 5 10 15 Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser 20 25 30 Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys 35 40 45 Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala 50 55 60 <210> 3 <211> 68 <212> PRT <213> metallothionein 3 <400> 3 Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys 1 5 10 15 Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys 20 25 30 Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp 35 40 45 Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys 50 55 60 Ser Cys Cys Gln 65 <210> 4 <211> 62 <212> PRT <213> metallothionein 4 <400> 4 Met Asp Pro Arg Glu Cys Val Cys Met Ser Gly Gly Ile Cys Met Cys 1 5 10 15 Gly Asp Asn Cys Lys Cys Thr Thr Cys Asn Cys Lys Thr Cys Arg Lys 20 25 30 Ser Cys Cys Pro Cys Cys Pro Pro Gly Cys Ala Lys Cys Ala Arg Gly 35 40 45 Cys Ile Cys Lys Gly Gly Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Pro 50 55 60 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Tat <400> 5 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> 11R <400> 6 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> MTS <400> 7 Ile Thr Met Val Ala Ser Leu 1 5 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Tat oligonucleotide <400> 8 tatggcagga agaagcggag acagcgacga cga 33 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> MTS oligonucleotide <400> 9 attaccatgg tgtccgctct 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> MT sense primer <400> 10 tgcagactcg agcctagaat ggac 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> MT antisense primer <400> 11 ctggaattcg cccttttcgt caca 24

Claims

서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 Tat 단백질 형질 도입 영역- 말레이트 디하이드로게나아제로부터 유래되며 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 미토콘드리아 타겟팅 서열-메탈로치오네인이 펩타이드 결합되어 연결된 항산화 융합 단백질.
제1항에 있어서,
상기 메탈로치오네인은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
삭제
삭제
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삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 단백질 형질 도입 영역 아미노 말단에 폴리히스티딘(poly-His) 영역이 결합된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
메탈로치오네인 단백질을 코딩하는 cDNA의 5' 말단에 단백질 형질 도입 영역및 미토콘드리아 타겟팅 서열을 코딩하는 cDNA가 결합된, 제1항의 항산화 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제10항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
제1항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학 조성물.
제1항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 심근병증 예방 및 치료용 약학 조성물.