KR101248367B1

KR101248367B1 - Production Method of White Clover With Mutation in Leaf Number

Info

Publication number: KR101248367B1
Application number: KR1020080007844A
Authority: KR
Inventors: 송인자; 배태웅; 임평옥; 이효연; 강시용; 강홍규
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2008-01-25
Filing date: 2008-01-25
Publication date: 2013-04-01
Also published as: WO2009093787A1; KR20090081784A

Abstract

본 발명은 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 화이트 클로버의 꽃에 돌연변이원을 처리하는 단계, 돌연변이원이 처리된 화이트 클로버를 재배하여 종자를 채종하는 단계 및 그 종자를 재배하여 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버를 선별하는 단계를 포함하여 구성되는 화이트 클로버의 제조방법을 개시한다.The present invention discloses a method for producing a white clover inducing leaf number mutation. Specifically, the present invention comprises the steps of: treating a mutagen to a flower of a white clover, cultivating the white clover treated with the mutagen, sowing seeds, and cultivating the seed to select a white clover inducing leaf number mutation It discloses a method of manufacturing a white clover comprising a.

화이트 클로버, 꽃, 잎 수, 돌연변이 White clover, flower, leaf number, mutant

Description

Production Method of White Clover With Mutation in Leaf Number

본 발명은 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing a white clover inducing leaf number mutation.

화이트 클로버(Trifolium repense L.)는 쌍떡잎식물 장미목 콩과의 여러해살이풀로서 유럽이 원산지이며 흰색의 꽃이 피기 때문에 화이트 클로버로 불린다.White Clover ( Trifolium repense L.) is a perennial plant of the dicotyledonous rosemary legaceae, which is native to Europe and is called white clover because of its white flowers.

땅위로 벋어가는 줄기 마디에서 뿌리가 내리고 독립 개체로 번식하며, 우리나에서는 6~7월에 개화한다. 잎은 3개가 달리는데, 간혹 4개 달리기도 한다. 화이트 클로버의 4 잎은 행운을 상징하는 것으로 알려져 있다.Roots take root and grow as independent individuals, and in Urina, bloom in June-July. Three leaves are running, sometimes four. Four leaves of white clover are known to symbolize good luck.

화이트 클로버에 대해 개발된 기술들은 크게 세 가지로 대별해 볼 수 있는데, 제1 유형은 화이트 클로버 잎 특히 행운을 상징하는 4 잎을 이용한 팬시 제품에 대한 기술이고, 제2 유형은 화이트 클로버가 가지는 생리활성을 이용한 기술이며, 제3 유형은 4 잎 클로버를 생산하기 위한 품종 개량 기술이다.The technologies developed for white clover can be roughly divided into three types. The first type is the technology of fancy products using white clover leaves, especially the four leaves symbolizing good luck, and the second type is the physiology of white clover. It is a technique using activity, and the third type is a breed improvement technique for producing four leaf clover.

4 잎 클로버를 일정한 크기와 모양으로 가공하여 투명 합성수지판에 개재한 장신구에 대한 기술을 개시하고 있는 대한민국 특허 제0391893호나, 4 잎 클로버를 투명 합성수지판으로 밀봉한 후에 이를 목걸이나 반지 등에 사용하는 기술을 개시하고 있는 대한민국 실용신안등록 제0190633호가 상기 제1 유형에 속하는 기술로 볼 수 있고, 클로버 잎 추출물을 이용한 노화방지 용도의 화장품을 개시하고 있는 대한민국 특허 제0545043호가 상기 제2 유형에 속하는 기술로 볼 수 있으며, 4 잎을 지닌 포복경을 채취하여 BAP, IBA 및 NH₄NO₃로 처리하고 무성번식시켜 신품종을 생산하는 기술을 개시하고 있는 대한민국 특허 제0330804호가 상기 제3 유형에 속하는 기술로 볼 수 있다.Korean Patent No. 0391893, which discloses a technique for ornaments embedded in a transparent synthetic resin plate by processing four leaf clover in a certain size and shape, or a technique of sealing four leaf clover with a transparent synthetic resin plate and then using it for necklaces or rings. Korean Utility Model Registration No. 0190633, which discloses a technology belonging to the first type, and Korean Patent No. 0545043, which discloses anti-aging cosmetics using clover leaf extract, is a technology belonging to the second type. Korean Patent No. 0330804, which discloses a technique for producing a new breed by harvesting a four-leaf lap cloth, treating it with BAP, IBA, and NH ₄ NO ₃ , and asexual breeding, can be seen as a technique belonging to the third type. have.

본 발명은 화이트 클로버를 돌연변이시켜 잎 수가 4 잎 이상인 잎을 지니는 화이트 클로버를 대량 생산할 수 있는 기술을 개시한다.The present invention discloses a technique capable of mutating white clover to mass produce white clover having leaves having four or more leaves.

본 발명의 기술적 과제는 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법을 제공하는 데 있다.The technical problem of the present invention is to provide a method for producing a white clover induced by leaf number mutation.

본 발명의 다른 기술적 과제는 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버 종자의 제조방법을 제공하는 데 있다.Another technical problem of the present invention is to provide a method for producing white clover seeds induced by leaf water mutation.

본 발명의 또 다른 기술적 과제는 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎 을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.Another technical problem of the present invention is to provide a method of manufacturing the leaves of the white clover having a leaf number of four or more leaves.

본 발명의 구체적인 기술적 과제나 기타의 양태는 이하에서 제시될 것이다.Specific technical objects or other aspects of the present invention will be presented below.

본 발명은 일 측면에 있어서, 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a method for producing a white clover, in which leaf number mutations are induced.

본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법은 (a) 화이트 클로버의 꽃에 돌연변이원을 처리하는 단계, (b) 돌연변이원이 처리된 화이트 클로버를 재배하여 종자를 채종하는 단계 및 (c) 그 종자를 재배하여 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버를 선별하는 단계를 포함하여 구성된다.The method for producing a white clover inducing leaf number mutation of the present invention comprises the steps of (a) treating a mutagen to a flower of a white clover, (b) cultivating a white clover treated with a mutagen and seeding seeds; c) cultivating the seed to select the white clover from which the leaf number mutation was induced.

하기 실시예 및 비교예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명자들은 화이트 클로버의 꽃에 돌연변이원인 감마선(⁶⁰Co) 또는 에틸메탄술포네이트(ethylmethanesulfonate; 이하 "EMS")를 처리하고 그 돌연변이원이 처리된 화이트 클로버를 배양하여 종자를 채종한 후 그 종자를 파종·발아시켜 재배할 경우에, 감마선이 처리된 경우는 생존 식물체의 약 3.5%의 비율(생존 식물체 113 개체 중 4 개체)로 잎 수에 있어서 돌연변이가 유도된 화이트 클로버가 얻어짐을 확인할 수 있었고, EMS가 처리된 경우는 생존 식물체의 1.1%의 비율(생존 식물체 총 363 개체 중 4 개체)로 잎 수에 있어서 돌연변이가 유도된 화이트 클로버가 얻어짐을 확인할 수 있었다.As confirmed in the following examples and comparative examples, the inventors treated the flowers of the white clover with a gamma ray ( ⁶⁰ Co) or ethylmethanesulfonate (hereinafter referred to as "EMS"), which is a mutagen, and the mutagen treated white. In the case of cultivating clover, seeding the seed, and cultivating the seed, and cultivating the seed, when gamma-ray treatment is performed, mutations in the number of leaves in about 3.5% of the surviving plants (4 out of 113 living plants) Induced white clover was obtained, and in the case of EMS treatment, a mutation-induced white clover was obtained in the number of leaves at a ratio of 1.1% (4 out of 363 living plants). there was.

특히 감마선이 처리된 화이트 클로버로부터 채종한 종자(M₁)를 재배하고 제1세대 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버를 얻은 다음, 그 제1세대 화이트 클로버부터 종자(M₂)를 채종하고 그 종자를 재배하여 제2 세대의 화이트 클로버를 재배하였을 때, 파종한 230개의 종자 중 생존한 화이트 클로버 130 개체 모두에서 잎 수 돌연변이 유도체가 관찰되었는데, 잎 수의 변이는 주로 4 잎 또는 5 잎이었지만 간혹 6 잎 또는 7 잎도 관찰되었고, 잎 수는 4개이지만 한 개의 잎이 부분적으로 나누어진 잎, 3개의 큰 잎과 2개의 작은 잎으로 이루어진 5 잎, 2개의 잎이 겹쳐서 4 잎으로 보이는 5 잎, 컵 모양의 잎을 가진 5 잎 등도 관찰되었다.In particular, cultivated seed (M ₁ ) cultivated from gamma-rayed white clover and obtaining a white clover from which first-generation leaf number mutations were induced, then seed (M ₂ ) from the first-generation white clover and seeding When cultivated the second generation of white clover, leaf number mutant derivatives were observed in all 130 surviving white clover out of 230 seed sown. The variation in leaf number was mainly 4 or 5 leaves, but sometimes 6 leaves. Or 7 leaves were also observed, 4 leaves but one leaf partially divided, 5 large leaves consisting of 3 large leaves and 2 small leaves, 2 leaves overlapping 4 leaves, 4 cups, cup Five leaves with shaped leaves were also observed.

본 발명은 전술한 바의 실험 결과에 기초하여 제공되는 것이다.The present invention is provided based on the experimental results as described above.

본 명세서에서, "잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버"란 잎 수가 4 잎 이상인 잎을 야생형 화이트 클로버보다 많은 비율로 갖는 화이트 클로버를 의미한다. 일반적으로 야생형 화이트 클로버에서 잎 수가 4 잎 이상인 잎이 0.1% 이하로 발생하는 것으로 알려져 있다. 상기 백분율은 1 개체의 화이트 클로버에서 3 잎의 전체 숫자에 대해 잎 수가 4 잎 이상인 잎의 전체 숫자의 백분율이다. 그러므로 "잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버"란 잎 수가 4 잎 이상인 잎이 10% 이상인 화이트 클로버로 정의되며, 바람직하게는 하기 실시예의 결과를 고려할 때 잎 수가 4 잎 이상인 잎이 20% 이상인 화이트 클로버로 정의될 수 있고, 더 바람직하게는 잎 수가 4 잎 이상인 잎이 30% 이상인 화이트 클로버로 정의될 수 있다.As used herein, the term "leaf clover-induced white clover" means a white clover having a leaf number of 4 or more leaves in proportion to a wild type white clover. In general, wild type white clover is known to produce less than 0.1% of the leaves having more than four leaves. The percentage is the percentage of the total number of leaves with four or more leaves relative to the total number of three leaves in one individual white clover. Therefore, "leaf clover derived from leaf number mutation" is defined as a white clover having at least 10% of leaves having 4 or more leaves, and preferably white clover having at least 20 leaves having 4 or more leaves, considering the results of the following examples. It may be defined as, and more preferably may be defined as a white clover having at least 30% of the leaves having 4 or more leaves.

또 상기 "잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버"는 잎 수가 4 잎 또는 5 잎인 잎을 갖는 화이트 클로버뿐만 아니라 잎 수가 6 잎 또는 7 잎을 갖는 화이트 클로버를 포함하는 의미이며, 잎 수가 4 잎 이상인 잎을 갖는 한, 일부 갯수의 잎이 다른 잎에 비하여 크기가 작은 경우와 모양이 다른 경우를 모두 포함하는 의미이다. In addition, the "leaf number mutation induced white clover" is meant to include not only white clover having a leaf number of 4 or 5 leaves, but also white clover having 6 or 7 leaves, and leaves having 4 or more leaves. As long as the number of leaves is small compared to other leaves, the meaning includes both the case of a different shape and the case.

또한 본 명세서에서, "돌연변이가 유도되었다는 것"은 그 돌연변이된 형질이 다음 세대에서도 발현될 수 있도록 유전적 변이가 일어난 경우를 의미한다. 그러므로 본 명세서에서 "잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버"는 잎 수에 있어서 유전적 변이가 발생하여 다음 세대에서도 그 표현형이 발현될 수 있는 화이트 클로버로 이해될 수 있다. In addition, in this specification, "mutation induced" refers to a case where a genetic mutation occurs so that the mutated trait can be expressed in the next generation. Therefore, in the present specification, "leaf clover derived from leaf number mutation" may be understood as a white clover in which a genetic variation occurs in leaf number so that the phenotype may be expressed in the next generation.

또한 본 명세서에서, "화이트 클로버의 꽃"이란 꽃의 각 기관인 암술, 수술, 꽃잎과 꽃받침이 분화된 상태에 있는 것을 의미한다. 일반적으로 개화는 꽃눈이 형성된 후에 이 꽃눈으로부터 꽃의 각 기관인 암술, 수술, 꽃잎과 꽃받침이 분화하고 그 분화한 꽃의 각 기관이 성숙하는 과정을 거치면서 이루어진다. 따라서 "화이트 클로버의 꽃"이란 꽃눈이 형성된 후 꽃의 각 기관이 분화된 시점부터 폐화되기까지의 상태에 있는 꽃을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.In addition, in the present specification, "flower of white clover" means that each organ of the flower, pistil, stamen, petal and calyx are in a differentiated state. In general, flowering occurs after the formation of the flower buds, from which the organs of the flower, pistils, stamens, petals and calyxes, differentiate, and each organ of the flower is matured. Therefore, the "flower of white clover" may be understood to mean a flower that is in a state from when the organs of the flower are differentiated to obstructed after the flower buds are formed.

일반적으로 개화는 온도, 빛의 양 등에 영향을 받는 것으로 알려져 있으므로, 온도, 빛의 양 등을 인위적으로 조작하면 개화 시기가 달라질 수 있으며, 또 지역에 따라 기후의 차이가 있기 때문에 지역이 다르면 개화 시기가 다를 수 있다. 예컨대 자연 상태의 클로버 즉 빛, 온도 등에서 인위적인 조작 없는 상태의 화이트 클로버의 경우 대한민국에서는 통상 6~7 월 경에 개화하는 것으로 알려져 있다. 따 라서 대한민국에서 자라는 화이트 클로버를 이용할 경우, 본 발명에서는 6~7월 경 개화 상태의 화이트 클로버를 사용할 수 있다.In general, flowering is known to be influenced by temperature, amount of light, etc. Artificially manipulating temperature, amount of light, etc., may change the timing of flowering, and because of climate differences depending on the region, the time of flowering is different. May be different. For example, in the case of natural clover, that is, white clover without artificial manipulation in light, temperature, etc., it is generally known to bloom in Korea from June to July. Therefore, when using the white clover growing in the Republic of Korea, the present invention can use the white clover of the blooming state in June-July.

한편 하기 비교예에서 확인되듯이, 화이트 클로버의 종자에 돌연변이원을 처리한 경우에는 잎 수에 있어서의 돌연변이가 유도되지 않았다. 그러나 하기 실시예에서 확인되듯이 화이트 클로버의 꽃에 돌연변이원을 처리한 경우는 모두 잎 수 돌연변이가 유도되었다. 그러므로 화이트 클로버의 꽃에 돌연변이원을 처리하는 것은 본 발명의 특징으로 이해될 수 있다. On the other hand, as shown in the comparative example below, when the murine was treated to the seeds of the white clover, the mutation in the leaf number was not induced. However, as shown in the examples below, all of the flowers of the white clover were subjected to mutagenesis mutations. Therefore, treatment of mutagens in the flowers of white clover can be understood as a feature of the present invention.

본 발명자들이 화이트 클로버의 꽃에 돌연변이원을 처리하였던 이유는, 개화 시기는 수분·수정이 이루어지는 시기여서 이 시기에 돌연변이원을 처리할 경우 돌연변이 효율이 높을 수 있다는 점에 착안한 것이다.The reason why the present inventors treated the mutagen on the flowers of the white clover was to focus on the fact that the flowering time is a period of moisture and fertilization, and thus the mutation efficiency may be high when the mutagen is treated at this time.

또한 본 명세서에서, "돌연변이원"은 물리적 돌연변이원와 화학적 돌연변이원을 모두 포함하는 의미이다. 일반적으로 돌연변이 식물체의 제작에는 ⁶⁰Co, X선, γ선, β선(³²P, ³⁵S 등), 중성자 빔과 같은 물리적 돌연변이원(Hasegawa et al. 1995; Ling et al. 1991; Wang et al. 1988; Honda et al. 2006; Naito et al. 2005)과, EMS, EES(ethyl ethane sulfonate), EO(Ethylene oxide), NMC와 같은 화학적 돌연변이원(Nitroso- methylurea)(Abe et al. 1995; Lee et al. 1998; Wu et al. 2005, Hohmann et al. 2005)이 주로 사용되어 왔으며, 특히 EMS와 ⁶⁰Co가 가장 널리 사용되어 왔다. 따라서 본 발명의 돌연변이원으로서는 상기 열거된 물리적· 화화적 돌연변이원이 모두 사용될 수 있지만, 바람직하게는 EMS와 ⁶⁰Co를 사용하는 경우이다. Also herein, "mutant" is meant to include both physical and chemical mutagens. Generally, the production of mutant plants involves physical mutagens such as ⁶⁰ Co, X-rays, γ-rays, β-rays ( ³² P, ³⁵ S, etc.) and neutron beams (Hasegawa et al. 1995; Ling et al. 1991; Wang et al. 1988; Honda et al. 2006; Naito et al. 2005) and chemical mutagens such as EMS, ethyl ethane sulfonate (EES), ethylene oxide (EO), and NMC (Nitroso-methylurea) (Abe et al. 1995; Lee et al. 1998; Wu et al. 2005, Hohmann et al. 2005) have been used mainly, and EMS and ⁶⁰ Co are the most widely used. Therefore, as the mutagen of the present invention, all of the above-described physical and chemical mutagens can be used, but preferably EMS and ⁶⁰ Co are used.

상기 돌연변이원의 처리는 돌연변이원의 종류에 따라 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 이루어질 수 있다. 통상적으로는 물리적 돌연변이원의 처리는 조사(irradiation)에 의해, 화학적 돌연변이원의 처리는 처리 대상 식물체의 기관 등(본 발명에서는 화이트 클로버의 꽃)을 화학적 돌연변이원의 용액에 침지시킴에 의해 이루어질 것이다.Treatment of the mutagen can be carried out according to any method known in the art depending on the type of mutagen. Typically, the treatment of the physical mutagen will be by irradiation, and the treatment of the chemical mutagen will be done by immersing the organ of the plant to be treated (the flower of white clover in the present invention) in a solution of the chemical mutagen. .

한편, 물리적 돌연변이원을 어느 정도의 시간 동안 조사하느냐 또는 화학적 돌연변이원을 어느 정도의 시간 동안 그리고 어떠한 농도에서 처리하느냐는 사용하고자하는 돌연변이원의 종류에 따라서 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 결정될 수 있다. 일반적으로 물리적 돌연변이원의 경우 강도가 높으면 상대적으로 강도가 낮은 물리적 돌연변이원에 비해 조사량을 짧게 하더라도 목적하는 돌연변이를 유발할 수 있을 것이며, 화학적 돌연변이원의 경우 그 용액의 농도가 높으면 상대적으로 농도가 낮은 경우에 비해 침지 시간을 짧게 하더라도 목적하는 돌연변이를 유발할 수 있을 것이다.On the other hand, how much time to irradiate the physical mutagen or how long the chemical mutagen is treated for a certain time and at what concentration may be determined within the range of ordinary skill of those skilled in the art according to the type of mutagen to be used . In general, the higher the intensity of the physical mutagen, the shorter the dose than the relatively low-intensity physical mutagen can cause the desired mutation, and in the case of the chemical mutagen if the concentration of the solution is relatively low concentration Even shorter immersion time can lead to the desired mutation.

그러므로 화이트 클로버의 꽃에 물리적 또는 화학적 돌연변이원을 처리하여 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버를 얻을 수 있는 한, 돌연변이원의 종류, 돌연변이원의 처리 방식 등이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.Therefore, as long as the flowers of the white clover can be treated with a physical or chemical mutagen to obtain a white clover inducing leaf number mutation, the type of mutagen, the manner of treatment of the mutagen, and the like are understood to limit the scope of the present invention. Should not be.

다만, 하기 실시예를 참조할 때 물리적 돌연변이원의 경우 그 돌연변이원의 종류를 불문하고 선량이 15(Gy) 내지 100(Gy) 범위 내에서 처리되는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 선량이 20(Gy) 내지 80(Gy) 범위 내에서 처리되는 경우이다. 특히 물리적 돌연변이원으로서는 ⁶⁰Co을 사용하는 것이 바람직하다.However, when referring to the following examples, in the case of physical mutagen, the dose is preferably treated within the range of 15 (Gy) to 100 (Gy) regardless of the type of the mutagen, and more preferably, the dose is 20 ( Gy) to 80 (Gy). In particular, it is preferable to use ⁶⁰ Co as a physical mutagen.

화학적 돌연변이원의 경우 그 돌연변이원의 종류를 불문하고 0.01% 내지 5%의 농도 범위 내에서 약 10 시간 내지 약 48시간 동안 침지시키는 것이 바람직한데, 특히 본 발명자들의 경험에 따르면 화학적 돌연변이원으로서 EMS를 사용할 때는 하기 실시예에서 보여지는 바와 같이 0.01% 내지 2% 농도 범위 내에서 24 시간 정도 보다 구체적으로 20 시간 내지 28시간 동안 침지시키는 것이 바람직하다. In the case of chemical mutagens, it is preferable to immerse for about 10 hours to about 48 hours in the concentration range of 0.01% to 5%, regardless of the type of the mutagen. When used, it is preferable to immerse for more than 20 hours to 28 hours in a concentration range of 0.01% to 2% more specifically as shown in the following examples.

한편, 전술한 바이지만 본 발명자들은 화이트 클로버의 꽃에 돌연변이원을 처리하고, 그 화이트 클로버로부터 제1세대 종자(M₁)를 채종한 후 그 종자를 재배하여 잎 수에 있어서의 돌연변이율이 가장 높은 제1세대 화이트 클로버를 선발한 다음 그 화이트 클로버로부터 채종한 제2세대 종자(M₂)를 재배하여 제2세대 화이트 클로버로 성장시킨 경우에 생존한 모든 화이트 클로버에서 잎 수 돌연변이를 확인할 수 있었다. On the other hand, as described above, the present inventors treated the mutagen to the flowers of the white clover, seeded the first generation seed (M ₁ ) from the white clover, and then grown the seeds to obtain the highest mutation rate in the number of leaves. Leaf number mutations were identified in all surviving white clover when the first generation white clover was selected and then grown to second generation white clover by cultivating second generation seed (M ₂ ) harvested from the white clover.

따라서 본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법은 상기 단계 (c) 후에, 그 선별된 화이트 클로버로부터 종자를 채종하고 그 종자를 재배하여 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 특히 상기 선별된 화이트 클로버는 잎 수 돌연변이율이 가장 높은 화이트 클로버인 것이 더 바람직하다. 즉 종자의 채종은 잎 수에 있어서의 돌연변이율이 가장 높은 화이트 클로버로부터 이루어지는 것이 바람직하다는 것이다.Therefore, the method for producing a leaf clover-induced white clover of the present invention comprises the steps of, after the step (c), seeding the selected white clover and cultivating the seed to select the white clover-induced leaf clover. It is preferable to further include, it is particularly preferable that the selected white clover is a white clover with the highest leaf number mutation rate. That is, it is preferable that seed seeding is made from the white clover having the highest mutation rate in the number of leaves.

한편, 본 발명자들이 직접적으로 확인하지는 못하였지만, 전술한 바를 참조할 때, 잎 수 있어서의 돌연변이율은 세대를 거듭할수록 높아질 것으로 기대하고 있다. 그러므로 전술한 바의 단계가 반복적으로 수행되는 것이 바람직할 것이다.On the other hand, although the inventors did not directly confirm, referring to the foregoing, it is expected that the mutation rate in the number of leaves will increase with generations. Therefore, it will be desirable to carry out the steps described above repeatedly.

상기에서 잎 수에 있어서의 돌연변이율은 특정 개체에 있어서 3 잎의 전체 숫자에 4 잎 이상의 잎 수를 갖는 잎의 숫자를 대비하여 계산할 수 있다. 3 잎의 전체 숫자에 대해 4 잎 이상의 잎 수를 갖는 잎의 숫자가 많을수록 잎 수에 있어서의 돌연변이율은 높은 것으로 볼 수 있다. In the above, the mutation rate in the number of leaves can be calculated by comparing the number of leaves having 4 or more leaves to the total number of 3 leaves in a specific individual. The larger the number of leaves having 4 or more leaves for the total number of 3 leaves, the higher the mutation rate in the number of leaves.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버 종자의 제조방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method of preparing white clover seeds induced by leaf water mutation.

본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 종자의 제조방법은 (a) 화이트 클로버의 꽃에 돌연변이원을 처리하는 단계 및 (b) 돌연변이원이 처리된 화이트 클로버를 재배하여 종자를 채종하는 단계를 포함하여 구성된다.The method for producing a seed of a white clover inducing leaf number mutation of the present invention comprises the steps of (a) treating a mutagen on a flower of a white clover and (b) cultivating a white clover treated with a mutagen to seed the seed. It is configured to include.

본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버 종자의 제조방법에 있어서도, 본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법과 마찬가지로, 상기 단계 (b)에서 채종한 종자를 재배하여 화이트 클로버로 성장시킨 후 그 화이트 클로버부터 종자를 채종하는 단계를 포함하는 것이 바람직하며, 여기서도 종자는 잎 수에 있어서의 돌연변이율이 가장 높은 화이트 클로버로부터 채종하는 것이 바람직하다. 그리고 동일한 이유에서 이러한 단계가 반복적으로 수행되는 것 이 바람직할 것이다.In the method for producing white clover seed induced with the leaf number mutation of the present invention, as in the method for producing the white clover induced with the leaf number mutation of the present invention, the seed obtained in the step (b) is grown and grown to white clover. It is preferable to include seeding from said white clover after seeding, and here, it is also preferable that seed is harvested from the white clover which has the highest mutation rate in leaf number. And for the same reason it would be desirable to perform these steps repeatedly.

기타 바람직한 양태를 포함하여 본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법과 관련하여 정의하거나 설명한 바는 상기 본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버 종자의 제조방법에 대해서도 그대로 유효하다.Definitions and explanations relating to the method for producing the white clover induced by the leaf number mutation of the present invention, including other preferred embodiments, are also valid for the method for producing the white clover seed induced by the leaf number mutation of the present invention.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎을 제조하는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method for producing a leaf of white clover having 4 or more leaves.

본 발명의 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎의 제조방법은 (a) 화이트 클로버의 꽃에 돌연변이원을 처리하는 단계, (b) 돌연변이원이 처리된 화이트 클로버를 재배하여 종자를 채종하는 단계, (c) 그 종자를 재배하여 성숙한 화이트 클로버로 성장시키는 단계, 및 (d) 그 성장된 화이트 클로버로부터 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎를 채취하는 단계를 포함하여 구성된다.The method for producing a leaf of four or more white clover leaves of the present invention comprises the steps of (a) treating a mutagen to a flower of a white clover, (b) cultivating the seed by cultivating the white clover treated with the mutagen, (c) growing the seeds to grow into mature white clover, and (d) harvesting leaves of four or more white clover leaves with the number of leaves from the grown white clover.

본 발명의 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎을 제조하는 방법에 따르면, 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎을 대량으로 제조할 수 있다. According to the method for producing a leaf of four or more leaves of white clover, the leaf number of the present invention can produce a large number of leaves of four or more leaves of white clover.

하기 실시예에서 확인되듯이, 제1세대 종자(M1)를 파종하여 잎 수 돌연변이를 나타내는 화이트 클로버 중 돌연변이율이 가장 높은 화이트 클로버를 선발하고 그 화이트 클로버로부터 잎 수의 돌연변이율이 가장 높은 포복경을 분리하여 번식시킨 경우에 4 잎이 20% 정도, 5 잎이 약 60% 정도로 야생형 식물체에 비하여 4 잎과 5 잎의 비율이 현저하게 증가하였다. As shown in the following examples, the first generation seed (M1) is seeded to select the white clover with the highest mutation rate among the white clover showing the leaf number mutation and isolate the lap top with the highest mutation rate of the leaf number from the white clover In the case of reproduction, the ratio of 4 leaves to 5 leaves was significantly increased compared to wild-type plants at about 20% for 4 leaves and about 60% for 5 leaves.

따라서 본 발명의 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎의 제조방법은 상기 단계 (c) 후에 성숙한 화이트 클로버 중 잎 수에 있어서 돌연변이율이 가장 높 은 화이트 클로버를 선발한 후에 그 화이트 클로버부터 잎 수의 돌연변이율이 가장 높은 포복경을 분리하여 번식시키는 단계를 포함하는 것이 바람직다. Therefore, the method for producing a leaf of four or more leaves of white clover according to the present invention is that after selecting the white clover having the highest mutation rate in the number of leaves among the mature white clover after the step (c), the mutation rate of the leaf number from the white clover It is desirable to include the step of separating and breeding this highest creep diameter.

한편, 본 발명의 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎을 제조하는 방법에 있어서도, 본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법이나 본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버 종자의 제조방법과 마찬가지로, 상기 단계 (c) 후에 성장한 화이트 클로버로부터 종자를 채종하고 그 채종한 종자를 재배하여 화이트 클로버로 성장시키는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 여기서도 종자는 잎 수에 있어서의 돌연변이율이 가장 높은 화이트 클로버로부터 채종하는 것이 바람직할 것이고, 그리고 동일한 이유에서 이러한 단계가 반복적으로 수행되는 것이 바람직할 것이다.On the other hand, also in the method of manufacturing the leaf of 4 clover or more white clover, the manufacturing method of the white clover in which the leaf number mutation of this invention was induced, or the production of the white clover seed | leaf in which the leaf number mutation of this invention was induced. Like the method, it is preferable to further include the step of seeding from the white clover grown after step (c) and cultivating the seed so grown to white clover. Here too, it will be desirable to seed the seed from the white clover with the highest mutation rate in the number of leaves, and for the same reason it will be desirable to carry out this step repeatedly.

기타 바람직한 양태를 포함하여 본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법과 관련하여 정의하거나 설명한 바는 상기 본 발명의 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎을 제조하는 방법에 대해서도 그대로 유효하다.The definition or description relating to the method for producing the white clover induced by the leaf number mutation of the present invention, including other preferred embodiments, is also valid for the method for producing the leaf of the white clover having four or more leaves. .

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 포복경을 번식시키는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to a method for propagating the creep diameter of a white clover having four or more leaves.

본 발명의 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 포복경을 번식시키는 방법은 (a) 화이트 클로버의 꽃에 돌연변이원을 처리하는 단계, (b) 돌연변이원이 처리된 화이트 클로버를 재배하여 종자를 채종하는 단계, (c) 그 종자를 재배하여 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버를 선별하는 단계, 및 (d) 그 선발된 화이트 클로버로부터 포복경을 분리하여 토양에 이식하여 번식시키는 단계를 포함하여 구 성된다.The method for propagating the creeping diameter of four or more leaves of the white clover of the present invention comprises the steps of: (a) treating the mutagen on the flowers of the white clover, (b) cultivating the white clover treated with the mutagen to seed the seeds. (c) cultivating the seed to select the white clover from which the leaf number mutation was induced, and (d) separating the laparotomy from the selected white clover and transplanting it into the soil to breed.

상기에서, 상기 포복경은 잎 수의 돌연변이율이 가장 높은 포복경이 것이 바람직하고, 또 상기 단계 (c) 후에 성장한 화이트 클로버로부터 종자를 채종하고 그 채종한 종자를 재배하여 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 또 이러한 단계를 추가로 포함할 경우에 종자는 잎 수에 있어서의 돌연변이율이 가장 높은 화이트 클로버로부터 채종하는 것이 바람직할 것이며, 또 이러한 단계가 반복적으로 수행되는 것이 바람직할 것이다. 그 이유는 앞서 설명한 바와 같으며, 상기 잎 수 돌연변이율의 의미도 앞서 설명한 바와 같다.In the above, the lap diameter is preferably the lap diameter with the highest mutation rate of the leaf number, and after the step (c) the seed is grown from the white clover grown, and the seed is grown to select the white clover induced leaf number mutation It is preferable to further include the step of doing this, and in the case of further including this step, it is preferable that the seed is harvested from the white clover having the highest mutation rate in the number of leaves, and this step is performed repeatedly. It would be desirable. The reason is as described above, and the meaning of the leaf number mutation rate is as described above.

또 상기에서 포복경을 토양에 이식할 때 그 토양은 노지의 토양이거나 화분의 토양일 수 있다. In addition, when transplanting the laparoscopic to the soil, the soil may be the soil of the open field or pollen soil.

한편, 기타 바람직한 양태를 포함하여 본 발명의 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법과 관련하여 정의하거나 설명한 바는 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 포복경을 번식시키는 방법에 대해서도 그대로 유효하다.On the other hand, the definition or description related to the method for producing the white clover induced by the leaf number mutation of the present invention, including other preferred embodiments, is also effective as it is for the method of propagating the lap diameter of the white clover having four or more leaves.

본 발명에 따르면 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조방법을 제공할 수 있으며, 또한 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버 종자의 제조방법과 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎을 제조하는 방법을 제공할 수 있다. According to the present invention, it is possible to provide a method for producing a white clover in which leaf number mutations are induced, and also a method for producing white clover seeds in which leaf number mutations are induced and a method for producing leaves of four or more leaves of white clover. can do.

본 발명에 따라 얻어지는 잎 수가 4 잎 이상의 화이트 클로버의 잎은 팬시용 상품 등의 소재로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.It is expected that the leaves of the white clover having 4 or more leaves obtained according to the present invention may be usefully used as materials for fancy goods.

이하 본 발명을 실시예 및 비교예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 비교예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples and Comparative Examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples and comparative examples.

<< 실시예Example > > 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조Preparation of Leaf Clover-Induced White Clover

<< 실시예Example 1> 1> 감마선(Gamma rays ⁶⁰⁶⁰ CoCo ) 조사에 의한 잎 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조) Preparation of White Clover Induced by Leaf Count Mutation by Irradiation

<실시예 1-1> 감마선( ⁶⁰ Co ) 조사 <Example 1-1> Gamma-ray ( ⁶⁰ Co ) irradiation

본 실험에 사용된 것은 화이트 클로버 (Trifolium repens L.)이며, 꽃이 피는 시기인 6-7월경에 꽃대가 20cm 정도 올라온 꽃들을 선별하여 감마선(⁶⁰Co) 처리에 이용하였다. The white clover ( Trifolium) was used in this experiment. repens L.), and flowers of about 20cm in height were selected and used for gamma ray treatment ( ⁶⁰ Co) around June-July.

화이트 클로버의 감마선(⁶⁰Co) 조사는 25(Gy) 및 50(Gy) 선량으로 제주대학교(대한민국 제주도 소재) 방사선 연구소의 조사 시설을 이용하여 25(Gy)의 경우는 1시간 가량, 50(Gy)의 경우는 2시간 가량 조사하였다. 감마선 조사 48시간 후 각 식물체는 제주대학교 온실 내 자연광 조건 하에서 재배되었으며 1-2 개월 후에 각 처리구로부터 종자(M₁)를 채종하였다. 채종된 종자는 4℃의 냉장고에서 저온 처리한 후 잎 수 돌연변이 식물체를 선발하기 위하여 파종하였다. The gamma ray ( ⁶⁰ Co) irradiation of white clover was carried out at 25 (Gy) and 50 (Gy) doses for about 1 hour at 25 (Gy) using the irradiation facility of Cheju National University (Jeju-do, Korea) radiation research facility. ) For 2 hours. After 48 hours of gamma irradiation, each plant was grown under natural light conditions in the greenhouse of Jeju National University, and seeds (M ₁ ) were harvested from each treatment group after 1-2 months. Seeds were sown in a refrigerator at 4 ° C. and then seeded to select leaf mutant plants.

<실시예 1-2> M ₁ 세대 화이트 클로버 의 발아율 및 잎 돌연변이율 조사 Example 1-2 M ₁ Leaves of three white clover germination and mutation rate survey

M₁ 세대의 잎 수 돌연변이 식물체를 선발하기 위하여 방사선 조사 후 얻어진 M₁ 화이트 클로버 종자를, 발아율을 높이기 위하여 센트페이퍼로 상처를 준 후 여과지 위에 파종하여 발아시켰다. 발아 시 배양 조건은 28℃±2의 연속광에서 수행되었다. 감마선 처리를 하지 않은 대조구에서 대해서는 100개의 종자를, 감마선을 처리한 실험구에 대해서는 처리구당 120개의 종자를 파종하였으며 파종 4주 후 발아율을 조사하였다. M ₁ M ₁ white clover seeds obtained after irradiation to select the generation of leaf number mutant plants were cut with a cent paper to increase the germination rate, and then seeded on filter paper. Culture conditions at germination were carried out in a continuous light of 28 ℃ ± 2. In the control group not treated with gamma-ray, 100 seeds were planted and 120 seeds per treatment in the gamma-ray treated group, and the germination rate was investigated 4 weeks after sowing.

대조구의 경우 98개의 종자가 발아해 98%의 발아율을 보였으나, 실험구의 경우 25(Gy) 처리구에서는 84개의 종자가 발아해 70%의 발아율을 보였으며, 50(Gy) 처리구에서는 86개의 종자가 발아해 71.7%의 발아율을 보였다(<표 1> 참조).In the control group, 98 seeds germinated and showed a germination rate of 98%. In the experimental group, 84 seeds germinated in the 25 (Gy) treatment group and 70% germination rate, and in the 50 (Gy) treatment group, 86 seeds were germinated. Germination showed a germination rate of 71.7% (see <Table 1>).

상기의 각 처리구에서 발아된 유식물체는 4주 후에 화분에 이식하고, 28±2℃의 자연광조건 하에서 3-4개월 동안 물을 공급하면서 온실에서 재배한 후(<도 1> 참조), 잎의 수, 잎의 색 및 잎 모양에서 돌연변이가 관찰되는 개체수를 조사하였다. After 4 weeks, the seedlings germinated in each of the treatment plants were transplanted into pots, and grown in a greenhouse while supplying water for 3-4 months under natural light conditions of 28 ± 2 ° C (see FIG. 1). The number of mutations observed in water, leaf color and leaf shape was examined.

대조구를 제외한 2개 처리구에서 총 170개의 종자가 발아하였으나 113 개체만이 식물체로 성장하였으며, 이 중 총 7개체에서 돌연변이가 관찰되었는데, 잎 수 변이체가 4개, 잎의 색 및 잎의 모양 변이체가 총 3개로 관찰되었다(<표 1> 참조).A total of 170 seeds germinated in the two treatment groups except the control, but only 113 individuals grew into plants, and among them, mutations were observed in 7 of them, including 4 leaf number variants, leaf color and leaf shape variants. A total of three observations were made (see Table 1).

대조구의 경우는 어떠한 잎 돌연변이가 관찰되지 않았다(<표 1> 및 <도 2>참 조).No leaf mutations were observed for the control (see Table 1 and Figure 2).

감마선 조사에 따른 발아율과 잎 돌연변이율Germination Rate and Leaf Mutation Rate According to Gamma Irradiation 선량(Gy)Dose (Gy) 파종 종자수Sowing seeds 발아 종자수(발아율)Germination seed number (germination rate) 생존 개체수Survival population 잎 돌연변이 개체수(변이율)Leaf Mutation Population (variation rate) 0 (대조구)0 (control) 100100 98(98)98 (98) -- 00 2525 120120 84(70)84 (70) 5151 6(11.7)6 (11.7) 5050 120120 86(71.7)86 (71.7) 6262 1(1.6)1 (1.6)

<실시예 1-3> M ₁ 세대 화이트 클로버의 잎 수 돌연변이 식물체의 선발 및 M1 세대 화이트 클로버의 잎 수 돌연변이율의 조사 <Example 1-3> M ₁ Three white clover leaf can be selected in mutant plants and three M1 numbers of white clover leaf investigation of mutation rate

감마선 조사 후 파종하여 얻어진 M₁ 세대 화이트 클로버 중 잎 돌연변이를 나타내는 7개체 중에서, 잎 수에 있어서 돌연변이를 나타내는 4개체만을 선발한 후, 온실에 이식하여 3잎이 나오는 분지를 제거하면서 28℃±2의 자연광 조건하에서 물을 공급하면서 온실에서 6개월 동안 번식시켰다. 여기서 3잎이 나오는 분지를 제거하면서 번식시킨 이유는 4잎 또는 5잎의 고정을 위해서이다. 1차 선발된 잎 수 돌연변이 식물체 중에서 돌연변이율이 가장 높은 1개체만을 선발하고 1년 정도 28℃±2의 자연광 조건 하에서 증식시킨 후(<도 3> 참조), 그 개체의 포복경 중 각 잎 수(즉 4잎과 5잎)에 대한 변이율이 가장 높은 포복경을 각각 4개씩 분리하고, 그 분리한 포복경을 제주대학교 온실에 이식한 후 28℃±2의 자연광 조건하에서 1년간 번식시켜(<도 4> 참조), 8개의 포복경 전체의 잎 수를 합산하여 각 잎 수에 대한 변이율을 조사하였다. 각 잎 수에 대한 변이율은 지상부로부터 2cm이상 자란 클로버 중 잎이 활짝 전개된 잎만을 조사하였다.Of the M ₁ generation white clover obtained by sowing after gamma irradiation, only 4 individuals showing mutations in the leaf number were selected from the 7 individuals showing leaf mutations, and then transplanted into a greenhouse to remove the branch of 3 leaves at 28 ° C ± 2 Breeding for 6 months in a greenhouse, supplying water under natural light conditions. The reason for breeding while removing the three-leaf branch here is to fix four or five leaves. Among the first selected leaf number mutant plants, only the one with the highest mutation rate was selected and propagated under natural light conditions of 28 ° C. ± 2 for about a year (see FIG. 3). Each of the four lap diameters having the highest variability for four leaves and five leaves) was separated, and the isolated lap diameters were transplanted to the Jeju National Greenhouse and reproduced for one year under natural light conditions of 28 ° C ± 2 (Fig. 4). The number of leaves of all eight creep diameters was summed to investigate the variation rate for each leaf number. The variation rate for each leaf number was examined only among leaves with wide spread of clover grown more than 2cm from the ground.

결과를 하기 <표 2>에 나타내었다.The results are shown in Table 2 below.

M₂ 세대 잎 돌연변이 식물체의 선발 및 변이율 조사M ₂ Selection and Variation Rate of Generation Leaf Mutant Plants 구분division 전체 잎의 수Number of whole leaves 3잎의 수(%)Number of 3 leaves (%) 4잎의 수(%)Number of 4 leaves (%) 5잎의 수(%)Number of 5 leaves (%) 대조구Control 762762 761(99.9)761 (99.9) 1(0.1)1 (0.1) 0(0)0 (0) M₁ M ₁ 33253325 670(20.3)670 (20.3) 660(19.9)660 (19.9) 1980(59.9)1980 (59.9)

상기 <표 2>에서 대조구는 3 잎의 포복경을 1년 동안 온실에서 28℃±2의 자연광 조건으로 번식시킨 것이다(<도 5> 참조). In <Table 2>, the control was a three-leaf creep diameter that was propagated in a greenhouse under natural light conditions of 28 ° C ± 2 for 1 year (see FIG. 5).

상기 <표 2>에서 확인되듯이, 대조구의 경우 3 잎이 99.9%, 4 잎이 0.1%, 5 잎이 0%였으나, M₁ 세대의 경우 3 잎이 20.3%, 4 잎이 19.9%, 5 잎이 59.9%로 대조구에 비해 4 잎과 5 잎의 비율이 현저하여 증가하였음을 알 수 있다. The <Table 2> As will be confirmed in the case of the control group is 99.9% 3 leaf, 0.1% 4 leaf yeoteuna 5 leaf is 0%, and 20.3% 3 leaves for M ₁ generation, a 19.9% 4 leaf 5 The leaves were 59.9%, indicating that the ratio of 4 and 5 leaves increased significantly compared to the control.

<실시예 1-4> M ₂ 세대 클로버의 발아율 및 잎의 수 돌연변이율 조사 Example 1-4 M ₂ Investigation of germination rate and leaf number mutation rate of generation clover

상기 <실시예 1-3>에서 재배 증식된 M₁ 세대 식물체로부터 종자(M₂)를 채종하여 건조시킨 후 4℃ 냉장고에서 저온 처리하고 여과지 위에 파종하여 발아시켰다. 발아 시 배양 조건은 28℃±2의 연속광에서 수행되었다. 발아된 유식물체를 4주 후에 화분에 이식하고, 자연광 조건 하에서 1개월 동안 온실에서 재배한 후 일반 토양에 이식하여 28℃±2의 자연광 조건하에서 1년 동안 번식시켰다(<도 6> 참조).M ₁ grown and grown in the <Example 1-3> Seeds (M ₂ ) from the generation plants were dried, dried at low temperature in a 4 ° C. refrigerator and sown on filter paper to germinate. Culture conditions at germination were carried out in a continuous light of 28 ℃ ± 2. Germinated seedlings were transplanted into pots after 4 weeks, cultivated in a greenhouse for 1 month under natural light conditions, and then transplanted into general soil and propagated for 1 year under natural light conditions of 28 ° C. ± 2 (see FIG. 6).

M₂ 종자의 발아율과 잎의 수 돌연변이율Germination Rate of M ₂ Seeds and Leaf Mutation Rate k파종 종자수k sowing seeds 발아 종자수(발아율)Germination seed number (germination rate) 생존 개체수Survival population 잎의 수 돌연변이 개체수(변이율)Number of leaves Mutant population (variation rate) 230230 150150 130130 130(100%)130 (100%)

상기 <표 3>에서 확인되듯이 잎의 수 돌연변이를 보이는 130 개체는 대부분이 4 잎, 5 잎 돌연변이 개체였으나 간혹 6 잎, 7 잎을 가지는 개체도 관찰되었으며(<도 7> 참조), 그 밖에 잎 수는 4 개이만 한 개의 잎이 부분적으로 나누어진 잎(<도 8>참조), 3개의 큰 잎과 2개의 작은 잎으로 이루어진 잎(<도 9> 참조), 2개의 잎이 겹쳐서 4 잎으로 보이는 5 잎(<도 10> 참조), 컵 모양의 잎을 가진 5 잎(<도 11> 참조) 등을 가지는 개체도 관찰되었다.As shown in Table 3, 130 individuals showing leaf number mutations were mostly 4 leaf and 5 leaf mutant individuals, but sometimes 6 leaf and 7 leaf individuals were also observed (see FIG. 7). The number of leaves is 4, but one leaf is partially divided (see Fig. 8), three large leaves and two small leaves (see Fig. 9), and two leaves overlap four leaves. Individuals with 5 leaves (see Fig. 10), 5 leaves with cup-shaped leaves (see Fig. 11), and the like were also observed.

한편 상기 130개의 개체 중에서 3 잎이 많이 나오는 1개체(M₂-3), 4 잎이 많이 나오는 1개체(M₂-4) 및 5 잎이 많이 나오는 1개체(M₂-5)를 선발하여 잎의 변이 수를 조사하여 그 결과를 하기 <표 4>에 나타내었다.On the other hand, among the 130 individuals, one individual (M ₂ -3) with a large number of leaves, three (4) with a large number of leaves (M ₂ -4) and one with a large number of five leaves (M ₂ -5) were selected. The variation number of leaves was examined and the results are shown in Table 4 below.

M₂ 세대 식물체의 잎의 변이 수Variation Numbers of Leaves of M Generation ₂ Plants 구분division 전체 잎 수Whole leaf can 3잎의 수(%)Number of 3 leaves (%) 4잎의 수(%)Number of 4 leaves (%) 5잎의 수(%)Number of 5 leaves (%) M2-3M2-3 382382 172(45)172 (45) 155(40.6)155 (40.6) 55(14.4)55 (14.4) M2-4M2-4 466466 151(32.4)151 (32.4) 184(39.5)184 (39.5) 131(28.1)131 (28.1) M2-5M2-5 466466 81(17.4)81 (17.4) 101(22.7)101 (22.7) 284(60.9)284 (60.9)

<< 실시예Example 2> 2> EMSEMS 처리에 의한 잎의 수 돌연변이가 유도된 화이트 클로버의 제조 Preparation of White Clover Induced Leaf Mutation by Treatment

EMS 처리는 상기 <실시예 1>과 마찬가지로 화이트 클로버의 꽃에 처리하였다. EMS는 0.01%, 0.2% 및 2%의 농도로 처리되었으며, 처리 방법은 24시간 동안 EMS 용액에 침지시키는 방법을 사용하였고, EMS 처리 기간 동안은 암 배양하였다. EMS 처리 후 제주대학교 온실 내 자연광 조건 하에서 재배되었으며, 1~2 개월 후 종자를 채종한 후에, 상기 <실시예 1-2>의 동일한 방법을 사용하여 발아시키고 성숙한 식물체로 성장시켰다. 처리구당 종자수는 200개로 하였다.EMS treatment was performed on flowers of white clover as in <Example 1>. EMS was treated at concentrations of 0.01%, 0.2% and 2%, the treatment method was a method of immersing in EMS solution for 24 hours, cancer culture during the EMS treatment period. After EMS treatment, the plants were grown under natural light conditions in the greenhouse at Jeju National University, and after seeding after 1 to 2 months, germinated and grown to mature plants using the same method as in Example 1-2. The seed count per treatment was 200.

EMS 처리에 따른 발아율과 잎 돌연변이율Germination Rate and Leaf Mutation Rate According to EMS Treatment 농도(%)density(%) 파종 종자수Sowing seeds 발아 종자수(발아율)Germination seed number (germination rate) 생존 개체수Survival population 잎 돌연변이 개체수(변이율)Leaf Mutation Population (variation rate) 0.010.01 200200 156156 125125 1(1)1 (1) 0.20.2 200200 143143 116116 4(3)4 (3) 22 200200 146146 122122 3(2)3 (2)

상기 잎 돌연변이를 보이는 총 8개체 중 잎 수 돌연변이를 보이는 4개체를 선발하여 온실에 이식한 후 3 잎이 나오는 분지를 제거하면서 28℃±2의 자연광 조건하에서 물을 공급하면서 온실에서 6개월 동안 번식시켰다. 여기서 3잎이 나오는 분지를 제거하면서 번식시킨 이유는 앞서 설명한 바와 같이 4잎 또는 5잎의 고정을 위해서이다. 1차 선발된 잎 수 돌연변이 식물체 중에서 돌연변이율이 가장 높은 1개체만을 선발하고 1년 정도 28℃±2의 자연광 조건 하에서 증식시켰다. 그 결과 상기 <실시예 1>과 비슷하게 4 잎, 5 잎이 많은 포복경이 다수 관찰되었다(<도 12> 참조).Of the total eight individuals showing the leaf mutations, four of them showing the leaf number mutation were selected and transplanted to the greenhouse, and then, after removing the branches with three leaves, breeding for 6 months in the greenhouse while supplying water under natural light conditions of 28 ° C ± 2. I was. The reason for breeding while removing the branch coming out of the three leaves is to fix the four leaves or five leaves as described above. Of the first selected leaf mutant plants, only one with the highest mutation rate was selected and grown under natural light conditions of 28 ° C. ± 2 for about a year. As a result, similar to the <Example 1>, a large number of lap diameters of 4 leaves and 5 leaves were observed (see FIG. 12).

<< 비교예Comparative example > > 화이트 클로버 종자에 감마선 또는 Gamma rays on white clover seeds or EMSEMS 처리에 의한 잎 돌연변이 여부 조사 Investigate Leaf Mutation by Treatment

<비교예 1> 종자에 감마선( ⁶⁰ Co )의 처리 Comparative Example 1 Treatment of Gamma Rays ( ⁶⁰ Co ) on Seeds

화이트 클로버 종자에 감마선(⁶⁰Co) 25(Gy), 50(Gy) 및 100(Gy)로 조사하고 상기 <실시예 1-2>와 동일하게 종자를 파종·발아 재배하였으나, 잎 수 돌연변이 화이트 클로버는 얻어지지 않았다(<도 13> 참조).The white clover seeds were irradiated with gamma rays ( ⁶⁰ Co) 25 (Gy), 50 (Gy), and 100 (Gy) and seeded and germinated and grown in the same manner as in <Example 1-2>. Was not obtained (see Fig. 13).

<비교예 2> 종자에 EMS 처리 Comparative Example 2 EMS Treatment of Seeds

상기 <실시예 2>와 동일한 방식으로 EMS를 처리하고 종자를 파종·발아 재배하였으나, 잎 수 돌연변이 화이트 클로버는 얻어지지 않았다(<도 14> 참조).EMS was treated in the same manner as in <Example 2>, and the seeds were sown and germinated and grown, but no leaf mutant white clover was obtained (see FIG. 14).

도 1은 화이트 클로버 M₁ 종자를 파종하여 발아한 유식물체를 화분에 이식하고 3-4개월 동안 온실에서 재배한 후의 사진이다.1 is a photograph of a seedling plant germinated by seeding the white clover M ₁ seed in a pot and grown in a greenhouse for 3-4 months.

도 2는 돌연변이원(감마선 ⁶⁰Co)이 처리되지 아니한 화이트 클로버의 종자를 파종하여 재배한 사진이다. Figure 2 is a photo cultivated by seeding the seeds of the white clover not treated with mutagen (gamma ray ⁶⁰ Co).

도 3은 M₁ 세대 화이트 클로버 중 돌연변이율이 가장 높은 1개체만을 선발하여 증식시킨 사진이다.3 is a photograph of only one individual having the highest mutation rate among M ₁ generation white clover.

도 4는 M₁ 세대 화이트 클로버 중 돌연변이율이 가장 높은 개체에서 각 잎 수(즉 4 잎과 5 잎)에 대한 변이율이 가장 높은 포복경을 분리하여 번식시킨 화이트 클로버의 사진이다. A는 4 잎이 많은 포복경을 번식시킨 사진이고 B는 5 잎이 많은 포복경을 번식시킨 사진이다. 검은 색의 별 표시는 4 잎이고 하얀 색의 별 표시는 5 잎을 가리킨다.FIG. 4 is a photograph of a white clover separated and multiplyed with the highest variability for each leaf number (ie, 4 and 5 leaves) in the highest mutation rate among M ₁ generation white clover. A is a photo of a four-leaved creeper breed, and B is a five-leaved creepy breed. The black star symbol indicates 4 leaves and the white star symbol indicates 5 leaves.

도 5는 3 잎의 포복경을 분리하여 번식시킨 사진이다.Figure 5 is a photograph of three foliar diameter separated.

도 6은 M₁ 세대 화이트 클로버로부터 채종한 M₂ 종자를 재배하여 번식시킨 사진이다. 6 is M ₁ M ₂ harvested from generation white clover Seeds grown and seeded.

도 7은 M₂ 종자를 재배하여 번식시킨 화이트 클로버에서 발견된 7 잎의 사진이다.7 is M ₂ Picture of seven leaves found in white clover grown from seed.

도 8은 M₂ 종자를 재배하여 번식시킨 화이트 클로버에서 발견된 잎 수는 4 개이만 한 개의 잎이 부분적으로 나누어진 잎의 사진이다.8 is M ₂ The number of leaves found in white clover grown from seed is only a picture of a leaf divided into four leaves.

도 9는 M₂ 종자를 재배하여 번식시킨 화이트 클로버에서 발견된 3개의 큰 잎과 2개의 작은 잎으로 이루어진 잎의 사진이다.9 is M ₂ Picture of three large leaves and two small leaves found in white clover grown from seed.

도 10은 M₂ 종자를 재배하여 번식시킨 화이트 클로버에서 발견된 2개의 잎이 겹쳐서 4 잎으로 보이는 5 잎의 사진이다.10 is M ₂ This is a photograph of five leaves that appear to be four leaves with two leaves found in white clover grown from seed.

도 11은 M₂ 종자를 재배하여 번식시킨 화이트 클로버에서 발견된 컵 모양의 잎을 가진 5 잎의 사진이다. 11 is M ₂ Photograph of five leaves with cup-shaped leaves found in white clover grown from seed.

도 12는 돌연변이원인 EMS를 처리하여 얻은 종자를 재배하여 얻은 화이트 클로버의 사진이다.12 is a photograph of a white clover obtained by cultivating seeds obtained by treating the mutant EMS.

도 13은 화이트 클로버의 종자에 돌연변이원인 감마선(⁶⁰Co)을 처리하여 얻은 종자를 재배하여 얻은 화이트 클로버의 사진이다.FIG. 13 is a photograph of a white clover obtained by cultivating a seed obtained by treating a gamma ray ( ⁶⁰ Co), which is a mutagen, on the seed of the white clover.

도 14는 화이트 클로버의 종자에 돌연변이원인 EMS을 처리하여 얻은 종자를 재배하여 얻은 화이트 클로버의 사진이다.14 is a photograph of a white clover obtained by cultivating a seed obtained by treating EMS as a mutagen to the seeds of the white clover.

Claims

(a) treating the flowers of the white clover ( Trifolium repense L.) with a gamma ray of 25 to 50 doses (Gy) or a mutagen of EMS at a concentration of 0.01 to 2.0%,

(b) growing the white clover treated with the mutagen to seed the seeds, and

(c) A method of producing white clover having four or more leaves, comprising cultivating the seed to screen the white clover with four or more leaves.

(a) treating the flowers of a white clover ( Trifolium repense L.) with a gamma ray of 25 to 50 doses (Gy) or a EMS of a mutagen at a concentration of 0.01 to 2.0%, and

(b) cultivating the white clover treated with the mutagen and seeding the seeds, wherein the number of leaves comprises four or more white clover seeds.

(b) culturing the white clover treated with the mutagen to seed the seeds,

(c) cultivating the seed to grow white clover, and

(d) extracting leaves of at least four leaves of white clover from the grown white clover;

(b) culturing the white clover treated with the mutagen to seed the seeds,

(c) cultivating the seed to select white clover with 4 or more leaves, and

(d) separating the laparoscopic diameter from the selected white clover and transplanting and propagating the soil in the soil to breed the lap diameter of the white clover having four or more leaves.

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5. The method according to any one of claims 1 to 4,

Gamma rays which are the mutagen are ⁶⁰ Co.

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