KR101245819B1

KR101245819B1 - 글리세롤로부터 부탄올 또는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올 또는 1,3-프로판디올의 제조방법

Info

Publication number: KR101245819B1
Application number: KR1020110023565A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 알록; 장유신
Original assignee: 바이오퓨얼켐 주식회사; 한국과학기술원
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2013-03-27
Also published as: KR20120105869A

Abstract

본 발명은 글리세롤(glycerol)을 탄소원으로 하여 부탄올을 포함하는 대사산물 생성능이 증가된 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올을 포함하는 대사산물의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올을 포함하는 대사산물의 제조방법을 이용하면 아세톤 등의 부산물의 생산 없이 글리세롤로부터 고농도/고수율의 부탄올 또는 1,3-프로판디올을 생산시키는 효과가 있다.

Description

글리세롤로부터 부탄올 또는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올 또는 1,3-프로판디올의 제조방법 {Microorganism Variant Having for Producing Ability of Butanol or 1,3-Propanediol from Glycerol and Method for Producing Butanol or 1,3-Propanediol Using the Same}

본 발명은 글리세롤(glycerol)을 탄소원으로하여 부탄올을 포함하는 대사산물 생성능이 증가된 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올을 포함하는 대사산물의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 부탄올 또는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에 돌연변이원을 도입하여 부탄올 또는 1,3-프로판디올 생성능이 증가된 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올 또는 1,3-프로판디올의 제조방법에 관한 것이다.

부탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤 등은 현재 산업 용매로써 거대한 시장을 형성하고 있다. 또한, 바이오 에탄올은 미국 및 브라질에서는 이미 자동차 등의 수송 연료로 사용되고 있으며, 부탄올 및 이소프로판올 또한 앞으로 자동차 등의 수송연료로 사용 가능성이 현실화되고 있어 계속적인 수요 증가가 예상되고 있다.

부탄올(C₄H₉OH)의 전세계 생산량은 약 백십만 톤/년으로 추정된다. 현재 시판되는 부탄올은 모두 화학적 합성으로 생산된 것이다. 부탄올의 화학합성법은 원료를 석유로 하고 있으며 이로부터 얻어진 프로필렌으로부터 합성되는 옥소법(oxo process)이 사용된다. 에탄올(C₂H₅OH)은 예로부터 녹말이나 당류를 발효시키는 방법으로 제조되었으며, 오늘날 주류(酒類)의 대부분은 이 방법으로 제조하고 있다. 공업용 에탄올은 석유로부터 얻은 에틸렌(에텐)을 황산에 흡수시켜 에탄올의 황산에스테르를 만든 후, 이것을 다시 가수분해하여 디에틸에테르와 함께 얻는 방법(황산가수법)과 기상(氣相)에서 에틸렌을 고체인산촉매에 접촉시켜 수증기와 반응시킴으로써 직접 에탄올을 합성하는 방법(직접수화법)으로 제조하고 있다. 이소프로판올 역시 대부분 석유로부터 얻은 프로필렌(propylene)으로부터 직접 수화 또는 황산을 이용한 산화반응을 통해 생산된다. 아세톤(CH₃COCH₃)은 무색, 유동성의 액체로 분자량은 58.08이며, 휘발성과 가연성을 가지는 용매로서, 화학적 방법에 의한 아세톤 생산은 원료물질로 큐멘(cumene)을 사용하여 벤젠과 프로필렌의 알킬화 반응에 의해서 제조된다. 2004년 기준으로 세계 아세톤 수급은 생산 4,937천톤에 수요 4,825천톤이다.

상술한 바와 같이 지금까지 생산되는 부탄올, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤의 경우 화학합성법에 의해 대부분 생산되고 있으며, 유가 상승과 환경 문제 야기 등으로 세계 각국에서는 이들 바이오 알코올 연구에 대한 관심이 급속하게 증가되고 있는 상황이다.

한편, 글리세롤은 바이오디젤의 생산과정에서 생산제품의 10%에 상당하는 많은 양의 부산물로서 생산된다. 이 부산물인 글리세롤의 활용이 큰 문제로 대두되고 있다. 글리세롤과 같이 폐기물로 처리될 수 있는 부산물을 적절히 활용할 경우, 환경문제를 해결할 뿐만 아니라, 오히려 유용한 자원으로 활용될 수 있다. 바이오디젤 부산물로부터 회수되는 글리세롤은 화학산업뿐만 아니라 바이오화학산업 분야에서 주요 구성요소(building block) 화합물의 생산을 위한 전구체나 탄소원으로 이용이 가능하다. 하지만, 지금까지 글리세롤을 효율적으로 잘 이용할 수 있는 미생물은 많지 않았다. 다만, 클로스트리듐 속(genus Clostridia), 락토바실러스 속(genus Lactovacilli), 사이트로박터 속(genus Citrobacter), 엔테로박터 속(genus Enterobacter), 크렙시엘라 속(genus Klebsiella) 등과 같은 미생물을 이용하여 글리세롤 발효를 통해 1,3-propanediol을 생산하는 것이 알려져 있다. 하지만, 글리세롤을 이용한 다양한 화합물의 생물학적 생산에 대한 연구는 거의 없다. 또 다른 한편으로, 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 균주는 산업적으로 유용한 부탄올을 생물학적으로 생산할 수 있는 주요한 균주이긴 하지만, 글리세롤을 이용할 수 없는 단점이 있었다. 따라서 당업계에서는 글리세롤을 주요 탄소원으로 이용하여 산업적으로 유용한 부탄올을 고효율로 생산하는 미생물의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 글리세롤을 탄소원으로 이용하여 산업적으로 유용한 부탄올, 1,3-프로판디올 등을 고효율로 생산하는 미생물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 부탄올 또는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에 돌연변이원을 처리하여 글리세롤로부터 부탄올 또는1,3-프로판디올 고생성능을 가지는 변이 미생물을 제조하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 글리세롤을 탄소원으로하여 다른 부산물의 생산 없이 부탄올을 포함하는 대사산물을 고효율로 생산하는 변이 미생물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 이용한 부탄올을 포함하는 대사산물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 글리세롤로부터 부탄올 또는1,3-프로판디올 고생성능을 가지는 변이 미생물 Clostridium pasteurianum MBEL-GLY2 (기탁번호 KCTC 11887BP)을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 미생물에 돌연변이원을 도입하여 글리세롤을 단일 탄소원으로하여 고농도의 부탄올 또는 1,3-프로판디올 생산이 가능한 변이 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 변이 미생물은 아세톤, 유기산 등의 부산물의 생산이 거의 없을 뿐만 아니라, 부탄올을 포함하는 대사산물의 산업적 생산에 유용하다.

도 1은 본 발명에 따른 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 변이 균주의 글리세롤을 이용한 부탄올, 에탄올, 아세톤, 아세트산, 부티르산의 생산 대사경로를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 글리세롤로부터 부탄올 또는 1,3-프로판디올 고생성능을 가지는 변이 미생물 Clostridium pasteurianum MBEL-GLY2 (기탁번호 KCTC 11887BP)에 관한 것이다.

본 발명에 따른 변이 미생물은,

(a) 미생물에 프로플라빈(proflavine), 아크리딘 오렌지(acridine orage), N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine:NTG 또는 MNNG), 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(4-nitroquinoline 1-oxide:4-NQO), 아질산(HNO₂), 하드록실아민(NH₂OH), 디메틸설파이드(dimethylsulfate:DMS), 디에틸설파이드(diethylsulfate:DES), 에틸에탄설포네이트 (ethyl ethanesulfonate:EES), 메틸메탄설포네이트(methyl methanesulfonate:MMS) 및 에틸메탄설포네이트(ethyl methanesulfonate:EMS)로 구성된 군에서 선택되는 돌연변이원을 처리하여 변이시키는 단계; 및

(b) 상기 변이되어 있는 미생물을 수득하는 단계를 거쳐 제조된다.

본 발명에서는 클로스트리듐 파스트리아눔(Clostridium pasteurianum) 균주에 돌연변이원을 처리하여 변이가 발생되어 있는 미생물을 제조하고, 제조된 변이 미생물이 글리세롤을 단일 탄소원으로하여 부탄올을 포함하는 대사산물을 고효율로 생산할 수 있는지를 확인하였다.

본 발명에 따른 변이 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하여 부탄올을 포함하는 대사산물이 고효율로 생성되는 것은, 부탄올 또는 1,3-프로판디올 생성능을 가지는 미생물에 돌연변이원을 처리하여, 돌연변이가 발생함으로써 효소 활성에 변화를 일으키거나 효소가 관여하는 생합성 경로의 일부 또는 상당부분에 변화가 유발되어 글리세롤이 고효율의 부탄올 등의 대사산물로 전환되는 것으로 추정할 수 있다(도 1).

본 발명의 일 실시예에서는, 돌연변이원으로 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine; NTG 또는 MNNG)을 이용하여 미생물에 돌연변이를 유발하였고, 돌연변이원을 처리함으로써 돌연변이가 발생하여 글리세롤을 단일 탄소원으로하여 부탄올을 고효율로 생산할 수 있는 변이 미생물을 개발하였다.

본 발명에서, 상기 돌연변이원은 미생물을 변이시킬 수 있는 것이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 프로플라빈(proflavine), 아크리딘 오렌지(acridine orage), N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine; NTG 또는 MNNG), 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드(4-nitroquinoline 1-oxide; 4-NQO), 아질산(HNO₂), 하드록실아민(NH₂OH), 디메틸설파이드(dimethylsulfate; DMS), 디에틸설파이드(diethylsulfate; DES), 에틸에탄설포네이트 (ethyl ethanesulfonate; EES), 메틸메탄설포네이트(methyl methanesulfonate; MMS) 및 에틸메탄설포네이트(ethyl methanesulfonate; EMS)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 변이 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 변이 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따라 제조된 변이 미생물을 글리세롤을 탄소원으로 하는 배지에서 배양하여 부탄올 및 1,3-프로판디올이 고효율로 생산되는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 변이 미생물의 배양 및 순수 화합물 및 혼합 화합물 회수 과정은 종래 발효 공업에서 통상적으로 알려진 배양방법 및 화합물의 분리 정제 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 아울러, 상기 화합물 중 유기용제의 회수는 배양이 완료된 이후에 수행하는 것이 일반적이나, 생산성을 높이기 위하여 가스-스트립핑(gas-stripping)방법 (Thaddeus et al ., Bioprocess Biosyst . Eng ., 27:207, 2005) 등을 이용하여 배양 도중에 회수할 수도 있다. 즉, 배양중에 생성된 부탄올 및 에탄올 또는/및 이소프로판올 및 아세톤을 회수하면서 계속 배양하는 것도 본 발명의 범위에 속한다.

이러한 본 발명에 따른 제조 방법을 통해 부탄올 또는 1,3-프로판디올을 생산할 경우, 부산물인 아세톤은 대사산물 생성량의 1중량% 이하로 생성되는 효과가 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 본 발명에 따른 미생물로 특정 클로스트리듐 파스트리아눔 균주만을 예시하였으나, 다른 클로스트리듐 균주들을 사용하더라도 글리세롤을 단일 탄소원으로하여 성장할 수 있는 한 이에 국한되지 않는 것 역시 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

돌연변이 유도

클로스트리듐 파스트리아눔(ATCC 6103) 균주를 2X YTG 배지 (Bacto Tryptone 16 g, Yeast extract 10 g, NaCl 4 g, Glucose 5 g, 1 리터 당) 10 ml에 3개씩 접종하여 OD 1.0이 될 때까지 혐기챔버에서 37℃로 배양하였다. 배양 종료 후, 미생물들을 원심분리 방법으로 회수하고, 다시 3 ml의 2X YTG 배지에 현탁시켜 1 ml씩 3개의 1.5 ml 튜브에 분주하였다. 100 mg/ml의 농도로 제조한 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine; NTG 또는 MNNG) 스톡을 이용하여 최종농도 200, 500, 1000 ug/ml로 5분 동안 돌연변이원을 처리하였다. 돌연변이 처리된 미생물들은 원심분리로 재회수하고, 2X YTG-Glycerol 배지 (Bacto Tryptone 16 g, Yeast extract 10 g, NaCl 4 g, Glycerol 5 g, 1 리터 당)를 이용하여 3번 세척하였다.

돌연변이 스크리닝

실시예 1에서 돌연변이원을 처리한 미생물을 다시 각각 1 ml의 2X YTG-Glycerol 배지에 현탁시키고, 10⁷배까지 희석하여 2X YTG-Glycerol 고체 배지에 도말하여, 37℃ 혐기조건에서 5일 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 형성된 콜로니들을 CGM-Glycerol 배지(표 1)에 접종하여 48시간 동안 37℃ 혐기조건에서 배양하였다. 배양 종료 후, 상등액을 회수하여 생산된 아세트산, 부티르산, 아세톤, 에탄올 및 부탄올 농도를 packed column(Supelco Carbopack^TM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 가스 크로마토그래피(gas chromatography: Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

CGM-Glycerol배지의 성분

성분	함량 (g/l)
Glycerol	60
K₂HPO₄ 3H₂O	0.982
KH₂PO₄	0.75
MgSO₄	0.348
MnSO₄ H₂O	0.01
FeSO₄ 7H₂O	0.01
(NH₄)₂SO₄	2
NaCl	1
Asparagine	2
p-Aminobenzoic acid	0.004
Yeast extract	5

변이 균주의 부탄올 및 에탄올 생산량 (g/l)

순번 (#)	부탄올	에탄올	아세톤
1	10.2	0.8	0
2	10.9	0.8	0
3	10.0	0.8	0
4	8.3	0.7	0
5	10.0	1.1	0
6	9.5	1.3	0
7	9.4	1.0	0
대조군	5.7	0.8	0

측정 결과, 대조군 균주에서는 약 5.7 g/l의 부탄올이 생성되는 반면, 변이 균주는 아세톤 생산 없이 최대 10.9 g/L의 부탄올을 생산할 수 있었고(표 2), 대조군의 부탄올 생산량과 비교할 때 본 발명에 따른 변이 균주는 고효율(고생성능)의 부탄올 생산능을 나타냄을 확인하였다. 위와 같은 방법으로 얻어진 변이 균주들 중에서 가장 많은 양의 부탄올을 생산한 2번 균주(Clostridium pasteurianum MBEL-GLY2)를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2011년 3월 3일자로 KCTC 11887BP의 수탁번호로 기탁하였다.

변이 미생물의 부탄올 생산성 분석

상기 실시예 2에서 제작한 변이 미생물들 중, Clostridium pasteurianum MBEL-GLY2 (기탁번호 KCTC 11887BP)에 대한 부탄올 생성능을 확인하기 위하여 2단 전배양 후 본배양을 한 다음 부탄올의 생산량을 측정하였다.

변이 균주 Clostridium pasteurianum MBEL-GLY2 (기탁번호 KCTC 11887BP)를 CGM 배지 10 ㎖을 함유한 30 ㎖ 시험관을 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼내어 질소가스를 채운 후 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후, 상기 변이 미생물을 접종하여 37℃에서 흡광도(600 nm)가 1.0이 될 때까지 혐기조건에서 전배양을 수행하였다. 상기 동일성분으로 구성된 CGM배지를 200 ㎖을 함유한 500 ㎖ 플라스크를 멸균 후 동일한 처리를 한 후, 상기 전배양액 10 ㎖을 접종하여, 흡광도(600 nm)가 1.0이 될 때까지 37℃, 혐기조건에서 2차 전배양 하였다. 그 후 상기 성분으로 구성된 배지 1.8 l를 함유한 5.0 l 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Kyunggi-Do, Korea)를 멸균 후 80℃ 이상에서부터 질소를 0.5 vvm으로 10시간 공급하면서 실온까지 온도를 낮춘 후, 상기 2차 전배양액 200 ㎖을 접종하여, 32℃, 200 rpm에서 60시간 배양하였다. pH 보정은 암모니아수를 이용하였으며 automatic feeding에 의해 5.0 이상으로 유지하였고, 배양 중에는 질소를 0.2 vvm (air volume/working volume/minute)으로 공급하였다.

배양 중, 시간별로 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성된 부탄올 및 아세톤의 농도를 packed column(Supelco Carbopack^TM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m × 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 가스 크로마토그래피(gas chromatography: Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하였다.

그 결과, 변이 균주 Clostridium pasteurianum MBEL-GLY2 (기탁번호 KCTC 11887BP)의 발효에서, 최종농도 약 18.1 g/l의 부탄올과 9.5 g/L의 1,3-프로판디올을 생산하였고, 아세톤은 생산되지 않았으며, 유기산인 아세트산 및 부티르산도 각각 0.5 g/L 이하의 농도로 검출되었다. 이는 본 발명을 통하여 글리세롤을 단일 탄소원으로 이용하여 고농도(high titer) 및 고수율(high yield) 부탄올을 생산할 뿐만 아니라 부산물인 아세톤, 아세트산, 부티르산을 효과적으로 제거할 수 있음을 보여준다.

이상으로, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC11887BP

20110303

Claims

글리세롤로부터 부탄올 또는 1,3-프로판디올 생성능을 가지며, 대사산물 생성량의 1중량% 이하의 아세톤을 생성하는 변이 미생물 Clostridium pasteurianum MBEL-GLY2 KCTC 11887BP.
제1항의 변이 미생물 Clostridium pasteurianum MBEL-GLY2 KCTC 11887BP를 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하여 아세톤 생성량이 대사산물 생성량의 1중량% 이하가 되도록 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
제1항의 변이 미생물 Clostridium pasteurianum MBEL-GLY2 KCTC 11887BP를 글리세롤을 탄소원으로 함유하는 배지에서 배양하여 아세톤 생성량이 대사산물 생성량의 1중량% 이하가 되도록 1,3-프로판디올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 1,3-프로판디올을 회수하는 것을 특징으로 하는 1,3-프로판디올의 제조방법.
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