KR101238539B1

KR101238539B1 - 젤라틴-아파타이트를 함유하는 생체고분자를 이용한 골 조직 재생용 나노섬유의 제조방법

Info

Publication number: KR101238539B1
Application number: KR1020100097966A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 신원상; 제갈승환; 김광진; 모하메드 엘토하미
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-07
Filing date: 2010-10-07
Publication date: 2013-02-28
Also published as: KR20120036217A

Abstract

본 발명은 젤라틴-아파타이트를 함유하는 생체고분자를 이용한 골 조직 재생용 나노섬유의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 합성 생체고분자에 젤라틴-아파타이트를 혼합하여 얻은 혼합물을 전기방사함으로써 젤라틴-아파타이트-생체고분자로 구성된 복합체 골 조직 재생용 나노섬유를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

젤라틴-아파타이트를 함유하는 생체고분자를 이용한 골 조직 재생용 나노섬유의 제조방법{A method of preparing nanofiber for bone tissue regeneration using biopolymer containing gelatin-apatite}

생체의료용 재료를 이용하여 손상된 경질의 조직을 재건하는 것은 재생 의료 분야에서 장래성을 보여 왔다. 최근, 나노섬유는 전기 방사 기술을 통해 스캐폴드 재료의 새로운 타입으로서 발전되어 왔다(Liang D et al., Adv. Drug Del. Rev., 2007, 59, 1392-1412; Pham QP et al., Tiss. Eng., 2006, 12, 1197-1211). 폴리(α-하이드록시산), 천연 단백질 및 다당류를 포함하는 생체 고분자는 지금까지 수십 내지 수백 나노미터의 크기를 가지는 나노섬유상 구조로서 제조되어 왔다(Badami AS et al., Biomaterials, 2006, 27, 596-606; Shin M et al., Tiss. Eng., 2004, 10, 33-41; Yu HS et al., J. Biomed. Mater. Res. A, 2008, 85A, 651-663). 상기 제조된 섬유의 형태는 다른 종래 가공 기술에 의해 얻기가 너무나 지나치게 어려운 것으로 여겨져 왔다. 더욱이, 많은 생물학적 테스트를 통해 세포의 부착 및 성장과 이후 조직 발달에 있어 나노섬유상 구조가 가지는 장점이 확인되었다(Woo KM et al., Biomater., 2007, 28, 335-343; Stevens et al., Science, 2005, 310, 1135-1138).

골 및 치아를 포함하는 경질 조직의 재생을 위하여, 최근 연구들은 무기 성분들과 고분자 매트릭스를 혼합시킨 복합체에 초점을 맞추어 왔다. 골 매트릭스는 아파타이트 나노결정과 콜라겐 섬유상 단백질로 이루어진 나노복합체의 한 유형이다. 그러므로, 상기 복합체 접근법은 천연 골 구조를 모방하는 것이라 여겨진다. 연구들을 통해 나노복합체 생체재료들이 단일의 고분자에 비해 시험관 내 골 세포 반응 및 생체 내 골 형성을 더 잘 유도한다는 점이 확인되었다(Kim HW et al., Biomaterials, 2005, 26, 5221-5230; Song JH et al., J. Biomed. Mater. Res. B, 2007, 83B, 248-257; Erisken C et al., Biomater., 2008, 29, 4065-4073; Kim HW et al., J. Biomed. Mater. Res. A, 2008, 85A, 651-663; Lee HH et al., Acta. Biomater., 2008, 4, 622-629). 특히, 하이드록시아파타이트-침전된 젤라틴으로 제조된 다공성 스캐폴드는 골 세포 반응을 현저히 증진시키는 것으로 확인되었다. 또한 분해성 고분자를 함유하는 복합체 내 생체 활성 유리 성분이 골형성/줄기 세포의 유전자 발현 및 분화를 자극하는 것으로 확인되었다. 더 나아가, 칼슘 포스페이트 무기 상을 혼합한 합성의 분해성 고분자 필름이 산성 환경과 관련된 급격한 분해에 대해 보다 나은 내성을 보였다. 그러나, 단지 제한된 연구들에서만 전기 방사 공정을 이용하여 복합체로 이루어진 나노섬유상 매트릭스의 제조를 수행하였다. 이는 단일의 고분자에 비해 복합체 조성물로부터 나노섬유상 망상조직을 건조하는 것이 너무나 지나치게 어렵기 때문이다.

최근에, 아파타이트와 젤라틴으로 구성된 나노섬유상 멤브레인이 전기방사에 의하여 제조되었다. 아파타이트 나노결정은 이들의 침전된 생성물이 유기 용매에 용해되었을 때 젤라틴 매트릭스 내에 균일하게 분배되는 것으로 확인되었다. 사실상, 상기 개념은 복합체 나노섬유계를 제작하는데 있어 중요한 통찰을 제공한다. 그러나, 상기 생성물이 가진 딱딱한 성질과 너무 이른 용해 특성이 경질의 조직 스캐폴드로서 잘 작용하는 매트릭스를 제조하기 위해 극복되어져야 한다.

이에 본 발명자는 상기와 같은 점을 감안하여 연구하던 중 합성 생체고분자에 젤라틴-아파타이트를 혼합하여 얻은 혼합물을 전기방사함으로써 젤라틴-아파타이트-생체고분자로 구성된 기능성 복합체 나노섬유상 멤브레인을 제조하고, 상기 멤브레인이 우수한 기계적 특성과 생물학적 특성을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 합성 생체고분자에 젤라틴-아파타이트를 혼합하여 얻은 혼합물을 전기방사함으로써 젤라틴-아파타이트-생체고분자로 구성된 복합체 나노섬유를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조되어 기계적 특성과 생체적합성이 향상된, 젤라틴-아파타이트-생체고분자로 구성된 복합체 나노섬유를 제공한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 젤라틴 내에 아파타이트 침전물이 분산되어 있는 젤라틴-아파타이트 졸을 제조하는 단계; 상기 젤라틴-아파타이트 졸을 동결건조시키는 단계; 상기 동결건조된 젤라틴-아파타이트를 유기 용매 중에서 생체고분자와 혼합하여 젤라틴-아파타이트와 생체고분자의 혼합물을 얻는 단계; 및 상기 혼합물을 전기방사하는 단계를 포함하는 골 조직 재생용 나노섬유의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "아파타이트(apatite)"란, 화학식이 Ca₅(PO₄)₃(OH, F, Cl)인 인산염 광물의 일종으로 인회석이라고도 한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "생체고분자(biopolymer)"란, 생체적합성을 가지는 합성 고분자를 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 사용할 수 있는 생체고분자로는 폴리락티드, 콜리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 또는 이들의 공중합체인 폴리락티-글리콜리드 공중합체, 폴리 락티드-카프로락톤 공중합체, 폴리 글리콜리드-카프로락톤 공중합체 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 젤라틴-아파타이트 졸을 제조하는 단계는 젤라틴 내에서 Ca(NO₃)₂·4H₂O와 (NH₃)₂HPO₄의 침전 반응으로 구현할 수 있다.

본 발명에서, 상기 젤라틴-아파타이트 졸을 동결건조시키는 단계와 상기 젤라틴-아파타이트와 생체고분자의 혼합물을 얻는 단계 사이에, 상기 동결건조된 젤라틴-아파타이트를 세척하고 다시 동결건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 유기 용매로는 트리플루오로-에탄올 (TFE), 헥사플루오로-에탄올 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 젤라틴-아파타이트:생체고분자의 혼합비율은 중량비로 1:4 내지 1:10인 것이 바람직하며, 가장 바람직하기로는 1:7이 좋다. 만일 혼합비율이 상기 범위 밖이면 기계적 특성이 저하될 수 있다. 특히 젤라틴-아파타이트의 비율이 상기 범위보다 높으면 즉, 25 중량%보다 높을 경우에는 나노섬유 상에 아파타이트의 응집으로 인하여 비드가 형성되어 기계적 특성이 오히려 나빠질 수 있다.

본 발명에서, 전기방사 방법은 공지의 방법을 통해 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 젤라틴-아파타이트-폴리(락틱-코-카프로락톤)(PLCL)으로 구성된 기능성 나노섬유 재료를 전기방사 공정을 이용하여 제조하였다. 먼저, 골 세포외 매트릭스를 모방하는, 젤라틴-아파타이트 침전물을 제조하고, 상기 침전물을 유기 용매인 트리플루오로-에탄올 (TFE) 중에서 다양한 농도의 PLCL와 균질화하여 혼합물을 얻었다. 그 다음 상기 혼합물을 전기방사함으로써 수백 나노미터의 직경을 가지는 섬유상 구조를 가지는 멤브레인을 성공적으로 제조하였다.

본 발명의 실험예에서는 상기와 같이 제조한 멤브레인의 표면 형태를 주사전자현미경과 투과전자현미경으로 분석하여 아파타이트 나노결정들이 젤라틴-PLCL의 고분자 매트릭스 내에 효과적으로 분포되어 있음을 확인하였다. 이때 저농도의 젤라틴-아파타이트 (14.3 중량%)를 혼합한 경우에는 비드가 없는 부직포의 나노섬유상 웹이 생성된 반면, 고농도의 젤라틴-아파타이트 (25 중량%)를 혼합한 경우에는 나노섬유 상에서 상당한 양의 비드가 관찰되었다.

또한, 소량의 젤라틴-아파타이트를 PLCL에 첨가함으로써, 유연성을 잃지 않으면서, 나노섬유의 인장 강도를 ~2 배까지 유의적으로 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

더 나아가, 복합체 나노섬유 상에서의 조직 세포 성장이 크게 향상됨을 또한 확인할 수 있었다. 세포의 골형성 분화는 순수한 PLCL 나노섬유에 비해 복합체 나노섬유에 의해 유의적으로 자극되었다.

결과적으로 상기와 같은 결과들을 종합하여 볼 때, 본 발명의 젤라틴-아파타이트-PLCL 복합체 나노섬유가 골 조직 재생 매트릭스로서 유용함을 확인할 수 있었다.

본 발명은 합성 생체고분자에 젤라틴-아파타이트를 혼합하여 얻은 혼합물을 전기방사함으로써 우수한 기계적 특성과 생체적합성을 가지는 젤라틴-아파타이트-생체고분자로 구성된 기능성 복합체 나노섬유를 제조할 수 있는 효과를 가진다. 상기와 같은 우수한 기계적 특성과 생체적합성으로 인하여 본 발명의 나노섬유는 골 조직 재생용 멤브레인으로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 전기방사에 의해 본 발명의 젤라틴-아파타이트-PLCL로 구성된 기능성 복합체 나노섬유상 멤브레인을 제조하는 방법을 단계적으로 간략히 도시한 흐름도이다.
도 2는 전기방사된 본 발명의 나노섬유상 시트의 형태를 조사한 결과이다. 이때 a 내지 c는 SEM 조사 결과로서, a는 순수한 PLCL, b는 저농도(1/7)의 젤라틴-아파타이트 침전물을 함유한 PLCL, c는 고농도(1/4)의 젤라틴-아파타이트 침전물을 함유한 PLCL을 이용한 나노섬유상 시트의 형태를 나타낸다. 한편, d는 저농도(1/7)의 젤라틴-아파타이트 침전물을 함유한 PLCL을 이용한 나노섬유상 시트에서, 침전된 아파타이트 나노결정들이 고분자 매트릭스 내에 분산되어 있는 모습을 관찰한 TEM 분석 결과이다.
도 3은 나노섬유상 복합체 멤브레인과 순수한 PLCL 멤브레인의 인장 강도를 조사하여 기계적 특성을 비교한 결과이다. 이때 a는 각 멤브레인의 대표적인 스트레스-변형 곡선이고, b는 최대 인장 스트레스를 비교하여 나타낸 그래프이며, c는 5 개의 개별적인 시료들로 측정한 파단시 연신율 (n = 5에 대해 평균 ± 표준편차)을 비교하여 나타낸 그래프이다. 복합체 나노섬유에서 얻은 값이 순수한 PLCL의 값과 유의적으로 달랐다 (^*p < 0.05 및 ^**p < 0.01, 스튜던트 t-테스트).
도 4는 복합체 나노섬유상 멤브레인에 대한 골형성 세포의 반응을 나타낸다. 이때 a는 3 일 및 7 일 째 저농도의 젤라틴-아파타이트를 함유하는 복합체 상에서의 세포 성장 형태를 보여주고, b는 MTS assay에 의해 측정된 7 일까지 동안의 세포 증식 정도를 나타내며, c는 7 일 및 14 일 째 나노섬유 상에서의 ALP 골형성 세포의 분화를 나타낸다. PLCL 대비 복합체 나노섬유 상에서 유의적인 차이가 관찰되었다 (^*p < 0.01, 스튜던트 t-테스트, n = 3). ALP에 있어 유의적인 증가는 저농도의 젤라틴-아파타이트를 함유하는 복합체 상에서 배양 시간에 대하여 관찰되었다 (p+ < 0.01, 7 일 대 14 일).

이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 젤라틴-아파타이트-PLCL으로 제조된 기능성 복합체 멤브레인의 제조

이전에 보고된 방법에 따라 젤라틴(Type B, bovine skin) 내에서 Ca(NO₃)₂·4H₂O와 (NH₃)₂HPO₄의 침전 반응을 수행하여 젤라틴-아파타이트 졸을 제조하였다(Kim HW et al., Adv. Fun. Mater., 2005, 15, 1988-1989). 간략히 언급하면, 2 개의 별도 Ca-젤라틴 용액과 P-젤라틴 용액을, NH₄OH를 이용하여 pH를 10으로 유지하면서, 40 ℃에서 격렬하게 교반하여 [Ca]/[P] = 1.67의 비율로 혼합하였다. 아파타이트-대-젤라틴 비율은 아파타이트를 형성하는 Ca와 P의 완전한 반응을 고려하여 당량으로 유지하였다. 상기 아파타이트-침전된 젤라틴 졸을 -20 ℃로 동결한 다음 진공 하에서 동결건조하였다. 그 다음, 상기 건조된 시료를 증류수/에탄올로 완전히 세척하여 임의의 염 부산물을 제거한 후, 다시 동결건조시켰다. 그 다음 상기 동결건조된 시료를 24 시간 동안 격렬하게 교반하여 트리플루오로-에탄올(TFE, Aldrich) 내에 15 w/v%로 용해시켰다. 그 후, 15 중량%로 TFE 내에 용해된 폴리(락타이드-코-카프로락톤)(PLCL, Boelinger Ingelheim)을 상기 젤라틴-아파타이트 용액과 2 개의 다른 혼합 비율(젤라틴-아파타이트:PLCL = 1:4 (고비율) 및 1:7 (저비율))로 혼합하였다. 그 다음 각 용액을 시린지에 넣고, 0.4 ㎖/h의 주입 속도로 15 ㎝의 거리를 두고 10 kV의 높은 DC 전압 하에서 회전 만드렐 상에 주입하였다.

도 1에 상기 젤라틴-아파타이트-PLCL로 제조된 기능성 복합체 멤브레인의 제조 방법을 간략히 단계적으로 도시하였다. 비록 PLCL과 같은 합성 고분자 나노섬유가 조직 재생에 있어 우수한 후보 물질일지라도, 젤라틴-아파타이트 조성물의 첨가로 인하여 골 조직과 관련된 생체적합성을 향상시킬 수 있다. 또한, 아파타이트 무기 상은 생체 고분자와 결합되었을 때 골형성 분화 및 석회화를 자극할 수 있다. 더욱이, 칼슘 포스페이트 무기질은 pH 감소 및 생체내 염증과 같은 고분자의 분해 중 형성되는 산성 생성물과 관련된 문제점을 감소시키는데 매우 효과적인 것으로 알려져 있다. 또한, 합성 고분자의 주요 약점이 소수성과 부족한 세포 친화성이기 때문에, 젤라틴 성분을 첨가하는 것은 PLCL과 같은 합성 고분자의 특성을 향상시킬 수 있다.

PLCL 상에 젤라틴 및 아파타이트 성분을 도입하기 위하여, 본 발명에서는 먼저 젤라틴-아파타이트 침전물을 합성한 다음 이를 공용매인 TFE 내에서 PLCL과 균질화하였다. 개별 성분(젤라틴 및 아파타이트)을 직접적으로 첨가하는 방법과 비교하였을 때, 본 발명에서 제시하는 접근법은 향상된 혼합 특성을 가진 복합체 용액을 제공하였다. 젤라틴 내의 한 무리(bunch)의 아미노산 기들이 아파타이트의 공간적인 균질한 핵형성을 촉진하여, 결과적으로 더욱 균일하고 더욱 미세한 크기의 나노결정들이 생성된다는 점은 이미 확인되었다(Kim HW et al., Adv. Fun. Mater., 2005, 15, 1988-1989). 결과적으로, 상기 침전물로부터 제조된 전기방사된 나노섬유는 직접 혼합법으로 제조된 것에 비해 더욱 우수한 섬유상 형태를 가졌다. 사실상, 무기-유기 복합체의 전기방사 도중에, 균일하고 비드가 없는 나노섬유의 제조를 보장하기 위하여는 적합한 혼합 특성을 가진 용액을 이용하는 것이 중요하다.

본 실시예에서 PLCL에 대한 젤라틴-아파타이트 침전물의 첨가는 PLCL에 대한 2 개의 다른 농도, 즉, 저농도 (1/7 비율 = 14.3 중량%) 및 고농도 (1/4 비율 = 25 중량%)로 수행하였다. 아파타이트의 결과적인 농도는 PLCL-젤라틴 고분자 상에 대하여 ~7.2 및 12.5 중량%이었다.

실험예 1: 멤브레인의 형태 조사

상기 실시예 1에서 제조한 전기방사된 나노섬유의 형태를 주사전자현미경(SEM)으로 조사하고, 섬유 직경을 이미지로부터 측정하였다. 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 상기 나노섬유 내의 아파타이트 나노결정의 존재 및 분포를 측정하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 젤라틴-아파타이트의 2 종류의 농도 모두에서, 조절된 조건 하에서 섬유상 제트로의 방사를 수행할 수 있었다. 저농도의 젤라틴-아파타이트가 사용되었을 때 (14.3 중량%, 도 2a), 수백 나노미터 크기의 섬유를 가지는 잘 발달된 부직포의 섬유상 웹이 제조되었다. 반대로, 고 농도의 젤라틴-아파타이트가 사용되었을 때 (25 중량%, 도 2b), 몇몇의 비드가 관찰되었고 섬유의 크기가 상대적으로 불균일하였다. 순수한 PLCL 나노섬유와 비교하였을 때 (도 2c), 복합체 나노섬유는 더욱 작은 직경을 가졌다. 구체적으로 PLCL에서는 평균 섬유 크기가 ~780 nm인데 반해, 고농도의 젤라틴-아파타이트에서는 ~315 nm이었고 저농도의 젤라탄-아파타이트에서는 ~330 nm였다. 아파타이트 무기상의 존재 여부는 TEM 이미지 상에서 분명하게 나타났다 (도 2d). 또한, 고도로 연신된 아파타이트 나노결정이 PLCL-젤라틴 매트릭스 내에 잘 분포되어 있었고, 젤라틴과 PLCL 간에 상분리 징후가 없는 것으로 나타났다. 이러한 점을 감안할 때, PLCL에 젤라틴-아파타이트를 첨가하는 것은 생체고분자 매트릭스 내에 잘-균질화된 무기-유기 성분을 가진 나노섬유를 얻는 효과적인 방법임을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 멤브레인의 기계적 특성 조사

상기 실시예 1에서 제조한 나노섬유상 멤브레인의 인장 기계적 특성을 Instron 3344를 이용하여 측정하였다. 멤브레인을 ~150-200 ㎛의 두께로 준비한 다음 30 mm × 4 mm (게이지 길이 10 mm)의 크기로 절단한 후, 인장 하중을 가하였다. 스트레스-변형 곡선을 기록하고 최대 인장 스트레스와 파단 연신율을 측정하였다. 각 멤브레인의 두께를 SEM 이미지 상에서 관찰된 평균 값으로부터 결정하고, 각 그룹을 위하여 총 5 개의 시료를 테스트하였다.

도 3에 순수한 PLCL 나노섬유와 비교한 본 발명의 복합체 나노섬유의 기계적 특성을 나타내었다. 각 조성의 나노섬유 멤브레인의 특징적인 곡선을 도 3a에 보여주었다. 모든 나노섬유 멤브레인은 스트레스에 있어 초기 급속한 증가를 보였고, 이후 최대 스트레스 값에 접근함에 따라 기울기가 감소한 다음, 파단되었다. 최대 스트레스 값(인장 강도)과 연신율(%) (파단시 변형율)은 도 3b 및 도 3c에 나타낸 스트레스-변형 곡선으로부터 얻었다. 저농도의 젤라틴-PLCL을 가진 복합체 멤브레인이 가장 높은 강도 (평균 10.1 MPa)를 보였으며, 이는 PLCL 나노섬유의 값 (평균 5.7 MPa)의 거의 2배였다. 그러나, 고농도의 젤라틴-아파타이트를 가진 복합체의 강도는 순수 PLCL의 값보다 약간 더 낮았다 (평균 4.3 MPa). 비록 순수 PLCL 나노섬유의 파단시 변형율이 ~330 % 정도로 높았을지라도. 젤라틴-아파타이트의 첨가로 인하여 이 값은 농도 의존 방식으로 감소하여, 저농도 및 고농도의 젤라틴-아파타이트를 함유하는 나노섬유에서 각각 ~230 % 및 ~90 %의 연신율 값으로 나타났다. 젤라틴-아파타이트 나노섬유계에서, 20 % 및 40 % 아파타이트를 함유하는 젤라틴 복합체 섬유는 각각 대략 4-5 MPa 및 4-7 %의 인장 강도와 연신율을 가지는 것으로 이미 보고된 바 있다 (Kim HW et al., Adv. Fun. Mater., 2005, 15, 1988-1989). 그러나, 상기 값들은 본 발명의 젤라틴-아파타이트-PLCL 복합체 나노섬유에서 얻은 값들보다 현저히 더 낮은 값이었다. 따라서, 본 발명의 젤라틴-아파타이트-PLCL 복합체 나노섬유가 종래의 젤라틴-아파타이트 나노섬유에 비해 기계적 특성면에서 현저히 더욱 우수함을 알 수 있다.

사실상, 고분자 상에 무기 입자를 첨가하는 것은 무기 입자들이 미세하고 균일하게 분산되었을 때 기계적 특성을 강화시키는 것으로 알려져 있다. 골과 같은 생물학적 계에서, 콜라겐 섬유 내에 담긴 아파타이트 나노결정들은 골 조직을 강화시키고 단단하게 만든다. 본 발명에서는, 소량의 아파타이트-젤라틴을 첨가하는 것이 PLCL 나노섬유의 기계적 강도를 증진시키는데 매우 효과적임을 확인하였다. 이는 초미세 아파타이트 나노결정이 나노섬유 내에 균일하게 분산되었기 때문에, 고분자가 가해진 하중에 의한 신장을 견딜 수 있게 된 것으로 보였다. 그러나, 고농도의 아파타이트-젤라틴을 첨가하는 것은 PLCL의 강도를 감소시키는 것으로 확인되었다. 이는 아파타이트 나노결정들의 응집으로 인한 것으로 생각되며, 나노섬유 상에 몇몇의 거대 비드가 존재하는 것으로 알 수 있다 (도 2b). 비록 무기상에 의한 어느 정도의 보강 효과가 있다는 점을 곡선의 초기 기울기로부터 알 수 있지만, 응집된 비드는 가해진 하중에 대한 내성보다는 조기 파단을 초래하는 것으로 보였다. 반대로, 저농도의 젤라틴-아파타이트를 함유하는 복합체 나노섬유는 순수한 PLCL의 나노섬유와 거의 동등한 높은 연신율을 보였다. 강화 효과와 별도로, 이러한 높은 유연성을 유지하는 것은 조직 재생 멤브레인이나 세포 성장용 스캐폴드를 위한 복합체의 유용성에 긍정적으로 작용할 것이다.

실험예 3: 멤브레인의 친수성 조사

상기 실시예 1에서 제조한 나노섬유 멤브레인의 친수성을 물 접촉각을 측정함으로써 조사하였다(Contact angle analyzer Phoenix300, SEO Co., Korea). 데이터를 1 시간까지 기록하고 각 그룹을 위하여 5 개의 시료를 테스트하였다.

그 결과, 복합체 멤브레인의 친수성은 PLCL 멤브레인보다 유의적으로 더 높은 것으로 확인되었다. PLCL의 나노섬유 표면의 초기 물 접촉각은 ~80 °이었고, 두 복합체의 경우 ~70 °였다. 또한, 물방울이 복합체 상에 완전히 펴지는 것으로 보였고, 나노섬유 매트릭스 내로 ~1 분 (고농도의 젤라틴-아파타이트) 및 ~5 분 (저농도의 젤라틴-아파타이트) 내에 침투되었다. 그러나, 순수한 PLCL 나노섬유를 조사하였을 때에는 심지어 1 시간 후에도 이러한 물 침투 현상이 관찰되지 않았다. 젤라틴-아파타이트가 첨가된 PLCL 나노섬유의 이러한 높은 친수성은 재료 표면이 유체와 효과적으로 빠르게 접촉되도록 하여, 생물학적 분자와 세포 간의 반응을 강화시킬 수 있다.

실험예 4: 멤브레인의 생체적합성 조사

상기 실시예 1에서 제조한 복합체 나노섬유의 시험관 내 생체적합성을 골형성 전구세포(MC3T3-E1, ATCC)를 사용하여 관찰하였다.

간략하게 언급하면, 상기 세포를 10% 우태아 혈청(FBS), 2 mM L-글루타민, 50 IU/㎖ 페니실린 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된 α-MEM으로 이루어진, 배지에서 계대배양하였다. 전기방사된 나노섬유 웹(대조구로서 순수 PLCL 및 2 개의 다른 복합체)을 10 mm × 10 mm의 직경으로 준비한 다음 24-웰 플레이트에 배치시킨 후, 상기 세포 현탁액(3×10⁴ 세포/㎖의 밀도)을 각 시료 상에 도말하였다. 그 다음 상기 시료들을 37 ℃에서 배양하고, 세포 성장 수준을 3일 및 7일 째에 MTS assay를 통해 평가하였다. 그 다음, 상기 세포를 고정하고, 단계적인 일련의 에탄올로 탈수한 다음, 헥사메틸디실라제인으로 처리하고, 금으로 코팅한 후, 세포 형태를 SEM으로 관찰하였다. 그 다음 세포의 골형성 분화를 알칼린 포스파타제(ALP)의 생산량을 측정함으로써 조사하였다. 7일 및 14일의 기간 동안 각 나노섬유 시료 상에서 배양된 세포를 이전에 보고된 방법에 따라 ALP 활성 키트(Sigma)를 사용하여 측정하였다(Kim HW et al., Adv. Fun. Mater., 2005, 15, 1988-1989). 각 그룹마다 3개의 시료를 사용하여 상기 모든 세포 테스트를 수행하였으며, 그룹들은 스튜던트 t-테스트에 의해 비교하였다. 유의성은 p<0.05 및 p<0.01으로 고려하였다.

종합하여 언급하면, PLCL 나노섬유 내의 젤라틴-아파타이트의 생물학적 역할을 시험관 내 세포 성장 및 골형성 발달로 평가하였다. 이를 위해 MC3T3-E1 쥐-유래의 골형성 전구세포를 나노섬유 멤브레인 상에서 배양한 다음, 세포 증식 및 세포 구조물 내에서 생성되는 알칼린 포스파타제 농도를 조사하였다.

그 결과로서, 도 4a는 복합체 (저농도의 젤라틴-아파타이트) 및 PLCL 나노섬유상 기질 상에서 성장한 세포의 형태를 보여준다. 복합체 나노섬유 상에서, 세포는 우수한 세포질 확장과 함께 초기 (3일 째)에 고도로 생존 가능하였고, 세포는 7일 째에 두꺼운 세포 층을 형성하는 합류에 거의 도달하였다. 순수한 PLCL 상에서, 세포는 3일 째 복합체보다 덜 확산되는 것으로 나타났으나, 7일 째에는 유사한 거동을 보였다. 나노섬유상에서의 세포 성장 수준을 MTS assay로도 측정하였다 (도 4b). 3일 째, 순수한 PLCL 보다 복합체 멤브레인 상에서 세포 증식이 유의적으로 더 높았다 (^*p < 0.01). 2 개의 복합체 나노섬유 간에 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 복합체 상에서의 초기 세포 확산 및 성장의 증가는 우선 이들의 강화된 친수성으로 인하여 단백질의 급속한 흡착이 가능하고 세포 부착 과정이 촉진되기 때문이다.

알칼린 포스파타제 농도가 복합체 나노섬유에서 유의적으로 증가함을 확인하였다 (도 4c). 7 일 및 14 일 동안 배양하는 도중 세포 구조물 상에서 생산된 ALP 효소적 활성이 측정되었다. 특히, 복합체 나노섬유 상에서 성장한 세포의 ALP 활성은 7일 째 순수한 PLCL 상에서 성장한 세포의 활성보다 유의적으로 더 높은 반면 (^*p < 0.01), 2 개의 복합체 나노섬유 간에는 유의적인 차이가 관찰되지 않았다. 이 지점에서, 세포는 이미 합류에 도달하였고, 두꺼운 층을 형성하였다. 그러므로, 이들은, 일반적으로 MC3T3-E1 세포의 포화된 증식 능력과 관련된, 골형성 분화를 수행할 수 있었을 것이다. 14 일 동안 배양을 연장시킨 후, 다른 멤브레인에서는 단지 약간의 증가만이 발견된 반면 저농도의 젤라틴-아파타이트를 포함하는 복합체 내에서는 ALP가 유의적으로 (거의 2배) 활성화 되었다. 결과적으로, 저농도의 젤라틴-아파타이트를 포함하는 복합체 내 ALP 농도는 다른 멤브레인 보다 (~2배로) 유의적으로 더 높았다. 나노섬유의 PLCL-젤라틴 매트릭스 내에 분산되어 있는 아파타이트는 골형성 분화를, 특히 7 일 또는 14 일 동안 배양하는 도중 강화시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한 젤라틴 망상조직의 존재 하에 합성된 아파타이트가 천연 골을 대부분 모방하는 것으로 보인다. 초기 생물학적 사건의 향상은 세포 분열 및 분화를 포함하는 전체적인 과정에서의 향상을 유도할 수 있다. PLCL 조성물 내 아파타이트와 젤라틴에 의한 시험관 내 생물학적 자극은 2 종류의 복합체 나노섬유에서 유사한 것으로 나타났다. 비록 고농도의 젤라틴-아파타이트를 함유하는 나노섬유가 생물학적 활성을 자극할 수 있을지라도, 이 농도에서 형성되는 어느 정도의 거대 비드가 세포적 사건 상에 부작용을 줄 수 있다.

상기 기계적 특성과 함께 시험관 내 세포 반응 상의 실험 결과를 종합하여 볼 때, 소량의 젤라틴-아파타이트가 골 조직 재생을 위한 최적의 기질 조건을 제공할 수 있다는 점을 알 수 있다.

Claims

젤라틴 내에 아파타이트 침전물이 분산되어 있는 젤라틴-아파타이트 졸을 제조하는 단계; 상기 젤라틴-아파타이트 졸을 동결건조시키는 단계; 상기 동결건조된 젤라틴-아파타이트를 유기 용매 중에서 생체고분자와 혼합하여 젤라틴-아파타이트와 생체고분자의 혼합물을 얻는 단계; 및 상기 혼합물을 전기방사하는 단계를 포함하고,
상기 젤라틴-아파타이트:생체고분자의 혼합비율은 중량비로 1:4 내지 1:10인, 골 조직 재생용 나노섬유의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 생체고분자는 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리락티-글리콜리드 공중합체, 폴리 락티드-카프로락톤 공중합체, 폴리 글리콜리드-카프로락톤 공중합체 또는 이들의 조합인, 골 조직 재생용 나노섬유의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 젤라틴-아파타이트 졸을 제조하는 단계는 젤라틴 내에서 Ca(NO₃)₂·4H₂O와 (NH₃)₂HPO₄의 침전 반응을 수행함으로써 구현하는, 골 조직 재생용 나노섬유의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 젤라틴-아파타이트 졸을 동결건조시키는 단계와 상기 젤라틴-아파타이트와 생체고분자의 혼합물을 얻는 단계 사이에, 상기 동결건조된 젤라틴-아파타이트를 세척하고 다시 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는, 골 조직 재생용 나노섬유의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 유기 용매로는 트리플루오로-에탄올 (TFE), 헥사플루오로-에탄올 또는 이들의 조합인, 골 조직 재생용 나노섬유의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 젤라틴-아파타이트:생체고분자의 혼합비율은 중량비로 1:7인, 골 조직 재생용 나노섬유의 제조방법.