KR20090071982A

KR20090071982A - 골조직유도 재생용 차폐막 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20090071982A
Application number: KR1020070139939A
Authority: KR
Inventors: 신흥수; 이부규; 이영무; 정성인
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2009-07-02
Also published as: KR100968231B1

Abstract

본 발명은 골조직유도 재생용 차폐막 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생분해성 고분자와 생체적합성 무기물을 포함하는 나노섬유로 이루어지고, 부직포 형태의 다공성 구조를 포함하는 골조직유도 재생용 차폐막 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 상기 차폐막은 일정한 강도, 생체 적합성 및 생체 분해성을 가지고, 골재생 효과가 우수하여 골조직 공학 분야에 적합하게 사용가능하다.

골재생, 차폐막, 조직 공학, 나노섬유

Description

골조직유도 재생용 차폐막 및 이의 제조방법{Nonwoven Nanofibrous Membranes for Guiding Bone Tissue Regeneration and Their Preparation Method}

본 발명은 일정한 강도, 생체 적합성 및 생체 분해성을 가지고, 골재생 효과가 우수하여 골조직 공학 분야에 적합하게 사용가능한 골조직유도 재생용 차폐막 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

임플랜트를 하기 위해서는 치주골이 손상되지 않은 상태를 유지하고 있어야 단단하게 고정이 될 수 있는데, 이때 치주골이 손상된 환자의 경우 차폐막을 이용하여 치주골이 재생하도록 유도를 한 후 임플랜트 시술이 가능해진다.

상기 차폐막의 재질로는 초기에 폴리테트라플루오로에틸렌과 같은 고분자가 사용되었으나, 치주골이 생성된 후 차폐막의 제거과정을 또한번 거쳐야하는 등의 문제가 발생하였다.

이에 생분해성 고분자를 이용하여 차폐막을 제조하고자 하는 다양한 시도가 있었다. 생분해성 차폐막을 이용하면 차폐막을 제거하기 위한 재수술이 필요 없고 비분해성 재료로 제조된 차폐막과 비교하여 조직을 재생하는 데에는 큰 차이가 없는 것으로 보고되고 있다.

대한민국 특허공개 제2003-2224호는 키토산 부직포 사이에 미세공이 형성된 다공성 생분해성 고분자막이 샌드위치된 조직재생 유도용 차폐막 및 그 제조방법을 개시하였다.

대한민국 특허공개 제2005-48360호는 키토산, 콜라겐 및 알긴산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종의 천연 고분자와, 락트산의 단일 중합체, 락트산과 글리코산의 공중합체, 글리코산의 단일 중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 합성 고분자의 혼합물로부터 제조되는 나노섬유가 부직포 형태로 되어 있는 조직 재생용 차폐막을 제안하였다.

그러나 상기와 같이 고분자로만 이루어진 차폐막으로 만들어져서 골조직을 재생시키는데 효과적이지 못한 단점을 가지고 있다. 또한 생분해성 재료를 이용하여 제조된 차폐막을 임상에 적용하는 경우에도 충분한 강도를 가지지 못하여 일정 형태를 유지하지 못하고, 조직이 자랄 수 있는 공간을 확보하지 못하여 재료에 의한 2차적인 염증을 발생시키는 또 다른 문제가 발생하였다.

이에 골조직과의 친화성을 증대시키기 위해 전기방사법을 이용하여 골조직과 형태학적으로 비슷한 나노 구조를 가지는 지지체를 제조하고자 하였다[Biological efficacy of silk fibroin nanofiber membranes for GBR, K.H. Kim et al. Journal of Biotechnology 120 (2005) 327-339)

또한 대한민국 등록특허 10-762928에서는 견 섬유에서 세리신을 제거하여 얻어진 견 피브로인 용액을 투석을 거쳐 급속 동결시킨 후 건조하고, 건조된 견 피브로인을 전기방사 용매에 용해시킨 후 전기방사하는 단계에 의해 얻어지는 골모세포 의 골조직유도 재생용 차폐막을 제안하였다

대한민국 특허공개 제2003-0022425호는 생분해성 고분자와 커플링제를 일정비율로 반응시켜 커플링된 생분해성 고분자에 세라믹 전구체를 반응시켜 유-무기 복합체를 제조하고, 상기 복합체가 임플란트 후 신속하게 뼈와 화학적 결합을 이룰 수 있고 골 흡수 현상을 효과적으로 억제시킬 수 있다고 언급하고 있다.

대한민국 등록특허 10-0650453호는 골대체용 복합재료를 제안하면서, 상기 재료로서 시아노아크릴레이트를 사용하여 접착력 및 형태 유지력을 부여하고, 무기재료로서 골전도성 무기물질을 사용하여 신생골 전도 능력을 확보할 수 있도록 이들 조성을 혼합한 골 대체재료를 언급하고 있다.

미합중국 특허공개 제2006-88569호는 중간엽 전구세포(mesenchymal precursor cell)와 세포외 기질을 배지가 포함된 생흡수성 고분자로 이루어진 다공성 시트의 표면에 고정시켜 중간엽 전구 조직의 재생을 유도하는 방법을 언급하고 있다.

미합중국 특허공개 제2005-226904호는 조직공학용 섬유 복합재를 제시하면서, 상기 복합제가 나노 수준의 기공을 가지는 SiO₂및 TiO₂ 등의 산화물과 생분해성 고분자를 포함하여 섬유 형태로 제조가 가능하다고 제안하고 있다.

미합중국특허 제6,863,694호는 골원성 골 임플란트 시트에 관한 것으로, 뼈 유래 입자를 이용하여 32% 이하의 공극 부피를 가지는 골 임플란트를 제조할 수 있다고 개시하고 있다.

그러나 상기 언급된 재료를 사용하더라도 물리적 강도를 충분히 확보하기가 어렵고 골조직을 효과적으로 유도시키지 못하였으며, 지지체 구조적인 측면에서 그의 제조법이 복잡하고 공극률 조절에 어려움이 있었다.

상기 문제를 해결하기 위한 본 발명의 목적은 일정 강도와 생체적합성 및 생분해성을 가지고 있으며, 미세공의 공극 크기 조절이 용이하고, 간단한 제조공정으로 제조할 수 있는 유/무기물 혼합 부직포 형태의 골조직유도 재생용 차폐막 및 그 제조방법을 제공하기 위한 것이다

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은

생분해성 고분자와 생체적합성 무기물을 포함하는 나노섬유로 이루어지고, 부직포 형태의 다공성 구조를 포함하는 골조직유도 재생용 차폐막을 제공한다.

또한 본 발명은

S1) 생분해성 고분자를 포함하는 용액과 생체적합성 무기물을 혼합하는 단계;

S2) 얻어진 혼합물을 방사용 바늘(needle)에 투입한 후 방사 공정을 수행하는 단계; 및

S3) 상기 방사 후 얻어진 나노섬유를 몰드에 주입한 후 동결 건조하는 단계;

를 포함하는 골조직유도 재생용 차폐막의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 골조직유도 재생용 차폐막은 골유도 물질로 생분해성 고분자와 생체적합성 무기물을 혼합하여 전기방사법을 통해 나노섬유로 방사하고, 이를 다공성을 갖는 차폐막으로 제조함으로써 삼차원적으로 부피대비 표면적을 극대화시킨 나노구조의 지지체이다.

상기 차폐막은 일정한 강도, 생체 적합성 및 생체 분해성을 가지고, 골재생 효과가 우수하여 골조직 공학 분야에 적합하게 사용가능하다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 골조직유도 재생용 차폐막은 생분해성 고분자와 생체적합성 무기물을 포함한다.

상기한 조성을 포함하는 골조직유도 재생용 차폐막은 생분해성 고분자와 생체적합성 고분자가 나노섬유 상태로 성형되어 다공성 구조의 부직포 형태를 갖는다.

상기 차폐막은 나노 구조에서 마이크로에 이르기까지 섬유의 크기를 제어할 수 있으며, 바람직하기로 나노 수준의 직경을 갖는 나노섬유가 부직포 형태로 성형된 형태를 갖는다.

상기 차폐막은 시술에 용이한 기계적인 강도를 유지하고 있어 특별한 훈련 없이 쉽게 이용이 가능하며 삼차원적으로 이루어진 높은 공극률은 재료가 인체 내에 삽입되었을 경우 공기 투과도가 높고 영양분을 공급하는데 우수한 특성을 가질 수 있다.

이러한 차폐막의 구조를 제어함으로서 조직 및 골형성 세포와의 상호작용을 조절하여 세포의 부착, 이동, 분화, 및 성장을 효과적으로 촉진할 수 있다.

상기 생분해성 고분자는 본 발명에서 한정하지 않으나, 본 발명에서 사용할 수 있는 생분해성 고분자 재료의 선택에 있어 중요하게 고려되어야 할 사항은 조직세포의 유착과 증식이 잘되어야 하고, 분화된 세포의 기능이 보전되어야 하며, 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 융화가 잘 되어 염증 반응이 없을 뿐만 아니라 일정 기간이 지난 후 스스로 분해되어 이물질로 남지 않아야 한다.

바람직하기로, 상기 생분해성 고분자로는 이 분야에서 공지된 바의 천연 고분자 및 합성 고분자가 가능하다. 상기 천연 고분자로는 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하고, 상기 합성 고분자로는 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하다. 이때 천연 고분자와 합성 고분자는 골조직유도 재생용 차폐막을 사용하기 위한 적절한 강도 및 생분해성을 갖도록 혼합 사용할 수 있으며, 혼합 사용 정도는 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 선별될 수 있다. 더욱 바람직하기로는 폴리락타이드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤 및 이들의 공중합체 등을 사용한다.

상기 생체적합성 무기물은 생체적합성이 있다고 공지된 모든 무기물(또는 세 라믹)이 가능하다. 본 발명에서 생체 적합성을 향상시키는 생체 외 기질 성분 및/또는 기계적 강도와 골조직 재생효과를 향상시키기 위해 첨가하는 무기물 재료의 선택에 있어, 인체 내에 이식될 때 주위의 뼈나 조직과의 접합력 및 안정성이 보전되어야 하며, 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 융화가 잘 되어 염증 반응이 없어야함이 우선적으로 고려되어야 한다.

바람직하기로, 상기 생체적합성 무기물로는 하이드록시아파타이트, 불소화 아파타이트, 옥시 아파타이트, 트리칼슘포스페이트, 모노칼슘포스페이트, 육인산사칼슘, 칼슘메타 포스페이트, 탈미네랄 동물뼈, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하다. 더욱 바람직하기로는 하이드록시아파타이트, 트리칼슘포스페이트, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종이 가능하다.

이때 생분해성 고분자와 생체적합성 무기물은 차폐막을 구성하는 나노섬유의 물성, 기공의 크기, 차폐막의 두께, 생체 외 기질 성분 및/또는 기계적 강도, 골조직 재생 효과 등을 고려하여 그 함량을 조절한다.

바람직하기로, 본 발명에 따른 골조직유도 재생용 차폐막은 생분해성 고분자와 생체적합성 무기물이 1:9∼9:1의 중량비, 더욱 바람직하기로 3:7∼7:3의 중량비로 혼합된다. 만약 상기 생분해성 고분자의 함량이 과도하면 생체적합성 무기물의 사용에 따른 효과를 얻을 수 없어 골조직 재생 효과가 충분치 않다. 이와 반대로 상기 생체적합성 무기물의 함량이 과도하면 나노섬유로 이루어진 차폐막의 성형이 불가능하여 골조직유도 재생용 차폐막으로의 적용이 불가능해진다.

추가로 상기 골조직유도 재생용 차폐막은 필요한 경우 호르몬, 약물, 성장인 자, 재생 효소 등의 각종 첨가제를 더욱 포함한다.

전술한 바의 골조직유도 재생용 차폐막은

S3) 상기 방사 후 얻어진 나노섬유를 몰드에 주입한 후 동결 건조하는 단계를 거쳐 제조한다.

먼저, 단계 S1)에서는 생분해성 고분자를 포함하는 용액과 생체적합성 무기물을 혼합한다.

상기 생분해성 고분자를 포함하는 용액은 방사를 수행하기 위해 생분해성 고분자를 용매와 혼합하여 제조된다.

상기 용매는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 생분해성 고분자를 용해할 수 있는 것이면 어느 것이든 가능하고, 본 발명에서 특별히 한정하지는 않는다. 일예로, 상기 용매로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급 알코올; 아세톤; 트리플루오로에탄올; 테트라하이드로퓨란; 디클로로메탄; 및 이들의 혼합용매가 가능하다

상기 생분해성 고분자를 포함하는 용액의 농도는 전기 방사를 수행하기 위한 적절한 범위로 사용하고, 바람직하기로 1∼20 중량%의 농도로 사용한다. 이때 용 액의 농도를 조절하여 나노섬유의 두께 조절이 가능하며, 골조직 재생 효과를 갖기 위해서 상기 범위 내에서 사용한다.

이때 생분해성 고분자를 포함하는 용액과 생체적합성 무기물의 혼합비는 최종 제조되는 차폐막 내의 생분해성 고분자와 생체적합성 무기물의 함량을 고려하여 적절히 선정한다.

다음으로, 단계 S2)에서는 상기 단계에서 얻어진 혼합물을 방사용 바늘(needle)에 투입한 후 방사 공정을 수행한다.

상기 방사는 공지된 바의 장치를 이용한 방법이 가능하며, 바람직하기로 전기 방사를 통해 수행한다.

나노섬유를 제조하기 위한 방법으로는 드로잉(drawing), 템플레이트 합성(template synthesis), 상분리(phase separation), 자기 조합(self assembly), 전기방사(electrospinning) 등이 있으며, 그중 본 발명에서는 전기방사 방법을 수행한다.

전기방사는 나노섬유를 연속적이고 대량으로 생산할 수 있는 방법으로 바늘(모세관 튜브, 또는 노즐)을 통해 밀리미터 직경의 액체 분사물(jet)을 방출시켜 나노섬유로 된 부직포를 생산하는 공정이다. 상기 전기방사는 공정 조건을 조절하여 수nm∼수천nm 크기의 다양한 직경을 가지는 나노섬유를 제조할 수 있으며, 부피 대비 표면적비가 높을 뿐만 아니라 제조된 막의 공극률이 매우 높은 잇점이 있다. 이러한 전기방사의 구체적인 공정조건은 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절히 채택될 수 있다.

본 발명에서는 상기 바늘의 내경이 0.3∼0.7 mm 이고, 바늘과 수집기 사이의 전압을 10∼20 kV으로 작용하여 전기방사를 수행하며, 바람직하기로는 18∼24 게이지의 바늘을 사용한다.

이때 전기방사시 규칙적으로 바늘을 흔들어주어 나노섬유 내 생분해성 고분자와 생체적합성 무기물이 균일하게 혼합되도록 한다.

다음으로, 단계 S3)에서는 상기 방사 후 얻어진 나노섬유를 몰드에 주입한 후 동결 건조하는 단계를 거쳐 부직포 형태의 골조직유도 재생용 차폐막을 제조한다.

상기 몰드는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 골조직을 재생하기 위해 조직공학 분야에서 사용되는 적절한 구조물을 제조하기 위한 재질이면 어느 것이든 가능하고, 그 구조 형태 또한 재생하고자 하는 골조직에 따라 삼차원 형태로 적절히 제조가 가능하다.

이전 단계에서 얻어진 나노섬유는 몰드 내 주입하여 골조직을 재생하는 데 적용가능한 적절한 형태로 변형되고, 이를 증류수에 침지시켜 투석에 의해 용매 및 잔류하는 불순물, 일예로 각종 염류 등을 제거한다.

다음으로, -100∼0℃에서 동결 건조하여 골조직유도 재생용 차폐막을 제조한다. 고온 건조의 경우 생체고분자의 수축이 발생할 우려가 있으므로, 본 발명에서는 동결 건조를 수행하여 몰드 내 존재하는 나노섬유의 형태를 그대로 유지하여 이의 특성을 보존한다.

이러한 단계를 거쳐 제조된 본 발명에 따른 골조직유도 재생용 차폐막은 전 술한 바와 같이, 생체고분자와 생체적합성 무기물이 혼합되어 나노섬유를 구성하고, 상기 나노섬유가 다공성을 지닌 부직포 형태를 갖는다.

본 발명에 따른 골조직유도 재생용 차폐막은 나노섬유의 굵기 및 부직포 형성 시에 나노섬유가 축적되는 정도를 조절하여 차폐막의 두께 조절과, 다공성 구조의 기공의 크기 또한 제어가 가능하다. 바람직하기로 상기 나노섬유의 직경은 0.1∼0.3 ㎛이고, 기공의 크기는 4∼10㎛이며, 차폐막의 두께는 0.2∼0.3㎛을 갖는다.

또한 상기 골조직유도 재생용 차폐막은 인장강도가 4∼5 MPa이어 내구성이 우수하고, 신율이 60∼110%이고, 영스 모듈러스(Young's modulus)가 25∼40 MPa로 탄성이 우수함을 알 수 있다.

본 발명에 따른 골조직유도 재생 차폐막은 각종 손상된 뼈의 골조직의 재생, 달리 말하면, 골아세포, 파골세포, 골세포의 증식을 위해 사용될 수 있다.

구체적으로 상기 차폐막에 손상 부위에 이식하여 골조직을 재생한다.

특히 기본적으로 치주질환으로 유래된 치주골의 형성을 촉진하는데 사용이 될 수 있으며, 차폐막에 이식한 부분과 치주골 내에 형성된 공간으로 치주골이 형성되도록 골유도 효과를 가져 올 수 있다. 나아가 외부에서 형성된 염증 및 섬유조직의 형성을 효과적으로 차단하는 역할을 할 수 있다.

더욱이 상기 골조직유도 재생 차폐막은 나노섬유의 직경, 기공의 크기, 및 기공율, 및 두께 등을 제어하여 골조직 재생을 위한 각종 세포와의 상호작용을 조절하여 세포의 부착, 이동, 분화, 및 성장을 효과적으로 촉진할 수 있다.

이러한 골조직유도 재생 차폐막은 골조직 재생을 위한 시술에 용이한 기계적 인 강도를 유지하고 있어 특별한 훈련 없이 쉽게 이용이 가능하며 삼차원적으로 이루어진 높은 공극률은 재료가 인체 내에 삽입되었을 경우 공기투과도 및 영양분을 공급하는데 우수한 특성을 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 실험예 6에 따르면, 인간의 턱 뼈에서 채취한 줄기세포를 상기 차폐막에 부착시킨 후 배양액에서 3주간 성장시켰다. 그 결과 상기 차폐막에 줄기세포가 잘 부착되어 있으며, 그 수가 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한 칼슘의 함량을 측정한 결과 뼈 재생에 필수적인 미네랄 과정이 촉진되었음을 확인하였다.

본 발명의 다른 바람직한 실험예 7에 따르면, in vitro 실험을 통해 랫트의 두개골에 상기 차폐막을 이식한 후, 3달 후 뼈 재생 정도를 측정한 결과, 약 90% 이상의 우수한 재생율을 나타내었으며, 기존의 뼈와 융합하여 손상 분위의 대부분에 걸쳐 새로운 뼈가 이어져 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

에탄올에 5 중량%의 농도로 폴리락타이드(PLA)가 용해된 PLA 용액 0.5g과 탈미네랄화 뼈 분말(DBP, demineralized bone powder, 입자 크기:0.01∼0.05㎛) 0.025 g을 균일하게 혼합한 후 23G의 스테인리스 주사기에 주입하여 방사하였다.

이때 회전수집기는 알루미늄 호일로 감싸주고 바늘로부터 20 cm의 거리에 두었으며, 주사기를 20 ul/min의 속도로 주사하였다. 상기 바늘과 수집기사이의 전압은 15 kV로 계속적으로 작용하게 하여, 용액이 24시간 돌아가는 수집기에 뿌려지도록 하였다.

상기 수집기에 뿌려진 나노섬유는 몰드에 주입하고 남은 화학물질들을 제거하기 위하여 25℃의 증류수에 2분 동안 침지시킨 후, 0℃에서 동결건조하여 골조직유도 재생 차폐막을 제작하였다.

<실시예 2>

무기물로 DBP를 0.1 g 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 골조직유도 재생 차폐막을 제조하였다.

<비교예 1>

상기 실시예 1과 동일하게 수행하되, 무기물을 사용하지 않고 PLA를 단독으로 사용하여 골조직유도 재생 차폐막을 제조하였다.

<실험예 1> 주사전자현미경 및 다공도 분석

상기 실시예 1, 2와 비교예 1에서 제조된 다공성 차폐막의 표면 상태를 알아보기 위해 주사전자현미경(Scanning electron microscopy)으로 분석하였고, 얻어진 결과를 하기 도 1에 나타내었다.

도 1의 (a)는 실시예 1, 2와 비교예 1에서 제조된 다공성 차폐막의 사진, (b)는 이들의 주사전자현미경 사진이고, (c)는 (b)의 확대사진이다.

도 1을 참조하면, PLA를 단독으로 사용하는 비교예 1의 경우와 비교하여, 본 발명에 따라 제조된 실시예 1,2의 다공성 차폐막의 경우 지지체 외부와 내부 단면에서 굵기가 다양하며, 다공성의 형태가 매우 균일할 뿐만 아니라 다공성의 연결도가 매우 우수한 나노섬유로 이루어진 차폐막임을 알 수 있다.

또한 상기 실시예 1, 2와 비교예 1에서 제조된 다공성 차폐막을 다공도 분석기(Porosimetry analyzer)를 통해 지지체의 공극 크기를 분석하였다. 그 결과 다공성 구조의 공극 크기가 4∼10 ㎛로 나타났으며, 기공이 차폐막 전체에 걸쳐 매우 균일하게 형성됨을 알 수 있다.

그리고 도 1(c)의 화살표로 표시한 부분에 보이는 바와 같이, 실시예 2의 차폐막의 경우 나노섬유의 표면에 DBP가 돌출하여 존재함을 알 수 있다. 상기 DBP는 뼈의 골세포에 친화적이기 때문에, 이러한 차폐막을 골조직의 재생에 이용하는 경우 그 진행 속도가 보다 빠르게 진행될 수 있음을 알 수 있다.

<실험예 2> AFM에 의한 표면 상태 분석

실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 골조직유도 재생용 차폐막의 표면형태를 원자간력 현미경(atomic force microscope)으로 측정하였다.

도 2의 (a)는 비교예 1에서 제조된 차폐막의 표면형태를 원자간력 현미경 분석 결과를 보여주는 도면이고, (b)는 실시예 1에서 제조된 차폐막의 표면형태를 원자간력 현미경 분석 결과를 보여주는 도면이다.

도 2의 (a)에서 보이는 비교예 1의 차폐막은 PLA를 단독으로 사용하여 표면이 매우 매끈함을 알 수 있다. 이와 비교하여 (b)의 실시예 1의 차폐막은 표면이 매우 거칠고, 이러한 거칠기도는 차폐막 내 함유된 무기물에 의한 것임을 알 수 있다.

<실험예 3> 물성 측정

실시예 1,2와 비교예 1에서 제조된 골조직유도 재생 차폐막의 물성을 측정하여 도 3 내지 도 5에 나타내었다.

도 3은 실시예 1,2와 비교예 1에서 제조된 골조직유도 재생 차폐막의 인장강도(tensile strength)를 보여주는 그래프이고, 도 4는 실시예 1,2 및 비교예 1에서 제조된 나노섬유 지지체의 신율(elongation)을, 도 5는 실시예 1,2 및 비교예 1에서 제조된 나노섬유 지지체의 영스 모듈러스(young's modulus)를 보여주는 그래프이다.

도 3을 참조하면, 실시예 1의 차폐막의 경우 PLA를 단독으로 사용한 비교예 1의 차폐막과 비교하여 인장강도가 약간 감소하였으며(유의적이지는 않음), 무기물인 DBP의 함량을 증가할수록(실시예 2) 인장 강도가 증가함을 확인하였다.

도 4를 살펴보면, 신율의 경우 차폐막 내 PLA의 함량이 많을수록 증가하였으며, 무기물인 DBP의 함량을 증가할수록(실시예 2) 감소하는 경향을 보였다.

도 5를 참조하면, 영스 모듈러스의 경우 실시예 1 및 2의 경우 비교예 1에 비해 훨씬 우수하여 PLA 단독으로 사용하는 경우와 비교하여 탄성이 향상됨을 알 수 있다.

<실험예 4> TGA 분석

실시예 1,2와 비교예 1에서 제조된 차폐막과 무기물인 DBP의 열중량분석(Thermal gravimetric analysis)을 수행하였으며, 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 이때 비교를 위해 DBP 단독의 경우 또한 측정하였다.

도 6은 실시예 1,2와 비교예 1에서 제조된 차폐막과 무기물인 DBP의 열중량분석 스펙트럼이다.

도 6을 참조하면, 비교예 1, 실시예 1,2의 차폐막 모두 300℃ 이상에서 열분해가 나타나기 시작하여 400℃에서 완전히 분해되었다. 그러나 실시예 1,2의 경우 차폐막 내 존재하는 무기물에 의해 400℃이상에서도 4∼13%의 남아있는 무기 성분들이 발견되었다.

<실험예 5> ATR-FTIR 분석

실시예 2와 비교예 1에서 제조된 골조직유도 재생 차폐막과 DBP 분말을 Attenuated total reflectance-Fourier transform infreared(ATR-FTIR)과 Raman 분석법으로 표면의 기능기를 확인하였다.

도 7은 실시예 2, 비교예 1에서 제조된 차폐막과 DBP 단독의 ATR-FTIR 스펙트럼이다.

도 7을 참조하면, DBP의 경우 포스페이트의 특성 피크인 1237 cm^-1, 1030 cm^-1, 및 604cm^-1 등이 나타났으며, 이러한 피크는 실시예 2의 스펙트럼에서도 나타났다. 또한 PLA의 특성 피크인 C=O (1759cm^-1) 또한 실시예 2의 스펙트럼에서 확인할 수 있다.

이러한 결과를 통해 실시예 2의 차폐막은 PLA-DBP가 공존함을 알 수 있다.

<실험예 6> 골조직유도 재생 효과 특성

실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 차폐막에 대한 골조직의 재생을 알아보기 위해 하기와 같이 수행하였다.

세포 성장

인간의 턱 뼈에서 채취한 줄기세포를 배양한 후, 2x10⁴개/cm²로 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 각각의 차폐막에 부착시켰다. 이어 3주간 골원성 배양액에서 자라게 한 후 세포 성장 정도를 DNA 측정법으로 확인하였으며, 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8은 실시예 2 및 비교예 1의 차폐막에 부착된 줄기 세포의 DNA 함량을 측정한 그래프이다.

도 8을 참조하면, 실시예 2 및 비교예 1의 차폐막 모두 3주 동안 세포가 잘 부착되어 있고, 시간에 따라 그 수가 증가함을 알 수 있다. 이러한 결과는 실시예 2 및 비교예 1의 차폐막 모두 세포에 아무런 해가 없음을 의미한다.

ALP 활성

상기에서 줄기세포가 배양된 차폐막의 3주 동안의 분화정도를 알아보기 위해, 뼈 분화 표지 인자인 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9는 실시예 2 및 비교예 1의 차폐막에 부착된 줄기 세포의 ALP 활성을 측정한 그래프이다.

도 9를 참조하면, 실시예 2 및 비교예 1 모두 활성이 증가하였으며, 분화 말기에 들어선 3주 이후에는 그 수치가 감소하는 경향을 나타내었으나, 전반적으로 실시예 2 및 비교예 1 모두 비슷한 경향을 보였다.

칼슘 함량

상기에서 줄기세포가 배양된 차폐막의 3주 동안의 골 재생 정도를 유추하기 위해, 칼슘의 함량을 측정하여 도 10에 나타내었다.

도 10은 실시예 2 및 비교예 1의 차폐막 내 존재하는 칼슘의 함량을 측정한 그래프이다.

도 10을 참조하면, 2주차의 경우 비교예 1의 차폐막 내 칼슘의 함량에 비하여 실시예 2의 차폐막 내 칼슘이 약 2배 이상 검출되었으며, 3주차서도 실시예 2의 차폐막의 칼슘 함량 수치가 우수하였다. 이러한 결과는 차폐막 내 함유된 생체적 합성 무기물인 DBP로 인해 뼈 재생에 필수적인 미네랄 과정이 촉진됨을 의미한다.

미네랄화

줄기세포 부착 후 실시예 2 및 비교예 1의 차폐막의 표면을 주사전자현미경으로 측정하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11의 (a)는 비교예 1의 차폐막의 줄기세포 부착직후 및 3주 후의 주사전자현미경 사진이고, (b)는 실시예 2의 차폐막의 줄기세포 부착직후 및 3주 후의 주사전자현미경 사진이다.

도 11을 참조하면, 비교예 1의 차폐막에 비하여 본 발명에 따른 실시예 2의 차폐막의 표면에 세포와 세포외 기질이 보다 넓게 덮여져 있고 보다 많의 양의 미네랄이 침적되어 있음을 알 수 있다.

< 실험예 7> In vivo 랫트 시험

상기 실험예 6에서 In vitro 에서 미네랄 형성이 향상된 것을 확인한 후, in vivo rat model을 통해 뼈 재생 정도를 알아보았다.

CT 스캔

먼저, 12주된 스프레그-다우리계 랫트(SD rat)의 두개골에 8 mm defect를 내어 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 각각 제조된 차폐막을 각각 이식하여 봉합한 후 2달과 3달 후에 뼈 재생 정도를 마이크로 CT 스캔을 이용해 측정하였으며, 얻어진 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12는 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 차폐막에 이식된 뼈의 재생 정도를 보여주는 CT 사진으로, 이식 후 2달 후 비교예 1의 차폐막의 경우 이식한 군에서는 손상부위의 말단 주변에서 약 15%의 재생률을 나타내었으며, 실시예 2의 차폐막의 경우 55%의 재생률을 나타내었다.

또한 3달차에서는 비교예 1의 차폐막의 경우 약 38%의 재생률을 보였으나, 본 발명에 따른 실시예 2의 차폐막의 경우 약 90% 이상의 우수한 재생률을 나타내 PLA를 단독으로 사용하는 경우보다는 뼈와 친화성이 있는 생체적합성 무기물을 혼합사용하는 것이 재생효과를 높일 수 있음을 알 수 있다.

조직 염색

차폐막을 이식한 후 3개월 이후 골조직을 염색하여 재생 여부를 확인하였다.

도 13은 비교예 1에서 제조된 차폐막을 이용한 골조직의 염색 사진이고, 도 14는 실시예 2에서 제조된 차폐막을 이용한 골조직의 염색 사진이다.

도 13을 살펴보면, PLA를 단독으로 사용한 차폐막을 이식한 쥐에서는 손상된 부위의 말단에서만 약간의 뼈가 형상되었으며 내부는 거의 재생되지 않음을 확인할 수 있다.

이와 비교하여, 실시예 2의 차폐막을 사용한 도 14의 사진을 보면, PLA와 DBP를 적절히 혼합한 차폐막의 경우 기존의 뼈와 융합되어 손상 부위의 대부분의 걸쳐 새로운 뼈가 이어져 있음을 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 골조직유도 재생용 차폐막은 각종 손상된 뼈의 조직 재생에 적용되며, 조직공학 분야에 이용 가능하다.

도 3은 실시예 1,2와 비교예 1에서 제조된 골조직유도 재생 차폐막의 인장강도(tensile strength)를 보여주는 그래프이다.

도 4는 실시예 1,2 및 비교예 1에서 제조된 나노섬유 지지체의 신율(elongation)을 보여주는 그래프이다.

도 5는 실시예 1,2 및 비교예 1에서 제조된 나노섬유 지지체의 영스 모듈러스(young's modulus)를 보여주는 그래프이다.

도 12는 실시예 2 및 비교예 1에서 제조된 차폐막에 이식된 뼈의 재생 정도를 보여주는 CT 사진이다.

도 13은 비교예 1에서 제조된 차폐막을 이용한 골조직의 염색 사진이다.

도 14는 실시예 2에서 제조된 차폐막을 이용한 골조직의 염색 사진이다.

Claims

생분해성 고분자와 생체적합성 무기물을 포함하는 나노섬유로 이루어지고, 부직포 형태의 다공성 구조를 포함하는 골조직유도 재생용 차폐막.
제1항에 있어서,

상기 생분해성 고분자는 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 조합으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 골조직유도 재생용 차폐막.
제1항에 있어서,

상기 생체적합성 무기질은 하이드록시아파타이트, 불소화 아파타이트, 옥시 아파타이트, 트리칼슘포스페이트, 모노칼슘포스페이트, 육인산사칼슘, 칼슘메타 포스페이트, 탈미네랄 동물뼈, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 골조직유도 재생용 차폐막.
제1항에 있어서,

상기 골조직유도 재생용 차폐막 내 생분해성 고분자와 생체적합성 무기물이 1:9∼9:1의 중량비로 존재하는 것인 골조직유도 재생용 차폐막.
제1항에 있어서,

상기 나노섬유는 직경이 0.1∼0.3 ㎛인 것인 골조직유도 재생용 차폐막.
제1항에 있어서,

상기 골조직유도 재생용 차폐막은 기공의 크기는 4∼10㎛인 것인 골조직유도 재생용 차폐막.
제1항에 있어서,

상기 골조직유도 재생용 차폐막은 그 두께가 0.2∼0.3㎛인 것인 골조직유도 재생용 차폐막.
제1항에 있어서,

상기 골조직유도 재생용 차폐막은 인장강도가 4∼5 MPa, 신율이 60∼110%이고, 영스 모듈러스(Young's modulus)가 25∼40 MPa인 것인 골조직유도 재생용 차폐막.
제1항에 있어서,

추가로 상기 골조직유도 재생용 차폐막은 첨가제를 포함하는 것인 골조직유도 재생용 차폐막.
제9항에 있어서,

상기 첨가제는 호르몬, 약물, 성장인자, 재생 효소 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 골조직유도 재생용 차폐막.
S1) 생분해성 고분자를 포함하는 용액과 생체적합성 무기물을 혼합하는 단계;

S2) 얻어진 혼합물을 방사용 바늘(needle)에 투입한 후 방사 공정을 수행하는 단계; 및

S3) 상기 방사 후 얻어진 나노섬유를 몰드에 주입한 후 동결 건조하는 단계;

를 포함하는 제1항의 골조직유도 재생용 차폐막의 제조방법.
제11항에 있어서,

상기 생분해성 고분자를 포함하는 용액은 용매로 물; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 및 부탄올의 저급 알코올; 아세톤; 트리플루오로에탄올; 테트라하이드로퓨란; 디클로로메탄; 및 이들의 혼합용매를 사용하는 것인 골조직유도 재생용 차폐막의 제조방법.
제11항에 있어서,

상기 생분해성 고분자를 포함하는 용액은 1∼20 중량%의 농도로 사용하는 것인 골조직유도 재생용 차폐막의 제조방법.
제11항에 있어서,

상기 전기 방사는 바늘의 내경이 0.3∼0.7 mm 이고, 바늘과 수집기 사이의 전압을 10∼20 kV으로 작용하여 전기방사를 수행하는 것인 골조직유도 재생용 차폐막의 제조방법.