KR20190007373A

KR20190007373A - 콩 단백질기반 조직 재생용 나노섬유 멤브레인의 제조방법

Info

Publication number: KR20190007373A
Application number: KR1020180069680A
Authority: KR
Inventors: 이병택; 이현정; 셀린
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2018-06-18
Publication date: 2019-01-22

Abstract

본 발명은 조직 재생용 나노섬유 멤브레인의 제조방법에 관한 것으로서, 세포 생존력 및 세포부착능이 우수한 등 높은 생체 적합성을 통해 골 결손 부위 및 임플란트 주위 뼈 형성 및 혈관 형성을 활발하게 도와 골이나 치주 조직의 조직재생 능력을 향상시키는 장점이 있다.

Description

콩 단백질기반 조직 재생용 나노섬유 멤브레인의 제조방법 {A fabrication method of soya protein based nanofibrous membranes for tissue regeneration}

본 발명은 분리대두단백질 조성을 기반으로 한 조직 재생용 나노섬유 멤브레인의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 골조직 재생을 위하여 자가골이나 동종골을 이식하는 방법이 오래전부터 이용되어 왔으며 현재에도 널리 이용되고 있다. 그러나 자가골은 그 공급이 충분치 않으며, 감염의 위험이 존재하고 자가골을 얻기 위한 수술이 필요하다는 단점을 가지고 있다. 또한, 동종골의 경우에는 면역반응의 유발과 질병 전염의 가능성이 존재한다는 단점을 가지고 있다. 따라서, 충분한 양의 골을 쉽게 얻을 수 있으며, 면역반응과 질병 전염의 가능성이 없는 골이식재의 개발이 절실히 요구되고 있다.

현재까지 개발된 골조직 재생 소재로는 동결건조 동종탈회 골피층부조직 및 망상골조직, 탄소화합물, 인회석 및 비흡수성 경조직 대체 고분자, 트리칼슘인산세라믹 등의 물질들이 손상부에서의 충전기능 및 재생기능성을 어느 정도 갖춘 것으로서 보고되고 있다. 그러나 골 분말 등의 재료에서는 면역반응 및 질병의 전염 등의 문제점이 있고, 합성물질들은 감염에 민감하고 이식 후 자기들끼리 집적되어 버리는 단점을 안고 있다. 또한, 이들이 자생적으로 발생한 것이 아니라 인위적으로 끼워 넣어진 뼈대 역할을 할 뿐이므로 이들이 주위조직세포를 자극하여 세포수준으로부터 조직 재생력을 가질지 여부는 미지로 남아있다.

이상적인 골 충진제 또는 이식재료는 골 손상부위에 충진시킴으로써 상피조직의 침입을 막고 골조직이 입자 사이로 전도되어 골 재생을 증가시킬 수 있어야 한다. 골 대체제의 요건은 다음과 같다. 첫째, 생체적합하여 면역 반응, 조직독성, 염증반응을 유발하지 않아야 한다. 둘째, 초기에 적절한 기계적 강도가 있어야 하고, 조직이 재생됨에 따라 분해되어야 한다. 셋째, 입자 사이의 공극으로 조직과 신생혈관이 자라나 들어와야 한다. 또한, 멸균방법에 제한을 받지 않아야 하고, 조작하기 용이해야 한다. 그러나, 현실로는 이들 요건을 전부 만족한 재료는 없고, 부분적으로 만족 될 뿐이다.

한편, 전기방사 나노섬유 멤브레인은 표면적이 넓어 세포의 부착이 용이하고 공극률이 커서 산소 및 기타 영양분들의 전달 능력이 뛰어나다. 더욱이 나노섬유의 구성성분, 직경, 구조, 방향성 등을 자유자재로 조절할 수 있어 다양한 크기와 특성을 갖는 세포들에 적절히 응용가능하다.

이러한 전기방사 나노섬유 멤브레인은 골아세포 또는 연골모세포 및 기타 관련 생체활성인자로 분화할 수 있는 골아세포를 포함하는 골막으로 연구되며 전구체세포 저장소, 국소 성장 인자 및 세포의 성장인자 모집을 위한 지지체로서 자연 뼈에 대한 골이식이나 조직공학에서 없어서는 안될 부분으로 간주되고 있다. 그럼에도 불구하고, 골막의 미세구조와 생물학적 기능에 관한 생체 공학적 연구는 초기단계에 머물러 있으며, 재료선택, 디자인 및 성능평가의 개선에 더 많은 주의를 기울여야 한다.

이에, 본 발명에서는 손상된 골 조직이나 골막 그리고 치주 조직의 재생을 촉진하기 위한 이식재료를 개발하고자 하였으며, 생체적합성이 우수하고, 독성, 발암성, 알러지, 염증 및 이물반응이 없는 치주 또는 골 조직 재생용 전기방사 나노섬유 멤브레인을 개발하고자 하였다.

대한민국 공개특허 제10-2012-0036217호

본 발명의 목적은 분리대두단백질을 대두 분말에서 분리하는 단계;

상기 분리된 분리대두단백질, 균일한 섬유를 형성하기 위한 고분자 및 전기적 특성을 가지는 용매를 혼합하여 전기방사 용액을 제조하는 단계; 및

상기 제조된 전기방사 용액을 전기방사하여 전기방사 나노섬유 멤브레인을 제조하는 단계를 포함하는, 조직 재생용 나노섬유 멤브레인의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는 순수 콩 단백질은 전기방사가 어렵고, 일반적인 유기용매에 용해되지 않으므로 대두 분말에서 분리대두단백질(SPI)만을 분리하였으며, 상기 분리된 분리대두단백질, 균일한 섬유를 형성하기 위한 고분자 및 전기적 특성을 가지는 용매를 혼합하여 전기방사 용액을 제조하였으며, 상기 전기방사 용액을 전기방사하여 전기방사 나노섬유 멤브레인을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 나노섬유 멤브레인은 분리대두단백질을 포함하지 않은 나노섬유 멤브레인에 비해 골 결손 부위 및 임플란트 주위 뼈 형성 및 혈관 형성을 활발하게 도와 골 조직과 치주 조직의 재생 능력을 향상시키는 장점이 있는 것을 확인하였다.

또한, 대두(콩)에서 분리된 대두분리단백질과 PEO의 조성을 조절하여, 가장 균일한 형태의 섬유 네트워크 구조를 가지는 비율을 확립하였다. 더불어 생분해 속도 조절을 위한 가교제 첨가 시, 멤브레인의 구조가 변형되는 점을 고려하여, 가교 전의 멤브레인 형태를 최대한 동일하게 유지시킬 수 있는 가교 방법을 확립하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 분리대두단백질을 대두 분말에서 분리하는 단계; 상기 분리된 분리대두단백질, 균일한 섬유를 형성하기 위한 고분자 및 전기적 특성을 가지는 용매를 혼합하여 전기방사 용액을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 전기방사 용액을 전기방사하여 전기방사 나노섬유 멤브레인을 제조하는 단계를 포함하는, 조직 재생용 나노섬유 멤브레인의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 조직 재생용 나노섬유 멤브레인의 제조방법은, 분리대두단백질을 콩(대두) 분말에서 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 용어 "분리대두단백질"은 대두에서 단백질 이외의 탄수화물 및 지방 등의 성분을 제거하고 단백질만을 분리한 것을 의미한다.

본 발명에서는 순수 콩 단백질은 전기방사가 어렵고, 일반적인 유기용매에 용해되지 않으므로 대두 분말에서 분리대두단백질(SPI)만을 분리하였다.

본 발명의 조직 재생용 나노섬유 멤브레인의 제조방법은, 균일한 섬유를 형성하기 위한 고분자 및 전기적 특성을 가지는 용매를 혼합하여 전기방사 용액을 제조하는 단계를 포함한다.

상기 분리된 분리대두단백질(SPI)을 균일한 섬유를 형성하기 위한 고분자 및 전기적 특성을 가지는 용매를 혼합하여 전기방사 용액을 제조하였다.

본 발명에서, 상기 균일한 섬유를 형성하기 위한 고분자는 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리락틱-코-글라이콜레이트(polylactic-co-glycolic acid), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리비닐알코올(polyvinlyalcohol), 폴리메타아크릴레이트(Polymetacrylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide)를 전기방사 용액 제조에 사용하였다.

본 발명에서, 상기 전기적 특성을 가지는 용매는 포름산(Formic acid), 수산화나트륨 (Sodium hydroxide), 디메틸 포름아마이드(Dimethy formamide), 다이클로로메테인(Dichloromethane), 증류수(Distill water), 에탄올(Ethanol), 아이소프로판올(Isopropanol), 염산(hydrochloric acid), 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판올(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol), 2,2,2-트리플루오로에탄올(2,2,2-trifluoroethanol), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 2,2,2-트리플루오로에탄올(2,2,2-trifluoroethanol)를 전기방사 용액 제조에 사용하였다.

본 발명의 상기 균일한 섬유를 형성하기 고분자와 분리대두단백질의 혼합비율은 1~3:7(w/v)일 수 있다.

본 발명의 조직 재생용 나노섬유 멤브레인의 제조방법은, 상기 제조된 전기방사 용액을 전기방사하여 전기방사 나노섬유 멤브레인을 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일실시예에서는 균일한 섬유를 형성하기 위한 고분자와 분리대두단백질을 1~3:7(w/v)의 비율을 가지는 나노섬유 멤브레인을 제조하였으며, 상기 비율에서 섬유가 일정하고 균일하게 생성되는 것을 확인하였다.

또한, 상기 나노섬유 멤브레인이 분리대두단백질을 포함하지 않은 나노섬유 멤브레인에 비해 치주 또는 골 조직에 대한 재생능력이 뛰어난 것을 확인하였다.

또한, 본 발명에서 상기 나노섬유의 직경은 400~500nm 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 제조된 나노섬유의 직경(굵기)은 400~500nm이였으며, 일정한 굵기를 가지고 연속성을 가지는 일정한 섬유형을 띄는 나노섬유가 제조된 것으로 확인하였다.

상기와 같은 직경을 가지는 나노섬유는 마이크로 섬유와 비교하여 표면적 대비 부피 비율이 높고 다공성이 높으며 기계적 강도가 뛰어나고 기능화가 유연하기 때문에 나노섬유의 직경이 작을수록 조직 재생 효과가 더 좋다.

본 발명에서, 상기 나노섬유 멤브레인의 제조방법은 상기 전기방사 나노섬유 멤브레인을 가교결합하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 가교 결합은 상기 전기방사 나노섬유 멤브레인을 80~100% 에탄올에 용해한 EDC/NHS 가교제에 1시간 침지하여 1회 가교결합을 진행하는 단계;

상기 1회 가교결합된 전기방사 나노섬유 멤브레인을 60~80% 에탄올에 용해한 EDC/NHS 가교제에 30분간 침지하여 2회 가교결합을 진행하는 단계; 및

상기 2회 가교결합된 전기방사 나노섬유 멤브레인을 40~60% 에탄올에 용해한 EDC/NHS 가교제에 30분간 침지하여 3회 가교결합을 진행하는 단계에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 전기방사 나노섬유 멤브레인을 90% 에탄올에 용해한 EDC/NHS 가교제에 1시간 침지하여 1회 가교결합을 진행하는 단계; 상기 1회 가교결합된 전기방사 나노섬유 멤브레인을 70% 에탄올에 용해한 EDC/NHS 가교제에 30분간 침지하여 2회 가교결합을 진행하는 단계; 및 상기 2회 가교결합된 전기방사 나노섬유 멤브레인을 50% 에탄올에 용해한 EDC/NHS 가교제에 30분간 침지하여 3회 가교결합을 진행하는 단계에 의해 가교결합된 나노섬유 멤브레인이 다른 조건에서 가교된 나노섬유 멤브레인에 비해, 가교전 멤브레인과 유사한 섬유 굵기를 보유하고 있었으며, 가장 균일하고 일정한 섬유를 만드는 것을 확인하였다.

본 발명에서, 상기 나노섬유 멤브레인의 물에 대한 3.5 내지 5분 사이의 접촉각은 10~3도일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 상기 가교결합된 나노섬유 멤브레인의 물에 대한 접촉각은 3.5 내지 5분에서 9.5~3.2도인 것을 확인하였으며, 5분 이내에 완전한 물 흡수를 관찰하여, 습윤성과 친수성이 우수하여, 재료 표면이 유체와 효과적으로 빠르게 접촉되도록 하여, 생물학적 분자와 세포 간의 반응을 강화시킬 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어 "조직 재생"은 골 또는 치주 조직 재생을 의미한다.

본 발명의 용어 "골조직(osseous tissue)"은 뼈를 형성하는 조직을 일컫는 용어이다. 뼈는 표면이 치밀골질로 이루어지며, 중심부나 장골의 양 끝은 그물눈 같이 연합된 해면골질로 되어 있다. 대부분의 뼈는 처음에 결합조직 중의 연골로서 발생하여 나중에 골조직으로 바뀌는데 일부는 결합조직 중에서 직접 생성된다. 말단에는 이웃 뼈와 접하는 부분에 관절면이 있고, 그 표면은 초자연골인 관절연골로 덮여있다. 해면질 가운데의 해면소주는 일정한 배열로 되어 있는 것이 특징이다. 골세포는 골층판 사이에 배열되어 있으며, 불규칙한 별모양으로 가는 원형질 돌기로 인접한 다른 골세포와 연결되어 있다. 뼈의 표면에는 질긴 결합조직성 골막이 있으며, 신경과 혈관이 분포되어 뼈의 보호와 영양을 맡고 있다. 골막이 결손되면 뼈의 생존, 신생, 재생 등의 곤란해진다. 골질의 성분은 수분 20%, 세포를 포함한 유기질 35%, 무기질 45%인데, 뼈가 일정한 탄력성을 유지하는 것은 유기질이 있기 때문이다. 연령이 증가함에 따라 무기질(주로 인산칼슘)이 증가하여 뼈의 경도도 증가한다.

본 발명에서 용어 "치주 조직"은 치조골, 잇몸, 백악질, 및 치주인대로 이루어져 있다. 치조골은 턱뼈에서 치아를 향해 나와 치아를 둘러싸며, 잇몸은 피부가 몸을 덮는 것처럼 치조골을 덮어 외부와 격리한다. 백악질은 치아 뿌리를 감싸며, 치주인대가 백악질에 붙는다. 치주 인대는 치아뿌리와 치조골을 연결하고, 씹는 힘을 분산시킨다. 치주인대에 있는 세포는 손상된 치아 주위 조직을 재생하는 역할을 한다. 즉, 치주조직은 치아를 턱에 붙어 있게 하는 조직이고, 치주 질환은 이 치주 조직이 파괴되어 치아를 잃게 되는 가장 큰 원인이다.

본 발명의 용어 "재생"은 일반적으로 생물체에는 몸의 일부 또는 그 기능을 상실하였을 때, 그 부분의 조직이나 기관을 다시 만들어 원래 상태로 복구시키거나 그 기능을 회복하려는 작용을 일컫는다.

본 발명은 다른 하나의 양태로서, 상기 나노섬유 멤브레인의 제조방법에 의해 제조된 조직 재생용 나노섬유 멤브레인을 제공한다.

상기 나노섬유 멤브레인의 제조방법은 전술한 바와 같으며, 용어 "조직 재생"도 전술한 바와 같다.

본 발명은 분리대두단백질을 이용한 나노섬유 멤브레인에 관한 것으로, 높은 생체 적합성을 통해 골 결손 부위 및 임플란트 주위 뼈 형성 및 혈관 형성을 활발하게 도와 골이나 치주 조직의 조직재생 능력을 향상시키는 장점이 있다. 본 발명에서는 천연 유래 물질을 조직재생용 지지체로 도입하기 위해 콩에서 분리된 콩단백질인 대두분리단백질을 이용하여, 골 재생을 위한 전기방사 멤브레인을 성공적으로 제조하였다. 또한, 대두(콩)에서 분리된 대두분리단백질과 PEO의 조성을 조절하여, 가장 균일한 형태의 섬유 네트워크 구조를 가지는 비율을 확립하였다. 더불어 생분해 속도 조절을 위한 가교제 첨가 시, 멤브레인의 구조가 변형되는 점을 고려하여, 가교 전의 멤브레인 형태를 최대한 동일하게 유지시킬 수 있는 가교 방법을 확립하였다.

도 1은 (A)분리대두단백질(SPI)과 (B)대두 분말(soybean flour)의 FTIR 측정결과 그래프이다.
도 2는 전기방사 나노섬유 멤브레인을 제작하기 위한 전기방사 장치를 나타낸 것이다.
도 3은 PEO/SPI 농도에 따른 전기방사 멤브레인의 표면 구조(SEM)와 FTIR 결과이다.
도 4는 분리대두단백질을 이용하여 제조된 전기방사 멤브레인의 가교에 따른 SEM 결과이다.
도 5는 분리대두단백질을 이용하여 제조된 나노섬유 멤브레인의 접촉각 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 분리대두단백질 기반 전기방사 멤브레인의 세포 생존능 및 부착능 관찰 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실험예 1: 분리대두단백질(soy protein isolate, SPI) 의 제조

순수 콩 단백질은 전기방사가 어렵고, 일반적인 유기용매에 용해되지 않으므로 대두 분말에서 분리대두단백질(SPI)만을 분리하였다.

먼저, 1L 비커에 6M 구아니딘염산(Guanidine hydrochloride) 200mL를 제조하였다. 제조된 6M 구아니딘염산에 대두 분말(Soybean flour typeⅠ, Sigma Aldrich) 2% (w/v)를 혼합한 후 DL-Dithiothreitol solution (1M in H2O, Sigma Aldrich)이 총 농도 25mmol/L가 되도록 30분에 한번씩 총 3시간 동안 넣어 반응시켜 혼합 용액을 제조하였다. 상기와 같이 반응된 혼합 용액을 관상막(tubular membrane) 튜브를 적당한 크기로 자른 후 고무줄로 끝을 묶은 후, 관상막 튜브에 부어주었다.

또한, 다른 1L 비커에 2M NaOH 수용액을 제조한 후, 상기 혼합 용액이 함유된 관상막 튜브를 상기 2M NaOH 수용액이 들어 있는 비커에 넣고 반응시켰다. 상기 혼합 용액의 색이 베이지 톤의 흰색에서 투명색으로 변한 후(약 30분 정도 소요), 증류수에 1시간 정도 washing 하였다. 상기 관상맥 튜브 안에 함유된 상기 혼합 용액을 다른 50 ml의 튜브에 옮기고 9000rpm/min, 10분 동안 원심 분리시켰다. 원심분리 시킨 상기 혼합 용액의 상층부만 따서 -80℃에서 동결 후 2일동안 동결건조시켜 분리대두단백질을 수득하였다. 상기와 같은 과정에 의해 얻어진 분리대두단백질을 도 1을 통하여 확인하였다.

분리대두단백질(SPI)이 대두 분말(soybean flour)에서 잘 분리되었는 지를 확인하기 위하여, 도 1에서 FT-IR 분석을 실시하였다. 도 1은 분리대두단백질과 대두 분말의 FT-IR 측정결과 그래프이다. 그 결과, 분리대두단백질(soy protein isolate, SPI)이 대두 분말에서 잘 분리된 것을 확인하였다.

실험예 2: 전기방사 용액의 제조 및 전기방사 멤브레인 제작

2-1: 전기방사 용액의 제조 및 전기방사 멤브레인 제작

대두분리단백질(soy protein isolate; SPI)의 전기방사성을 높이기 위해 폴리에틸렌옥사이드(PEO)를 섞어 전기방사 멤브레인을 제작하였다. 구체적으로, 트리플로오로에탄올 용매에 PEO(폴리에틸렌옥사이드, polyethylene oxide)와 SPI(분리대두단백질, Soya Protein Isolate)를 0:7, 1:7, 3:7, 5:7, 7:0의 비율(w/v)로 혼합하여, 전기방사용액을 제조하였다. 상기 제조된 전기방사용액을 23 게이지 바늘을 사용하여 9㎕/min 속도로 방사하여 전기방사 멤브레인을 제작하였고, 멤브레인 형태는 3.5cm 지름 집합 드럼을 사용하여 획득하였다.

구체적인 전기방사조건은 다음과 같다. 제조된 전기방사 용액을 시린지에 넣은 후, 상기 용액을 9㎕/min의 속도로 토출시키면서, 니들(23G)에 23kV의 전압을 가해주면서, 콜렉터와 바늘 사이의 거리는 13cm로 고정하고, 콜렉터의 회전 속도는 350rpm, 시린지 직경은 4.78mm인 조건에서 전기방사를 진행하였다.

전기방사 조건

Composite	2,2,2-Trifluoroethanol, 0~7% (w/v %) SPI, 0~7% (w/v %) PEO
Needle Gauge	23
Voltage (kV)	23
Flow rate (μL/min)	9
Roller speed (rpm)	350
Between collector distance (cm)	13
Syringe diameter (mm)	4.78

상기 제작한 멤브레인을 진공건조 후 0.5 M 농도의 EDC-NHS(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide-N-hydroxy succinimide)을 각각 50, 70, 90% 에탄올에 녹여 각각 가교결합을 하였다.

2-2: 콩단백질 기반 전기방사 멤브레인의 미세구조 및 구성 분석

상기 제조된 멤브레인의 표면 미세구조를 SEM 기기를 사용하여 관찰하였으며, 화학적 구성 확인을 위해 각각 다른 농도를 가지는 멤브레인의 FTIR 분석을 진행하였다. 최적화된 농도의 멤브레인을 사용하여, 가교결합 에탄올 농도와 침지시간에 따른 변화 관찰을 위하여 SEM 기기를 사용하여 각 멤브레인의 섬유 굵기를 측정하였으며, 통계적 유의성 분석을 진행하였다.

2-3: 콩단백질 기반 전기방사 멤브레인의 미세구조 및 화학적 특성 평가

도 3에는 각각 다른 농도의 PEO/SPI의 비율을 가지는 전기방사 멤브레인의 미세구조를 관찰한 결과를 나타내었다. 전기방사 결과 PEO:SPI의 비율이 0:7인 경우, 즉, PEO를 포함하지 않은 경우, 전기방사상 섬유로 만들어지지 않았다.

또한, SEM 이미지에서 확인할 수 있듯이, PEO:SPI의 비율이 1:7과 3:7을 비교한 결과 PEO의 농도가 높을수록 섬유모형이 균일하고 일정한 것을 관찰하여, PEO:SPI의 비율이 3:7인 경우, 전기방사 멤브레인의 섬유가 가장 일정하고 균일한 것을 확인하였다. 그러나, PEO:SPI의 비율이 5:7일때는 용액의 점도가 너무 높아져서 섬유모형이 일정하지 않고, 크기가 제각각 다른 것을 확인하였다(도 3A).

상기 제조된 전기방사 멤브레인의 화학적 구성 확인을 위하여 서로 다른 PEO:SPI의 비율을 가지는 전기방사 멤브레인의 FTIR을 분석한 결과 800cm^-1와 1090cm^-1부근 파장에서 PEO의 파장수가 나타나며, 3200cm^-1와 1500cm^-1 부근 파장에서 SPI의 파장수와 같은 파장수가 관찰되는 것을 도 3B에서 확인하였다.

2-4: 전기방사 멤브레인의 가교에 따른 특성 평가

본 발명에서는 생분해 속도 조절을 위한 가교제 첨가 시, 멤브레인의 구조가 변형되는 점을 고려하여, 가교 전의 멤브레인 형태를 최대한 동일하게 유지시킬 수 있는 가교 방법을 확립하고자 하였다.

도 4의 SEM 이미지는 섬유가 가장 일정하고 균일한 PEO:SPI 3:7인 전기방사 멤브레인을 에탄올에 용해된 가교제에 침지하여 가교결합한 후, 상기 전기방사 멤브레인의 섬유 굵기를 측정한 결과이다. 가교 조건 및 가교에 따른 섬유의 직경굵기)은 표 2에 나타내었으며, 섬유의 형태를 도 4에 나타내었다.

표 2에 기재된 b 가교조건(EDC/NHS 가교제를 에탄올 90%에 용해 후, 1시간 가교 진행, EDC/NHS 가교제를 에탄올 70%에 용해 후, 1시간 가교 진행, EDC/NHS 가교제를 에탄올 50%에 용해 후, 1시간 가교 진행)에서 전기방사 멤브레인을 가교 한 후, 도 4b에서 SEM 이미지 관찰 결과 섬유들 사이의 merge는 이루어지지 않았지만 가교전 멤브레인(도 4a)과 비교할 때 멤브레인의 이동이 있는 것을 확인하였다.

표 2에 기재된 c 가교조건(EDC/NHS 가교제를 에탄올 90%에 용해 후, 1시간 가교 진행, EDC/NHS 가교제를 에탄올 70%에 용해 후, 30분 가교 진행, EDC/NHS 가교제를 에탄올 50%에 용해 후, 30분 가교 진행)에서 전기방사 멤브레인을 가교 한 후, 도 4c에서 SEM 이미지 관찰결과 가교전 멤브레인과 큰 차이를 보이지 않은 것을 확인하였다.

표 2에 기재된 c 가교조건(EDC/NHS 가교제를 에탄올 90%에 용해 후, 1시간 가교 진행, EDC/NHS 가교제를 에탄올 70%에 용해 후, 15분 가교 진행, EDC/NHS 가교제를 에탄올 50%에 용해 후, 15분 가교 진행)에서 전기방사 멤브레인을 가교 한 후, 도 4d에서 SEM 이미지 관찰 결과 섬유들사이의 merge가 많이 이루어져 전체적으로 섬유 형태가 없어지고 필름에 가까워져 다공성이 부족하여 세포 부착에 부적합 것을 확인하였다.

결론적으로 표 2의 c 조건에서 가교한 경우, 가교전과 전기방사 멤브레인의 섬유 굵기 및 섬유 형태가 가장 비슷하여 c의 조건이 가교 조건으로 가장 바람직한 것을 확인하였다. 따라서 c의 가교 조건이 가교 전 후에 변화없이 가장 균일하고 일정한 섬유를 만드는 가교 조건인 것을 확인하였다.

실험예 3: 콩단백질 기반 전기방사 멤브레인의 친수성 결과

상기와 같이 전기방사 멤브레인을 제조 후 지지체의 친수성 정도를 분석하기 위해 접촉각을 측정하였다. 물을 떨어트린 후 물층과 지지체 사이에 만들어 지는 각도를 측정하였다. 전기방사 멤브레인의 친수성 특성은 조직 공학적 생체 내 적용 시 중요한 요인으로, 물을 멤브레인에 떨어뜨려 물과 멤브레인의 접촉각을 시간에 따라 측정함으로써 친수성 정도를 파악 할 수 있었다. 도 5는 PEO:SPI의 비율이 3:7인 전기방사 멤브레인을 0.05 M 농도의 EDC/NHS로 1h:30min:30min (90:70:50% EtOH) 조건에서 가교 처리하여 측정한 것으로 상기 가교결합된 나노섬유 멤브레인의 물에 대한 접촉각은 3.5 내지 5분에서 9.5~3.2도였으며, 5분 이내에 완전한 물 흡수를 관찰하였다. 이는 상기 제조된 전기방사 멤브레인이 우수한 습윤성과 친수성을 나타내는 것을 보여주는 결과이다. 이러한 높은 습윤성에 의해 재료 표면이 유체와 효과적으로 빠르게 접촉되도록 하여, 생물학적 분자와 세포 간의 반응을 강화시킬 수 있다.

실험예 4: 콩단백질 기반 전기방사 멤브레인의 생체적합성 평가

세포를 사용하여 지지체의 독성 및 세포 부착 능력을 확인하기 위하여, 세포로 mouse fibroblast (L929)을 사용하였으며 상기 PEO:SPI의 비율이 3:7인 전기방사 멤브레인을 0.05 M 농도의 EDC/NHS로 1h:30min:30min (90:70:50% EtOH) 조건에서 가교 처리하여 사용하였다. 상기 가교된 멤브레인을 10분씩 3번 헹군 후 세포 배양액에 1시간 담가둔 후 사용하였다. 지지체와 함께 배양한 세포의 독성평가를 알아 보기위해 1×10³ cell/well을 96 well 플레이트에 배양한 후 1, 3, 5 일 후 CCK(Cell Counting Kit)-8을 이용하여 흡광도 값을 측정하였다. 또한, 세포의 부착 능력을 확인하고자 1×10³ cell/well을 confocal dish에 24시간 배양 후에 고정, Vinculin 시약으로 염색하여 세포의 부착여부를 공초점 현미경을 통해 확인하였다.

그 결과, 가교 된 전기방사 멤브레인의 세포 생존능 및 부착력을 평가하기 위해 CCK-8 실험을 관찰한 결과, 배양 시간에 따라 멤브레인에서의 세포 흡광도 값이 증가되는 것을 확인하여, 상기 전기방사 멤브레인에서 세포의 생존이 우수한 것을 확인하였다(도 6A). 또한, Vinculin 염색 후 공초점 현미경으로 세포 부착능을 관찰한 결과, 배양 24시간 이후에는 세포가 잘 부착되어 있는 것을 확인하여, 상기 전기방사 멤브레인이 세포 부착이 잘 되는 것을 확인하였다(도 6B).

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

분리대두단백질을 대두 분말에서 분리하는 단계;
상기 분리된 분리대두단백질, 균일한 섬유를 형성하기 위한 고분자 및 전기적 특성을 가지는 용매를 혼합하여 전기방사 용액을 제조하는 단계; 및
상기 제조된 전기방사 용액을 전기방사하여 전기방사 나노섬유 멤브레인을 제조하는 단계를 포함하는, 조직 재생용 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 조직은 치주 또는 골의 조직인 것인, 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 균일한 섬유를 형성하기 위한 고분자는 폴리에틸렌옥사이드(polyethylene oxide), 폴리락틱-코-글라이콜레이트(polylactic-co-glycolic acid), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리비닐알코올(polyvinlyalcohol), 폴리메타아크릴레이트(Polymetacrylate), 폴리카보네이트(polycarbonate), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인, 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 전기적 특성을 가지는 용매는 포름산(Formic acid), 수산화나트륨 (Sodium hydroxide), 디메틸 포름아마이드(Dimethy formamide), 다이클로로메테인(Dichloromethane), 증류수(Distill water), 에탄올(Ethanol), 아이소프로판올(Isopropanol), 염산(hydrochloric acid), 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판올(1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol), 2,2,2-트리플루오로에탄올(2,2,2-trifluoroethanol), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인, 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 균일한 섬유를 형성하기 고분자와 분리대두단백질의 혼합비율은 1~3:7(w/v)인 것인, 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 제조된 나노섬유의 직경은 400~500nm인 것인, 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 전기방사 나노섬유 멤브레인을 가교결합하는 단계를 더 포함하는 것인, 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 가교 결합은 상기 전기방사 나노섬유 멤브레인을 80~100% 에탄올에 용해한 EDC/NHS 가교제에 1시간 침지하여 1회 가교결합을 진행하는 단계;
상기 1회 가교결합된 전기방사 나노섬유 멤브레인을 60~80% 에탄올에 용해한 EDC/NHS 가교제에 30분간 침지하여 2회 가교결합을 진행하는 단계; 및
상기 2회 가교결합된 전기방사 나노섬유 멤브레인을 40~60% 에탄올에 용해한 EDC/NHS 가교제에 30분간 침지하여 3회 가교결합을 진행하는 단계에 의해 이루어지는 것인, 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 나노섬유 멤브레인의 물에 대한 3.5 내지 5분 사이의 접촉각은 10~3도인 것인, 나노섬유 멤브레인의 제조방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 나노섬유 멤브레인의 제조방법에 의해 제조된 조직 재생용 나노섬유 멤브레인.